ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Huy Hoàng

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Xác nhận của tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

THÁI NGUYÊN - 2017

i

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI

I. Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu

STT Họ và tên Đơn vị công tác

1 ThS. Nguyễn Huy Hoàng Đại học Y Dược - ĐHTN

2 PGS. TS. Lê Văn Sơn Viện Công nghệ Sinh học

3 TS. Phạm Bích Ngọc Viện Công nghệ Sinh học

4 TS. Nguyễn Thu Hiền Đại học Y Dược - ĐHTN

5 TS. Nguyễn Thị Thu Ngà Đại học Sư phạm - ĐHTN

II. Đơn vị phối hợp chính

STT Tên đơn vị Họ tên người đại diện

1 Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam PGS. TS. Chu Hoàng Hà

ii

MỤC LỤC

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI .................... I

MỤC LỤC ....................................................................................................... II

DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................... III

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ IV

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................... VII

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... III

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3

1.1. Interleukine 7 ........................................................................................ 3

1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong

y học..................................................................................................................7

1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới ............................. 7

1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước ............................... 9

1.3. Nghiên cứu biểu hiện interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá....10

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 15

2.1. Vật liệu.................................................................................................15

2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................ 15

2.1.2. Các chủng vi khuẩn ....................................................................... 15

2.1.3. Các gene và vector ........................................................................ 15

2.1.4. Hóa chất và thiết bị máy móc ....................................................... 15

2.1.5. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 16

2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 16

2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................17

2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu

hiện ở thực vật ......................................................................................... 18

2.2.2. Thiết kế mồi .................................................................................. 19

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp . 19

2.2.5. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử ... 24

2.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7 ..................................... 26

2.2.7. Đánh giá hoạt tính protein interleukin 7 tái tổ hợp ....................... 28

2.2.8. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ....................................... 29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 30

3.1. Thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật30

3.2. Thiết kế vector chuyển gene interlukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá 32

3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP ............. 32

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-

100xELP ................................................................................................. 34

3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng

phương pháp Agro-infiltration......................................................................36

3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp..........................39

3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp................39

3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp ..................44

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................. 46

4.1. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá...46

4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC 47

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................................... 50

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ....... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 68

iii

DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký tự Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

35S Promoter CaMV 35S

A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens

bp Base pairs Cặp bazơ

BSA bovine serum albumin Dung dịch protein chuẩn

cDNA Complementary DNA Complementary DNA

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

E.Coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic

ELISA Enzym-linked

immunosorbent assay

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên

trong mẫu xét nghiệm

ELP elastin-like peptide

hIL-7 human interleukin 7 interleukin 7 của người

HRP Horseradish Peroxidase Horseradish Peroxidase

IFN Interferon

IL Interleukin

IMAC Immobilized Metal ion Affinity

Chromatography Sắc kí ion cố định kim loại

kb Kilo base

kDa Kilo danton

mITC membrane-based Inverse

Transition Cycling Đảo ngược theo màng

OD Optical Density Mật độ quang

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RNase Ribonuclease Enzyme ribonuclease

rpm Revolutions per minute Vòng/phút

scFv Single-chain variable fragment

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T

WT Wild type Chủng hoang dại

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật 11

2.1 Trình tự mồi sử dụng trong đề tài 16

2.2 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn 20

2.3 Thành phần phản ứng lai 20

2.4 Thành phần gel SDS-PAGE 25

3.1 Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp

mITC 43

3.2 Kết quả hoạt hóa dòng tế bào 2E8 bằng interleukin 7 45

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc protein Interleukin 7 người 3

1.2 Thụ thể interleukin 7 4

2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 17

3.1 Trình tự gene interleukin 7 trước và sau khi thay đổi mã di truyền 31

3.2 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 32

3.3 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene

pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 33

3.4 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene

pCB301/IL7/100xELP 35

3.5 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

bằng enzyme NcoI 36

3.6 Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu

IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R 37

3.7 Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI 38

3.8 Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

cây thuốc lá 39

3.9 Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng

Western blot 40

3.10 Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC 41

3.11 Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC 43

3.12 Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch 44

3.13 Hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp 46

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Đơn vị: Trường Đại học Y Dược

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:

Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh

giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Huy Hoàng

Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên

Thời gian thực hiện: 2014 - 2017

2. Mục tiêu:

Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7 tái

tổ hợp.

Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7

3. Kết quả nghiên cứu:

Thiết kế được 2 cấu trúc vector chuyển gene và biểu hiện protein tái tổ

hợp ở thực vật.

Biểu hiện thành công protein ở thực vật bằng phương pháp Agro-

infiltration.

Đã đánh giá được hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp.

4. Sản phẩm:

4.1. Sản phẩm khoa học:

03 bài báo đăng các tạp chí khoa học, 01 trình tự gen đăng kí trên Ngân

hàng gen.

- Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích

Ngọc, Lê Văn Sơn (2014), “Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở

người”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, Tập 118 số

04, tr. 153-156.

- Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn

(2015), “Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển gen

trong hệ thống thực vật”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái

Nguyên, Tập 134 số 04, tr. 25-28.

- Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn

(2017), “Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá

(Nicotiana benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltration”, Tạp chí

Sinh học, Tập 39 số 02, tr. 232-238.

- Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene

is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:

MF170526.1

4.2. Sản phẩm đào tạo

4.3. Sản phẩm ứng dụng

01 quy trình thiết kế vector tái tổ hợp mang gene mã hóa protein

interleukin 7 và sản phẩm vector tái tổ hợp.

01 quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium.

01 quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật bằng phương pháp

Agro-infiltration.

5. Hiệu quả:

Khoa học công nghệ: Đề tài hoàn thành sẽ góp phần hoàn thiện các

phương pháp sản xuất protein interleukin 7 tái tổ hợp phục vụ trong y học

Thông tin: Cung cấp những thông tin về giá trị của các loại cytokin nói

chung và interleukin, trong đó có interleukin 7 nói riêng trong hệ thống miễn

dịch của con người

Nâng cao năng lực nghiên cứu của những người tham gia, đặc biệt với

chủ nhiệm đề tài.

Bổ sung 01 tài liệu tham khảo phục vụ cho việc nghiên cứu, giảng dạy

và học tập của học viên, sinh viên chuyên ngành Di truyền học.

6. Khả năng áp dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:

Đề tài đã cung cấp quy trình biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp ở

cây thuốc lá chuyển gene trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục

đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào.

Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein interleukin 7 tái

tổ hợp thu được sau khi tinh sạch, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn.

Ngày 14 tháng 7 năm 2017

Cơ quan chủ trì (ký, họ và tên, đóng dấu)

Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên)

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information:

Project title: Research on expressing the recombinant interleukin 7

protein in plant culture systems

Code number: ĐH2014-TN05-01

Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA

Implementing institution: TNU-University of Medicine and Pharmacy

Duration: from 2014 to 2017

2. Objective(s):

- Design the recombinant interleukin 7 encoded gene transferred the

plant culture systems culture systems.

- Generates tobacco expressing protein interleukin 7.

3. Research results:

- Design of two transgenic vector constructs and recombinant protein

expression in plants.

- Successfully expression of protein in plants by Agroinfiltration.

- The recombinant IL-7 protein was evaluated bioactivity

4. Products:

4.1. Scientific product:

03 articles published scientific journals, 01 sequence has been registered

on the genebank

- Nguyen Huy Hoang, Nguyen Thu Giang, Chu Hoang Ha, Phạm Bich

Ngoc, Le Van Son (2014), “Interleukin 7 and role in the immune system of

humans”, TNU-Journal of scrience and technology, 118 (04), pp. 153-156.

- Nguyen Huy Hoang, Chu Hoang Ha, Pham Bich Ngoc, Le Van Son

(2015), “Vector construction contained structure interleukin-7 in plant”, TNU-

Journal of scrience and technology, 134 (04), pp. 25-28.

- Nguyen Huy Hoang, Pham Bich Ngoc, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2017),

“Transient expression of a taste-modifying protein, interleukin-7, in nicotiana

benthamiana using agro-infiltration”, Journal of biology, 39 (02), pp. 232-238.

- Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene

is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:

MF170526.1

4.2. Training product

4.3. Application product:

01 recombinant vector design process carrying genes encoding

interleukin 7 protein and recombinant vector product.

01 recombinant vector transformation process into Agrobacterium.

01 process of recombinant protein expression in plants by method

Agroinfiltration.

5. Effects:

Science and Technology: The completed project will contribute to the

improvement of the methods of recombinant interleukin 7 production in

medicine.

Information: Provides information on the value of cytokines and

interleukins, including interleukin 7 in particular in human immune systems.

Improve the research capacity of the participants, especially the leader.

Additional 01 reference material for the research, teaching and learning

of students, specialized students in Genetics.

6. Transfer alternatives of reserach results andapplic ability:

The subject has provided a process for expression of interleukin 7 recombinant protein in transgenic tobacco plants in a laboratory scale for cell culture purposes.

Initial evaluation of the bioactivity of the recombinant interleukin 7 protein obtained after purification, is the premise for further research.

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc

sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng. Tuy nhiên, hiện nay con người

đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường,

SARS, ebola v.v…. Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo

từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang

tính cầm cự.

Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các

tế bào bạch cầu. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu

vào các Interleukine. Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL-7) là một cytokine có

vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T [3]. Đây là những

dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng

là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ

thể con người.

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng

rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước

đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết

từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi

nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm

bệnh nguy hiểm cho con người. Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được

đặt ra một cách cấp thiết.

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực

công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như

trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng

hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính

2

tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng

rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin,

hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong

khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn.

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm

nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như

chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết

ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch

dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con

người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do

các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.

Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng

liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản

xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu. Căn

cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng

tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene

interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7.

Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7

3. Nội dung nghiên cứu

Tối ưu mã di truyền gene interleukin 7 biểu hiện ở thực vật.

Thiết kế gen mã hóa interleukine 7 tái tổ hợp vào vector chuyển gen phù

hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật.

Chuyển cấu trúc gen vào cây thuốc lá

Phân tích, đánh giá chất lượng interleukine 7 tái tổ hợp thu được.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Interleukine 7

IL-7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4

kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu

nối disulfide nội phân tử [102]. Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm

có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Cấu trúc

phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động mạnh

(2,1 - 8,0) [18]. Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung 2-

mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết disulfide

có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [7].

Hình 1.1. Cấu trúc protein hIL-7

(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98].

hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex

[58] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989 [59]. hIL-7 có vai trò quan

trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu

lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [54], [55].

hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [58], [99]. Ngoài ra, các tế bào

khác như các tế bào tủy [26], nội mạc ruột [97] và tế bào sừng trên da [31] cũng

có thể sản xuất IL-7. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIL-7 còn được

4

sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào T của hạch

bạch huyết [47].

hIL-7 có hai thụ thể (IL-7 receptor) là IL-7Rα và thụ thể γc. Trong đó,

thụ thể IL-7Ra (CD127) cũng là thụ thể của các lymphopoietin mô đệm tuyến

ức (TSLP) [107] và chuỗi g (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-9, IL-15 và IL-21

[15], điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các cytokine trong hệ miễn

dịch người [22]. Trong khi thụ thể gc thường thấy ở các tế bào tạo máu thì IL-

7Ra lại thấy ở trên bề mặt các tế bào bạch huyết. Gen mã hóa cho protein thụ

thể hIL-7 nằm ở vị trí 5p13 trên nhiễm sắc thể số 5, gần với vị trí của thụ thể

hormone tăng trưởng prolactin và một gen ức chế ung thư tế bào bạch cầu có

đặc điểm tín hiệu tương tự như thụ thể IL-7 [31].

Trọng lượng phân tử của protein thụ thể IL-7 là 80 kDa. Chuỗi γc là

thành phần chức năng và có vai trò góp phần làm tăng liên kết giữa hIL-7 và

IL-7 receptor. Protein IL-7Rα tồn tại ở hai dạng: dạng liên kết với màng và

dạng hòa tan. Các đồng vị màng (p64) cũng được liên kết với IL-2Rγc [31].

Hình 1.2. Thụ thể interleukin 7

(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98]

5

Janus kinase-3 (Jak3) gắn chọn lọc với các chuỗi gc [89] trong khi Jak1

gắn với IL-7Ra [76]. Sự đột biến ở chuỗi gc [13], [20], [64] hoặc Jak3 [9], [62],

[70] gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải trầm trọng ở người, đặc

trưng bởi sự thiếu hụt lympho T và NK [63]. Khi hIL-7 gắn với IL-7Ra mang

theo chuỗi gc liên kết với Jak1 và Jak3, điều này làm hoạt hoá kinase và

phosphoryl hoá các vị trí Y449 quan trọng trên IL-7Ra [33]. Sau đó, các thụ

thể trở thành điểm bám cho protein Stat5 qua sự tương tác SH2-

phosphothyrosine để thực hiện các chức năng. Các tiểu đơn vị p85a của

PI3Kinase liên kết trực tiếp với Y449 phosphoryl hoá thông qua vùng SH2. Các

PI3K được đưa qua màng tế bào và hoạt hoá các gen PDK1 và Akt [85]. Akt

sau đó sẽ phosphoryl hoá gen điều tiết chuyển hoá tế bào, sự tiến triển của chu

kì tế bào như GSK3b, P27. hIL-7 điều khiển quá trình này bằng việc phosphoryl

hoá GSK3b, làm ngăn cản quá trình phosphoryl hoá các phân tử tín hiệu của tế

bào b-catein, cản trở sự suy thoái và kết hợp với các yếu tố phiên mã khác như

TCF/LEF-1, giúp một số gen được biểu hiện [57].

hIL-7 có tính đặc hiệu cao với IL-7 receptor. Sweeney và cộng sự đã

chứng minh yếu tố DAB389 gây độc tế bào chỉ hoạt động với tế bào có IL-7

receptor, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề trị liệu nhằm chống lại các khối

u ác tính mang IL-7 receptor. Sự biểu hiện của IL-7 receptor cũng có thể được

coi là mục tiêu điều trị trong các khối u ác tính [90].

Tuy nhiên, hIL-7 cũng được chứng minh có khả năng tạo ra các tín hiệu

khác khi truyền thông tin trong các tế bào không có sự xuất hiện của IL-7R bởi

khả năng đặc hiệu với các thụ thể bề mặt khác như Flt-3 và c-kit [26].

Hoạt tính sinh học của hIL-7

hIL-7 có chức năng chủ yếu là hỗ trợ cho sự tăng trưởng và chống lại các

yếu tố phá hủy các tế bào lympho B và lympho T, thúc đẩy sự tăng trưởng của

tế bào lympho B gốc [104] và kích thích tế bào lympho B và lympho T phát

6

triển [7], [18]. hIL-7 giúp tăng cường sự phát triển của tế bào thực bào tự nhiên

và thúc đẩy sự tăng trưởng và khác biệt của các dòng tế bào lympho T [71],

[75], [86], đồng thời tăng cường hệ thống, kích thích sự hoạt động của bạch cầu

đơn nhân máu ngoại vi [7]. hIL-7 có thể tăng tốc độ sản sinh bạch huyết trong

trạng thái giảm bạch cầu lympho như ở những bệnh nhân AIDS [26], [64] hoặc

sau khi hóa trị liều cao hoặc xạ trị [57, [57].

Morrissey (1991) đã chỉ ra rằng tế bào lympho T đáp ứng với phorbal

myristate acetate trong thụ thể của hIL-7 thay vì trải qua quá trình apoptosis.

Apoptosis hay quá trình chết của tế bào theo một chu trình là một quá trình

phức tạp của các hoạt động thông qua trung gian hoặc mất yếu tố tăng trưởng

cytokine cần thiết hoặc do sự tham gia của một thụ thể chết với TNF. Ví dụ khi

loại bỏ p53 ở gen ức chế khối u trong Rag-1-/- ở chuột, quá trình apoptosis bị

chặn lại, tế bào lympho T ban đầu sẽ sống sót lâu hơn mà không có một chức

năng TCR cụ thể [54]. Do đó, nhiều khả năng đây là một chức năng quan trọng

của hIL-7 để ngăn chặn tế bào gốc từ tuyến ức trải qua quá trình apoptosis.

Cytokine sử dụng chuỗi γc trong các thụ thể của chúng, chẳng hạn như IL-2,

IL-4, IL-9 và IL-15 để có thể tồn tại trong điều kiện nhất định. hIL-7 có thể

duy trì khả năng tồn tại của tế bào bằng cách ngăn cản yếu tố “gây chết” hoặc

kích hoạt yếu tố “thúc đẩy sự sống” [55].

Mặt khác, hIL-7 có thể hoạt hóa các tế bào T chống lại quá trình

apoptosis bằng cách nâng cao mức độ hoạt động của các protein chống

apoptosis như Bcl-2 và Bcl-XL [7], [22]. Ngoài ra, hIL-7 ngăn chặn tế bào chết

bằng cách ức chế một số protein pro-apoptosis như Bid, Bad hoặc Bax [57,

[37], [67] và có thể hoạt động như một đồng yếu tố với gen V, D, J tái tổ hợp

để thực hiện các phản ứng của các chuỗi TCR trong sự hiện diện của hIL-7 tái

tổ hợp [97]. Đặc biệt, hIL-7 cũng đóng góp vào quá trình cân bằng nội môi của

tế bào T CD8+ ở các tế bào lymphopenic và có thể thay thế cho sự thiếu hụt của

IL-15 [83]; làm tăng khả năng sinh kháng thể chống ung thư [72].

7

Hiện nay, hIL-7 được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh như

bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính [35], [80], bệnh cúm A [4], một số bệnh

tự miễn [14]; được sử dụng là yếu tố chỉ thị một số bệnh như viêm đường mật

cấp tính [88], ung thư đại trực tràng (CRC) [44], bệnh viêm gan B [105] v.v…

đã thu được nhiều kết quả khả quan.

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÁC LOẠI

CYTOKINE TÁI TỔ HỢP TRONG Y HỌC

1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới

Cytokine đầu tiên được phát hiện là interferon vào năm 1957, là một

cytokine có hoạt tính chống virus. Trong những thập niên vừa qua, các nghiên

cứu và hiểu biết về vai trò sinh lý cũng như sinh lý bệnh của cytokine đã đạt

được những thành tựu đáng kể. Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh

học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm.

Ngoài ra, các phân tử này cũng đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như:

bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, các bệnh lý viêm mạn tính (viêm đại

tràng mạn, bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp, bệnh vảy nến...), viêm gan

siêu vi, nhiễm HIV v.v... Các cytokine cũng được sử dụng là các tác nhân trị

liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt được sử dụng trong huyết học) hay là các đích

điều trị (như TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v...).

Vì vậy hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp

đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt các cytokine

khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng

như: hIL-2, hIL-7, IFN-a, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO [45], [50]. Ngoài

ra, còn có một số loại cytokine khác đã được sử dụng nhưng còn hạn chế do

chưa kiểm soát được khả năng thải loại cũng như các hiệu ứng phụ khác như

TNF-a, hIL-12 v.v…

Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng

8

điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động theo bốn

hướng chính:

Dùng các chất đối vận với các cytokine được xem là có vai trò gây bệnh.

Sử dụng các kháng thể kháng cytokine như kháng thể kháng TNF a trong điều

trị nhiễm trùng huyết hoặc ức chế hIL-6 trong viêm đa khớp dạng thấp v.v…

Dùng các cytokine để kích thích các hoạt động sinh lý của cơ thể:

erythropoietin trong điều trị thiếu máu, các yếu tố kích thích tạo khóm trong

điều trị giảm bạch cầu v.v…

Sử dụng cytokine trong liệu pháp điều hoà miễn dịch, tự miễn dịch. hIL-

6, hIL-7 được xác định như một yếu tố biệt hóa tế bào B, đóng một vai trò quan

trọng trong sự phát triển của các tế bào B huyết tương sản xuất kháng thể. hIL-

6 kích hoạt tế bào B qua hoạt tính của chúng trên các nguyên bào huyết tương

và gần đây đã cho thấy gián tiếp kích hoạt tế bào B sản xuất kháng thể bằng

cách hoạt hóa các tế bào T CD4 có đặc tính hỗ trợ tế bào B thông qua sự sản

xuất IL-21 v.v…

Dùng cytokine trong điều trị nhiễm virus, bệnh ung thư: điều trị viêm

gan bằng interferon, hIL-12 [27], [38], điều trị ung thư bằng hIL-2 v.v…

Một số thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng cytokine trong điều trị

bệnh như: hIL- 11 và hIL-3 được sử dụng để điều trị bệnh thrombocytopenia

do chúng có khả năng kích thích sự tạo thành tiểu cầu [82]. hIL-2 được sử dụng

để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch bạch huyết,

đặc biệt là ung thư thận và da; hIL-7 được ứng dụng giúp hồi phục mạch bạch

huyết sau khi phẫu thuật, sử dụng trong các bệnh suy giảm hệ miễn dịch như

HIV/AIDS do có khả năng bảo vệ và thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu

lympho T CD4+ và T CD8+. hIL-12 được sử dụng để làm tá chất cho sản xuất

vaccine [6], [8].

Interferon là một nhóm trong số các nhóm chính của cytokine cũng có

nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Từ năm 1991, FDA đã đồng ý cho

9

sử dụng một số loại IFN để chữa một số bệnh do virus như HBV, HCV. Những

sản phẩm này gồm có interferon 2b (Intron A), interferon 2b (Roferon,

infergen) và peginterferon (PEG-IFN). Đặc biệt, IFN có thể được đưa vào cơ

thể bằng đường miệng với một liều lượng thấp hơn nhưng cho hiệu quả cao

hơn đường tiêm [11].

1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước

Trong bối cảnh hiện nay, Bộ Y tế rất khuyến khích việc nghiên cứu tự

sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh.

Cùng với những ưu điểm của các loại cytokine nói chung cũng như IL nói

riêng, ở Việt Nam đã và đang có một số công trình nghiên cứu, chuyển giao

công nghệ về việc sản xuất và ứng dụng các loại cytokine trong điều trị bệnh

cho con người.

Trong đó, nổi bật nhất là công trình nghiên cứu và sản xuất interleukin-

2 ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư năm 2010 do PGS. TS. Trương Nam

Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam thực hiện đã thu được protein hIL-2 tái tổ hợp có độ tinh sạch 95% và có

hoạt tính tốt, đang được triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp [1]. Điều này

mở ra triển vọng rất lớn đối với bệnh nhân ung thư, khi theo đánh giá của tổ

chức y tế thế giới WHO thì Việt Nam hiện đứng trong 50 nước top 2 của bản

đồ ung thư thế giới khi mỗi ngày có khoảng 315 người chết vì ung thư [100].

Ngoài ra, trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM đang tiến hành các

nghiên cứu về cytokine hIL-33, thuộc họ cytokine tiền viêm hIL-1 (IL-1β, IL-

1α, IL-1Ra, hIL-18, hIL-33) được phát hiện vào năm 2005. Cytokine hIL-33

giữ vai trò kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng của

cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm. Ức chế hoạt động của hIL-33 có thể là

liệu pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh tự miễn như thấp khớp, hen

suyễn, dị ứng quá mẫn v.v…, hIL-33 là một cytokine ít được nghiên cứu trên

thế giới nhưng Việt Nam đã thành công trong việc thử nghiệm ứng dụng điều

10

trị hen suyễn ở chuột. Hiện nhóm nghiên cứu của trung tâm Công nghệ sinh

học TP. HCM đang hướng đến mục tiêu tạo ra thuốc trị bệnh tự miễn như các

loại thuốc ngoại nhập đang có mặt trên thị trường, từng bước tiến đến tự sản

xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu trong nước [2].

1.3. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG

CÂY THUỐC LÁ

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp và thực vật chuyển gen đã

tạo nền tảng cho việc sản xuất protein từ thực vật hoặc tế bào thực vật. Những

kết quả đầu tiên đã được công bố từ thập niên 80 của thế kỷ 20 [5]. Việc sản

xuất thành công hormone tăng trưởng của người trong cây thuốc lá và hạt hướng

dương [10]; albumin trong thuốc lá và khoai tây [87] đã cho thấy hệ thống nuôi

cấy thực vật có thể được sử dụng để sản xuất các protein của động vật có vú,

trong đó có con người.

Erythropoietin là một trong những cytokine đầu tiên được sản xuất bằng

tế bào thực vật. cDNA mã hóa erythropoietin của người được biểu hiện qua

promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) trong tế bào thuốc lá BY2, tuy

nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt 0,0026% tổng số protein tan [51].

Tiếp sau erythropoietin thì yếu tố GM-CSF của người cũng được tập

trung nghiên cứu, biểu hiện ở thực vật. Ban đầu, chúng được biểu hiện trong

thuốc lá [21],[46] và dịch treo tế bào lúa [39], [40], [84]. Để tăng năng suất, các

loại muối khoáng hoặc 5% (w/v) gelatin đã được bổ sung vào môi trường nuôi

cấy, giúp sản lượng của hệ thống đạt 129 mg/l. Ngoài biểu hiện trên cây thuốc

lá và tế bào lúa thì yếu tố GM-CSF còn được biểu hiện trên một số cây trồng

khác như: trong lá mía chuyển gen là 0,02% [95], trong lá thuốc lá khoảng

0,22% của protein tan tổng số [28], trong hạt giống lúa chuyển gen GM-CSF

tái tổ hợp tích lũy lên tới 1,3% của protein tan tổng số [79], đặc biệt hàm lượng

GM-CSF biểu hiện cao nhất là ở khoai tây lên tới 2% protein tổng số với lớp

vỏ protein biến đổi [106]. Trong hầu hết các trường hợp, các hoạt tính sinh học

11

của GM-CSF tái tổ hợp đã được chứng minh ở mức độ phòng thí nghiệm, và

trên cơ thể sống trong mô hình chuột [61].

Bảng 1.1. Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật

Cytokine Cây

biểu hiện

Đặc điểm của

cassette biểu hiện

Hàm lượng

protein thu được

GM-CSF Mía Promoter Mubi-1 của ngô hoặc

Scubi-9 của mía

0,02% protein tan

tổng số [92].

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1, Gt3 (glutelin) và tín

hiệu peptide, nos terminator

0,005 - 0,03% protein

tan tổng số [77].

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1 và tín hiệu peptide,

nos terminator

1,3% protein tan tổng

số [78].

GM-CSF Lúa Promoter Gt3α, tín hiệu peptide

glutelin, nos terminator

0,5 - 14 µg/hạt [41],

[60].

Murine

GM-CSF Thuốc lá

Promoter RbcS1, tín hiệu peptide,

KDEL

19 µg/g lá tươi;

0,22% [28].

IL-2 Khoai tây Promoter patatin, nos terminator 115 U/mg protein

tổng số [69].

IL-4 Thuốc lá,

khoai tây Promoter 35S, KDEL

0,1% protein tổng số

ở thuốc lá; 0,08%

protein tổng số ở

khoai tây [49].

IL-10 Thuốc lá

Promoter 35S cùng trình tự tăng

cường, ELP, KDEL, nos

terminator

0,27% protein tan

tổng số [68].

IL-10 Thuốc lá (A). Promoter 35S CaMV, có hoặc

không có his tag, peptide lục lạp

(A). 7 ng/mg protein

tổng số (không có his

12

(B). Promoter 35S CaMV, his tag,

peptide ty thể

tag); 43 ng/mg (có his

tag).

(B). Không biểu hiện

[52].

IL-12 Thuốc lá Promoter 35S và terminator 40 ng/g [29].

IL-12 Cà chua Promoter 35s cùng trình tự

tăng cường, 35S terminator

7,3 µg/g ở lá; 4,3 ng/g

ở quả [30], [77].

IL-13 Thuốc lá Hai promoter 35S, KDEL, nos

terminator

0,15% protein tổng số

[91].

IL-18 Thuốc lá Promoter 35S, nos terminator

0,004 - 0,051%

protein tổng số, 351

ng/g [103].

IFN-α2b

IFN-α8 Khoai tây - 560 IU/g mô [65]

IFN-α2b Cà rốt

(A). Promoter 35S, nos terminator,

tín hiệu mục tiêu calreticulin

(B). Promoter MLL, nos

terminator, tín hiệu mục tiêu

calreticulin

(A). 26,8 x 103 U/g

FW của lá tươi

(B). 8,56 x 103 U/g

FW của rễ [48].

IFN-β

Biểu hiện

tạm thời

lá rau

diếp

Promoter 35S, nos terminator 3,1 x 104 IU/ml [34]

TNF-α Khoai tây Promoter 35S, trình tự SEKDEL 15 µg/g mô [66]

FGF8b Thuốc lá

Promoter 35S cùng hai trình tự

tăng cường, 35S terminator,

c-myc, his, KDEL

4,1% protein tổng số

[73].

13

Ngoài ra, một số loại cytokine khác cũng được nghiên cứu biểu hiện như:

IL-12 [29], [30], [77], [84], IL-13 [94], cardiotrophin 1 [42], IL-18 [103], yếu

tố hoại tử khối u TNF-α được biểu hiện trong khoai tây với hàm lượng tích lũy

đạt khoảng 15 µg/1g mô thực vật [66].

Những kết quả này mở ra hướng nghiên cứu sử dụng thực vật như các

bioreactor để sản xuất các protein có hoạt tính sinh học ổn định [32], ứng dụng

trong y học.

Ở Việt Nam, năm 2012, Phan Tường Lộc và cộng sự đã chuyển thành

công gen HIV-1 p24 và gen aadA vào lục lạp cây thuốc lá Virginia (V2), là

giống thuốc lá được nhập nội và thuần hóa ở Việt Nam cho năng suất cao.

Gen HIV-1 p24 mã hóa cho protein p24 kháng nguyên vỏ của HIV. Protein tái

tổ hợp p24 được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu như điều chế vaccine đa

thành phần và kit chẩn đoán HIV. Gen aadA quy định tính kháng hai loại

kháng sinh spectinomycin và streptomycin, được dùng làm marker chọn lọc

cây chuyển gen [3].

Hiện nay, ngoài phương thức biến nạp tạo cây chuyển gen, còn có thể sử

dụng phương pháp biểu hiện tạm thời để biểu hiện protein ở thực vật.

Hệ thống biểu hiện tạm thời cho thấy là một phương pháp thuận lợi để

phân tích khả năng biểu hiện của protein đích trong thực vật do phương pháp

này không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong hệ gen của thực vật, thời

gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh và đặc biệt là có thể biểu hiện được tốt

ngay cả trên những mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá [24]. Hiện nay có hai

phương pháp để biểu hiện tạm thời là sử dụng virus thực vật làm vector và

phương pháp Agro-infiltration. Tuy nhiên, phương pháp Agro-infiltration tỏ ra

chiếm ưu thế hơn do mức độ biểu hiện protein cao, quy trình thực hiện đơn giản

và có thể chuyển những đoạn gen có kích thước lớn hơn so với phương pháp

sử dụng virus thực vật làm vector chuyển gen.

14

Phương pháp Agro-infiltration đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

biểu hiện và sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với hàm

lượng cao tới 200 mg HA/kg lá tươi [101], 675 mg HA/kg lá tươi [56], 400 mg

NA/kg lá tươi [53] … Bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời này,

Vaquero và đồng tác giả đã biểu hiện thành công scFv; chuỗi nặng, chuỗi nhẹ

của kháng thể [93]. Phân tử kháng thể đầy đủ có thể biểu hiện bằng cách tiêm

đồng thời hai chủng vi khuẩn Agrobacterium mang riêng biệt chuỗi nặng và

chuỗi nhẹ vào lá cây. Phương pháp biểu hiện tạm thời này phù hợp để kiểm tra

sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật, đồng thời cũng để kiểm

tra sự hoạt động của cấu trúc vector vừa thiết kế trước khi tiến hành tạo cây

chuyển gen [23].

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy thực vật là hệ thống có nhiều ưu

điểm để biểu hiện protein trong đó có protein interleukin 7 tái tổ hợp.

15

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Cây thuốc lá N. benthamiana được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ

Việt Nam.

2.1.2. Các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp từ Viện

Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm:

Chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens C58C1/pGV2260 mang

yếu tố phiên mã FUS3 được ứng dụng để đồng biểu hiện tạm thời với vector

đích chứa trong vi khuẩn Agrobacterium cho sự biểu hiện của protein tái tổ hợp

dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S

Dòng tế bào 2E8 do Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp được sử

dụng để đánh giá bước đầu hoạt tính sinh học của interleukin 7.

2.1.3. Các gene và vector

Vector pBSK mang gene interleukin 7 tái tổ hợp đã được tối ưu mã để

biểu hiện ở thực vật.

Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP [12] mang promoter 35S chứa

gene kháng kháng sinh ampicilin, trình tự 100xELP và đuôi Cmyc-tag, KDEL;

vector hỗ trợ biểu hiện protein pMON6530/Hc-Pro.

Vector chuyển gene pCB301 chứa gene kháng kháng sinh kanamycin.

2.1.4. Hóa chất và thiết bị máy móc

Thang DNA 1kb (Fermentas), marker protein, Master Mix 2X (Promega),

Kit tinh sạch DNA AccuPrep® Gel Purification, kit tách chiết plasmid (Bioneer).

16

Các loại hoá chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, agarose, trypton, KCl, Tris-

HCl, EDTA, SDS. Các loại kháng sinh kanamycin, chloramphenicol,

carbenicillin, spectinomycin của các hãng Fermentas, Invitrogen, … Các loại

enzyme sử dụng của hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…

Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: máy nghiền mẫu (Retsch), máy nuôi

lắc, máy ly tâm lạnh (Hettich), máy PCR (Thermo Scientific), bộ điện di

DNA(Biorad), bộ điện di protein, máy chụp ảnh gel (Cleaver Scientific), thiết bị

hấp khử trùng (Hirayama), máy đo quang phổ (Shimadzu), máy khuấy từ gia

nhiệt (Velp), máy đo pH (Horiba), cân kỹ thuật, cân phân tích (Sartorius), buồng

an toàn sinh học cấp II (Esco), máy sấy Speed-Vac, ELISA reader …

2.1.5. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong đề tài

Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’ - 3’)

Sản

phẩm

(bp)

IL7_BamHI_R CCGGATCCTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGTGGTGGTGG 564

IL7_BamHI_F GAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGATCC

35S-SQF CACTGACGTAAGGGATGACGC Gene

+ 250 35Sterm CTGGGAACTACTCACACA

2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm trong đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về

Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

17

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

RB NPT II T35S 100xELP Cmyc Interleukin 7 P35S LB KDEL His-tag Interleukin 7

Thay đổi mã di truyền, tổng hợp nhân tạo

Thiết kế vector chuyển gene mang gene Interleukin 7

Cây thuốc lá

Chuyển gene, chọn dòng và phân tích biểu hiện protein IL-7

18

2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu

hiện ở thực vật

Cơ sở lý thuyết

Mã di truyền là phần mật mã quy định thông tin về trình tự các acid amin

được mã hóa dưới dạng các trình tự nucleotide trên gene, trong đó ba nucleotide

liên tiếp sẽ quy định một loại acid amin nhất định. Acid amin có thể được quy

định bởi nhiều bộ ba mã di truyền khác nhau [10], [43]. Do đó, để phù hợp và

tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của gene interleukin 7 trong hệ thống

thực vật, chúng tôi tiến hành thay đổi những mã di truyền hiếm của gene ngoại

lai interleukin 7 thành mã di truyền phổ biến trong thực vật mà không làm thay

đổi trình tự acid amin của protein.

Phương pháp

Quá trình thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 gồm các bước:

Bước 1: Khai thác thông tin trình tự nucleotide gene interleukin 7 trên

Ngân hàng Gene quốc tế, mã số 3574 [28] và trình tự mRNA, mã số J04156.1.

Bước 2: Thay thế các codon hiếm trong gene interleukin 7 bằng các

codon phổ biến ở thực vật bằng phần mềm Codon Optimization 2.0 dựa trên

thông tin tần suất các codon phổ biến ở thực vật trong cơ sở dữ liệu mã di truyền

Codon Usage Database [18]. Ngoài ra, trình tự ATTTA được loại bỏ và sử dụng

phần mềm Invitrogene để tối ưu nhằm giảm thiểu sự hình thành mRNA thứ

cấp.

Bước 3: Bổ sung các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI, NcoI,

HindIII, BamHI vào trình tự gene nhằm phục vụ cho quá trình cắt và ghép nối

gene khi thiết kế vector chuyển gene.

Bước 4: Thêm đoạn trình tự mã hoá cho epitope c-Myc tag và His-tag

vào đầu 3’ của gene interleukin 7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein

interleukin 7 tái tổ hợp trong thực vật thông qua các phương pháp lai miễn dịch

Western blot và phân tích ELISA.

19

Bước 5: Sử dụng phần mềm BioEdit để kiểm tra và so sánh trình tự

nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của gene interleukin 7 trước và sau

khi đổi mã. Gene interleukin 7 tái tổ hợp được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng

Epoch Life Science (Mỹ) và được nhân dòng trong vector pBSK-IL7.

2.2.2. Thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm BioEdit và trình tự gene interleukin 7 tái tổ hợp cùng

trình tự gene đã công bố trên Ngân hàng Gene quốc tế để thiết kế các cặp mồi

phục vụ nghiên cứu trong luận án, thể hiện tại bảng 2.1

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp

Quá trình thiết kế vector chuyển gen gồm các bước chính sau: Bước 1.

Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng lai; Bước 2. Ghép nối các đoạn gene tạo

plasmid tái tổ hợp; Bước 3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli

DH-5a để nhân dòng; Bước 4. Chọn dòng khuẩn lạc bằng phương pháp colony-

PCR và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn.

a. Nhân dòng gene IL-7

Đoạn gene IL-7 được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng khuôn là

plasmid pBSK-IL7 với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R.

Phản ứng PCR được tiến hành trong điều kiện: 50 µl hỗn hợp phản ứng gồm

0,3 µM mồi, 0,2 µM dNTPs, 5 µl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 2,5U Pwo

SuperYield DNA polymerase, 20 ng khuôn. Chu trình nhiệt: 940C/5 phút, 30

chu kỳ lặp lại các bước 940C/30 giây, 500C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây. Sau

đó giữ 720C/10 phút và sản phẩm được giữ bảo quản ở 150C. Kết quả PCR được

kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

b. Ghép nối gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP

* Phản ứng cắt enzyme giới hạn

Cơ sở lý thuyết

Enzyme giới hạn nhận biết các vị trí cắt đặc hiệu trên phân tử DNA. Chúng

phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA nhưng không làm ảnh hưởng

20

tới bases. Các liên kết hóa học ở các gene bị enzyme giới hạn cắt có thể nối lại

nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau cùng sự xúc tác của enzyme ligases.

Phương pháp

Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP và gene IL-7 được cắt đồng thời

bằng enzyme giới hạn BamHI theo bảng 2.2

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 H2O deion 9,5

2 Buffer 10x 10

3 DNA (~1µg) 80

4 Enzyme BamHI 0,5

Phản ứng được ủ ở 370C trong vòng 2 - 4 giờ.

* Phản ứng lai ghép đoạn gene IL-7 với pRTRA 35S-100xELP

Sản phẩm tinh sạch - đoạn gene IL-7 được ghép nối vào vector pRTRA 35S-

100xELP tạo plasmid tái tổ hợp mang gene IL-7 (ký hiệu pRTRA 35S/IL7-cmyc-

histag-100xELP)

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng lai

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nước 0

2 Buffer 10x 1

3 Sản phẩm cắt (vector) 5

4 Sản phẩm cắt (IL-7) 3

5 Enzyme T4 ligation 1

Tổng thể tích 10

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 220C trong 1 giờ 30 phút.

Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế

bào khả biến E.coli DH-5α.

21

c. Biến nạp sản phẩm ghép nối gene vào tế bào khả biến E.coli DH-5α

bằng phương pháp sốc nhiệt

* Chuẩn bị tế bào khả biến

Cơ sở lý thuyết

Tế bào nuôi cấy trên môi trường mới đến đầu pha log và được làm sạch

nhờ việc rửa nhiều lần bằng CaCl2 0,1M. Dưới tác dụng của muối CaCl2, thành

tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể

chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột. Tế bào chứa

DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các gene kháng kháng sinh nên được

chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh đó.

Phương pháp tạo tế bào khả biến

Tế bào khả biến E. coli DH-5α được tạo theo phương pháp của Sambrook

và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl2 0,1M sau khi ly

tâm. Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ hai 30 phút, lần

thứ ba 45 phút.

* Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α

Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được biến nạp vào tế bào

khả biến E.Coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp được

thực hiện như sau:

• Bổ sung 5 µl vector vào tế bào khả biến và đảo nhẹ

• Ủ trong đá 15 - 30 phút.

• Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây.

• Để trong đá 15 - 30 phút.

• Bổ sung 200 µl LB lỏng.

• Nuôi lắc 200v/phút ở 370C trong 1giờ.

• Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc

carbenicillin 50 mg/L.

• Nuôi qua đêm ở 370C

22

* Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR

Kỹ thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA

được thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị

phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho

phản ứng PCR nhân gene bằng cặp mồi đặc hiệu.

* Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn

Cơ sở lý thuyết

Dưới tác dụng của NaOH và SDS, thành tế bào vi khuẩn sẽ bị phá vỡ

giải phóng DNA genome, các phân tử protein và DNA genome sẽ bị biến tính.

Khi thay đổi độ pH của dịch tách chiết tế bào bằng kali acetae, các phân tử

protein và DNA genome sẽ bị kết tủa. Phần protein còn sót lại, cùng với các

mảnh vỡ của tế bào sẽ được tủa bằng hồn hợp chloroform : isoamylalcohol

(24:1 v/v), sau ly tâm sẽ được tách khỏi phần dung dịch DNA plasmid. DNA

plasmid nằm ở pha trên được thu lại bằng cách tủa trong isopropanol và rửa lại

bằng cồn 70%. Sau đó, sử dụng nước deion khử trùng có bổ sung RNase

10µg/µl để hòa tan DNA plasmid và loại bỏ RNA có trong dung dịch.

Phương pháp tách plasmid

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang vector pRTRA 35S/IL7-

cmyc-histag-100xELP đã được kiểm tra colony PCR trong môi trường LB

lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/L ở 370C qua đêm. Các tế bào E.coli mang

plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng được cho vào ống eppendorf 2ml ly

tâm thu cặn. Bổ sung sol I (Glucose 50 mM, TrisHcl 25 mM; EDTA 10 mM

pH 8,0), voltex để hòa tan và ổn định tế bào. Tiếp tục bổ sung sol II (NaOH

0,2N; SDS 1%), đảo nhẹ để phá vỡ thành và màng tế bào bằng kiềm và chất

tạo sức căng bề mặt. Tiếp tục bổ sung sol III (CH3COOK 3M, CH3COOH 5M),

đảo nhẹ để biến tính và tủa DNA hệ gen và protein, phần tủa bị loại bỏ khỏi

dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm, thu 800 µl dịch nổi. Bổ sung 800 µl

chloroform : isoamylalcohol (24 : 1 v/v), đảo nhẹ, ly tâm 13.000 rpm trong 10

23

phút, thu 500 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống epppendorf 1,5 ml. Bổ

sung 1 ml isopropanol, ủ 30 phút trong -200C, ly tâm thu cặn. Bổ sung 1ml

ethanol 70%, ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, thu cặn. Làm khô cặn bằng máy

Speed-vac trong 2 phút. Hòa tan DNA bằng 30 µl nước deion khử trùng có bổ

sung RNase 10 µg/µl. Bảo quản ở -200C.

*. Thiết kế cấu trúc tối ưu biểu hiện chuyển gen pCB301_IL7/ELP

Thực hiện phản ứng cắt vector pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP

và vector pCB301 bằng enzyme HindIII và loại bỏ gốc phosphate bằng enzyme

SAP. Sản phẩm ghép nối DNA vào vector pCB301 được biến nạp vào vi khuẩn

E.coli DH-5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh

kanamycin 50 mg/l. Plasmid tái tổ hợp pCB301_IL7/ELP sau khi được chọn

dòng bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme NcoI sẽ được biến nạp vào vi

khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng xung điện để phục vụ cho nghiên

cứu biểu hiện tạm thời.

2.2.4. Biểu hiện tạm thời interleukin 7 ở cây thuốc lá

Quá trình biểu hiện tạm thời protein IL-7 gồm các bước chính sau:

Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: Chủng vi khuẩn A.

tumefaciens mang vector pCB301_IL7/ELP mã hóa cho protein IL-7 và chủng

A.tumefaciens mang vector chứa gene mã hóa cho protein HcPro ức chế câm

gene hoạt động trong cây được nuôi cấy riêng trong 200ml môi trường YEB có

bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamycin 50 mg/ml, nuôi lắc qua

đêm ở 280C, 140 rpm. Sau 24 giờ, chuyển 50 ml dịch khuẩn sang bình lớn, bổ

sung 500 ml môi trường LB với kháng sinh thích hợp vào hai bình nuôi cấy,

nuôi thêm 24 giờ, ở 280C, 140 rpm. Ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 40C để thu cặn

khuẩn, hòa trong buffer (10 mM 2 - N - morpholimo MES acid

ethanesulphonic, 10 mM MgSO4, pH 5,6). Trộn lẫn 2 dịch khuẩn, pha loãng

trong đệm để nồng độ khuẩn cuối cùng OD600 0,5 chuẩn bị cho quá trình biến

nạp vào cây thuốc lá N.benthamiana.

24

Bước 2. Chuẩn bị cây thuốc lá N. benthamiana

Cây con sau giai đoạn nuôi cấy invitro khoảng 4 tuần tuổi được tiến hành

ra cây bầu nhỏ. Sau 1 - 1,5 tuần chuyển cây từ bầu nhỏ sang bầu lớn, mỗi ngày

tưới 1 - 2 lần nước. Khi cây 4 - 6 tuần và có từ 8 đến 12 lá sẽ được sử dụng để

biến nạp infiltration.

Bước 3. Biến nạp

Tiến hành bọc nilon quanh bầu đất và úp ngược cây chìm trong bình chứa

dịch khuẩn; đặt vào bình hút chân không. Tiến hành hút chân không ở điều kiện

25 inches Hg trong 2 phút, sau đó xả từ từ. Các cây sau biến nạp được đặt trong

nhà kính ở 21oC - 26oC. Sau 6 ngày, tiến hành thu lá và bảo quản ở -80oC để

chuẩn bị kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp

western blot.

2.2.5. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2.2.5.1. Kỹ thuật PCR

DNA tổng số từ các dòng chuyển gene được tách chiết và sử dụng làm

khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R. Sản phẩm

PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.

2.2.5.2. Lai Western blot

Cơ sở lý thuyết

Wertern blot hay còn gọi là protein immuno blot là kỹ thuật lai giữa

protein với protein (kháng nguyên - kháng thể). Protein kháng nguyên được

phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang. Phương pháp này sử

dụng điện di trên gel acrylamide để phân tách các protein theo độ dài của mạch

polypeptide. Sau đó, chuyển lên màng lai (thường dùng màng nitrocellulose

hoặc màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu để phát

hiện protein mục tiêu.

25

Phương pháp

Tách chiết protein tan tổng số

Thu 1 gam sinh khối nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày

sứ, bổ sung đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X. Thu dịch nghiền vào

ống eppendorf 2ml, ly tâm 10.000 rpm ở 4oC, thu dịch protein ở phía trên.

Protein tổng số được định lượng bằng phương pháp so màu của Bradford

(1976) [20] dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự đổi màu xảy

ra khi CBB (Coomasie Brilliant Blue) liên kết với protein trong dung dịch acid.

Điện di protein tổng số và chuyển màng

Protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện

không khử, sau đó chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng Fast

blotter G2 (Thermo Scientific Pierce) ở 25V, 1,3A trong 20 phút. Tháo màng,

tráng bằng nước deion trong 5 phút.

Bảng 2.4. Thành phần gel SDS-PAGE

Thành phần Gel tách Gel cô

Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml

Nước deion 0,55 ml 1,1 ml 0,45 ml 1,3 ml

Tris HCl 1,125 ml 1,25ml 0,2 ml 0,5 ml

Glycerol 50% 0,9 ml 1,8 ml - -

Acrylamid 30% 1,89 ml 3,78 ml 0,14 ml 0,35 ml

SDS 10% 45 µl 90 µl 4 µl 10 µl

APS 10% 30 µl 60 µl 8 µl 20 µl

TEMED 3 µl 6 µl 1 µl 2 µl

* Tris HCl 1,5M; pH 8,8 cho gel tách.

Tris HCl 0,5M, pH 6,8 cho gel cô.

Blocking protein

Protein trên màng lai được blocking bằng sữa tách béo 5% (pha trong

PBS 0,05% Tween); ủ với kháng thể 1 anti c-myc nồng độ 180 µg/ml pha loãng

26

tỷ lệ 1 : 100 qua đêm ở 40C, rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5

phút; ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP (Horseradish

Peroxidase) pha loãng tỷ lệ 1 : 10.000 trong 1 giờ. Rửa màng bằng dung dịch

PBST 3 lần, mỗi lần 10 phút

Hiện màu protein

Sự có mặt của protein interleukin 7 trong mẫu được phát hiện nhờ phản

ứng hiện màu bằng cơ chất DAB (Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi

hiện băng màu nâu.

2.2.5.3. Sử dụng kỹ thuật ELISA để phân tích sự tích lũy IL-7 tái tổ hợp

Kỹ thuật ELISA gián tiếp định lượng protein interleukin 7 thông qua

định lượng protein c-myc được tiến hành theo phương pháp của Sun và cộng

sự với một số cải tiến (2006) [88], gồm các bước chính: Bước 1: Pha loãng dịch

chiết protein tổng số của các mẫu chứa interleukin 7 đến nồng độ 200 µg/ml,

sử dụng 100 µl mẫu tra vào các ô trên đĩa microplate, mỗi mẫu lặp lại 3 lần;

Bước 2: Ủ qua đêm ở 40C; rửa đĩa 2 lần bằng PBS-T (Tween 0,05%); Bước 3:

Blocking bằng sữa tách béo 5% pha trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;

rửa đĩa 2 lần; Bước 4: Ủ với kháng thể 1 anti c-myc (180µg/ml) pha loãng 1:100

trong 2 giờ; lặp lại 3 lần; Ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP

(Thermo scientific Pierce) pha loãng 1:10.000 trong 1 giờ và cơ chất hiện màu

là TMB; Bước 5: Dùng HCl 1N để dừng phản ứng màu; Đo màu ở bước sóng

630nm.

2.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7

Để loại bỏ ảnh hưởng của các protein không đặc hiệu, đồng thời làm tăng

độ tinh sạch qua đó làm tăng hoạt tính và khả năng sử dụng của protein, chúng

tôi tiến hành tinh sạch protein IL-7. Dựa trên cấu trúc gene interleukin 7 tái tổ

hợp đã thiết kế, chúng tôi sử dụng phương pháp tinh sạch sử dụng cột sắc ký ái

lực Ni-NTA (IMAC) và phương pháp tinh sạch đảo chiều thuận nghịch qua

màng mITC.

27

2.2.6.1. Phương pháp tinh sạch IMAC

Cơ sở lý thuyết

Đây là phương pháp sử dụng ái lực giữa cấu tử gắn (ligand) và protein

cần tách. Cột sắc ký ái lực có chứa các hạt gel Sepharose có gắn ion Ni2+ trên

bền mặt. Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách do có histidine nên sẽ gắn với

các ion Ni2+ trong khi các loại protein khác sẽ bị rửa trôi. Sau khi rửa sạch tạp

chất, protein cần tách được thu nhận lại bằng cách sử dụng Imidazole, chất này

sẽ cạnh tranh vị trí gắn với ion Ni2+. Kết quả giúp thu nhận được protein đích

với độ tinh sạch cao.

Phương pháp

* Chuẩn bị cột

Lắc đều lọ đựng Pro BondTM resin. Hút 2ml dung dịch cho vào cột tinh

sạch, để lắng dần hoặc ly tâm 800 rpm trong 1 phút, hút bỏ dịch.

Bổ sung 6 ml nước deion khử trùng, đảo đều. Để lắng hoặc ly tâm, hút

bỏ dịch. Bổ sung 6 ml Native binding buffer, đảo đều, ly tâm bỏ dịch, thực hiện

2 lần

* Tinh sạch

Thêm dung dịch đã siêu âm và lọc vào cột, đảo đều trong 30 - 60 phút.

Ly tâm, thu cặn; phần dịch để riêng. Tiếp tục bổ sung 8 ml Native wash

buffer vào cột. Ly tâm thu cặn; phần dịch để riêng. Lặp lại 4 lần.

Bổ sung 8 - 12 ml Native Elution buffer, thu từng phân đoạn 1 ml để điện

di kiểm tra.

2.2.6.2. Phương pháp tinh sạch mITC

Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bổ sung 200 ml Tris-

HCl 50 mM (pH 8) lạnh. Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC. Bổ sung NaCl

đến nồng độ 2M. Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC. Dung dịch đưa qua

màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 40C để thu dịch chiết trước xử lý. Dịch

chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm

28

sử dụng máy bơm. Rửa màng 2 lần bằng NaCl 2M để loại protein lẫn. Nước

Milipore-Q lạnh được chuyển qua màng lọc để thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp.

2.2.7. Đánh giá hoạt tính protein interleukin 7 tái tổ hợp

Chúng tôi sử dụng dòng tế bào 2E8 để bước đầu đánh giá hoạt tính của

protein Interleukin 7 tái tổ hợp. 2E8 là một dòng tế bào hoàn toàn phụ thuộc

vào interleukin 7 để tồn tại, sinh trưởng và sinh sản [69].

Cơ sở lý thuyết

Tế bào 2E8 là tế bào phụ thuộc hoàn toàn vào interleukin 7. Khi môi

trường nuôi cấy không được bổ sung IL-7 thì tế bào sẽ chết sau 48 giờ. Vì thế,

dòng tế bào 2E8 được sử dụng là dòng chuẩn để xác định hoạt tính sinh học

của protein IL-7 tự nhiên cũng như protein tái tổ hợp. Khi bổ sung IL-7 vào

môi trường nuôi cấy tế bào 2E8, tùy theo hoạt tính sinh học của protein IL-7

mà tế bào 2E8 sẽ duy trì sự sống và khả năng hoạt hóa quá trình sinh trưởng,

phát triển và sinh sản của tế bào, hoạt tính của protein IL-7 càng mạnh thì khả

năng sống sót và hoạt hóa của tế bào 2E8 càng cao.

Phương pháp

a. Nuôi cấy, bảo quản dòng tế bào 2E8

Môi trường nuôi cấy tế bào: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s

medium) có bổ sung 4 mM L-glutamin, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 0.05 mM

2-mercaptoethanol, 1 ng/ml interleukin 7 và 20% fetal bovine serum.

Nuôi cấy, duy trì: Tế bào nuôi ở dạng hỗn dịch với chu kỳ cấy chuyển là

từ 3 - 5 ngày và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 370C và 5% CO2.

b. Thử nghiệm hoạt tính protein IL-7 tái tổ hợp

Lựa chọn dòng IL-7 tái tổ hợp tốt nhất để thử nghiệm hoạt tính sinh học.

Sử dụng màng lọc có kích cỡ 0.22 µm để lọc khuẩn, sau đó pha loãng bằng

PBS đã khử trùng để đạt nồng độ gốc là 0.1 mg/ml.

Hai ngày sau khi cấy chuyển, tế bào 2E8 được rửa sạch 3 lần bằng môi

trường IMDM cơ bản (không có huyết thanh và không có IL-7). Sau đó, tiếp

29

tục hòa trong môi trường IMDM với nồng độ 1 x 105 tế bào/ml và chuyển vào

96 giếng, thực hiện phản ứng ELISA (190 µl/giếng). Bổ sung mẫu protein IL-

7 tái tổ hợp vào các giếng với các nồng độ khác nhau. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.

Các giếng đối chứng âm chỉ có tế bào 2E8 và môi trường nuôi cấy IMDM cơ

bản có bổ sung huyết thanh, không bổ sung IL-7.

Các giếng được ủ trong tủ ấm CO2 với điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48

giờ bổ sung thêm 30 µl dung dịch thuốc nhuộm trong bộ kit Non-radioactive

proliferation để định tính và định lượng protein IL-7. Tiếp tục ủ trong tối 4 giờ

và đọc kết quả bằng máy ELISA reader bước sóng 525 nm.

2.2.8. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm

Kết quả nghiên cứu của luận án được phân tích thống kê bằng phần mềm

Microsoft Excel 2016, Table Curve theo các tham số thống kê: giá trị trung

bình, độ lệch chuẩn (σ), sự sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm định

bằng giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD của Fisher với α=0,05, chỉ số ED50 v.v...

30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Thay đổi mã di truyền gene Interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật

Chúng tôi sử dụng trình tự gene interleukin 7 ở người được công bố trên

Ngân hàng Gene có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở

thực vật (Codon Usage Database) [36], cùng với phần mềm Codon

Optimization 2.0 để loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen

IL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần

và trật tự các acid amin. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự

ATTTA trên gen IL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA,

kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogene để giảm thiểu sự hình thành cấu

trúc mRNA thứ cấp.

Kết quả thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, chúng tôi đã thành công trong

việc thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 để phù hợp và nâng cao hiệu

quả biểu hiện trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với

gene gốc, với độ tương đồng nucleotide là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là

100%. Ngoài ra, để chuẩn bị cho việc cắt và ghép nối gene trong quá trình thiết

kế vector chuyển gene, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI,

HindIII đã được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gene interleukin 7. Đồng thời, chúng

tôi cũng thêm các trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his-

tag cũng được gắn vào đầu 3’ của gene.

Trình tự nucleotide gene interleukin 7 sau khi được tối ưu có kích thước

536bp, được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và

được nhân dòng trong vector pBSK/IL7.

31

Hình 3.1. Trình tự gene interleukin 7 trước và sau khi thay đổi mã di truyền

32

3.2. Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá

3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Cấu trúc vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

được thiết kế kế thừa từ vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP

bằng cách loại bỏ và thay thế gene TBAG bằng gene IL-7 được mô phỏng như

hình 3.2

Hình 3.2. Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP

Chúng tôi tiến hành nhân gene IL-7 từ vector pBSK/IL7 bằng phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Sản phẩm PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.A

cho thấy, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng

với kích thước tính toán lý thuyết.

Vector pRTRA 35S/TBAG-histag-cmyc-100xELP được xử lý với

enzyme cắt giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả

thể hiện trên hình 3.3.B cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích

thước khoảng 5051 bp và 1152 bp tương ứng với kích thước của vector pRTRA

35S-histag-cmyc-100xELP mở vòng và gene TBAG theo tính toán lý thuyết.

Chúng tôi tiến hành thôi gel và tinh sạch đoạn DNA có kích thước 5051 bp để

sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

Tiến hành lai ghép gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-histag-cmyc-

100xELP tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP với sự

xúc tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút. Plasmid tái tổ hợp

sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng bằng phương pháp

sốc nhiệt.

33

Để chọn lọc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc có mang

vector chứa gene mã hóa protein IL-7, chúng tôi thực hiện phản ứng colony

PCR với cặp mồi đặc hiệu để check chiều 35S-SQF và IL7_BamHI_R. Kết quả

thể hiện trên hình 3.3.C cho thấy, trong 10 dòng khuẩn lạc thí nghiệm, có dòng

2, 4, 5, 7, 8, 9 dương tính với băng có kích thước khoảng 0,8kb gồm kích thước

của gene mã hóa protein IL-7 (564bp) cộng kích thước của một đoạn promoter

(250bp). Để loại bỏ khả năng dương tính giả của phản ứng colony PCR, chúng

tôi tiến hành tách plasmid các khuẩn lạc dương tính và thực hiện phản ứng cắt

bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.

A B C D

Hình 3.3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép

tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

(A). Kết quả PCR nhân gene IL-7 bằng IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R; (B). Kết

quả cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme BamHI; (C):

Kết quả colony PCR bằng cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu khuẩn,

(-). Đối chứng âm (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+). Đối chứng

dương (pBSK/IL7); (D). Kết quả cắt kiểm tra vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-

100xELP bằng enzyme giới hạn BamHI

Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp khi cắt bằng enzyme

giới hạn BamHI sẽ cho 2 băng khi kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Tại đường

34

chạy 1 trên hình 3.3.D xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5 kb và 0,56 kb

tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng (5051bp) và gene IL-7

(564bp). Điều này khẳng định, vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli

DH5α để nhân dòng và sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301

35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP

Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 được xử lý

đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII. Với plasmid pBC301 để tránh

hiện tượng tự đóng vòng, sản phẩm cắt với enzyme HindIII sau khi tinh sạch

được xử lý tiếp bằng enzyme SAP. Các sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên

gel agarose 0,8%. Trên hình 3.4.A cho thấy, ở đường chạy 1 (sản phẩm cắt

pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP) xuất hiện 2 băng có kích thước

khoảng 2.9 kb và 2.6 kb; ở đường chạy 2 (sản phẩm cắt pCB301 đã xử lý qua

SAP) có 1 băng có kích thước khoảng 5.6 kb. Điều này chứng tỏ đã cắt thành

công plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 bằng

HindIII. Tiến hành thôi gel, tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước 2.9 kb

và 5.6 kb chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.

Tiến hành phản ứng lai ghép casette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

vector mở vòng pCB301 tạo vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái

tổ hợp và được biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào vi khuẩn E.coli DH5α

để chọn lọc, nhân dòng.

Chọn 5 khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc, tiến hành phản ứng

colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, kết quả

thể hiện trên hình 3.4.B cho thấy, ở các đường chạy xuất hiện 1 băng có kích

thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước gene IL-7 theo tính toán lý

thuyết. Để tránh khả năng dương tính giả của PCR, chúng tôi tiến hành tách

plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII. Kết quả thể hiện trên

35

hình 3.4.C, trên đường chạy 1 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 2.9 kb

và 5.6 kb theo đúng kích thước tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng

tôi đã thiết kế thành công vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái

tổ hợp.

A B C

Hình 3.4. Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép

tạo vector chuyển gene pCB301/IL7/100xELP

(A). Kết quả xử lý vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và vector pCB301

bằng enzyme giới hạn HindIII; (B). Kết quả kiểm tra colony PCR pCB301/IL7-

cmyc-histag-100xELP bằng cặp mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, (-). Đối

chứng âm (pCB301), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả cắt kiểm tra

vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme giới hạn HindIII

Do chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn khi tạo đầu dính giữa vector

pCB301 và cassette 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP nên chúng tôi sử dụng

enzyme giới hạn NcoI để kiểm tra chiều cassette chuyển vào so với chiều của

vector pCB301. Vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp có

hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, một vị trí nằm trên vector và một

36

vị trí nằm trên cassette, do đó khi xử lý bằng NcoI sẽ cho ra 2 băng có kích thước

khác nhau tùy theo cassette gắn xuôi chiều hay ngược chiều với vector pCB301.

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra

vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme NcoI

M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm cắt ngược chiều; 2. Sản cắt xuôi chiều

Kết quả thể hiện trên hình 3.5 cho thấy, ở đường chạy 1 xuất hiện 2 băng

có kích thước khoảng 3.6 kb và 4.9 kb tương ứng với kích thước tính toán lý

thuyết khi cassette gắn ngược chiều với chiều của vector pCB301, còn ở đường

chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 6.9 kb và 1.6 kb tương ứng với

trường hợp cassette gắn xuôi chiều với vector pCB301. Sau đó, lựa chọn những

vector tái tổ hợp có chứa cassette ngược chiều sau khi cắt kiểm tra để biến nạp

vào tế bào A.tumefaciens C58C1 bằng xung điện để chuẩn bị cho thí nghiệm

tiếp theo.

3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng

phương pháp Agro-infiltration

3.3.1. Tạo dòng tế bào A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301

35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Từ kết quả ở mục 3.2.5, vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

tái tổ hợp đã được thiết kế thành công, sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn

37

Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng phương pháp xung điện

(mục 2.2.3.2.f). Sản phẩm của quá trình biến nạp được cấy trải trên môi trường

LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l, carbemycin 50 mg/l và

kanamycin 50 mg/l trong 2 ngày.

Chúng tôi lựa chọn 5 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tròn đều phát triển trên môi

trường chọn lọc để kiểm tra bằng phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu

IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R và phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn NcoI.

Kết quả thể hiện trên hình 3.6 và 3.7.

Hình 3.6. Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R

M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 - 5. Các dòng khuẩn lạc;

(-). Đối chứng âm; (+). Đối chứng dương

Hình 3.7. Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI

Trên hình 3.6 cho thấy, tại các đường chạy 1 - 5 xuất hiện một băng có

kích thước khoảng 564 bp, tương ứng với kích thước gene IL-7 nhân bằng cặp

38

mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, đồng thời giếng đối chứng âm không có

băng nào, đối chứng dương là plasmid pBSK/IL7 cũng xuất hiện một băng kích

thước khoảng 564 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng colony PCR đã thành công

và mẫu không bị nhiễm.

Để khẳng định chắc chắn cho kết luận, chúng tôi tiến hành tách plasmid

các dòng khuẩn dương tính với phản ứng colony PCR và cắt bằng enzyme giới

hạn NcoI. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy, tại đường chạy số 1 xuất hiện hai

băng có kích thước khoảng 3,6 kb và 4,9 kb đúng theo tính toán lý thuyết của

vector pCB301 và cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.

Từ những kết quả trên cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector

pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vi khuẩn A.tumefaciens

C58C1/pGV2260.

3.3.2. Biểu hiện tạm thời protein IL-7 bằng phương pháp Agro-infiltration

Quá trình biến nạp vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

cây thuốc lá được thực hiện theo quy trình đã trình bày tại mục 2.2.4.

Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá, bảo quản ở -800C để chuẩn bị cho

các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-

100xELP và biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp với sự hỗ trợ của

protein Hc-Pro ức chế cơ chế câm gene hoạt động trong cây bằng phương pháp

western blot.

Hình 3.8. Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào cây thuốc lá

A. Sơ đồ lắp đặt cây và thiết bị chuẩn bị biến nạp; B. Cây thuốc lá trước và sau khi biến nạp

39

3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp

Để kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành

tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của Bradford (1976),

sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot trên các vị trí biểu hiện tạm

thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy khả năng

biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp khác nhau ở các lá có độ tuổi khác nhau, trong

đó biểu hiện mạnh nhất ở lá non; điều này có thể giải thích do ở lá non có tốc độ

sinh trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh hơn so với lá bánh tẻ và lá già.

Kết quả thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3 xuất

hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein

IL-7 tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết, trong khi ở đường chạy đối chứng âm,

cây thuốc lá không chuyển gene không xuất hiện băng này

Hình 3.9. Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2. Lá bánh tẻ, 3. Lá

già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gene)

3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein Il-7 tái tổ hợp

Sau khi biểu hiện thành công protein IL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá, chúng

tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại

(niken) để tinh sạch và định lượng protein IL-7 tái tổ hợp. Đây là phương pháp

hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với his-tag. Phương pháp này

40

dựa trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với các kim loại hoá trị II (niken) ở

nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của protein liên kết his-tag với kim loại

phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ

được hoà tan thu lại bằng cách giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm

ion hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole.

Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ

hợp bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch Western blot. Kết

quả thể hiện trên hình 3.10 cho thấy, chúng tôi chỉ thu được một băng protein

có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán lý thuyết.

Hình 3.10. Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC

(A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch chiết

thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein IL-7 sau tinh sạch

(B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch chiết

thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein IL-7 sau tinh sạch

(C). Định lượng protein IL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm ImageJ: 1C,

2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C. Dịch

chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C. protein IL-7 sau tinh sạch (30 µg

protein tổng số/giếng.

Từ 1kg mẫu lá tươi, sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC và thu

nhận lại protein IL-7 tái tổ hợp bằng concentrator iCONTM, nồng độ protein

41

tổng số được định lượng theo phương pháp của Badford và protein IL-7 được

định lượng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được 252 mg

protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương

đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg lá tươi. So sánh với một

số nghiên cứu biểu hiện protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein IL-

7 trong cây thuốc lá N. Benthamiana của chúng tôi là tương đối cao.

Kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và

tinh sạch protein IL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn,

dễ thực hiện.

Để có thể thu được protein IL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn,

chúng tôi tiếp tục định lượng và tinh sạch bằng phương pháp mITC dựa trên

đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích IL-7.

Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp bằng phương

pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein IL-7 tái tổ hợp theo

phương pháp mITC (mục 2.2.6.2).

Chúng tôi tiến hành thu lại dịch chiết protein sau mỗi bước tinh sạch

gồm dịch chiết thô trước tinh sạch, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch chiết

thô qua màng và dịch tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp tách khỏi màng khi rửa

màng bằng nước milipore Q lạnh. Dịch thu được sau từng bước được đo nồng

độ protein theo phương pháp Bradford (1976) và phân tích bằng phương pháp

lai miễn dịch western blot để kiểm tra protein tinh sạch và đánh giá hiệu suất

thu hồi protein. Kết quả thể hiện trên bảng 3.1 và hình 3.11.

Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng có

kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein có gắn

đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng lọc sau khi

đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng protein nào,

điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ lại trên màng lai

42

không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy số 1 là dịch chiết sau

khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng

protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7

tái tổ hợp theo tính toán.

Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC

Dịch chiết protein Protein

tổng số (mg)

Protein

tái tổ hợp (mg)

Hiệu suất

thu hồi (%)

Độ tinh sạch

(%)

Dịch thô

trước tinh sạch 1634,7 38,3 100 X

Dịch IL-7

đã tinh sạch 45,8 36,7 95,82 86,3

Hình 3.11. Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC

M. Thang protein chuẩn; 1. Protein IL-7 tinh sạch sau khi rửa màng bằng nước

lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 3. Dịch chiết

protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch

43

Hình 3.12. Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch

1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng);

2. Protein IL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh;

3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.

Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein

IL-7 bằng phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt 86,3%. Hàm lượng

protein IL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là 2,34%, kết quả này tương

đương với những nghiên cứu trước đó về hàm lượng protein tái tổ hợp trên

protein hòa tan tổng số: 2% [47], [143]; 2,2% [1]; 3% [29].

Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ ra có nhiều ưu điểm như

dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt của ELP,

đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu được thường khá cao. Shoj và cộng

sự (2009) đã thu nhận được 200 mg HA/kg lá tươi, Mortimer và cộng sự (2012)

cũng thu nhận được 675 mg HA/kg lá tươi khi sản xuất kháng nguyên của virus

cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp này. Trong nghiên cứu biểu hiện protein

IL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, chúng tôi cũng đã thu nhận được 367 mg/kg lá

tươi. Kết quả này cho thấy sự biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp

trong cây thuốc lá N. benthamiana khá cao, là cơ sở để chúng tôi tiến hành sản

44

xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng

trong y học.

3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp

Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 chúng tôi tiến hành thí

nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.7 với các nồng độ IL-7 là: 0,125

µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 1,5 µg/ml; 2 µg/ml; 2,5 µg/ml. Kết

quả thu được được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.13.

Bảng 3.2. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng interleukin 7

Nồng độ protein IL-7 % hoạt hóa dòng tế bào 2E8

0.125 µg/ml 35.7

0.25 µg/ml 45.3

0.5 µg/ml 53.5

1 µg/ml 65.8

1.5 µg/ml 73.6

2 µg/ml 82.5

2.5 µg/ml 79.3

Giá trị ED50 (µg/ml) 0.35

Qua bảng 3.2 và hình 3.13 cho thấy, protein IL-7 tái tổ hợp có hoạt tính

sinh học trong việc hỗ trợ sinh trưởng và hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả

năng hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ sung

IL-7 vào môi trường nuôi cấy). Ở các nồng độ chất thử IL-7 tăng dần, % hoạt

hóa tế bào của mẫu cũng tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học của mẫu thử

khá ổn định; trong đó, khả năng hoạt hóa cao nhất đạt được ở nồng độ 2 µg/ml

là 82,5%, sau đó khả năng hoạt hóa không tăng mà lại giảm đi, điều này có thể

giải thích do interleukin 7 khi ở liều lượng cao có thể gây ức chế cho sự sinh

sản và hoạt hóa tế bào, thậm chí gây chết cho tế bào.

45

Qua kết quả trên, có thể bước đầu khẳng định protein IL-7 tái tổ hợp có

khả năng thể hiện hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở ra khả năng sản

xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ trong y học nhằm đáp ứng nhu

cầu chữa bệnh cho con người.

35.7

45.3

53.3

63.8

73.6

82.579.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5

% h

oạt h

óa d

òng

tế b

ào 2

E8

Nồng độ mẫu thử (µg/ml)

Protein IL-7

Hình 3.13. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp

46

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá

Thực vật hiện nay được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu biểu hiện

protein tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp có thể được biểu hiện trong thực vật thông

qua hai phương pháp: tạo cây chuyển gen và biểu hiện tạm thời. Trong phương

pháp tạo cây chuyển gen, gen tái tổ hợp được nhân bản trong vector biểu hiện

và chuyển vào hệ gen thực vật. Do đó, gen tái tổ hợp sẽ được di truyền qua các

thế hệ tiếp theo và có thể sản xuất quy mô lớn protein tái tổ hợp [19], [74].

Trong phương pháp biểu hiện tạm thời, thay vì tích hợp vào hệ gen của thực

vật thì gen chuyển sẽ nhanh chóng tạo ra protein tái tổ hợp. Phương pháp này

có lợi thế về mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao hơn rất nhiều so với

phương pháp khác, cũng như thời gian sản xuất protein nhanh hơn, không bị

ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen trong tế bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn

đề an toàn sinh thái như phương pháp tạo cây chuyển gen [42].

Tuy nhiên, phương pháp biểu hiện tạm thời do gen chuyển không được

gắn vào hệ gen của thực vật nên thường bị cơ chế câm gen (RNAi) dịch mã và

sau dịch mã tác động, dẫn đến hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận được

không cao. Đây là cơ chế phản ứng của thực vật trước sự xâm nhập của DNA

ngoại lai, dẫn đến sự phá hủy trình tự gen đặc hiệu và làm giảm sản phẩm

protein do gen mã hóa [96].

Trong nghiên cứu của luận án, để tránh gặp phải hiện tượng RNAi có thể

làm giảm hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi đã biểu hiện đồng thời

cả protein đích interleukin 7 và protein hỗ trợ Hc-Pro của virus khoai tây Y

nhằm chống lại hiện tượng câm gen ở thực vật bằng cách ngăn cản sự phân giải

mRNA và RNA sợi đôi, từ đó giảm lượng siRNA hoặc phá hỏng chức năng cắt

của enzyme cắt sợi đôi Dicer và RISC [104]. Kết quả, chúng tôi đã thu được

protein IL-7 tái tổ hợp biểu hiện ở lá cây thuốc lá với hàm lượng khá cao.

47

4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC

Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp ở thực vật thường không cao là

một trong những giới hạn khi nghiên cứu biểu hiện protein ở thực vật. Đã có

nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm vượt qua giới hạn đó để tăng cường khả

năng biểu hiện protein tái tổ hợp khi biểu hiện ở thực vật bằng nhiều phương

pháp như: tối ưu hóa codon [16], kết hợp với một thành phần hỗ trợ như enzyme

lichenase [53], ELP [16], [25].

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã sử dụng 100xELP cùng với

protein IL-7 dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35 nhằm tăng cường khả

năng biểu hiện protein IL-7 ở thực vật. Kết quả của chúng tôi phù hợp với một

số nghiên cứu khác như: Patel và cộng sự (2007) đã tăng cường sự biểu hiện

của interleukin 4 của người lên 19 lần và interleukin 10 lên 15 lần khi kết hợp

với 27xELP [68]; nghiên cứu của Floss (2009) cũng cho thấy, mức độ biểu hiện

của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng HIV (2F5 và 2G12) cao hơn

khi không có sự kết hợp với ELP [25]. Từ những kết quả này cho thấy sự tích

lũy các protein tái tổ hợp là do hiệu ứng của ELP chứ không phải do vị trí của

gen chuyển.

Sự tăng cường biểu hiện của protein kết hợp với ELP có thể được giải

thích là do các protein kết hợp ELP khó bị protease của tế bào chủ phân cắt

hoặc thủy phân hơn. Điều này dẫn tới hàm lượng protein tái tổ hợp cao hơn so

với bình thường, góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp tinh sạch

và thu nhận protein tiếp theo.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp nhằm tinh sạch và thu nhận các loại

protein tái tổ hợp đạt nồng độ cao và tinh khiết như: phương pháp sắc ký lọc

gel, phương pháp sắc ký ái lực (IMAC), sắc ký trao đổi ion, phương pháp đảo

chiều thuận nghịch mITC. Tùy thuộc vào nghiên cứu và loại protein,người ta

lựa chọn phương pháp tinh sạch tối ưu nhất để thu được hàm lượng protein tái

tổ hợp cao nhất.

48

Phương pháp tinh sạch protein đảo chiều thuận nghịch mITC dựa trên

tính chất đảo ngược chuyển từ trạng thái tan sang trạng thái không tan và ngược

lại khi nhiệt độ môi trường thay đổi của ELPylated tỏ ra có nhiều ưu điểm và

được ứng dụng ngày càng rộng rãi do hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận

được nhiều với độ tinh sạch cao, các bước tiến hành nhanh và đơn giản do sự

kết tinh của các protein gắn kết ELP được giữ lại trên bề mặt màng và dễ dàng

được khử khỏi màng.

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng hai phương pháp để

tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp là phương pháp sắc ký ion cố định kim loại

(IMAC) và phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC). Đối với

phương pháp sắc ký ion cố định kim loại, chúng tôi thu được hàm lượng protein

IL-7 tái tổ hợp đạt 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng

số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg

lá tươi. Đối với phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng đảo chiều thuận

nghịch qua màng (mITC), chúng tôi thu được hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp

đạt 367 mg/kg lá tươi với hiệu suất thu hồi đạt 95,82 % và độ tinh sạch đạt

86,3%. Qua số liệu thu được cho thấy, phương pháp đảo chiều thuận nghịch

qua màng (mITC) dựa trên đặc tính của ELP có hiệu suất thu hồi cao hơn hẳn

các phương pháp khác; kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với

những nghiên cứu trước đó về biểu hiện protein tái tổ hợp có gắn kết ELP như

Scheller và cộng sự (2006) đã tổng hợp được protein scFV tái tổ hợp với hàm

lượng tăng gấp 40 lần so với thông thường, không gắn với ELP [81], Theo Floss

(2009), việc gắn kết với ELP có thể làm tăng mức độ biểu hiện của các kháng

thể vô hiệu hóa HIV biểu hiện trong hạt [25]; ELP kết hợp với các protein tái

tổ hợp ở đầu C cũng làm tăng sự tích lũy của nhiều loại protein biểu hiện trong

lá [16], [17], [68].

Từ những kết quả trên cho thấy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp gắn kết

với ELP và tinh sạch bằng phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng

49

mITC cho hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp với độ tinh sạch cao hơn so với

các phương pháp khác. Mở ra một hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho mục

đích thu nhận protein tái tổ hợp của người sản xuất ở thực vật nhằm phục vụ

trong y dược học, chữa bệnh cho con người.

50

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

1. Kết luận

1. Mã di truyền của gen hIL-7 được thay đổi phù hợp với hệ thống biểu

hiện ở thực vật với độ tương đồng nucleotide là 63,6 % và độ tương đồng acid

amin là 100%.

2. Các cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/IL7/cal;

pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S-IL7-100xELP; pCB301_IL7/ELP được

thiết kế phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế

bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein

interleukin 7 tái tổ hợp.

3. Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy cao

nhất đạt 367 mg/kg lá tươi khi biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá và thu nhận bằng

phương pháp tinh sạch mITC; thấp nhất khi biểu hiện qua hệ thống nuôi cấy

huyền phù BY-2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số.

4. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 đạt 82,5% ở nồng độ 2 µg/ml.

2. Đề nghị

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, để tiếp tục phát triển

các kết quả nghiên cứu sâu hơn; chúng tôi đề xuất một số đề nghị sau:

1. Tiếp tục thử nghiệm protein IL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở mức độ

động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nhằm đánh giá sâu hơn hoạt tính sinh học

của protein IL-7 trước khi sản xuất trên diện rộng.

2. Nghiên cứu biểu hiện protein IL-7 ở một số loài thực vật khác để làm

phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein IL-7 tái tổ hợp.

51

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc,

Lê Văn Sơn (2014). Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở người.

Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. Tập 118 số 04, trang

153-156.

2. Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2015).

Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển gen trong hệ

thống thực vật. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. Tập

134 số 04, trang 25-28.

3. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2017).

Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá (Nicotiana

benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltration. Tạp chí Sinh học.

4. Hoang,N.H., Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene is

optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:

MF170526.1

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trương Nam Hải (2010), Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của interleukin-2

tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư, Báo

cáo tổng kết đề tài khoa học cấp Nhà nước, Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2. Mi Hoàng (2015), “Bước tiến trong điều trị bệnh tự miễn”, Tạp chí Thông

tin Khoa học và Công nghệ, 9, tr. 28-30.

3. Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Biểu hiện

gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp”, Tạp chí phát triển

Khoa học và Công nghệ, 15(1), tr. 52-61.

Tiếng Anh

4. Adam W. P., Daniel T. P., Jung H. S., Emma-Kate L., François J., Steven

F. Z., Ninan A. (2012), “Interleukin-7, but not thymic stromal

lymphopoietin, plays a key role in the T cell response to influenza A

virus”, PLoS One, 7(11), PP. 1-8, doi: 10.1371/journal.pone.0050199.

5. Agnieszka S., Tomas V., Anna G., Patrycja R. (2011), “Recombinant

Cytokines from Plants”, Int. J. Mol. Sci., 12(6), pp: 3536-3552,

doi:10.3390/ijms12063536.

6. Alkayyal A. A., Tai L. H., Kennedy M. A., Tanese S. C., Zhang J., Lefebvre

C., Sahi S., Ananth A. A., Mahmoud A. B., Makrigiannis A. P., Cron G. O.,

Macdonald B., Marginean E. C., Stojdl D. F., Bell J. C., Auer R. C. (2017),

“NK-cell recruitment necessary for eradication of peritoneal carcinomatosis

with an IL12-expressing maraba virus cellular vaccine”, Cancer Immunol

Res, 5(3), pp. 211-221, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-16-0162.

7. Appasamy P. M. (1999), “Biological and clinical implications of interleukin-

7 and lymphopoiesis”, Cytokines Cell. Mol. Ther., 5(1), pp. 25-39.

53

8. Azizi H., Kazemi B., Bandehpour M., Mohebali M., Khamesipour A.,

Aryaeipour M., Yaghoobi H., Rokni M. B. (2016), “Modulation of the

immune response to DNA vaccine encoding gene of 8-kDa subunit of

echinococcus granulosus antigen B using murine interleukin-12 plasmid

in BALB/c Mice”, Iran J Parasitol, 11(4), pp.480-489.

9. Baird A. M., Lucas J. A., Berg L. J. (2000), “A profound deficiency in

thymic progenitor cells in mice lacking Jak3”, J Immunol, 165(7),

pp.3680–3688, PubMed: 11034372.

10. Barta A., Sommergruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A.,

Matzke A. J. M. (1986), “The expression of a nopaline synthase-human

growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower

callus tissue”, Plant Mol. Biology, 6(5), pp. 347–357.

11. Beilharz M. W., Cummins M. J. (2010), “Oromucosal administration of

interferon to humans”, Pharmaceuticals, 3(2), pp.323-344.

12. Budzianowski J. (2010), “Tobacco a highly efficient producer of

vaccines”, Przegl. Lek., 67(10), pp. 1071-1076.

13. Cao X., Shores E. W., Huli J., Anver M. R., Kelsall B. L., Russell S. M.,

Drago J., Noguchi M., Grinberg A., Bloom E. T., Paul W. E., Kayz S. I.,

Love P. E., Leonard W. J. (1995), “Defective lymphoid development in

mice lacking expression of the common cytokine receptor-γ chain”,

Immunity, 2(3), pp. 223-238, PubMedID: 7697543.

14. Chen Y., Chauhan S. K., Tan X., Dana R. (2017), “Interleukin-7 and -15

maintain pathogenic memory Th17 cells in autoimmunity”, J Autoimmun,

77, pp. 96-103, doi: 10.1016/j.jaut.2016.11.003, PubMedID: 27899224.

15. Chong D. K. X., Langridge W. H. R. (2000), “Expression of full-length

bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants”, Transgenic

Res, 9(1), pp. 71-78.

54

16. Conley A. J., Joensuu J. J., Jevnikar A. M., Menassa R., and Brandle J. E.

(2009), “Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression

and purification of recombinant proteins in plants”, Biotechnology

Bioeng, 103(3), pp. 562-573, doi: 10.1002/bit.22278.

17. Conrad U., Plagmann I., Malchow S., Sack M., Floss D. M., Kruglov A.

A., Nedospasov S. A., Rose-John S., Scheller J. (2011), “ELPylated anti-

human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal

septic shock”, Plant Biotechnol. J., 9(1), 22-31, doi: 10.1111/j.1467-

7652.2010.00523.x.

18. Costello R., Imbert J., Olive D. (1993), “Interleukin-7, a major

Tlymphocyte cytokine”, Eur. Cytokine Netw., 4(4), pp. 253-262.

19. Davies H. M. (2010), “Review article: commercialization of whole-plant

systems for biomanufacturing of protein products: evolution and

prospects”, Plant Biotechnol J., 8(8), pp. 845-861, doi: 10.1111/j.1467-

7652.2010.00550.x.

20. Disanto J. P., Muller W., Guygrand D., Fischer A., Rajewsky K. (1995),

“Lymphoid development in mice with a targeted deletion of the

interleukin-2 receptor-γ chain”, Proc Natl Acad Sci USA, 92(2), pp. 377-

381, PubMed: 7831294.

21. Eddie A. J., Changlin W., Zeping W., Raymond R., Joong H. S., Nancy

S. M., James M. L. (2000), “Production and characterization of

biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified

plant cells”, Protein Expression and Purification, 19(1), pp: 131–138, doi:

https://doi.org/10.1006/prep.2000.1232.

22. Faller E. M., Ghazawi F. M., Cavar M., MacPherson P. A. (2010), “IL-7

induces clathrin-mediated endocytosis of CD127 and subsequent

degradation by the proteasome in primary human CD8 T cells”,

Immunology and Cell Biology, 165(2), pp. 11-23.

55

23. Fischer R., Emans N. (2000), “Molecular farming of pharmaceutical

proteins”, Transgenic Research, 9(4-5), pp. 279-299.

24. Fischer R., Schumann D., Zimmermann S., Drossard J., Sack M.,

Schillberg S. (1999), “Expression and characterization of bispecific

single-chain Fv fragments produced in transgenic plants”, Eur. J.

Biochem, 262(3), pp.810-816.

25. Floss D. M., Sack M., Arcalis E., Stadlmann J., Quendler H., Rademacher

T., Stoger E., Scheller J. R., Fischer R., Conrad U. (2009), “Influence of

elastin-like peptide fusions on the quantity and quality of a tobacco-

derived human immunodeficiency virus-neutralizing antibody”, Plant

Biotechnology J., 7(9), pp. 899-913, doi: 10.1111/j.1467-

7652.2009.00452.x.

26. Funk P. E., Stephan R. P., Witte P. L. (1995), “Vascular cell adhesion

molecule 1-positive reticular cells express interleukin-7 and stem cell

factor in the bone marrow”, Blood, 86, pp. 2661-2671.

27. Gao P., Zhang C., Bian X., Guo Y., Wei Y., Zhang L., Liu Z., Wang X.,

Huang S. (2016), “The increasingly anti-tumor effect of a colonic

carcinoma DNA vaccine carrying HER2 by the adjuvanticity of IL-12”,

Immunopharmacol Immunotoxicol, 38(6), pp. 441-446, doi:

http://dx.doi.org/10.1080/08923973.2016.1233426.

28. Gora-Sochacka A., Redkiewicz P., Napiorkowska B., Gaganidze D.,

Brodzik R., Sirko A. (2010), “Recombinant mouse granulocyte-

macrophage colony-stimulating factor is glycosylated in transgenic

tobacco and maintains its biological activity”, J. Interferon Cytokine Res.,

30(3), pp. 135-142, doi: 10.1089/jir.2009.0053.

29. Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias L. J., Sanchez-

Torres C., Gomez-Lim M. A. (2004), “Expression of a single-chain

56

human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional

studies”, Biotechnology Bioeng., 85(7), pp. 734-740.

30. Gutierrez-Ortega A., Sandoval-Montes C., de Olivera-Flores T. J., Santos-

Argumedo L., Gomez-Lim M. A. (2005), “Expression of functional

interleukin-12 from mouse in transgenic tomato plants”, Transgenic Res.,

14(6), pp. 877–885, doi: 10.1007/s11248-005-1464-8.

31. Heufler C., Topar G., Grasseger A., Stanzl U., Koch F., Romani N.,

Namen A. E., Schuler G. (1993), “Interleukin 7 is produced by murine and

human keratinocytes”, J. Exp. Med., 178(3), pp. 1109-1114.

32. Jha S., Sanyal I., Amla D. (2015), “High-level expression and purification

of a therapeutic recombinant serine protease inhibitor from transgenic

tomato plants”, International Journal of Advance Research In Science

And Engineering 4(1), pp. 1158-1176.

33. Jiang Q., Li W. Q., Aiello F. B., Mazzucchelli R., Asefa B., Khaled A. R.,

Durum S. K. (2005), “Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin”,

Cytokine Growth Factor Rev, 16(4-5), pp. 513–533, doi:

10.1016/j.cytogfr.2005.05.004.

34. Jing L., Min C., Xian-Wei L., Hou-Cheng Z., Fa F. S., George P. W.

(2007), “Transient expression of an active human interferon-beta in

lettuce”, Scientia Horticulturae, 112(3), pp. 258-265,

http://doi.org/10.1016/j.scienta.2006.12.047.

35. Kariminia A., Ivison S. M., Leung V.M., Sung S., Couto N., Rozmus J.,

Rolf N., Narendran A., Dunn S. E., Reid G. S., Schultz K. R. (2017), “Y-

box-binding protein 1 contributes to IL-7-mediated survival signaling in

B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia”, Oncology Letters, 13(1),

pp. 497-505. doi: 10.3892/ol.2016.5437. PubmedID: 28123588.

36. Kazusa DNA Res. Inst. (2017), Codon usage database,

http://www.kazusa.or.jp/codon, ngày 7/01/2017.

57

37. Khaled A. R., Li W. Q., Huang J., Fry T. J., Khaled A. S., Mackall C. L.,

Muegge K., Young H. A., Durum S. K. (2002), “Bax deficiency partially

corrects interleukin-7 receptor-alpha deficiency”, Immunity, 17(5), pp.

561-573.

38. Kim H. J., Park S. M., Lee H., Kim Y. S. (2016), “Membrane-bound p35

Subunit of IL-12 on Tumor Cells is Functionally Equivalent to

Membrane-bound Heterodimeric Single Chain IL-12 for Induction of

Anti-tumor Immunity”, Immune Netw, 16(5), pp. 305-310, doi:

10.4110/in.2016.16.5.305.

39. Kim N. S., Kim T. G., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S.

(2008), “Amylase gene silencing by RNA interference improves

recombinant hGM-CSF production in rice suspension culture”, Plant Mol.

Biol., 68(4-5), pp. 369–377, doi: 10.1007/s11103-008-9376-7.

40. Kim N. S., Kim T. G., Kim O. H., Ko E. M., Jang Y. S., Jung E. S., Kwon

T. H., Yang M. S. (2008), “Improvement of recombinant hGM-CSF

production by suppression of cysteine proteinase gene expression using

RNA interference in a transgenic rice culture”, Plant Mol. Biol., 68(3), pp.

263–275, doi: 10.1007/s11103-008-9367-8.

41. Kim T. G., Lee H. J., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S.

(2008), “Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant

human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in

transgenic rice cell suspension culture”, Protein Expr. Purif., 61(2),

pp.117–121, doi: 10.1016/j.pep.2008.06.005.

42. Komarova T. V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E.,

Dorokhov Y. L. (2010), “Transient expression systems for plant-derived

biopharmaceuticals”, Expert Rev Vaccines, 9(8), pp. 859-876, doi:

10.1586/erv.10.85.

58

43. Kowalczyk T. , Lucka M., Szemraj J., Sakowicz T. (2016), “Hairy roots

culture as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med

Dosw (Online), 70, pp. 1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186.

44. Krzystek-Korpacka M., Zawadzki M., Neubauer K., Bednarz-Misa I.,

Górska S., Wiśniewski J., Witkiewicz W., Gamian A. (2017), “Elevated

systemic interleukin-7 in patients with colorectal cancer and individuals

at high risk of cancer: association with lymph node involvement and tumor

location in the right colon”, Cancer Immunol Immunother, 66(2), pp. 171-

179. doi: 10.1007/s00262-016-1933-3, PubmedID: 27866242.

45. Kwon T., Kim Y., Lee J., Yang M. (2003), “Production and secretion of

biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating

factor in transgenic tomato suspension cultures”, Biotechnology Letters

25(18), pp. 1571-1574, doi: 10.1023/A:1025409927790.

46. Lee J. H., Kim N. S., Kwon T. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2002),

“Increased production of human granulocyte-macrophage colony

stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in

plant suspension cultures”, J. Biotechnol., 96(3), pp: 205–211.

47. Link A., Vogt T. K., Favre S., Britschgi M. R., Acha-Orbea H., Hinz B.,

Cyster J. G., Luther S. A. (2007), “Fibroblastic reticular cells in lymph

nodes regulate the homeostasis of naive T cells”, Nat Immunol,

8(11):1255–1265, doi:10.1038/ni1513.

48. Luchakivskaya Y., Kishchenko O., Gerasymenko I., Olevinskaya Z.,

Simonenko Y., Spivak M., Kuchuk M. (2011), “High-level expression of

human interferon alpha-2b in transgenic carrot (Daucus carota L.) plants”,

Plant Cell Rep., 30(3), pp. 407-415, doi: 10.1007/s00299-010-0942-5.

49. Ma S., Huang Y., Davis A., Yin Z., Mi Q., Menassa R., Brandle J. E.,

Jevnikar A. M. (2005), “Production of biologically active human

59

interleukin-4 in transgenic tobacco and potato”, Plant Biotechnol. J.,

2005, 3(3), pp. 309-318, doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00125.x.

50. Mauro F. R., Gentile M., Foa R. (2002), “Erythropoietin and chronic

lymphocytic leukemia”, Rev Clin Exp Hematol, 1, pp. 21-31.

51. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. (1995), “Characterization of

a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco

cells”, Plant Mol. Biol., 27(6), pp: 1163–1172.

52. Menassa R., Kennette W., Nguyen V., Rymerson R., Jevnikar A., Brandle

J. (2004), “Subcellular targeting of human interleukin-10 in plants”, J.

Biotechnol., 108(2), pp. 179-183.

53. Mett V., Musiychuk K., Bi H., Farrance C. E., Horsey A., Ugulava N.,

Shoji Y., de la Rosa P., Palmer G. A., Rabindran S., Streatfield S. J.,

Boyers A., Russell M., Mann A., Lambkin R., Oxford J. S., Schild G. C.,

Yusibov V. (2008), “A plant-produced influenza subunit vaccine protects

ferrets against virus challenge”, Influenza Other Respi. Viruses, 2(1), pp.

33-40, doi: 10.1111/j.1750-2659.2008.00037.x.

54. Morrissey P. J., Conlon P., Braddy S., Williams D. E., Namen A. E.,

Mochizuki D. Y. (1991a), “Administration of IL-7 to mice with

cyclophosphamide-induced lymphopenia accelerates lymphocyte

repopulation”, J. Immunol, 146(5), pp. 1547-1552.

55. Morrissey P. J., Conlon P., Charrier K., Braddy S., Alpert A., Williams

D., Namen A. E., Mochizuki D. (1991b), “Administration of IL-7 to

normal mice stimulates B-lymphopoiesis and peripheral

lymphadenopathy”, J. Immunol, 147(2), pp. 561-568.

56. Mortimer E., James M. M., Sandiswa M., Amelia B., Anna-Lise W., Inga

I. H., Edward P. R. (2012), “Setting up a platform for plant-based

influenza virus vaccine production in South Africa”, BMC Biotechnol,

12:14. doi: 10.1186/1472-6750-12-14.

60

57. Nahed E., Ronald E. G. (2010), “An Overview of IL-7 Biology and Its

Use in Immunotherapy”, J Immunotoxicol, 7(1), pp. 1-7,

doi:10.3109/15476910903453296.

58. Namen A. E., Lupton S., Hjerrild K., Wignall J., Mochizuki D. Y.,

Schmierer A., Mosley B., March C. J., Urdal D., Gillis S. (1988a),

“Stimulation of B-Cell progenitors by cloned murine interleukin- 7”,

Nature, 333(6173), pp. 571-573, doi: 10.1038/333571a0.

59. Namen A. E., Schmierer A. E., March C. J., Overell R. W., Park L. S., Urdal

D. L., Mochizuki D. Y. (1988b), “B cell precursor growth-promoting

activity. Purification and characterization of a growth factor active on

lymphocyte precursors”, J. Exp. Med., 167(3), pp. 988-1002.

60. Ngoc P. B. (2009), Production and Secretion of Recombinant Sweet-

Tasting Thaumatin from Suspension Cells and Hairy Roots of Nicotiana

tabacum, University of Heidelberg, Germany.

61. Ning T., Xie T., Qiu Q., Yang W., Zhou S., Zhou L., Zheng C., Zhu Y.,

Yang D. (2008), “Oral administration of recombinant human granulocyte-

macrophage colony stimulating factor expressed in rice endosperm can

increase leukocytes in mice”, Biotechnology Letter, 30(9), pp. 1679-1686,

doi: 10.1007/s10529-008-9717-2.

62. Nosaka T., Vandeursen J. M. A., Tripp R. A., Thierfelder W. E., Witthuhn

B. A., McMickle A. P., Doherty P. C., Grosveld G. C., Ihle J. N. (1995),

“Defective lymphoid development in mice lacking Jak3”, Science,

270(5237), pp. 800-802.

63. O'Connor A. M., Crawley A. M., Angel J. B. (2010), “Interleukin-7

enhances memory CD8+ T-cell recall responses in health but its activity

is impaired in human immunodeficiency virus infection”, Immunology,

131(4), pp. 525-536, doi: 10.1111/j.1365-2567.2010.03325.x.

61

64. Ohbo K., Suda T., Hashiyama M., Mantani A., Ikebe M., Miyakawa K.,

Moriyama M., Nakamura M., Katsuki M., Takahashi K., Yamamura K.,

Sugamura K. (1996), “Modulation of hematopoiesis in mice with a

truncated mutant of the IL-2 receptor-γ chain”, Blood, 87(3), pp. 956-967.

65. Ohya K., Matsumura T., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C. (2001),

“Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato

plants”, J. Interferon Cytokine Res., 21(8), pp. 595-602, doi:

10.1089/10799900152547858.

66. Ohya K., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C., Matsumura T.

(2002), “Expression of biologically active human tumor necrosis factor-

alpha in transgenic potato plant”, J. Interferon Cytokine Res., 22(3), 371-

378, doi: 10.1089/107999002753675802.

67. Oliver P. M., Wang M., Zhu Y., White J., Kappler J., Marrack P. (2004),

“Loss of Bim allows precursor B cell survival but not precursor B cell

differentiation in the absence of interleukin 7”, J. Exp. Med., 200(9), pp.

1179-1187, doi: 10.1084/jem.20041129, PubMed ID: 15520248.

68. Patel J., Zhu H., Menassa R., Gyenis L., Richman A., Brandle J. (2007),

“Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of

recombinant proteins in tobacco leaves”, Transgenic Res., 16(2), pp. 239-

249, doi: 10.1007/s11248-006-9026-2.

69. Park Y., Cheong H. (2002), “Expression and production of recombinant

human interleukin-2 in potato plants”, Protein Expr. Purif., 25(1), pp.

160-165, doi: 10.1006/prep.2002.1622.

70. Park S. Y., Saijo K., Takahashi T., Osawa M., Arase H., Hirayama N.,

Miyake K., Nakauchi H., Shirasawa T., Saito T. (1995), “Developmental

defects of lymphoid cells in Jak3 kinase-deficient mice”, Immunity, 3(6),

pp. 771-782. PubmedID: 8777722.

62

71. Pellegrini M., Calzascia T., Elford A. R., Shahinian A., Lin A. E.,

Dissanayake D., Dhanji S., Nguyen L. T., Gronski M. A., Morre M.,

Assouline B., Lahl K., Sparwasser T., Ohashi P. S., Mak T. W. (2009),

“Adjuvant IL-7 antagonizes multiple cellular and molecular inhibitory

networks to enhance immunotherapies”, Nature Medicine, 15, pp. 528-

536, doi:10.1038/nm.1953.

72. Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C., Sourrouille C., de

March G., Gomord V. (2009), “Production of recombinant proteins in

suspensioncultured plant cells”, Methods Mol Biol., 483, pp. 145-161,

doi:10.1007/978-1-59745-407-0_9.

73. Potula H. H., Kathuria S. R., Ghosh A. K., Maiti T. K., Dey S. (2008),

“Transient expression, purification and characterization of bioactive

human fibroblast growth factor 8b in tobacco plants”, Transgenic

Res.,17(1), pp. 19-32, doi: 10.1007/s11248-007-9072-4.

74. Qiang C. (2011), “Expression and manufacture of pharmaceutical proteins

in genetically engineered horticultural plants”, Transgenic Horticultural

Crops: Challenges, and Opportunities-Essays by Experts. Boca Raton:

Taylor & Francis, pp. 83-124, doi: 10.1201/b10952-5.

75. Rich B. E., Campos-Torres J., Tepper R. I., Moreadith R. W., Leder P.

(1993), “Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin 7

transgenic mice”, J. Exp. Med., 177(2), pp. 305-316.

76. Rodig S. J., Meraz M. A., White J. M., Lampe P. A., Riley J. K., Arthur C.

D., King K. L., Sheehan K. C. F., Yin L., Pennica D., Johnson E. M. J.,

Schreiber R. D. (1998), “Disruption of the Jak1 gene demonstrates

obligatory and non-redundant roles of the Jaks in cytokine-induced

biologic responses”, Cell, 93(3), pp. 373-383, PubMed: 9590172.

77.Sanchez-Hernandez C., Gutierrez-Ortega A., Aguilar-Leon D., Hernandez-

Pando R., Gomez-Lim M., Gomez-Garcia B. (2010), “In vivo activity of

63

plant-based interleukin-12 in the lung of Balb/c mouse”, BMC Res. Notes,

3:151, doi: 10.1186/1756-0500-3-151.

78. Santos R. B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T. (2016),

“Putting the Spotlight Back on Plant Suspension Cultures”, Front Plant

Sci., 7:297, doi: 10.3389/fpls.2016.00297.

79. Sardana R., Dudani A. K., Tackaberry E., Alli Z., Porter S., Rowlandson

K., Ganz P., Altosaar I. (2007), “Biologically active human GM-CSF

produced in the seeds of transgenic rice plants”, Transgenic Res., 16(6),

pp. 713-721, doi:10.1007/s11248-006-9062-y.

80. Savino A. M., Izraeli S. (2017), “Interleukin-7 signaling as a therapeutic

target in acute lymphoblastic leukemia”, Expert Rev Hematol., 10(3), pp.

183-185, doi: 10.1080/17474086.2017.1292121.

81. Scheller J., Leps M., Conrad U. (2006), “Forcing single-chain variable

fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like

polypeptides”, Plant Biotechnol. J., 4(2), pp. 243-249, doi:

10.1111/j.1467-7652.2005.00176.x.

82.Schwertschlag U. S., Trepicchio W. L., Dykstra K. H. (1999),

“Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-

11”, Leukemia, 13(9), pp. 1307-1315.

83. Seddon B., Tomlinson P., Zamoyska R. (2003), “Interleukin 7 and T cell

receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells”, Nature

Immunol, 4(7), pp. 680-686, doi: 10.1038/ni946.

84. Shin Y. J., Hong S. Y., Kwon T. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2003), “High

level of expression of recombinant human granulocyte-macrophage

colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture”,

Biotechnol. Bioeng, 82(7), pp.778-783, doi:10.1002/bit.10635.

85. Shiroki F., Satoshi M., Tomomitsu D., Mari F., Yoshito M., Takashi K.,

Harumi S., Shigeo K. (2007), “The p85α regulatory subunit of class IA

64

phosphoinositide 3-kinase regulates beta-selection in thymocyte

development”, Journal of Immunology, 178(3), pp. 1349–1356, doi:

10.4049/jimmunol.178.3.1349.

86. Silva M. R., Hoffman R., Srour E. F., Ascensao J. L. (1994), “Generation

of human natural killer cells from immature progenitors does not require

marrow stromal cells”, Blood, 84, pp. 841-846.

87. Sijmons P. C., Dekker B. M., Schrammeijer B., Verwoerd T. C., van den

Elzen P. J., Hoekema A. (1990), “Production of correctly processed

human serum albumin in transgenic plants”, Nature Biotechnology, 8, pp.

217-222, doi:10.1038/nbt0390-217.

88. Matsuyama R., Goto K., Kadokura T., Sato M., Mori R., Kumamoto T.,

Taguri M., Miyasho T., Endo I. (2017), “IL-7 and procalcitonin are useful

biomarkers in the comprehensive evaluation of the severity of acute

cholangitis”, J Hepatobiliary Pancreat Sci, 24(2), pp. 81-88,

doi:10.1002/jhbp.420. PMID: 28002647

89. Suzuki K., Nakajima H., Watanabe N., Kagami S., Suto A., Saito Y., Saito

T., Iwamoto I. (2000), “Role of common cytokine receptor-γ chain- and

Jak3-dependent signaling in the proliferation and survival of murine mast

cells”, Blood, 96(6), pp. 2172–2180.

90. Sweeney E. B., Foss F. M., Murphy J. R., Spek J. C. (1998), “Interleukin 7

(IL-7) receptor-specific cell killing by DAB389 IL-7: a novel agent for the

elimination of IL-7 receptor positive cells”, Bioconjug chem.,9(2), pp. 201

- 207, doi: 10.1021/bc9701757.

91. Vandana K., Laura A. P., Yevgeniy Y., Florian M. B., Surojit S. (2015),

“Quiescence of Memory CD8(+) T Cells Is Mediated by Regulatory T Cells

through Inhibitory Receptor CTLA-4”, Immunity, 42(6), pp. 1116-1129.

92. Van den Bergh J. M., Lion E., Van Tendeloo V. F., Smits E. L. (2017), “IL-

15 receptor alpha as the magic wand to boost the success of IL-15

65

antitumor therapies: The upswing of IL-15 transpresentation”,

Pharmacology & Therapeutics, 170, pp. 73-79, doi:

10.1016/j.pharmthera.2016.10.012.

93. Vaquero C., Sack M., Chandler J., Drossard J., Schuster F., Monecke M.,

Schillberg S., Fischer R. (1999), “Transient expression of a tumor-specific

single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves”, Proc

Natl Acad Sci U S A, 96(20), pp. 11128-11133.

94. Wang D. J., Brandsma M., Yin Z., Wang A., Jevnikar A. M., Ma S. (2008),

“A novel platform for biologically active recombinant human interleukin-

13 production”, Plant Biotechnology J., 6(5), pp. 504–515, doi:

10.1111/j.1467-7652.2008.00337.

95. Wang M. L., Goldstein C., Su W., Moore P. H., Albert H. H. (2005),

“Production of biologically active GM-CSF in sugarcane: A secure

biofactory”, Transgenic Res., 14(2), pp. 167-178.

96. Wang X. B., Wu Q., Ito T., Cillo F., Li W. X., Chen X., Yu J. L., Ding S.

W. (2010), “RNAi-mediated viral immunity requires amplification of

virus-derived siRNAs in Arabidopsis thaliana”, Proc Natl Acad Sci U S

A, 107(1), pp. 484-9, doi: 10.1073/pnas.0904086107.

97. Watanabe M., Ueno Y., Yajima T., Iwao Y., Tsuchiya M., Ishikawa H.,

Aiso S., Hibi T., Ishii H. (1995), “Interleukin 7 is produced by human

intestinal epithelial-cells and regulates the proliferation of intestinal

mucosal lymphocytes”, J. Clin. Investigation, 95(6), pp. 2945-2953, doi:

10.1172/JCI118002.

98. Wikipedia, Interleukin 7, https://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_7, ngày

01/01/2017.

99. Wiles M. V., Ruiz P., Imhof B. A. (1992), “Interleukin-7 expression during

mouse thymus development”, Eur. J. Immunology, 22(4), pp. 1037-1042,

doi: 10.1002/eji.1830220424.

66

100. World Health Organization (2016), Vietnam has among world’s highest

cancer fatality rates,

https://www.vietnambreakingnews.com/2016/10/vietnam-has-among-

worlds-highest-cancer-fatality-rates/, ngày 01/01/2017.

101. Yoko S., Hong B., Konstantin M., Amy R., April H., Gourgopal R., Brian

G., Moneim S., Christine E. F., Barbara T., Nutan M., Natalia U. (2009),

“Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection

with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine, 27(7), pp.

1087-1092, doi:10.1016/j.vaccine.2008.11.108.

102. Yoseph S., Yoram T. (2016), “Plant specific N-glycan do not have proven

adverse effects in humans”, Nature Biotechnology, 34, pp. 706-708,

doi:10.1038/nbt.3556.

103. Zhang B., Yang Y. H., Lin Y. M., Rao Q., Zheng G. G., Wu K. F. (2003),

“Expression and production of bioactive human interleukin-18 in

transgenic tobacco plants”, Biotechnology Letter, 25(19), pp. 1629-1635.

104. Zhang X., Du P., Lu L., Xiao Q., Wang Q., Cao X., Ren B., Wei C., Li Y.

(2008), Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from

Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the

accumulation of siRNAs, Virology, 374(2), pp. 351-360, doi:

10.1016/j.virol.2007.12.045.

105. Zhong H., Gu X., Dai Y., Wang Z., Fu D., Guo X., Wu H., Wang D., Lu

Z. (2016), “Interleukin-7 in Patients With Chronic Hepatitis B May Have

Effect on T Follicular Helper Cells and Specific Cellular Immunity”,

Hepat Mon, 16(9): e36068, doi:10.5812/hepatmon.36068.

106. Zhou F., Wang M. L., Albert H. H., Moore P. H., Zhu Y. J. (2006),

“Efficient transient expression of human GM-CSF protein in Nicotiana

benthamiana using potato virus X vector”, Appl. Microbiology

Biotechnology, 72(4), pp. 756-762, doi: 10.1007/s00253-005-0305-2.

67

107. Ziegler S. F., Liu Y. J. (2006), “Thymic stromal lymphopoietin in normal

and pathogenic T-cell development and function”, Nature Immunology,

7(7), pp. 709-714, doi: 10.1038/ni1360.

68

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần một số dung dịch đệm

Dung dịch đệm Thành phần

Đệm xử lý mẫu

(Treatment buffer 6X)

Tris HCl 1M

Glycerol 100%

SDS

2-mercaptoethanol

Bromophenol blue

pH

3,75 ml

6 ml

1,2 g

0,9 ml

1,2 mg

6,8

Đệm chạy điện di protein

(running buffer protein)

Tris HCl

Glycine

SDS

25 mM

250mM

0,1%

1 lít running buffer 1X: 3g Tris, 18,8 g glycine, 1g SDS

Đệm Staining buffer

CBBR - 250

Methanol

Acid axetic

0,25%

30%

10%

Đệm Destaining buffer Methanol

Acid axetic

30%

10%

Đệm chiết DNA tổng số

Tris-HCl 1M

NaCl 5M

EDTA 0.5M

CTAB

pH

50 mM

300 mM

20 mM

4%

8.0

69

Phụ lục 2. Các vector sử dụng trong luận án

* Sơ đồ cấu trúc vector pBSK/IL7

* Sơ đồ cấu trúc vector pCB301 35S/IL7-histag-cMyc-100xELP