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7/22/2019 coryne_diphtheriae_1

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Aislamiento y Caracterizacin de Corynebacterium

diphtheriae

Servicio Bacteriologa Clnica -INEI ANLISDr.Carlos G. Malbrn

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antitoxina (obtenida en suero de caballo) tiene caractersticas alergnicas y sensibiliza a losindividuos contra el suero.

1913. Schick disea una prueba cutnea como forma de determinar la inmunidad a ladifteria en humanos.1929. Ramndemuestra la conversin de la toxina diftrica a no txica (toxoide) utilizandoformaldehdo.1951. Freeman descubre que las cepas patgenas (toxignicas) de C. diphtheriae sonlisognicas (estn infectadas por un fago temperado), mientras que las no lisognicas sonno toxignicas. Esto demuestra que el gen para la produccin de la toxina esta localizado enel DNA del fago .1960. Pappenheimery su grupo demuestran el mecanismo de accin de la toxina diftrica.Descubren que la toxina inhibe la sntesis de protenas en el ribosoma, bloqueando latransferencia de aminocidos desde el tRNA a la cadena polipeptdica en crecimiento.

Distribucin de la Enfermedad

A principios del siglo XX, en Estados Unidos, la difteria era una enfermedad comn,especialmente en nios y una de las principales causas de muerte. Durante los aos 20, seregistraban anualmente 150.000 casos y alrededor de 13.000 muertes como causa de estaenfermedad. En el ao 1945, luego que se introdujo la vacunacin, el nmero de casos descendi a19.000.

1970-1979. (USA). Se registraron un promedio de 196 casos anuales.1980-1989. (USA). El nmero descendi a 24 casos (2 fueron fatales y 18 enfermos eranmayores de 20 aos). La mayora de los afectados eran individuos no vacunados convacunacin incompleta.La prevalencia de difteria en frica, Asia, Amrica Central y Sudamrica es alta. La OMSinform 92.000 casos de difteria respiratoria en 1980 y 46.000 casos en 1983.En los aos 80 se registraron epidemias en Suecia y DinamarcaA principios de los 90, en los estados independientes de la Unin Sovitica hubo unaumento dramtico en el nmero de casos. Entre 1990 y 1996, fueron informados por laFederacin Rusa ms de 110.000 casos de difteria y 2.900 muertes. La incidencia declina a

partir de 1996, debido a la vacunacin secundaria y a la iniciacin de programas dedeteccin temprana, implementados a causa de la epidemia.En nuestro pas, la difteria pas de cientos de casos anuales en la dcada del 70 a:

Ao 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

Casos 31 1 4 3 3 5 1 0 2 0 0 0 0

Fuente:SINAVE, Ministerio de Salud de la Nacin

Estructura y Clasificacin de Corynebacterium diphtheriae


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Corynebacterium diphtheriaees un bacilo gram positivo, aerobio, no esporulado, pleomrfico,

en forma de clava y disposicin en letras chinas, inmvil y no capsulado. La coloracin de Gram

realizada a partir de cultivos viejos, es variable. Con la coloracin de azul de metileno pueden

observarse grnulos metacromticos (polimetafosfatos) intracelulares, de color azul-prpura.

La mayora de los aislamientos requieren cido pantotnico y nicotnico para su desarrollo;

algunos otros, necesitan tiamina, biotina o cido pimlico. Para una ptima produccin de toxina, el

medio debe ser suplementado con aminocidos y deficiente en hierro.

Las cepas toxignicas son lisognicas por la accin de un bacterifago, que es portador del gen

estructural toxque codifica la produccin de la toxina diftrica.

Las cepas no toxignicas (tox-) causan un cuadro leve, parecido a la forma localizada producida

por las cepas (tox+), pero no producen la forma diseminada. Las cepas tox- pueden convertirse en

tox+ in vivo, por infeccin con el fago portador del gen de la toxina (fago conversin).C. diphtheriae comprende cuatro biotipos, var. gravis, var. intermedius, var. mitis y var.

belfanti.Todos los biotipos, con excepcin del biotipo var. belfanti, pueden producir la exotoxina

letal. Este microorganismo se clasifica en lisotipos en base a su sensibilidad frente a diferentes

corinebacteriofgos.

Descripcin de la Enfermedad

Es una enfermedad del tracto respiratorio superior que se caracteriza por dolor de garganta,

fiebre y presencia de una membrana adherente, la que se localiza en los pilares tonsilares y en lanasofaringe.

Inicialmente, se desarrolla una lesin producida por injuria necrtica del tejido epitelial. Como

resultado de sta: una red de fibrina, leucocitos, eritrocitos, clulas epiteliales muertas, y bacilos de

C. diphtheriaede crecimiento rpido, forman una membrana que recubre el rea y que se conoce

como pseudomembrana.

El bacilo diftrico no invade los tejidos subyacentes del epitelio y en el sitio de la lesin en

nasofaringe produce la toxina, la cual es absorbida y diseminada por los vasos linfticos y la sangre

a los tejidos susceptibles de los diferentes rganos. Como resultado de la patologa sistmica, se

producen cambios degenerativos en los tejidos del corazn, msculo, nervios perifricos, adrenales,

riones, hgado y bazo.

Modo de Transmisin

El hombre es el nico reservorio de la infeccin, aunque se han aislado cepas toxignicas en

caballos. El contacto directo facilita la transmisin de la enfermedad, a travs de aerosoles y/o

secreciones nasofarngeas.

Los portadores son fuente de transmisin, pero los pacientes con infeccin activa, son los que

ms pueden transmitir la enfermedad. El polvo y las ropas tambin pueden contribuir a la

transmisin.


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Perodo de Incubacin

El perodo de incubacin, generalmente, es de 2 a 5 das.Para la difteria cutnea, el perodo de incubacin es de 7 das, despus de la infeccin primaria

de piel.

Signos y Sntomas

Sntomas No Especficos

Fiebre leve y escalofros (entre el 50 y el 85% de los casos).Malestar general y dificultad para respirar.

Dolor de garganta (85-90%).

Voz ronca y disfagia (26-40%).

Edema y linfoadenopata cervical (50%).

Tos, rinorrea (mucopurulenta, que puede ser tambin sanguinolenta).

Estridor.

Nauseas y vmitos.

Sntomas Especficos

Sospechar difteria cuando se observa una pseudomembrana

y el paciente presenta nasofaringitis, tonsilitis o laringitis

La enfermedad respiratoria se caracteriza por la pseudomembrana fibrosa en las vas

respiratorias superiores, seguido por la produccin de exotoxina. Hay dificultad respiratoria por

obstruccin de la va area superior debido a la presencia de la membrana.

La mucosa orofarngea es inicialmente edematosa, hay hiperemia, seguida de necrosis epitelial einflamacin aguda. La pseudomembrana es generalmente adherente, delgada, de color blanco

griscea. Se localiza en paladar, faringe, epiglotis, laringe o trquea y puede extenderse al rbol

traqueo bronquial. Sangra al ser retirada (Figura 1).

Cuello: Se observa marcado edema en los pilares tonsilares, en la vula, en la regin submaxilar

y cuello anterior. Puede haber linfoadenopata cervical anterior y hemorragias petequiales.

Sintmas cardiovasculares: La toxicidad cardiovascular generalmente se evidencia despus de

1 a 2 semanas del comienzo de la enfermedad.


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La miocarditis puede presentarse en las dos terceras partes de los enfermos y el 10 al 25% de los

mismos desarrollan disfuncin cardiaca. Otras complicaciones son colapso circulatorio, paro

cardaco, bloqueo atrioventricular y disrritmias.

Sntomas neurolgicos: Alrededor de las tres cuartas partes de los pacientes con enfermedad

severa desarrollan neuropata. Pueden presentar neuritis y parlisis motora. Se observa parlisis de

los nervios craneales (ej: oculomotor, nasociliar) y perifricos.

Despus de 2 a 8 semanas de establecida la infeccin se manifiesta la neuritis perifrica.

El sntoma neurolgico revierte completamente con la resolucin de la infeccin.

Otros sistemas: Puede presentarse necrosis focal renal, heptica y de glndulas adrenales.

La difteria cutnea se asocia con un trauma previo o una enfermedad primaria de la piel.Eritema, dolor y presencia de exudado son caractersticos de las infecciones secundarias. Las

lesiones aparecen como lceras con membranas grisceas (Figura 2).

Patogenicidad

La patogenicidad de Corynebacterium diphtheriaecomprende dos mecanismos diferentes.

a- Invasin del Tejido de la Cavidad Nasofarngea

Requiere la colonizacin y posterior proliferacin de la bacteria. Hasta el momento, se

desconocen los factores de colonizacin de C.diphtheriae. Sin embargo, otros factores, adems de

la produccin de la toxina podran contribuir a la virulencia.

C. diphtheriaeproduce neuraminidasa que cliva el cido silico de la superficie celular en piruvato

y cido N-acetil neuraminico. Esta enzima podra ser una de las causas de injuria celular.

El factor de anclaje (6,6'-di-O-micoloil-a,a'-D-trehalose) es un componente de la superficie de C.

diphtheriae, pero su rol en la colonizacin del husped no ha sido esclarecida.

Estudios epidemiolgicos han demostrado que un lisotipo determinado puede persistir en una

poblacin por largos perodos y puede ser suplantado por otro lisotipo. La emergencia y

predominancia de un nuevo lisotipo en una poblacin, se debe probablemente a su capacidad de

colonizar la nasofaringe y competir en ese nicho ecolgico.

b- Toxignesis

La toxina diftrica causa la muerte de la clula eucariota y de los tejidos por inhibicin de la

sntesis de protenas. Aunque la toxina es responsable de los sntomas letales de la enfermedad, la

virulencia de C. diphtheriaeno puede ser atribuida slo a la toxigenicidad, ya que aparentemente

una fase invasiva precede a la toxignesis.

Los biotipos de Corynebacterium diphtheriae conocidos como gravis, intermedius y mitis se

diferencian en cuanto a su patogenicidad. El biotipo gravis es el ms agresivo, seguido por


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intermedius y por ltimo mitis. Todos producen la misma toxina y colonizan la nasofaringe. La

diferencia en la virulencia, entre los tres biotipos, puede explicarse por la rapidez y cantidad de la

toxina producida por cada uno de ellos y por tener diferentes velocidades de crecimiento.

Toxigenicidad

Los factores de mayor importancia en la produccin de toxina diftrica son:

Baja concentracin extracelular de hierro.

Presencia de un profago lisognico en el cromosoma bacteriano.

El gen de la toxina se encuentra en el genoma del profago, pero una protena bacteriana

represora, controla la expresin del gen. El represor es activado por el hierro y de esta forma, el

hierro tiene influencia en la produccin de la toxina. Las bacterias lisognicas sintetizan grandes

cantidades de toxina en condiciones deficientes de hierro.

Importancia del Hierro

En cultivos in vitro, el factor ms importante que controla la produccin de toxina es la

concentracin de hierro inorgnico (Fe++o Fe+++) presente en el medio de cultivo.

La toxina es sintetizada en grandes cantidades, slo despus que el aporte de hierro exgeno hasido agotado. Esto tiene importancia prctica en la produccin industrial del toxoide.

La bacteria no puede producir grandes cantidades de toxina hasta que el aporte de hierro en los

tejidos del tracto respiratorio superior no disminuya. La regulacin de la produccin de toxina es

parcialmente controlada por el hierro. El gen tox es regulado por un mecanismo de control negativo,

mediante una molcula represora, producto del genDtxR, que es activado por el hierro.

La expresin del gen toxdepende del estado fisiolgico de C. diphtheriae. Bajo condiciones en

las cuales el hierro es el sustrato limitante del crecimiento, el hierro se disocia de DtxR, el gen tox

se dereprime y la toxina diftrica es sintetizada y secretada al medio de cultivo (Esquema 1).


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toxP/O Corinebacterifago

dtxRP Corynebacteri um diphtheriae

DtxR + Fe2+ DtxR-Fe2+

Reduce Niveles

de TD

Esquema 1. Mecanismo Regulador del Hierro en la produccin de la Toxina Diftrica

TD = toxina diftrica, P = promotor, dtxR = gen regulador de TD,

DtxR = aporepresor, P/O = promotor/operador, tox= gen toxina

Importancia del fago

El fago contiene el gen estructural de la molcula de la toxina. El experimento original demostr

que la lisogenia de C. diphtheriaepor fagos beta mutados, producan una molcula no txica, pero

antignicamente similar a la toxina (llamado CMR por cross-reacting material). Las propiedades

de esta molcula, demostraron sin duda, que el gen toxse encuentra en el fago y no en el genoma

bacteriano.

Aunque el gen tox no forma parte del DNA bacteriano, la regulacin de la produccin de la

toxina, se encuentra bajo el control de la bacteria, ya que el gen regulatorio DtxRforma parte de su

genoma y la produccin de toxina depende del metabolismo bacteriano del hierro.

El gen estructural toxpara la toxina diftrica, es portado por una familia de corinebacterifagos

muy relacionados, de los cuales el fago ,es el ms estudiado.

Mecanismo de Accin de la Toxina

La toxina diftrica, una protena de 58 kD, es extraordinariamente potente, en especies sensibles

(ej: humanos, monos, conejos, cobayos). Una dosis de slo 100 a 150 ng/kg de peso corporal, es


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letal. Est compuesta por una sola cadena polipeptdica de 535 aminocidos. Los estudios genticos

y cristalogrficos por rayos X, demuestran que la toxina esta compuesta por tres dominios

estructurales y funcionales (Figura 3):

dominio cataltico (A) Tiene actividad de N-terminal ADP-ribosiltransferasa.

dominio de unin (B) de la toxina al receptor de la clula eucariota, ubicado en la

superficie celular, que permite que la toxina entre a la clula mediante un mecanismo de

endocitosis mediada por un receptor.

dominio de translocacin (T)Una regin que permite que el dominio cataltico atraviese

la membrana celular (dominio transmembrana). En el endosoma, una cada del pH de 7.0 a

5.0 produce un cambio conformacional en el dominio de translocacin (T) de la toxina, la

cual luego se inserta en la membrana endosomal y facilita la transferencia del dominio

cataltico al citoplasma.

La digestin suave de la toxina con tripsina y reduccin en condiciones desnaturalizantes, lacliva en dos fragmentos polipeptdicas (A y B). El fragmento A es el componente N-terminal de la

toxina de 21 kD y contiene el centro cataltico para la ADP-ribosilacin del factor de elongacin 2

(EF-2).

La toxina se une a un receptor especfico (conocido como receptor HB-EGF,heparin- binding

epidermal growth factor) de la clula y penetra por endocitosis. La acidificacin de la vescula

endoctica produce un cambio en la conformacin de la protena y la insercin de uno de sus

segmentos dentro de la membrana endosomal. Como resultado de la actividad sobre la membrana

del endosoma, la subunidad A, se separa de la subunidad B, mientras A se inserta y pasa a travs de

la membrana (Figura 4).

Una vez en el citoplasma, el fragmento A vuelve a tener su conformacin inicial y su actividad

enzimtica. El fragmento A cataliza la transferencia de ADP-ribosa desde el NAD al factor de

elongacin 2 (EF-2) de la clula eucariota.

Se inhibe la funcin de EF-2 en la sntesis de protenas, lo que causa la muerte de la clula. La

unin del grupo ribosil-ADP se realiza a un derivado poco frecuente de histidina llamado diftamina

(Figura 5).

La toxina diftrica nativa es inactiva y puede ser activada por tripsina en presencia de tiol. La

actividad enzimtica del fragmento A no se manifiesta en la toxina intacta. El fragmento B es

necesario para unir la toxina nativa a su receptor y permitir la salida del fragmento A del endosoma.El extremo C terminal del fragmento B, contiene una regin peptdica que se une al receptor

HB-EFG de la membrana celular y el extremo N-terminal es una regin hidrofbica que se insertar

dentro de la bicapa lipdica de membrana.

El precursor del receptor especfico de membrana EB-EFG es una protena de superficie

presente en muchas clulas. El nmero y distribucin de receptores HB-EGF, determina la

susceptibilidad de una especie animal y de algunos tejidos a la toxina diftrica.

Normalmente, el precursor HB-EGF libera una hormona peptdica que tiene actividad sobre el

crecimiento normal y la diferenciacin celular.


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Una de las hiptesis, es que el receptor HB-EGF, es una proteasa que cliva el fragmento A del

fragmento B y reduce los puentes disulfuro entre ambos, en el momento en que el fragmento A sale

a travs de la membrana endosomal al citoplasma.

Tratamiento

Los pacientes con evidencia clnica de difteria debern ser aislados

y tratados antes que el laboratorio confirme el diagnstico

Administrar rpidamente la antitoxina en los casos severos, debido a las complicaciones (ej:

miocarditis, neuritis), las que estn directamente relacionadas con el tiempo de demora en la

administracin de la misma.

La antitoxina diftrica es un antisuero hiperinmune de caballo que neutraliza la toxina antes

que penetre a la clula, lo cual es importante en la prevencin de las secuelas de la difteria.

Aplicar por va intramuscular una sola dosis de 20.000 a 100.000 unidades, segn la

duracin de los sntomas, la zona de afeccin y la gravedad de la enfermedad.

El tratamiento antibitico erradica al microorganismo y limita la produccin de la toxina.Sin embargo, el antibitico no es sustituido por la antitoxina. Se recomienda en general

penicilina o eritromicina. Ambas drogas son igualmente efectivas en resolver la fiebre y los

sntomas locales, sin embargo, la eritromicina ha demostrado ser superior en la erradicacin

del estado de portacin. Deber administrarse tratamiento antibitico tanto en enfermos

como en contactos ntimos con sintomatologa. Antes deben tomarse las muestras para

cultivo. Se recomienda aplicar:

Eritromicina endovenosa (40 a 50 mg/Kg/da, mximo 2 g /da) hasta que el paciente

pueda deglutir. Luego, pasar a un rgimen de igual dosis de eritromicina oral,

dividida en cuatro tomas diarias o penicilina V, 125-250 mg 4 veces por da, durante

un perodo de 14 das.

Penicilina G sdica intramuscular (100.000 a 150.000 U/Kg/da dividida en 4 dosis

durante 14 das.

Se define como contactos ntimos, a los individuos que duermen en la misma casa o

comparten alimentos, bebidas o utensilios de comida con el enfermo, as como al personal

de salud expuesto a las secreciones respiratorias del paciente.


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Los enfermos debern permanecer en estricto aislamiento a pesar de la terapia y andespus de la misma.

Si la laringe est comprometida se requerir la entubacin, a fin de facilitar laremocin de la membrana traqueobronquial. Se recomienda el monitoreo cardaco

para la deteccin de posibles arritmias. Debern tener dos cultivos negativos

consecutivos, con un intervalo de 24 horas entre los mismos, a fin de documentar la

erradicacin del microorganismo. Los materiales para estos cultivos, sern tomados

por lo menos 2 semanas despus de concluda la terapia antimicrobiana.

En el caso de los contactos ntimos con sintomatologa, se realizar: 1) toma de muestra

para cultivo, 2) tratamiento antibitico, 3) evaluacin para iniciar la terapia con antitoxina

diftrica. En el caso que los cultivos fueran positivos, se repetir dos veces ms el cultivo

nasofarngeo, dos semanas despus de terminado el tratamiento antibitico. Las muestrassern tomadas con un intervalo de 24 hs:

Si los cultivos son negativos el contacto ser considerado libre de la infeccin.

Si alguno de los cultivos resultara positivo, se le administrar eritromicina oral

durante 10 das ms y se repetirn los cultivos.

Los casos y contactos con sintomatologa que no tuvieran la vacunacin al da, debern

comenzar o completar un plan de inmunizacin activa con toxoide diftrico, de acuerdo a la

edad, durante la convalecencia.

Con los contactos ntimos asintomticosse deber:

Tomar hisopados nasofarngeos

Controlar la aparicin de sntomas, por lo menos durante 7 das despus de la ltima

exposicin.

Todos los contactos ntimos recibirn tratamiento antibitico independientemente

del resultado del cultivo y del estado de inmunizacin.

Vacunacin de bloqueo de todos los contactos sin importar antecedentes de

vacunacin.

Los contactos ntimos adultos, cuya ocupacin incluya la manipulacin de alimentos o la

relacin ntima con nios no inmunizados, debern ser eximidos de sus funciones hasta

que los exmenes bacteriolgicos corroboren que ya no son portadores.

Los portadores asintomticoscon cultivo positivo de C.diphtheriaeno deben notificarse

como casos sospechosos o confirmados de difteria. Se deber:

Vacunar si no tuvieran esquema completo de vacunacin o hayan recibido la ltima

dosis hace ms de un ao.


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Inmunizacin y Prevencin

La prevencin se logra a travs de la vacunacin con el toxoide diftrico inactivo (toxina

diftrica tratada con formaldehdo). El esquema es el siguiente:

Esquema de Vacunacin

EdadCudruple Bacteriana

(DPT+HIb)

Triple Bacteriana

DPT

Doble AdultosdTa

Recin nacido - - -

2 meses 1ra. Dosis - -4 meses 2da. Dosis - -

6 meses 3ra. Dosis - -

12 meses - - -

18 meses 4ta. Dosis - -

6 aos - Refuerzo -

16 aos - - Refuerzo

Cada 10 aos - - Refuerzo

Referencias:

DPT + Hib= Difteria Ttanos Coqueluche + Haemophilus influenzae tipo b

DPT= Difteria Ttanos Coqueluche

dTa= Difteria - Ttanos

Embarazadas: Se indica dTa como esquema bsico a partir del segundo trimestre de embarazo


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Figura 1. Faringitis por Corynebacteri um diphtheriae.Obsrvese la pseudomembrana adherente, blanca griscea,

asimtrica, con inflamacin a su alrededor. Puede ocupar

amgdalas, pilares y pared posterior de la faringe

Fuente:www.vet.uga.edu/erc/WEBFILES/sgrposrdBAILEY AND SCOTT'S DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY, 9

thedition. E.J. Baron, L.R. Peterson, and S.M. Finegold,

editors, Moseby-Year Book, Inc., 1994.

Figura 2. Lesin cutnea de difteria localizada en la pierna


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http://www.vet.uga.edu/erc/WEBFILES/sgrposrdhttp://www.vet.uga.edu/erc/WEBFILES/sgrposrdhttp://www.vet.uga.edu/erc/WEBFILES/sgrposrdhttp://www.vet.uga.edu/erc/WEBFILES/sgrposrd


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Fuente:http://phil.cdc.gov/phil/results.asp

Figura 3. Monmero de la Toxina Diftrica.

A (rojo) es el dominio cataltico; B (amarillo) es el dominio de unin al receptor

de la celula; T (azul) es el dominio hidrofbico que se inserta en la membrana

del endosoma para la liberacin de A dentro del citoplasma

Fuente:Todar's Online Textbook of BacteriologyKenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.


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Figura 4. Actividad de la Toxina Diftrica en Clulas Eucariotas.

A representa A/B de la toxina del dominio A (cataltico). B es el

dominio B (receptor). T es el dominio T (hidrobofbico)

que est inserto dentro de la membrana celular


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Fuente:Todar's Online Textbook of Bacteriology

Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.

Figura 5. Mecanismo de Accin del Fragmento A de la Toxina Diftrica

en la Sntesis de Protenas


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Fuente: Adaptado de Enfermedades Infecciosas: Pri ncipios y Prctica, Mandell/Douglas/Bennett. EditorialMdica Panamericana, 2000.


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TOMA DE MUESTRAS, MEDIOS DE CULTIVO, IDENTIFICACION

TOMA DE MUESTRAS

Tipo de Muestras

Para el diagnstico etiolgico de la enfermedad respiratoria se requieren muestras dehisopados de fauces y nasofarngeos y/o trozos de membrana.

Si se sospecha difteria cutnea las muestras deben ser de piel, garganta y nasofarngea.

Toma de Muestras

Los hisopos utilizados para la toma de muestras son los habituales: hisopos estriles con punta

de algodn, dacrn o alginato de calcio.

La toma de muestras debe realizarse previo al tratamiento antibitico

a- Hisopado de Fauces

La faringe debe estar claramente visible y bien iluminada.

Deprimir la base de la lengua con baja lengua e hisopar la garganta, sin tocar saliva ni

mucosas laterales.

Frotar vigorosamente cualquier membrana, o rea inflamada, presionando ligeramente con

el hisopo y ejerciendo un movimiento de rotacin.

Si existe alguna membrana, levantar el borde e hisopar por debajo de la misma, para

acceder a los microorganismos diftricos localizados ms profundamente. Es

recomendable, adems, enviar un trozo de membrana.

Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la

coloracin de Gram y la coloracin de azul de metileno de Leffler.


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Remitir la muestra al laboratorio junto con los portaobjetos.

b- Hisopado Nasofarngeo

Insertar el hisopo flexible de alambre de cromo o acero inoxidable en la nariz, a travs del

orificio nasal, ms all de la parte anterior de la narina.

Introducir suavemente el hisopo en la nariz hasta encontrar resistencia a nivel de los

cornetes (no debe utilizarse la fuerza para salvar algn tipo de obstruccin).

Rotar el hisopo sobre la mucosa nasal.

Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la

coloracin de Gram y la coloracin de azul de metileno de Leffler.

c- Muestra Cutnea

Limpiar con solucin salina estril y remover el material adherido a la lesin.

Presionar el hisopo firmemente dentro de la misma.

Nota: Introducir el hisopo con la muestra dentro de un tubo con medio de Amies,aproximadamente, a un tercio del fondo. Cortar el sobrante del palillo del hisopo y cerrar la tapa

a rosca, empujando el hisopo hacia el fondo del tubo. Mantener a temperatura ambiente durante

el transporte.

TRANSPORTE DE MUESTRAS

Enviar el hisopo y/o la muestra de membrana en medio Amies con carbn activado;

especialmente cuando los cultivos no se realizan en el mismo lugar donde se efectu la

toma del material.

Como alternativa, puede colocarse el hisopo en un tubo estril conteniendo cristales de

slica gel en el fondo y tapa a rosca, para evitar la desecacin.

El envo se realiza a temperatura ambiente, cualquiera sea el sistema de transporte

utilizado.

El tiempo para el transporte en medio de Amies no debe exceder las 24 horas. En slica gel,

el tiempo de transporte puede ser mayor de 24 horas, si bien, siempre es aconsejable el

rpido procesamiento de la muestra.


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PROCESAMIENTO DE LA MEMBRANA

Utilizar uno de los siguientes mtodos:

a- Homogeneizacin con Bistur Estril

Fragmentar el trozo de membrana en una placa de petri, con bistur estril, hasta que su

consistencia sea homognea. Se puede utilizar un pequeo volumen de caldo nutritivo

para suspender el material y mantenerlo hmedo.

Tomar la muestra disgregada y sembrar con pipeta Pasteur estril.

b- Homogeneizacin con Mortero

Colocar una pequea cantidad de arena estril en el mortero. (La arena ayuda a la

maceracin del material).

Agregar 1 a 2 ml de caldo nutritivo y una porcin de la membrana.

Disgregar la muestra realizando un movimiento circular con el piln.

Retirar el material del mortero utilizando una pipeta Pasteur.

Colocar en tubo estril y centrifugar durante 1 minuto a 2500-3000 rpm para separar el

homogeneizado de la arena.

Retirar el sobrenadante con pipeta Pasteur y proceder al cultivo.

MEDIOS DE CULTIVO

Siembra de hisopados y homogeneizados de membrana. Medios utilizados

Medio Agar Sangre Cistina Telurito (ASCT).

Medio Leffler (ML). Se aconseja para la observacin de la morfologa bacteriana.

Agar Sangre (AS).

Caldo Todd Hewitt (CTH) con 3 % de sangre.

SIEMBRA DE LA MUESTRA

En lo posible, las muestras clnicas deben ser sembradas sin demora


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Si el hisopo farngeo o nasofarngeo se encuentra deshidratado o es recibido en slica gel,

colocarlo en un caldo Todd Hewitt con 3% de sangre estril. Incubar durante 18 hs y

resembrar en un medio ASCT.

Si el hisopo fue enviado en el medio de transporte de Amies y/o si se dispone del

homogeneizado de membrana, realizar la siembra en los medios ASCT, AS.

Incubar los cultivos a 37 C en aerobiosis. Examinar las placas de ASCT y AS a las 18 h, 24 h y 48 hs C. diphteriaedesarrolla colonias

negras en el medio de cultivo ASCT.

Sembrar caldo nitrato, medio urea y realizar la prueba de la pirazinamidasa a partir de lascolonias negras con morfologa y microscopa compatibles con C. diphtheriaey sembrar de

las mismas colonias AS, para realizar la identificacin bioqumica de las mismas.

Algoritmo para el Diagnstico de Laboratorio de Difteria

Diferenciacin Diagnstico de casos,

contactos y portadores

Agar telurito, agar sangre

18 a 48 hs Agar telurito, agar sangre

18 a 48 hs

Colonias negras

Bacilos Gram positivos

Catalasa positiva

Nitrato24-48 hs

Pirazinamidasa4 hs

Urea24 hs

Pirazinamidasa

4 hs

Biotipificacin

24 hs

Laboratorio Referencia

Prueba de Elek

24 hs 48 hs

PCR: 6 hs

Cistinasa

24 hs

Agar sangre(cultivo puro)

Laboratorio

de

Referencia

Muestra Clnica


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CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS

Examen Microscpico

a- Coloracin de Gram

Bacilos pleomrficos gram positivos, dispuestos en forma de letras chinas y en empalizada,

posibles formas cocobacilares, ms predominantes en cultivos viejos. Los frotis directos de garganta

muestran mucho menos pleomorfismo; los microorganismos son generalmente ms cortos y se

tien ms uniformemente que los cultivados (Figura 6).

No debe realizarse el diagnstico presuntivo de difteria nicamente por el examen directo,

ya que la microscopa puede dar resultados falsos positivos o falsos negativos

b- Coloracin de Azul de Metileno de Leffler

Bacilos rectos o levemente curvos, frecuentemente, se deforman en forma de clavas en uno o

ambos extremos y no se tien con uniformidad sino que muestran grnulos (metacromticos color

rojo prpura) o barras que se colorean ms profundamente. Pueden mostrar diversas formas: en

clava, granular, en barra, en cua y de coloracin intensa.

La coloracin de Leffler no es especfica para C. diphtheriae


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CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS Y PRUEBAS DE IDENTIFICACION

Aspecto de las Colonias

a- Medio Agar Sangre Cistina Telurito

Corynebacterium diphtheriaereduce el telurito del medio a telurito metlico, el cual precipita y

produce el desarrollo de colonias negras, gris acero, de 1 a 3 mm de dimetro (Figura 7). El aspecto

de las colonias es orientador de los posibles biotipos.

C. diphtheriaevar.intermedius: colonias negras planas y pequeas.

C. diphtheriae var. mitis y C. diphtheriae var. gravis : colonias negras, ms grandes,

convexas, lisas y brillantes.

b- Medio de Leffler

Luego de 24 horas de incubacin a 37 C, las colonias tienen alrededor de 1mm de dimetro y

son circulares, de superficie lisa y borde entero. Son cremosas, fcilmente emulsionables en agua o

solucin fisiolgica y convexas, con centro ligeramente elevado. Despus de 48-72 hs. de

incubacin, las colonias se agrandan, el centro se hace ms elevado y la periferia sigue siendo plana

y ms transparente que el centro.

El ML no es selectivo para C. diphtheriae, pueden desarrollar otros microorganismos,

por lo cual no es recomendado como medio de aislamiento primario

c- Medio Agar Sangre

C. diphtheriae var. intermedius: ms pequeas, planas, cremosas, transparentes, nohemolticas.

C. diphtheriae var. mitis y C. diphtheriae var. gravis: ms grandes, convexas, dbil beta

hemlisis.

d- Medio Agar Tinsdale

Este medio de cultivo se utiliza para la deteccin de la enzima cistinasa y es de utilidad para la

identificacin presuntiva de C. diphtheriae.


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El medio agar Tinsdale contiene telurito y cistina. La cistinasa produce sulfuro de hidrgenoa

partir de la cistina, el cual reacciona con el teluritoformando un halo marrn difusoalrededor

de una colonia negra, luego de incubar a 37 C durante 24-48 hs. Otras especies de corinebacterias

pueden dar colonias negras, pero sin la formacin del halo marrn (Figuras 8A y 8B).

Reaccin positiva: colonias negras con halo marrn.

C. diphtheriae

C. pseudotuberculosis

C. ulcerans

Reaccin negativa: ausencia de halo marrn.

Otras corinebacterias

Nota:No se recomienda el medio de Tinsdale para el cultivo primario, dado que es muy selectivo

y por lo tanto puede dar resultados falsos negativos, especialmente en muestras clnicas que

tengan un bajo nmero de microorganismos.

e- Produccin de Pirazinamidasa

Esta enzima hidroliza la pirazinamida dando cido pirazinoico. El cido reacciona con el sulfato

amnico ferroso dando un compuesto rojo naranja.

Reaccin positiva: rosa/naranja.

Otras corinebacterias

Reaccin negativa: incoloro o amarillo plido.

C. diphtheriae


C. ulcerans

Las pruebas de pirazinamidasa y cistinasa son tiles para diferenciar las especies

potencialmente toxignicas de otras corinebacterias

f- Produccin de Ureasa


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La urea es una diamina del cido carbnico que puede ser hidrolizada por la enzima ureasa

existente en algunos grupos bacterianos, con liberacin de amoniaco y dixido de carbono. El

amonaco en solucin pasa a formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin del

medio y por lo tanto un cambio de color debido al indicador de rojo de fenol.El caldo urea y el agar urea de Christensen, son los dos medios ms comnmente utilizados en los

laboratorios clnicos para la determinacin de la actividad de la ureasa.

Reaccin positiva: rosado intenso.

C. ulcerans


Reaccin negativa: amarillo.

C.diphtheriae

Nota:Tambin se pueden utilizar discos de urea comerciales para la determinacin de la hidrlisis

enzimtica de urea.

g- Reduccin de Nitrato

Estas pruebas tienen por objeto analizar la capacidad de las diferentes especies de reducir los

nitratos a nitritos, los cuales se detectan mediante la reaccin con cido sulfanlico ydimetilnaftilamina.

Reaccin positiva: rojo.

Reaccin negativa: incoloro.

h- Fermentacin de Carbohidratos

Para la determinacin de la fermentacin de carbohidratos se utiliza un caldo enriquecido con

suero de caballo y el agregado del indicador de Andrade. La concentracin de hidratos de carbonoes de 0.5% al 1%. Los azcares utilizados son glucosa, maltosa, sacarosa y almidn (Tabla 1).

Reaccin positiva: rosado.

Reaccin negativa: amarillo.

Tabla 1. Identificacin bioqumica de los biotipos de C. diphtheriae y su diferenciacin con

corinebacterias relacionadas


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Especies CYS PYZ Nitrato Urea Glu Mal Sac Alm

C. diphtheriae

var.gravis + - + - + + - +

var. mitis + - + - + + - -

var. intermedius + - + - + + - -

var. belfanti + - - - + + - -

C. ulcerans + - - + + + - +

C. pseudotuberculosis + - - + + + - -

C. amycolatum - + V V + V V -

C. imitans - + - - + + + -

C. pseudodiphtheriticum - V + + - - - -C. striatum - + + - + - V -

Referencias: Glu = Glucosa; Mal = Maltosa; Sac = Sacarosa; Alm = Almidn; + = Reaccin dbil; V = Reaccin variable;

CYS = Produccin de cistinasa en el medio de Tinsdale; PYZ = Actividad de pirazinamidasa

i- Prueba de Toxigenicidad: Mtodo de Inmunoprecipitacin de Elek

La confirmacin de la patogenicidad de una cepa de C. diphtheriaerequiere la demostracin de

su capacidad para producir toxina.

La prueba de inmunoprecipitacin de Elek, es el mtodo ms utilizado.El medio base empleado para la prueba de Elek fue modificado en 1992, para mejorar la

sensibilidad, dado que se increment la claridad y visualizacin de las lneas dbiles de

precipitacin, para una correcta interpretacin del resultado.

En el agar se deben observar lneas blancas de precipitacin, que aparecen aproximadamente a

10 mm del borde de la tira de papel de filtro, formando un ngulo de 45, respecto de la lnea de

crecimiento. Estas bandas indican que la toxina producida, por el aislamiento en estudio, ha

reaccionado con la antitoxina homloga (Figura 9).

La aparicin de lneas de precipitacin, en forma de arco entre el control positivo y la cepa cuya

toxicidad se est probando, indican que sta es productora de toxina. Las cepas no toxignicas no

forman lneas de precipitacin.

Despus de 48 horas de incubacin, pueden aparecer lneas de precipitacin inespecficas,debido a otros antgenos solubles que pueden ser producidos por cepas toxignicas y no toxignicas,

por lo cual laplaca no debe incubarse ms de 48 horas.

j- Otros Mtodos empleados para Determinar la Produccin de Toxina

Los metdos que se utilizan para la deteccin de cepas toxignicas son: western blotting, dot

blotting y ELISA. Sin embargo, estos mtodos aunque sensibles, son laboriosos e insumen mucho

tiempo, por lo que no son recomendados para la rutina.


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Prueba de Deteccin de Toxina in vivoLa prueba consiste en inocular conejos o cobayos por va subcutnea con una suspensin

bacteriana. Los animales son previamente protegidos con 200 unidades de antitoxina diftricaDebido a la demora de los resultados, la limitacin de trabajar con animales y la naturaleza

compleja de la prueba in vivo, ya no se la utiliza.

Prueba de Deteccin de Toxina in vitro

En esta prueba se observa el efecto de la toxina diftrica en cultivos de clulas Vero

(citotoxicidad).

Deteccin del Gen de la Toxina Diftrica mediante la Tcnica de PCRLos mtodos genotpicos basados en la tcnica de PCR, ofrecen ventajas sobre las pruebas

fenotpicas habituales.

La PCR es rpida, simple, fcil de interpretar y muchos laboratorios en el mundo ya la utilizan.

Se han descrito primers especficos para amplificar diferentes regiones del gen y su utilizacin

ha resultado exitosa.

La secuencia de los primers descriptos para la amplificacin de un fragmento interno del gen

de la toxina de 248 bp es la siguiente (Pallen et al, 1994):

5 ATC CAC TTT TAG TGC GAG AAC CTT CGT CA-35 GAA AAC TTT TCT TGC TAC CAC GGG ACT AA-3

La tcnica utiliza como templado DNA, obtenido por calentamiento de una suspensin

bacteriana en bao de agua a 100 C. Se obtienen resultados en el trmino de 6 hs.

Sin embargo, este mtodo no demuestra si el microorganismo puede expresar la toxina diftrica

funcional. La PCR debe ser utilizada con cuidado, porque un bajo porcentaje de aislamientos de C.

diphtheriae (alrededor de un 3%) poseen el gen , pero no expresan la toxina.

Se recomienda el uso de la PCR en forma conjunta con la prueba fenotpica de Elek.


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Fuente:Adaptado de www.endeavor.med.nyu.edu/courses/microbiology/courseware/infect-disease/GPB3

Figura 9. Test de Inmonoprecipitacin de Elek.

Corynebacteri um diphtheriae: reaccin positiva,

obsrvese las lneas de precipitacin de identidad

entre las toxina y antitoxina diftricas

Fuente:Adaptado de www.medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/corydiap


29
http://www.medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/corydiaphttp://www.medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/corydiap


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BIOSEGURIDAD

a- Recomendaciones Generales para el Envo de Muestras

El laboratorio de microbiologa debe asegurar un transporte adecuado de las sustancias

infecciosas y especmenes para diagnstico. El correcto acondicionamiento de los materiales

infecciosos enviados generan menores riesgos de exposicin accidental tanto para el personal del

laboratorio como para todo el que entra en contacto con el envo. Por otra parte, se asegura que las

muestras lleguen en condiciones adecuadas lo que redundar en la calidad del estudio que se realice.

El acondicionamiento seguro de muestras para el diagnstico bacteriolgico es responsabilidadde todos los involucrados en el proceso: el profesional, el tcnico de laboratorio y el personal de

correos. El embalaje de materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o mal

empaque del envo.

Los aislamientos presuntivos de C. diphtheriae, as como las muestras clnicas deben ser

enviados en medio de transporte y acondicionadas en un sistema triple bsico de embalaje de

acuerdo a las recomendaciones de la Organizacin Mundial de la Salud, 1999 (Guidelines forthe

Safe Transport of Infectious Substances and Diagnosctic Specimens, WHO, Geneva, 1999).

Recipiente primario, a prueba de agua, bien cerrado, en el cual se coloca la muestra.

Recipiente secundario, a prueba de agua, resistente.

Recipiente terciario o envoltorio externo, es para proteger el envase secundario deinfluencias externas, como dao fsico o agua.

Para armar un sistema de envo se pueden utilizar los envases de toma de muestra, de reactivos

de laboratorio o de alimentos que sean de material resistente.

La parte externa del recipiente primario debe ser cuidadosamente examinada y debe limpiarse

en caso que haya sangre, materia fecal u otros contaminantes, antes de embalarlo para su envo.

El espacio entre los recipientes primario y secundario debe llenarse con material absorbentesuficiente, para absorber el contenido del recipiente primario, en caso que ocurra una prdida

durante el transporte.

Los formularios con datos del especimen, notas y otro tipo de informacin que identifiquen o

describan la muestra y tambin identifiquen al remitente y al destinatario, deben ser pegados con

cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario.

Es aconsejable una buena coordinacin entre quien enva y quien recibe de manera que la

muestra llegue a tiempo y en buenas condiciones; para esto es conveniente realizar arreglos con el

destinatario, previos al envo, para asegurarse que las muestras sean aceptadas y conservadas

convenientemente.


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Finalmente se debe enfatizar la necesidad de una correcta rotulacin del envo con la mayor

cantidad de datos posibles.

b- Recomendaciones especficas para el Manejo de Muestras Clnicas y Aislamientos

de C. diphtheriae

Han sido publicado informes de infecciones por C. diphtheriae adquiridas porel personal de

laboratorio, que contrajo la enfermedad accidentalmente por manipuleo incorrecto de materiales

clnicos y/o aislamientos de dicho microorganismo.

El accidente laboral puede ocurrir por: inhalacin de aerosoles, inoculacin accidental o

ingestin del microorganismo, a travs de la exposicin con exudados, secreciones nasofarngeas,

heridas, sangre, piel del paciente y/o cultivos del patgeno.

Las prcticas de laboratorio para la manipulacin de materiales clnicos y cultivos deCorynebacterium diphtheriae son las recomendadas para un Nivel de Bioseguridad 2 y deben ser

realizadas en cabina de seguridad biolgica Clase 1.

Debe recordarse que los controles positivos utilizados para la prueba de Elek (NCTC 10648,

control positivo fuerte) y (NCTC 3984, control positivo dbil) son toxignicas y pueden causar

infeccin. Las normas internacionales recomiendan:

Todo el personal de laboratorio que, por su trabajo,

Pueda estar expuesto a la Difteria deber vacunarse.

Debe tener un mnimo de proteccin de 0.01 UI/ml

Importante: El personal de laboratorio que manipula aislamientos toxignicos con

regularidad, debe tener un nivel mayor de 0.1 UI/ml.

A pesar que el riesgo de contraer difteria en el laboratorio es bajo, el refuerzo con la vacuna

difteria-ttanos dTacada 10 aos, reduce el peligro de exposicin del personal de laboratorio.

c- Envo de los Aislamientos Sospechosos de Corynebacterium diphtheriae

Cuando se aisle una cepa con caractersticas morfolgicas y/o bioqumicas compatibles con

Corynebacterium diphtheriae, remitirlas al Laboratorio de Referencia del Instituto Nacional de

Enfermedades Infecciosas ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn a fin de completar la caracterizacin

bioqumica y realizar la prueba de toxigenicidad del aislamiento.


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Remitir el cultivo en medio de Amies con carbn activado y un extendido del mismo,coloreado con algunas de las dos tcnicas indicadas. Adjuntar Fichacon datos completos

del paciente, resea de la historia clnica, determinaciones de laboratorio realizadas y,

datos de la institucin (denominacin, direccin, N de TE/FAX) y del profesional

(nombre, apellido y correo electrnico) al cual debe remitirse el resultado.

Datos del Laboratorio de Referencia para el envo de la Encomienda:

Servicio Bacteriologa Clnica

Departamento Bacteriologa

INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

Av. Velez Sarsfield 563

CP 1282 AFF C.A.B.A.

Datos del Laboratorio de Referencia para comunicarse por telfono, FAX o correo

electrnico:

TEL/FAX: 54(11)4301 - 9346

e-mail: [email protected]
mailto:[email protected]:[email protected]


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ANEXO

Preparacin de Colorantes, Medios de Transporte y Cultivo

1- Coloracin de Gram

Colorantes habitualmente utilizados en el laboratorio de bacteriologa.

Advertencia: Se recomienda decolorar con alcohol. La decoloracin con alcohol acetona

puede desvirtuar la observacin microscpica, ya que son bacilos gram positivos lbiles.

2- Coloracin de Azul de Metileno Leffler

Reactivo

Azul de Metileno 1 g

Etanol 96% 10 ml

Mezclar y mantener durante 7 das a 37 C.

Preparar una solucin acuosa al 10% a partir de la solucin anterior y agregar 10 ml deuna solucin acuosa 0.1% de KOH.

Incubar a 37 C durante una semana y filtrar.

Coloracin

Los extendidos son fijados por calor y coloreados durante 10 min con la solucin.

Lavar con agua corriente.


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3- Medio de Transporte Amies

Medio de Transporte Amies

Cloruro de Sodio 3 g

Cloruro de Potasio 0.2 g

Fosfato Disdico 1.15 g

Tioglicolato de Sodio 1 g

Cloruro de Calcio 0.1 g

Cloruro de Magnesio 0.1 gAgar 4 g

Agua Destilada o

Desionizada1000 ml

pH final 7.2 0.2

Preparacin del medio a partir de los componentes

Disolver el agar en agua, calentando hasta disolucin. Agregar los dems componentesmientras la solucin se encuentra caliente, a una temperatura inferior a la de ebullicin.

Agitar hasta disolucin completa y agregar 10 g de carbn activado.

Agitar suavemente y autoclavar a 121 C durante 15 minutos.

Una vez retirado del autoclave, fraccionar en caliente de a 7ml, en tubos plsticos estriles

con tapa a rosca.

Conservacin

En tubo cerrado a 15-20 C en la oscuridad, hasta 6 meses.

Medios de cultivo y transporte comerciales

Medio deshidratado Marca Difco cat. 0996-17-7.

Hisopos comerciales con medio de transporte Amies y carbn activado.

1. Marca COPAN cat. 114 C.2. Marca Difco cat. 9345-26-5.


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4- Medio Leffler ML

Medio Leffler ML

Caldo Peptonado 100 ml

Suero Normal Equino

estril300 ml

Glucosa 2 g

Preparacin

Adicionar 2 g de glucosa a 100ml de caldo nutritivo y calentar hasta disolucin.

Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

Enfriar a 56 C.

Aspticamente, agregar 300ml de suero equino estril. Mezclar.

Fraccionar de a 6ml en tubo de vidrio estril de 16x150mm.

Utilizar coagulador o de lo contrario realizar la coagulacin a bao mara.

Colocar los tubos en posicin inclinada y con la tapa semicerrada sobre dos soportes

metlicos colocados sobre un recipiente con agua en ebullicin, cuidando que los tubos

estn en contacto con el vapor durante unos minutos. El medio debe tornarse color blancoamarillento.

Retirar del bao una vez alcanzado este color, ajustar la tapa y dejar enfriar sobre la

mesada en forma inclinada hasta que termine el proceso de coagulacin.

Conservacin

Hasta 6 meses a 4 C.

5- Medio Agar Sangre Cistina Telurito ASCT

Medio Agar Sangre Cistina Telurito

Agar Infusin Corazn 2% 100 ml

Sangre Equina estril 5 ml

Solucin de Telurito de Potasio 0.3% 15 ml

L-cistina polvo estril 5 mg

Preparacin


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Preparar una suspensin turbia equivalente a un McFarland 8 de la cepa en estudio en lasolucin de pirazinamida. De la misma manera, preparar en otros dos tubos suspensiones

de una cepa control positivo y de una cepa control negativo.

Incubar a 37 C durante 4 horas o durante toda la noche.Agregar 1 gota del reactivo revelador a cada suspensin.

Interpretacin

La reaccin positiva se evidencia por la aparicin de un color rojo anaranjado.

7- Medio Agar Tinsdale

Medio Agar Tinsdale

Proteosa N 3 20 g

Cloruro de Sodio 5 g

Agar deshidratado 14 g

Agua destilada 1000 ml

Preparacin

Disolver los componentes y ajustar el pH a 7.4

Autoclavar a 121 C durante 15 min.

Enfriar a 55 C y agregar aspticamente las siguientes soluciones estriles

Medio Agar Tinsdale

NaOH 0.1N 60.0 ml

Solucin de L-Cistina 0.4% * 60.0 ml

Sol. aq. Telurito de Potasio 1% 30.0 ml

Sol. de Tiosulfato de Sodio 17.0 ml

Suero Bovino estril 100 a 150 ml


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* Sol. de L-Cistina: 0.24 g de L-Cistina disuelta en 60ml de HCl 0.1 N a 60-70 C.

Sol. de Tiosulfato: 2.5 g de Tiosulfato de Sodio disueltos en 100ml de agua destilada a 60 C.

Verter el medio en placa de petri y conservar a 4 C por no ms de 4 das.

Controlar cada lote con la cepa de referencia y observar la formacin de colonias negras

con halo difuso.

8- Prueba de Ureasa

a- Urea de Christensen

Urea de Christensen

Agar Base Urea Difco 2.9 g

Agua Destilada 10 ml

Preparacin

Disolver el medio base en agua destilada. No hervir o autoclavar.

Esterilizar por filtracin.

Suspender 1,5 g de Bacto Agar en 90 ml de agua destilada y hervir hasta disolucin total.Esterilizar a 121 C durante 15 min.

Enfriar a 50-55 C.

Agregar en forma estril el Agar Base Urea. Mezclar bien. No calentar el medio completo.

Fraccionar 3ml por tubo y dejar enfriar en pico de flauta.

Procedimiento

Sembrar en la superficie del pico.

Incubar a 37 C durante 18 a 24 horas.

Lectura: La aparicin de un color rosado indica actividad de ureasa.

b- Caldo Urea

Caldo Urea

Fosfato Monopotsico 0.1 g

Fosfato Dipotsico 0.1 g

Cloruro de Sodio 0.5 g

Rojo Fenol 1/500 0.5 ml



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Sembrar el caldo con la cepa a probar e incubar a 37 C durante 24-48hs.

Revelado de la Reaccin

Aadir 0.5 ml del reactivo I y 0.5 ml del reactivo II.

Interpretacin

La reaccin positiva est determinada por la presencia de NO2,producto de la reduccin

de nitrato, que produce una reaccin color rojo vinoso, al agregar el reactivo revelador.

Interpretacin: NO3NO2

positivo.

Si la reaccin es negativa, aadir zinc en polvo y agitar. La formacin de un color rojosignifica que el zinc reduce el nitrato a nitrito y se interpreta como reduccin de nitrato,

NO3 NO2

negativo.

10- Fermentacin de Hidratos de Carbono

Medio Base

Medio Base

Peptona 0.5 g

PO4HNa 2 0.1 g

Suero Normal Equino 17.8 ml

Indicador de Andrade 0.78 mlAgua Destilada c.s.p 100 ml

PreparacinDisolver la peptona y el fosfato disdico en agua destilada. Hervir hasta disolucin. Filtrar

y enfriar.

Ajustar a pH 7.4.

Autoclavar a 121C durante 15 min. Enfriar.Agregar el suero y mezclar bien, calentando a 50 C durante 20 min.

Agregar el indicador y ajustar a pH 7.7.

Agregar 1ml de la solucin del azcar al 10%, esterilizado por filtracin, por cada 9ml de

medio base previamente esterilizado. La concentracin final de los azcares es al 1% paraglucosa, maltosa y sacarosa. La concentracin final del almidn es 0.5%.

Fraccionar 4.5 ml por tubo.

Preparacin de la solucin de AlmidnPreparar una solucin acuosa de almidn soluble, agregando 0.15 g de almidn en 5 ml de

agua destilada estril y agitando continuamente.

Hervir durante 5 minutos aproximadamente. Enfriar. Agitar a intervalos.

Adicionar 0.15 ml de esta solucin por cada 3ml de medio base estril. Fraccionar en

volmenes de 4.5 ml.


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Nota:Se debe utilizar un tubo control con caldo base sin el agregado de hidratos de carbono.

Interpretacin: Reaccin positiva:color rosado (produccin de cido).

Reaccin negativa:color amarillo (alcalinizacin).

Indicador de Andrade

Fucsina cida 2 g

H2O destilada 1000 ml

NaOH 1N 160 ml

Preparacin

Disolver la fucsina en agua destilada.

Agregar el hidrxido de sodio. Si la fucsina no est suficientemente decolorada despus de

dejar en reposo toda una noche, agregar 1 a 2 ml de hidrxido de sodio ms. La fucsina

debe tener un color ligeramente naranja o ms oscura.

Autoclavar a 121 C durante 20 min.

Nota:El indicador de Andrade debe envejecer por 6 meses antes de ser utilizado.

11- Prueba de Toxigenicidad: Mtodo de Inmunoprecipitacin de Elek

Medio Base

AProteosa peptona N 2 20 g


OHNa (40% W/V 10 N) 3.25 ml

Acido Lctico 0.7 ml

Maltosa 3 g

Preparacin

Disolver la peptona en agua.

Adicionar NaOH (40% p/v = solucin 10 N)

Mezclar y calentar a ebullicin en bao. Enfriar.Filtrar para eliminar el precipitado de los fosfatos.

Agregar solucin de cido lctico 90%.

Mezclar y agregar maltosa.

Disolver y ajustar con pHmetro. a pH 7.8 con HCl 1N o HCl 5N.

B

ClNa 5 g

Lab M agar 10 g


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Preparacin

Mezclar. Dejar hidratar y luego colocar a bao mara hasta disolver. Enfriar a 50 C y

ajustar a pH 7.8 con NaOH 1N.

Calentar Aa 50 C y luego mezclar Ay B.

Fraccionar en volmenes de 15 ml en tubos y autoclavar a 116 C por 10 minutos.

Preparacin de las Tiras de Papel de Filtro con Antitoxina

Las tiras pueden ser de papel Whatman N 1 o N 3 y el tamao es de 1.5 cm de ancho x 8

cm. de largo. Se colocan en un tubo de boca ancha y se esterilizan por calor, previo a serembebidas con la antitoxina.

Diluir la antitoxina a 500 UI/ml con agua destilada estril, de acuerdo al ttulo inicial que

tenga el suero. La antitoxina diluida es estable durante 6 meses conservada a 4 C.

Embeber la tira estril con 0.3 ml de la antitoxina diluida.

Dejar escurrir el exceso.

Conservacin

Las tiras embebidas en antitoxina y secas pueden conservarse en un tubo estril a 4 C durante 6

meses.

Realizacin de la Prueba de Elek

Fundir 15 ml de agar base Elek y transferir a un bao mara a 50 C.

Adicionar al agar base, 3 ml de suero fetal bovino suero normal equino.

Mezclar y verter en la placa. Dejar solidificar y secar en estufa a 37 C por 20-30 minutos.

La placa puede conservarse solamente 24 hs a 4 C.

La siembra debe hacerse en forma de puntos o lneas (6-7mm de dimetro). La distancia

entre cada punto o lnea debe ser 7-8 mm. La distancia entre el borde de la tira y el lugar

de siembra es de 5 mm.

En forma estril, colocar la tira con la antitoxina sobre el agar, en el centro de la placa.Incubar a 37 C durante 24-48 hs.

Lectura e Interpretacin de la Prueba

Utilizar una fuente de luz y una lupa para examinarcuidadosamente la placa, despus de

18 hs de incubacin. Observar las lneas de precipitacin de identidad entre la cepa en

estudio y las cepas control positivo fuerte y positivo dbil. El control negativo no debe

mostrarlneas de precipitacin.

Reincubar por 24 hs ms y leer nuevamente. No incubar ms de 48 hsporque pueden

observarse lneas de precipitacin inespecficas.


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diphtheriae

Cepas Patrn

Control Microorganismo

Positivo C. diphtheriae 510 NCTC 10648

Negativo C. diphtheriae 511 NCTC 10356

Positivo Dbil C. diphtheriae 512 NCTC 3984

12- Conservacin de Aislamientos a Corto y Largo plazo

Corto plazo

Cultivar los microorganismos en agar nutritivo, agar Mueller Hinton, Medio Leffler a 35-

37 C durante 18-24 hs. Conservar los cultivos a 4 C.

Subcultivar una vez por mes en placas o estras de medio de cultivo fresco.

Largo plazo

Suspender un cultivo fresco en caldo Brucela con 15% de glicerol.

Fraccionar 1 ml de la suspensin en criotubos de 1.5 ml de volumen. Conservar a -70 C.

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