Chg.-ODN 的免疫刺激作用
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Chg.-ODN 的免疫刺激作用. CPG 概念. 为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列，即 CpG 基序。 一种免疫佐剂 作用靶点 TLR9 细胞免疫，体液免疫. Th1 免疫应答. 慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下 HBV 免疫耐受，持续感染 肿瘤微小残留病的清除. CPG 提高 PBMC 中 Th1 细胞. Th1 占淋巴细胞百分比. CPG 提高 PBMC 中 Th1 、 Tc1 细胞百分率. *. *. * ： 与对照组比较， P
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Chg.-ODNChg.-ODN 的免疫刺激作用的免疫刺激作用
CPG 概念
为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列，即 CpG 基序。
一种免疫佐剂 作用靶点 TLR9 细胞免疫，体液免疫
Th1 免疫应答
慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下
HBV 免疫耐受，持续感染
肿瘤微小残留病的清除
CPG 提高 PBMC 中 Th1 细胞
Th1 占淋巴细胞百分比
CPG 提高 PBMC 中 Th1 、 Tc1 细胞百分率
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Th1 Tc1 Th2
对照 CPG-ODN
*
*
* ：与对照组比较， P<0.05
CPG 刺激 BPMC 分泌细胞因子
0
10
20
30
40
50
60
70
80
IFN-γ IL-2 I L-4 I L-10
对照组 CPG-ODN组
*
* ：与对照组比较， P<0.05
CPG 诱导 PBMC 杀伤靶细胞
1. 收集 CPG 活化的 PBMC2. 细胞毒性实验：效应细胞为 CPG 活化的 PB
MC ；靶细胞为 CFSE 预染的 K562 细胞。对照组效应细胞为未经 CPG 活化的 PBMC 。
3. 效：靶＝ 20 ： 1 ，混合培养 2h 。流式细胞术检测靶细胞死亡率。
CPG 诱导 PBMC 杀伤靶细胞
CFSE 染色靶细胞1. 浓度为 5μmol/ L 的 CFSE （ 2 羧基
荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液2. 取对数生长期的靶细胞浓度 108/ L3. 细胞悬液与等体积 CFSE 工作液混合4. 37 ℃ 孵育 10 min 。5. 离心洗涤两次后6. 悬浮细胞备用
CFSE 染色靶细胞
实验结果
CpG 活化 PBMC 对 K562 细胞的杀伤作用 (N=5)
CPG 活化 PBMC 16.85±5.14 % 对照组 8.62±2.83 %
*
* ：与对照组比较， P<0.05
CIK 细胞杀伤靶细胞
CIK 细胞杀伤靶细胞
研究背景
通过主动免疫、过继特异性免疫、过继非特异性免疫等方式，清除慢性乙肝患者体内残存的 HBV ，达到治疗效果。
研究背景
B 淋巴细胞具有抗原递呈细胞的性质，同时具有 CpG-ODN 受体： TLR-9 。本研究探讨 CpG-ODN 诱导 B 淋巴细胞成为高效 APC ，使之具有类似于树突状细胞功能的可行性。
TOLL 受体
TOLL 受体在血细胞中的表达
活化 B 细胞负载核心抗原
1. 磁珠分选 B 淋巴细胞
2. CPG 活化 B 淋巴细胞
3. 核心抗原肽 :FLPSDFFPSV-FITC
4. 流式细胞仪、荧光显微镜检测抗原负载状况
磁珠分选 B 细胞
分选前 B 细胞 7.89%
分选后 B 细胞 89.6%
活化 B 细胞负载抗原肽
Marker % Gated
All 100.00
M1 41.34
M1
活化 B 细胞负载核心抗原
荧光显微镜观察 B细胞负载 HBcAg18-27肽
APC 与 T 细胞作用机制
CPG 对 B 细胞抗原递呈相关分子的作用研究
1. CpG2006 、 2216由上海生物工程技术服务有限公司合成，全硫代化修饰
2. 对照组为含 10%FCS 的 RPMI1640＋外周血 PBMC ，细胞量 107/孔， 37℃ 、 5%CO2 、 48 小时
3. 实验组加入 CpG2006或 CpG2216 ，终浓度均为 1umol/mL ，余同上
CpG 提高淋巴细胞 CD69 表达
0
5
10
15
20
25
30
35
对照
CpG2006
Cp
G221
6
对照
CpG2
006
CpG2
216
T 淋巴细胞 B 淋巴细胞
CD69
表达率
（%
）
*
*
* ：与对照组比较， P<0.05
B 细胞 CD80 、 CD86 表达
对照组 加 CPG-ODN 组 加 CPG-ODN 组
CpG 提高 B 细胞表面 CD80 、 CD86 的表达
01020304050607080
对照
Cp2006
Cp
G221
6
对照
CpG2
006
CpG2
216
CD80 CD86
CD80
、CD86
表达率
（%
）
*
*
*
*
* ：与对照组比较， P<0.05
B 细胞 MHC-Ⅰ、 MHC-Ⅱ表达
对照组 加 CPG-ODN 组
CpG 提高 B 细胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达
0
500
1000
1500
2000
2500
对照
CpG2006
Cp
G221
6
对照
CpG2
006
CpG2
216
MHC-Ⅰ MHC-Ⅱ
MHC
表达量（M
FI
）
*** *
* ：与对照组比较， P<0.05
活化 B 细胞诱导 CTL
1. 负载了抗原的活化 B 细胞与淋巴细胞混合培养 (含 IL-2 的 RPMI1640 培养液 ).
2. 收集细胞 , 以五聚体技术检测 HBV 特异性 CTL.
3. 实验组特异性 CTL 为 0.50±0.19%，对照组为 0.20±0.10%。
特异性 CTL 诱导
Pro5TM MHC Pentamers检测对照组和实验组 HBcAg18-27 抗原特异性 CTL （ Q2-1区）。前者为对照组（未加 APC ），后者为实验组（加 APC ）。
结论1. CpG 能够活化 B 细胞，对 T 细胞无明显的作用
2. CpG 能够提高 B 细胞表面抗原递呈相关分子的表达
3. CPG 诱导 PBMC产生高水平的 IFN-γ
4. CPG 诱导淋巴细胞向 Th1 、 Tc1 分化
5. CPG增强 PBMC 对 K562 细胞的杀伤作用
6. 通过 B 细胞介导 , CPG 可诱导特异性 CTL
