孤発性筋萎縮性側索硬化症の病因に...

2015年度 IBCグラント研究奨励金報告会

孤発性筋萎縮性側索硬化症の病因に基づいた特異治療法の確立

中央大学駿河台記念館 610教室 2016年11月6日

山下雄也1、赤松恵1、寺本さやか1、村松慎一2、3 相澤仁志4 郭伸1、5

1. 東京大学大学院医学系研究科2. 自治医科大学3. 東京大学医科学研究所4. 東京医科大学5. 国際医療福祉大学臨床医学研究センター

ADAR2低下が本当に運動ニューロン死の原因？

ALSでは、AMPA受容体のサブタイプのGluA2のRNA編集↓

なぜRNA編集が低下？

ADAR2（RNA編集酵素）↓

（1999 Ann. Neurol, 2004 Nature, 2012 Neurobiol Dis）

(2010 Acta Neuropathol, 2012 Neurobiol Dis）

・ADAR2遺伝子を運動ニューロンで欠損させたマウス（AR2）を作成

ADAR2コンディショナルノックアウトマウス（AR2）

AR2 マウス

• GluA2のRNA編集↓• 運動機能↓• ADAR2欠損した運動ニューロンで変性・脱落

ADAR2低下が運動ニューロン死の原因。

孤発性ALSとADAR2活性・GluA2 RNA編集

• ADAR2↓• GluA2のRNA編集↓• TDP-43病理

ALSでは

ADAR2

pTDP-43

ALS患者脊髄運動ニューロンのTDP-43病理

ADAR2とTDP-43病理は関係がありそう！異常：TDP-43病理あり：ADAR2なし（）正常：TDP-43病理なし：ADAR2あり（）

AR2マウスを用いてADAR2とTDP-43の関係について調べた

・AR2マウスでTDP-43病理は？

ADAR2コンディショナルノックアウトマウス（AR2）

AR2 マウス

• 運動ニューロン死の速度（半年くらいで9割の細胞が死ぬ）• 運動ニューロン選択性（脊髄の運動ニューロン細胞だけが死ぬ）• TDP-43病理

WT マウス AR2 マウス孤発性 ALS

TDP-43

AR2マウスはALSにそっくり

マウス脊髄運動ニューロン

1. Ca2+ 流入2. 細胞質のカルパイン活性化3. TDP-43切断4. 断片化5. 凝集しやすい6. 塊を作る7. 封入体8. TDP-43巻き込まれる9. TDP-43病理

TDP-43

カルパイン

Ca2+

TDP-43切断（）N C

Ca2+

カルパイン

封入体核

TDP-43

TDP-43病理

TDP-43病理：ALSの病理マーカー

AR2マウスにTDP-43病理が見られるALSのモデル動物として妥当！！

カルパイン（蛋白質分解酵素）

異常なAMPA受容体（未編集GluA2）

ADAR2 発現低下

GluA2 Q/R 部位 RNA編集↓

Ca2+透過性 AMPA 受容体の発現↑

過剰Ca2+流入↑

運動ニューロン死

カルパインの活性化↑

TDP-43を切断し、易凝集性の断片↑

TDP-43病理

ADAR2 発現低下から細胞死に至るカスケード

AR2マウスの解析から分かったこと・細胞死に至るカスケード（流れ）・AR2マウスがALSの病態を反映したモデルマウス

治療ができるのでは？

ADAR2 発現低下



過剰Ca2+流入↑


ALS治療法のターゲット（標的）



TDP-43病理

我々の分子カスケードに基づく治療戦略

①低下しているADAR2発現を上げる。

②ペランパネルを用いてカルシウムイオンの流入を抑制する。（IBCグラントによるサポート）

①

②

2.アデノ随伴ウイルス（AAV）による治療法の確立①低下しているADAR2発現を上げる。

ADAR2 発現低下



過剰Ca2+流入↑




TDP-43病理


アデノ随伴ウイルス(AAV：運び屋)を用いてADAR2遺伝子の発現を上げた。

AAV9は脊髄運動ニューロンに送達された

遺伝子をのせたAAV（運び屋）をマウスに注射

脊髄の神経細胞で遺伝子が発現（緑色に光った）

成功

AR2マウスにAAV－ADAR2遺伝子を注射した。

コントロール AAV-GFP

GFP/TO-PRO-3BBB（血液脳関門）の通過は困難！

AAV9-hADAR2単回投与 AAV9-hADAR2

AAV9 AAV9

SalineSaline

AAV9-hADAR2投与による進行性の運動機能低下の阻止

AR2マウスの運動機能低下を阻止できた。

AAV-ADAR2投与AR2マウス

コントロールAR2マウス

AR2マウスへのAAV9-ADAR2投与により

•生理機能が回復•運動ニューロン死を阻止•運動ニューロンの生化学的機能回復

• ADAR2の発現量が上昇• GluA2のRNA編集の低下が回復• TDP-43病理が回復

• 孤発性ALSの分子病態モデル動物であるAR2マウスを用いて、 AAV9-hADAR2の単回血管内投与により、脊髄運動ニューロンで遺伝子を発現させることに成功し、行動・生理機能の回復、神経細胞変性・細胞死を抑制した。

まとめ

正常化 ADAR2 発現低下

GluA2 Q/R 部位のRNA編集↓

Ca2透過性 AMPA 受容体の発現↑

過剰Ca2+流入↑



TDP-43病理


3.ペランパネルによる治療法の確立②ペランパネルを用いてカルシウムイオン流入を抑制する（IBCグラントによる成果）

ADAR2 発現低下



過剰Ca2+流入↑


ALS治療法のターゲット（標的）

非競合的AMPA受容体アンタゴニスト（ペランパネル）



TDP-43病理


AAV-ADAR2の遺伝子治療

• 高選択的・非競合AMPA受容体アンタゴニスト→日本で抗てんかん薬として承認（2016年6月）

• ALS臨床試験；AMPA受容体アンタゴニスト- talampanel→phase II は良好、phaseⅢでnegative results (May 2010)

• talampanelのT1/2=3～4 hrs、perampanelのT1/2=105 hrs→perampanel は半減期が長い⇒ALS治療薬として有望

Ref. Rogawski MA, Epilepsy Curr. 2011

Perampanel(ペランパネル)

【薬剤】ペランパネル⇒経口投与 (1回／日)

【投与期間】①短期投与（14日）: 3.3, 6.6, 13.2, 20 mg/kg/day （用量の設定）②長期投与（90日）: 13.2(4日間)-20 mg/kg/day （治療効果の評価）

【評価項目】①運動機能 (ローターロッド、グリップ力)②脊髄前角細胞数③TDP-43の細胞内局在

方法

TDP-43の細胞内局在

absent

ペランパネル 14日投与

• TDP-43陽性細胞数が増加（用量依存的）• TDP-43 の局在が回復（核に染色）

ペランパネル 90日投与 (20 mg/kg/day)

効果があった

ペランパネル 90日投与 (20 mg/kg/day) ― 行動変化

ローターロッド解析グリップパワー解析

# #

0 4 8 12-4 0 4 8 12-4

AR2マウスの運動機能低下を阻止できた。

ペランパネル投与AR2マウス

コントロールAR2マウス

Perampanel 90日投与 ― TDP-43脊髄前角の大型ニューロン（AHC）内局在

脊髄のTDP-43凝集体の改善 TDP-43の運動ニューロン内局在

TD

P-4

3T

O-P

RO

-3

非投与群ペランパネル

TDP-43陽性運動ニューロン数

運動ニューロンの直径

• 脊髄運動ニューロン数の減少を阻止• 運動ニューロンのサイズ（大きさ）を回復• TDP-43病理が回復

AR2マウスへのペランパネル 90日投与 (20 mg/kg/day)

• AMPA受容体アンタゴニストペランパネルは、AR2マウスのALS症状（行動変化・前角細胞数・TDP-43の前角細胞内局在）を改善させた。

• 孤発性ALSがこのメカニズムで発症しているとすれば、有効な治療法として期待される。

まとめ

4.今後の展望臨床応用

臨床応用の準備状況とハードル

遺伝子治療ペランパネル

製剤の安全性OK認可済み（但し他疾患（てんかん））

適用拡大臨床試験安全性OK（但しALS患者での安全性）有効性の確認資金必要（億円単位）公的な承認

PMDA（医薬品医療機器総合機構）IRB（治験審査委員会）

他疾患での臨床試験承認されたもの・脂質代謝異常症に関する遺伝子治療薬・がん治療の遺伝子治療薬・下肢虚血の遺伝子治療薬

中枢神経の病気に対するものなし

前臨床試験安全性の確認製剤の製造過程での混入物

遺伝子自体有効性の確認遺伝子自体

臨床試験を行うには？資金（製造と臨床試験（十億円単位））➡莫大に必要。

製剤準備前臨床試験

資金

PMDA（医薬品医療機器総合機構）IRB（治験審査委員会）臨床試験

準備状況と時間シェーマ

遺伝子治療ペランパネル

資金不足➡（公的な競合的研究資金申請中）

（2017年前半）（2017年I/II相臨床試験開始）遺伝子治療研究所

2015年度 IBCグラント研究奨励金へのお礼

本研究をご援助頂きました日本ALS協会、

関係者の方々、ならびにご支援頂きましたALS患者の皆様、ご家族の皆様に深く感謝いたします。

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