Adresa společnosti: VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel.: 220 443 151, fax: 233 334 769, e-mail: Danka Pokorná@vscht.cz, IČO 00570397, číslo účtu: 19534-061/0100 Komerční banka Praha 6, Dejvická 52,

SWIFT CODE: COMBCZTPP

BIOP R S P E C T

Redakční rada

RNDr. Tomislav Barth, DrScÚOCHB AVČR, Flemingovo n. 2, 166 10 Praha 6(Editor)

RNDr. Milan Fránek, DrScVýzkumný ústav veterinárního lékařstvíHudcova 70, 621 32 Brno

Ing. Petra Lipovová, Ph.D.VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6(Editor)

Prof. Ing. Jan Káš, DrScVŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6

Doc. Ing. Ladislav Fukal, CScVŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6(Editor in Chief)

Ing. Pavel Ulbrich, Ph.D.VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6(Editor)

RNDr. Vladimír ValaIvax, Ostravská 29, 747 70 Opava

RNDr. Tomáš Vaněk, CScÚOCHB AVČR, Flemingovo n. 2, 166 10 Praha 6

Bc. Pavel JenčVŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6

BULLETIN

BIOTECHNOLOGICKÉ

SPOLEČNOSTI

zakládajícího člena Českého svazuvědeckotechnických společností

(ČSVTS) a

člena „European Federation of Biotechnology“ (EFB)

Šestnáctý ročníkČíslo 3 – 4/2006

http://bts.vscht.cz

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:41 Str. 2

Society address: ICT, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel.: 420-220 443 151, fax: 420-233 334 769, e-mail: danka.pokorna@vscht.cz, IČO 00570397, account No.: 19534-061/0100 Komerční banka Praha 6, Dejvická 52,

SWIFT CODE: COMBCZTPP

BIOP R S P E C T

research and practice in our biotechnology. The Bulletin should facilitate the exchange andtargeted delivery of information. In each issuethere will be advertisements of products suchas chemicals, diagnostics, equipment andapparatus, which have already appeared on theCzech and Slovak market, or are projectedenter it. Services, free R&D or productionfacilities can also be advertised. The editorialboard, together with the executive commiteeof the Biotechnology Society, hope that maybesome information published in the Bulletin, or some new contacts based on it, will givebirth to new cooperations with domestic or foreign research teams, to collaborations,joint ventures or strategic alliances providingaccess to expertise and financing in interna-tional markets.

The editorial board invites all of You, whoare involved in the field called biotechnology,and who are seeking contacts in Czech andSlovak Republic, to advertise in the BulletinBIOPROSPECT, which is mailed directly to more than one and a half thousand Czechand Slovak biotechnologists.

For more information contact the editorialboard or directly:Ladislav Fukal, Ph.D. (editor in chief)ICT, Technická 3166 10 Prague 6, Czech RepublicPhone +420 220 445 137e-mail: fukall@vscht.cz

BULLETIN OF CZECHBIOTECHNOLOGY

SOCIETY

member of European Federationof Biotechnology

SUMMARY

Bioprospect, the bulletin of the Biotechnolo-gy Society is a journal intended to inform thesociety members about the most recent deve-lopments in this field. The bulletin should sup-ply the vitaly important knowledge directly to those who need it and to those who are ableto use it properly. In accordance with the rulesof the Society, the Bulletin also deals with boththeoretical and practical questions of biotech-nology. Articles will be published informingabout the newest theoretical findings, but manyplanned papers are devoted to fully practicaltopics. In Czech and Slovak Republic there is a growing gap between basic research and pro-duction. It is extremely important to reverse as soon as possible the process of further open-ing of the scissors, and we hope the Bulletinwill help in this struggle by promoting both

16th VolumeNo. 3 – 4/2006

http://bts.vscht.cz

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:34 Str. 3

ke konci letošního roku jsme pro Vás připravili dvojčíslo (č. 3 – 4) 16. ročníku našeho Bioprospectu.Doufám, že se Vám bude líbit stejně jako předchozídvě letošní čísla. Připravili jsme pro Vás opět řaduinformačních článků z různých oblastí biotechnologie,tak snad každý z Vás zde najde něco co ho zaujme.Jedná se např. o tato témata: geneticky modifikovanéplodiny, biotechnologie v chemickém průmyslu, bio-mikronanotechnologie, enzymové modifikace fosfolipi-dů, acylace proteinů, oxidační stres a cytokiny v relacis protinádorovou imunitní odpovědí. Po delší dobějsme také zařadili jen článek v angličtině, jehož jednímz autorů je hostující vědecký pracovník ve Výzkumnémústavu veterinárního lékařství v Brně a týká se popu-lárního tématu bioanalysy. Nechybí ani aktuální informace, i když těžiště takovýchto příspěvků sechystáme přesunout jednak na naše webové stránkyhttp://bts.vscht.cz nebo do e-mailového servisu.

V současnosti již pracujeme na přípravě Bioprospec-tu 17. ročníku a uvítáme Vaše náměty, aby náš bulletinbyl pro Vás ještě přítažlivější a samozřejmě se těšímena Vaše příspěvky i krátké informace z Vašeho oboru čiprofesního okolí. Doufám, že jste si již prohlédli našizpřístupněnou webovou stránku http://bts.vscht.cz, na které stále pracujeme. Je však řada informací, kterépřicházejí na poslední chvíli a vystavovat je na webunemá valný význam, neboť asi nikdo z nás neotevíráwebové stránky každý den. Pro tento účel je nejvhod-nější odeslání zprávy e-mailem. Máte-li zájem o infor-mace („last moment“) sdělte nám to, a my Vás zařadí-me do našeho e-mailového informačního servisu.V rámci tohoto servisu zasíláme zájemcům měsíčníinternetový bulletin Evropské federace biotechnologií,informace o přednáškách, kursech, oznámení o grantových projektech, možnostech mezinárodní

spolupráce, nabídkách podpory podnikatelům a dalšízajímavosti. V tomto směru spolupracujeme s řadoupartnerů jako jsou např. CzechInvest (http://www.cze-chinvest.org), CzechTrade (www.czechtrade.cz), Inova-Pro (www.inovapro.cz), Ministerstvo životního prostředí(www.env.cz), Ministerstvo zemědělství (www.mze.cz),Jihomoravské inovační centrum (www.jic.cza www.gate2biotech), Biotrin (www.biotrin.cz), univer-sity, výzkumné ústavy i sesterské společnosti.

Rád bych využil této příležitosti a pozval Vás na 13. Evropský biotechnologický kongres organi-zovaný Evropskou biotechnologickou federací ve dnech 17. – 19. září 2007 ve španělské (katalán-ské) Barceloně. Hlavním tématem kongresu je symbi-osa mezi vědou, průmyslem a občanskou společností.Bližší informace naleznete na webových stránkáchhttp://www.ecb13.eu. Vložné je přijatelné (300 EUROpro členy EFB, t.j.členy Biotechnologické společnostia 200 EURO pro studenty, pokud se vložné zaplatí do 30. 6. 2007).

O dalších akcích Vás budeme průběžně informovatna našich webových stránkách a/nebo e-mailovýmservisem.

Závěrem bych Vás rád požádal abyste laskavě infor-movali o činnosti naší společnosti všechny jednotlivce,podniky i instituce zajímající se o biotechnologiea požádali je o spolupráci. Děkuji Vám všem za pří-zeň v r. 2006, přeji Vám přijemné prožití vánočníchsvátků a po celý rok 2007 mnoho úspěchů v soukro-mém i profesním životě.

Váš

Jan Káš

ÚVODEM

1

Vážení přátelé,

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 6

2

Projekt JPD3 CZ04.3.07/4.2.01/0009Senzory a biosenzory pro lékařskou diagnostiku

Spolufinancovaný ze státního rozpočtu ČR a Evropského sociálního fonduwww.sbb.cz

Přes sedm stovek osob z více než 50 organizacínavštívilo během posledních dvanácti měsíců odbornésemináře, semestrální kurzy, přednášky, praktické kurzya další akce pořádané v rámci projektu Senzory a bio-senzory pro biotechnologie, lékařskou diagnostikua životní prostředí. Dvouletý vzdělávací projekt, finan-

covaný z Evropského sociálního fondu a státního roz-počtu ČR je zaměřený na oblast Prahy a odstartovalv říjnu 2005.

Řešiteli projektu, koordinovaného společností VIDIAspol. s r.o., jsou dále ÚRE AV ČR, ÚMCH AV ČR, MFF UK,VŠCHT Praha, Inova Pro, s.r.o a Safibra, s.r.o.

Značnému zájmu odborné veřejnosti se těšily dvaodborné semináře Optické biosenzory a jejich vy-užití, pořádané Ústavem radiotechniky a elektroniky AVČR. Více než stovka účastníků na nich získala přehledo tom, jak daleko dospěl výzkum, vývoj a komerciona-lizace optických senzorů. Na každou přednášku nava-zoval diskusní panel, v jehož rámci odpovídali odbor-níci z vysokých škol, Akademie věd i firem a diskuto-vali mimo jiné o tom, jak a kde využít biosenzorickétechnologie v moderní analytice.

Velmi příznivý ohlas měla též tříhodinová seminárnípřednáška Mikrofluidní systémy, popis konstrukcea výroby mikrostruktur, vybrané biosenzorovéa další aplikace pořádaná VŠCHT Praha. Každý z 40přítomných dostal k tomuto účelu vytvořený tištěnýučební materiál v rozsahu 90 stran.

Na dvoudenním praktickém laboratorním kurzu seseznámila dvacítka účastníků s moderními metodami

diagnostiky systémem antigen-protilátka. Ve dvoulaboratořích si vyzkoušeli různé imunoanalytické meto-dy a polymerázovou řetězovou reakci.

Pro potřeby účastníků Laboratorního kurzu vydalaVŠCHT Praha obsáhlá skripta. Jde o jeden ze čtyř prak-tických kurzů organizovaných v rámci projektu.

Seminář na téma „Jak chránit duševní vlastnictvív oblasti biotechnologií“ organizovaný společnostíInova Pro, byl příležitostí získat informace o licenčnípolitice, o tom, jak podávat patent, ochrannou známkuči užitný vzor, jakož i o úskalích patentování a jehofinancování ochrany duševního vlastnictví. Tři desítkyúčastníků z řad vysokých škol, výzkumných ústavů i bio-technologických firem vyslechly několik případovýchstudií a v diskusi řešili další konkrétní příklady z oblastiduševního vlastnictví.

Více informací o pořádaných akcích na www.sbb.cz

Ing. Jiřina Shrbená, Ing. Daniela Vojtová, Inova Pro, s.r.o.

Projekt Biotechnologie pro Prahu bilancuje

Koho projekt oslovuje:

Nejpočetnější cílovou skupinou jsou studenti (43 %), z převážné většiny studenti vysokých škol – hlavně VŠCHT Praha a Matematicko fyzikálnífakulty Univerzity Karlovy. Přes 40 % účastníků některé z akcí projektu představují zaměstnanci výzkumných ústavů nebo vysokých škol. Zhruba každý desátý účastník byl zaměstnancem malého či středního podniku (MSP).

Některé z uskutečněných akcí:

Mezinárodní konference New aspect in aquaculture(11. – 13. 10. 2005, Plovdiv, Bulharsko)

Konference byla uspořádána ke 40. výročí založeníplovdivského rybářského ústavu, který je nyní poboč-kou ústavu ve Varně (Institut of Fisheries and Aquacul-ture, Varna, Branch of Freshwater Fisheries, Plovdiv).Konference se zúčastnilo 60 osob, z toho 10 zahranič-ních účastníků z celkem 7 zemí (ČR 3, SRN 2, Maďar-sko 1, Bělorusko 1, Řecko 1, Chile 1, Makedonie 1).Prezentováno bylo celkem 32 příspěvků. Účastníciz VÚRH JU Vodňany prezentovali celkem 3 příspěvky (J. Hamáčková, J. Kouřil, Z. Stupka: Clove oil utilisationas an anaesthetic in aquaculture; J. Kouřil, J. Hamáčko-vá, P. Lepič, A. Lepičová, T. Barth: Semiartificial and arti-ficial propagation of European perch /Perca flviatilis/with GnRH analogues; Z. Stupka, O. Valentová, J. Ha-máčková, P. Lepič, J. Kouřil: Total ammonium nitrogen

excretion in intesivly cultured African catfish /Clariasgariepinus/ at different water temperatures). Jednáníkonference probíhalo v sekcích: Kvalita rybího masaa výživa ryb (celkem 8 příspěvků), Akvakultura a envi-ronment (7), Chov ryb (9), Nemoci ryb (4) a Genetikaryb (4). Všechny příspěvky byly prezentovány formoupřednášek. Z konference nebyl vydán sborník abstrak-tů, plné znění příspěvků bude prezentováno v Bulga-rian Journal of Agricultural Science. Na závěr konferen-ce byla uspořádána exkurse na farmu firmy Oscietracommerce Ltd. v Boliartzi u Plovdivu. Farma je zamě-řena na chov generačních ryb 6 druhů jeseterů, pro-dukci násadového materiálu, kaviáru a tržních ryb.

Tomislav Barth, Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Praha 6

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 7

3

Biotechnologie pronikají do stále nových oblastía přináší dříve netušené možnosti. Takovou oblastí jsounapř. elektrické baterie a akumulátory, kde podle nej-novějších výzkumů by se mohly uplatnit bakteriea možná i viry. Nápad na využití bakterií pro produkcielektrického proudu není nový, ale takovéto bateriezatím nedoznaly praktického využití (1 – 4). BakterieRhodoferax ferrireducens, objevená v sedimentech veVirginii, funguje jako mikrobiální palivový článek a pře-měňující energii cukrů na elektrickou energii s účinnos-tí 81 %. Chaudhuri a Lovley z Massachusettské univer-zity použili R. ferrireducens k sestrojení unikátní „bak-teriální baterie“. Kultura bakterií v nádobě s grafitovýmielektrodami, živících se glukózou, produkovala dlouho-době stabilní elektrický proud (5). Bakterie konvertova-ly v elektrický proud i další cukry: fruktózu, xylózua sacharózu. Tato cesta nabízí možnost zužitkování nej-různějšího bioodpadu k výrobě elektrické energie.

Neobyčejně zajímavé možnosti nabízí některé modi-fikované viry, zejména při výrobě miniaturních bateriípro speciální účely. Bioinženýři z Massachusetts Institu-te of Technology (MIT) zveřejnili objev geneticky modi-fikovaného viru, který na sebe „nabaluje“ atomy kovua může fungovat jako kovová elektroda. Takto uprave-né viry by mohly najít uplatnění i v tak odlehlém oboru,jako je výroba baterií. Základem pro genetickou úpravu

byl virus M13 (bakteriofág). Za to, že se virus obalujevrstvičkou kovu, je zodpovědná uměle vložená DNA,respektive povrchový protein, který se podle ní synteti-zuje. Nejdříve byly vyzkoušeny proteiny, které umožňu-jí živočišným buňkám vázat vápník a pak byly hledánydalší, vážící i jiné kovy. Zatím vyzkoušené modifikaceumožňují virům vychytávat z okolí kobalt a zlato, před-pokládá se ale, že jiné dodané řetězce DNA povedouke vzniku struktur, které budou vykazovat afinitu i k dal-ším kovům. DNA požadovaných vlastností se zjišťujejednoduše tak, že směs různě modifikovaných virů senalije na vrstvičku kovu na níž zůstanou nadějné varianty „přilepeny“, zatímco ostatní se odplaví. Elektro-du s tenkým kovovým povlakem lze ze záporně nabi-tých komplexů viru a kovu vytvořit tak, že se nechá tvarovat na kladně nabitém podkladu z plastu (6).Nová technologie má oproti stávající výrobě bateriícelou řadu výhod. Proces výroby probíhá za pokojovéteploty a normálního tlaku a bez použití nebezpečnýchchemikálií, což zlevňuje výrobu. Takto vytvořené baterieby mohly být lehčí a menší než jsou současné výrobkyodpovídající energetické kapacity (7). Předností je, že viry mohou vytvářet elektrody od nanometrovýchměřítek až po centimetrové tyčinky. Uvažuje se takéo tom, že by geneticky modifikované viry mohly býtv budoucnu využity i ke stavbě solárních článků.

ODBORNÉ PŘÍSPĚVKY

BIOTECHNOLOGIE PŘI VÝROBĚ BATERIÍJiří PatočkaZdravotně sociální fakulta Jihočeské univerzity, České Budějovice

Literatura1. Daumas S., Massiani Y., Crousier J., Corrosion Sci. 28:

1041-1050, 1988.2. Scholz F., Schroder U., Nature Biotechnol. 21: 1151-

1152, 2003.3. Whitehouse D.,

http://news.bbc.co.uk/1/low/sci/tech/3092754.stm(10/09/2003).

4. http://www.sciencentral.com/articles/view.php3?article_id=218392129 (23/04/2004).

5. http://www.sciam.com/article.cfm?articleID=00054931-E680-1F58-905980A84189EEDF&sc=I100322

6. Nam K.T. et al., Science 312: 885-888, 2006.7. Nanotechweb. http://www.nanotechweb.org/

articles/news/5/4/4/1.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 8

4

Biomikronanotechnologie je vědním oborem, kterýse za posledních deset let rapidně rozvinul v jednuz nejdůležitějších a do budoucna potenciálně význam-ných výzkumných a průmyslových oblastí. Zjednoduše-ně by se tento obor dal definovat jako soubor techno-logií umožňujících práci v mikroskopických až nanosko-pických měřítcích a kombinující přitom biologickémateriály se zákonitostmi fyziky, chemie a genetikya tvořící synthetické struktury analogické živým tkáňím.Jelikož se jedná o soubor interdisciplinárních odvětví,není jednoduché je striktně rozdělit. Jednotlivá odvětvíplynule přechází do druhých a vzájemně se prolínají.Velmi zhruba tedy můžeme biomikronanotechnologiirozdělit do několika velmi příbuzných kategorií: nano-biotechnologie, bioMEMs (biological micro-electrome-chanical systems), mikrofluidní systémy, biosenzory,bio(mikro)čipy a tkáňové inženýrství.

Nanobiotechnologie Lze je definovat jako výrobu zařízení z organických

nebo biologických materiálů, kde alespoň jedna funkč-ní komponenta svou velikostí odpovídá molekulárnímnebo dokonce atomárním rozměrům. Právě takovéfunkční rozměry nám mohou umožnit hlouběji porozu-mět biochemickým procesům dalo by se říci atom po atomu. To skýtá obrovské možnosti využití v medicí-ně a diagnostice. Dlouhodobým cílem, který si nano-biotechnologie ukládá, je sestavení vysoce funkčníhosystému biosenzorů, elektronických okruhů, nanosko-pických čipů a molekulárních přepínačů a dále tkáňo-vých analogů schopných nahrazovat nebo opravovatnapříklad poničené původní tkáně jako pokožka, kosti,svaly a další tělesné orgány. V rámci tohoto odvětví existují dva základní přístupy řešení problému. Prvnímje tzv. „bottom up“. Tento typ využívá znalostí strukturya biochemických procesů biomolekul k vytvářenínových funkčních materiálů, biosenzorů a bioelektroni-ky pro biologické a biomedicínské využití. Příklademtakového postupu jsou tzv. proteinové motory, kterémohou umožnit chemicky poháněný pohyb dalšímmikro- nebo nano- zařízením jako nanoskopické pře-našeče nebo sondy pro povrchové skenování. Druhýmtypem je tzv. „top down“. V tomto případě se jednáo aplikaci nástrojů a postupů nano- a mikro- technolo-gie k vytvoření zařízení pro studium nejrůznějších bio-systémů. Příkladem takového zařízení je separace dlou-hořetězcových polymerů pomocí mikrodestičky s hus-tou sítí tzv. nanopilířů. Poté se aplikuje dělená směs za působení elektrického proudu. Podle délky pulsua podmínek během reakce se kratší molekuly plněinkorporují do sítě nanopilířů a delší jen částečně nebovůbec. Přestane-li poté působit elektrické pole, máloinkorporované nebo neinkorporované proteiny se sbalía z destičky snadno odstraní.

BioMEMsSdružují mikrostrojové elementy, většinou ze siliko-

nových materiálů, obsahující různé převody, mikromo-tory, akční členy a další. Takové vysoce integrovanémikrosystémy mohou vyřešit mnoho technických problému, které jsou běžnými metodami neřešitelné.Příkladem takového zařízení jsou mikročerpadla růz-ných typů a velikostí, ale také mnohem sofistikovanějšímikročipy, tzv. „lab-on-chip“ zařízení. Jedná se o jedno-tku, kombinující reakční komory s detektory, schopnévlastní analýzy, vstupy a výstupy, vybavené i připojením na externí zařízení. Zjednodušeně řečeno, schopnénahradit celou laboratoř.

Mikrofluidní systémyJsou to zařízení kontrolující tok plynných nebo kapal-

ných látek v malých množstvích a v miniaturních systé-mech. Jedná se obor úzce související s ostatními obory.Můžeme pod něj zahrnout mikrozařízení jako mikromí-siče, ať už pasivní, míchající pomocí různých štěpenía rotací tekutiny, nebo aktivní, využívající magnetohyd-rodynamického vlivu, elektroosmózy a dalších jevů.Dále sem patří tepelné mikrovýměníky, jejichž výhodouje ohřátí či ochlazení v řádech milisekund, chemickémikroreaktory, umožňující podstatně vyšší stupeň kon-verze a vyšší selektivitu, ale můžeme sem zařadit i jižzmíněná mikročerpadla, mikroventily atd.

Biosenzory Tak se nazývají zařízení kombinující element biologic-

ký jako prvek detekční a element fyzikální jako prvekpřevádějící měřený signál na zpracovatelné pulsy. Biosenzory mají široké uplatnění v biomedicíně, moni-torování životního prostředí nebo při kontrole kvalityproduktů ve výrobě. Kromě notoricky známých biosen-zorů, například na principu enzym – elektroda existujecelá řada dalších, často ještě experimentálních přístro-jů tohoto typu. Takovým příkladem je tzv. biolaser,někdy též biokavitační laser. Jedná se o ultramalý laserkombinovaný s dalšími mikrostrukturami, případněbiologickými prvky. V praktickém použití se využívá tzv.„smart scalpel“. Je to vlastně online průtokový cytome-tr, využívaný zejména na operačních sálech. Jeho výho-dou jsou oproti běžným průtokovým cytometrům velmimalé rozměry. Díky němu je možné rozeznat u operacírakovinných nádorů, kde nádor končí a kde již začínázdravá tkáň. Dále je možné podobně detegovat poru-chy imunity skenováním povrchu buněk.

Mikro(bio)čipyJsou jednou z nejkomerčnějších technologií poslední

doby. Opět, podobně jako u mikrofluidních systémů sejedná o obor velmi úzce spjatý s ostatními obory. Výho-dou mikročipu jsou opět velmi malé dávky vzorků

BIOMIKRONANOTECHNOLOGIEBoris BartošÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 9

a u některých také možnost urychlení reakce pomocíelektrického proudu. Velmi známým příkladem jsou tzv.DNA biočipy (DNA microarray). Na definované ploše(čipu) jsou navázány řetězce oligonukleotidů, k nimž seselektivně váží komplementární fragmenty DNA tzv.hybridizační reakcí. Dnes se jedná o standardní vybave-ní pro charakterizaci DNA. Existují i proteinové biočipy,využívající metod ELISA nebo western blotting, na prin-cipu interakcí antigen – protilátka a dalších.

Tkáňové inženýrstvíJeho cílem je vytvoření plně funkční a kontrolovatel-

né mikrostruktury analogické živé tkáňi. Kombinuje při-tom synthetické a biologické materiály, mikrostrukturya zařízení. Nachází uplatnění při přípravě umělýchimplantátů, regenerační medicíně, ale i při přípravěnový biosenzorů nebo mikročipů. Zajímavým příkla-dem je koncept „Animal-on-chip“. Jedná se o integracimnoha tkáňových kultur jednoho organismu (včetněčlověka) na jeden mikročip. Výsledkem by mohla býtreprodukce možné odpovědi vlastního organismu narůzná farmařila nebo látky, přítomné v životním pro-středí. Zde se ještě stručně pozastavím nad výběremmateriálů pro tkáňové inženýrství. Mohou být tři typypožadavků na materiál. Prvním je schopnost indukovatbuněčnou migraci a tkáňovou regeneraci. Druhým jeschopnost vytvořit tzv. imunoisolační bariéru, která bydovolila přístup k dané struktuře jen některým moleku-lám. Konečně třetí typ pak slouží jako podpůrná matrix,poskytující nosnou kostru a organizaci, jako jsou napří-klad vlákna lakto/glykolátového kopolymeru.

Materiály a technologie pro přípravu mikro-a nanostruktur

Co se týče základních materiálů, má výsostné posta-vení křemík. Jako monokrystalové jednotky má významzejména v mikroelektronice. Ještě širší použití však majísilikony, a to při výrobě mikročipů a dalších mikrostruk-tur. Výhodou je hlavně obrovská variabilita silikonů různých vlastností.

Sklo je jedním z nejstarších využívaných materiálů. Je biologicky i chemicky stabilní, je transparentní. Nevý-hodou je vyšší křehkost. Často využívaná je také kera-mika, která je značně chemicky a mechanicky odolná.Kovy se používají zejména k vytvoření aktivních vrstevnapříklad při galvanickém pokovování. Obtížně ses nimi pracuje při vytváření 3D struktur. Z oxidů kovů senejčastěji používá tzv. alumina (Al2O3), ale i některé

další jako BeO.Velmi používaným materiálem jsou polymerní plasty.

Jsou poměrně levné a tudíž snadno dostupné. Jejichnevýhodou je však nízká tvrdost a tepelná stabilita.K dispozici je řada plastů, od běžných plastů jako pol-vinylchlorid (PVC), polyethylen (PE) nebo polypropylen(PP), přes technicko-inženýrské, které mají lepší vlast-nosti než běžné plasty, hlavně vyšší tepelnou odolnost,což jsou například polyethylentereftalát (PET), polyami-dy (PA) nebo polybutylentereftalát (PBT), až po speci-ální plasty jako polysulfonáty (PSU), polyether-

etherketo (PEEK) nebo kapalné krystalické polymery(LCP).

Zvláštní a v poslední době hojně využívanou skupi-nou jsou tzv. fotorezisty. Jedná se o materiály citlivé na některé druhy elektromagnetického záření. Dělí sena dva typy, a to fotorezisty negativní a fotorezisty pozi-tivní. Negativní fotorezisty se působením záření „vytvr-dí“, dochází k zesíťování vazeb. Pozitivní fotorezisty senaopak dají odstranit lépe než neexponované části,vazby se působením záření narušují. Příkladem negativ-ního fotorezistu je například komerční materiál SU8.Pozitivním fotorezistem je třeba komerční FOTURANnebo polyimidy (PI).

Fotolitografie. Jedná se o metodu, při které docházík selektivnímu ozáření fotorezistu, ať už pozitivníhonebo negativního, naneseného na povrch substrátua následné odleptání exponované (pozitivní fotorezist)nebo neexponované (negativní fotorezist) části. Celýpostup se dá zhruba shrnout do těchto kroků: Prvnímje čištění substrátu, kdy se odstraní veškeré nečistotyz povrchu materiálu třemi po sobě jdoucími chemický-mi čistěními. Druhým je nanesení fotorezistu na sub-strát pomocí tzv. spin coateru. Třetím krokem je vlastníexpozice fotorezistu většinou UV zářením přes maskus požadovaným vzorem a konečně čtvrtým krokem jetzv. vývoj fotorezistu, kdy se odstraní nejčastěji leptá-ním. Fotolitografie je často používanou metodou přivýrobě mikročipů různých druhů a mikrofluidních zařízení. O něco preciznější, ale také podstatně náklad-nější metodou je rentgenová litografie (RTG litografie).Zde je rezist senzitivní na rentgenové záření, kterému jeopět vystaven přes masku s požadovaným vzorem.Nutností je však působení kolineárního svazku RTGzáření, produkovaného synchrotronem. Právě kvůlitomu je použití této metody značně omezené. Jejívýhodou jsou však nižší vlnové délky záření a z tohovyplývající větší rozlišení při výrobě.

Další metodou je tzv. anizotropní mokré leptání. Zdese substrát vloží do roztoku, kde dochází k leptání.U krystalických materiálů, jako je například křemík,závisí rychlost leptání na krystalografických rovinách.,tzn. Dutiny se vytváří jen podél určitých rovin. K leptáníse využívá různých činidel, například KOH. Naprotitomu u izotropního mokrého leptání je rychlost leptáníve všech směrech stejná, zejména u amorfních materi-álů jako sklo.

Tzv. suché leptání se provádí pomocí toku vysocereaktivního ionizovaného plynu, plasmy. Jako masky sepoužívá například SiO2 nebo fotorezisty.

Jako už bylo zmíněno výše, galvanické pokovování sepoužívá k vytváření aktivních kovových vrstev. Jedná seo elektrolytické nanášení kovů ( hlavně Ni nebo Cu) nasubstrát, který tvoří jednu z elektrod.

Mikroobrábění se může provádět několika způsoby.Mechanicky, laserem nebo pomocí elektrojiskry.Mechanicky se provádí pomocí různých mikrofréza mikrovrtaček, nevýhodou je však limitace rozlišení,která je maximálně v řádech stovek mikrometrů.O něco lepší je obrábění laserem, kdy se materiál

5

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 10

vpodstatě odpaří přes masku nebo přímo. Elektrojis-krové mikroobrábění využívá erozivního působení elek-trického výboje na svrchní vrstvy materiálu.

Existuje také celá řada metod replikace již hotovýchvýrobků. Jedná se zejména o vtlačování nebo vytlačo-vání za tepla, vstřikování nebo odlévání. Při vtlačovánínebo vytlačování je forma vtisknuta do filmu z termo-plastu, přičemž jak forma, tak termoplast jsou předemzahřáty na teplotu blízkou skelnému přechodu plastu.Příkladem může být výroba mikrokanálků. Provádí setak, že mezi dvě polymerní destičky se vloží tenký kovo-vý drátek. Pak je sestava sevřena mezi dvě skleněnédesky a zahřáta na teplotu 90 °C. Destičky se spojía drát se vtiskne do nich. Metoda vstřikování je velmipodobná výrobě plastů v makrosvětě. Do vakuově uza-vřené formy se vstřikuje polymer, který se opět zahřívá.Při tomto způsobu replikace je potřeba udržovat vyso-ký stupeň čistoty, ale jinak jsou náklady na replikacinízké. Odlévání je standardní metodou. Samozřejmě je

potřeba vyrobit formu jako primární matrici, nejčastějiz kovu. Ta se poté zalije tekutým polymerem a necháztuhnout. Poté se finální struktura oddělí od matrice. Jeto tudíž velmi jednoduchá metoda, která nevyžaduježádné zvláštní vybavení.

Další metody většinou spočívají v modelování 3Dstruktur pomocí nanášení a zápisu (vytvrzení) vrstvy zavrstvou jako například 3D printing (3DPTM), selektivníslinování laserem (SLS) – zde je vrstva nanesena veformě prášku a některé další. Také existují i kombino-vané technologie, tzv. „LIGA“ (lithografie), „Galvanofor-mung“ (pokovování) a „Abformung“ (otisk). Souhrnněse dá říci, že se jedná o různé variace výše uvedenýchtechnik a samozřejmě některých dalších jako třebaelektrodepozice.

Závěrem lze shrnout, že biomikronanotechnologiejsou v současné době nesmírně dynamicky se rozvíjejí-cí oblastí s obrovskými možnostmi.

6

Literatura1. Šnita, D.: Mikrofluidní systémy, popis konstrukce

a výroby mikrostruktur, vybrané senzorové a dalšíaplikace. Odborný seminář, VŠCHT Praha, 2006.

2. Goodsell, D.S.: Nature, 430, 20 (2004).3. Langer, R., Peppas, N.A.: AIChE J., 49, 2990 (2003).4. Gourley, P.L.: Biotechnol. Prog., 21, 2, (2005).

5. He, X., Zhao, X.J., Drake, T.: Med. Res. Rev., 24, 621(2004).

6. Sharma, G., Mavroidis, C., Ferreira, A.: Handbook ofTheoretical and Computational Nanotechnology, Vol X, 1-33 (2005).

BIOTECHNOLOGIE JAKO ALTERNATIVA PRO CHEMICKÝPRŮMYSLPavel Vopálenský, VŠCHT PrahaÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Na počátku 20. století, dříve než byla ropa označenaza univerzální surovinu a zdroj energie, se chemickýprůmysl opíral o uhlí a obnovitelné zdroje. Do třicátýchlet byla běžná výroba paliv a základních chemikálií jakoethanol, butanol a různých organických kyselin usku-tečňována biotechnologickými postupy. S nástupempetrochemického průmyslu bylo však mnoho těchtopostupů nahrazeno chemickou syntézou. V sedmdesá-tých letech, po první ropné krizi, začaly biotechnologieopět přitahovat pozornost. Dle prognóz by mělo býtdosaženo maximální produkce ropy během příštíchdesetiletí, přičemž se snižující se dostupností ropybudou její ceny vzrůstat. Společně s tímto ekonomic-kým faktorem vstupuje do popředí i faktor „ekologic-ký“. Lidé „prostřednictvím svých ekonomických aktivita jednostranné environmentálně a sociálně bezohled-né honbě za ekonomickým prospěchem zničilivýznamnou část svých existenčních podmínek“. (Návrhstrategie udržitelného rozvoje České republiky, Českýekologický ústav). Lidé si začali uvědomovat, že zatím-co jejich pohodlí je robustně zabezpečeno materiálněa ekonomicky, environmentální a zdravotní podmínkyse stávají neudržitelnými. V roce 1987 byl poprvé

definován pojem udržitelný rozvoj: „Udržitelný rozvojznamená zlepšování životní úrovně a blahobytu lidív mezích kapacity ekosystémů při zachování přírodníchhodnot a biologické rozmanitosti pro současné a příštígenerace.“ (Nařízení Evropského parlamentu a Radyčíslo 2493/2000 a číslo 2494/2000) Zachování udrži-telného rozvoje znamená využívat co nejvíce obnovitel-ných zdrojů, snížit produkci odpadů a přiblížit se tak conejvíce přírodním dějům na Zemi. Jediným prvotnímzdrojem energie na Zemi je Slunce a všechny přírodníděje jsou dlouhým vývojem postaveny tak, aby co nej-efektivněji tuto energii využívaly a transformovaly. Pře-měny látek v živých systémech jsou tak jedny z nejúčin-nějších, které známe. Proto je zřejmé, že vhodně navr-žený biotechnologický proces by, ve srovnání s tradičníchemickou technologií, měl být teoreticky vždy účinněj-ší a ekonomičtější, zejména pak při použití organizmůvyužívajících přímo energie Slunce. Z níže uvedenýchpříkladů biotechnologických výrob je však patrné, žev současné době zatím není biotechnologie většinouschopna ekonomicky konkurovat tradičním chemickýmvýrobám. To je dáno špatným konceptem tzv. tržní eko-nomiky, která „nepřisuzuje hodnotu věcem o sobě

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 11

7

(včetně přírodních zdrojů), ale pouze věcem pro nás,věcem, které mohou mít pro nás nějaký konzumovatel-ný význam a v důsledku toho se mohou stát komodi-tou a je k nim možné explotací či zpracováním přidathodnotu“ (Návrh strategie udržitelného rozvoje Českérepubliky, Český ekologický ústav), tedy v tržní ceněnení nijak započítávána „vzácnost“ suroviny, dopadvýroby na životní prostředí a příspěvek k udržitelnémuvývoji. Tato situace se začíná pozvolna měnit např.zaváděním různých ekologických daní, které upravujícenu výrobku na základě dopadu jeho výroby, likvidacea recyklace na ekologii, a dále nalézáním nových, efek-tivnějších a ekonomicky výhodnějších biotechnologic-kých procesů. Uvedené příklady ilustrují některé jižpoužívané a nově navržené biotechnologické postupynahrazující tradiční průmyslovou výrobu.

PalivaPaliva jsou jednou z nejdiskutovanějších otázek

ve věci udržitelného rozvoje. Petrochemický průmyslv současné době produkuje tisíce barelů nafty a jinýchfosilních paliv denně, nicméně již z podstaty těžby ropyje zřejmé, že nejde o obnovitelnou surovinu, navíc spa-lováním fosilních paliv vznikají organické polutanty.Proto je stále větší důraz kladen na vývoj a používáníbiopaliv. V dnešní době je podíl paliv pocházejícíchz biomasy na celkové produkci světové energie pouze1 %, dle prognóz uvedených v grafu by však mělběhem sta let dosáhnout až 50 %. Nejpoužívanějšímbiopalivem je ethanol. Ten používal již Henry Ford ve svém prvním autě, v Brazílii tvoří 20 % obsahupohonných hmot a v Evropské unii je na základě Kyotského protokolu stanoven cíl zvýšit obsah bioetha-nolu ve všech pohonných hmotách na 5,75 % do roku2010. Ethanol je vyráběn biotechnologicky kvasnýmprocesem pomocí buněk Saccharomyces cerevisiae.Jako substrát se používá hydrolyzovaný kukuřičný neboobilný škrob, v jihoamerických státech cukrová třtina.Obrovské úsilí je vynakládáno na vývoj technologické-ho postupu štěpení celulózy (biotechnologicky pomocíenzymu celulázy), který by umožnil použití velkéhomnožství levných rostlinných odpadů na produkci etha-nolu, žádná vhodná technologie však dosud nalezenanebyla. Genetickými manipulacemi byla připravenatransgenní bakterie Zymomonas mobilis, která je vedlehexóz schopna využívat i pentózy, a tak poskytuje vyso-ké výtěžky ethanolu nejen ze škrobových hydrolyzátů,ale např. z rýžových stébel.

Jiné možnosti přípravy biopaliva jsou anaerobní pro-cesy rozkladu biologických materiálů na tzv. bioplyn(přibližně 55 % methanu a 45 % oxidu uhličitého).Tyto anaerobní procesy zároveň slouží při čištěníodpadních vod a jiných organických odpadů. Tzv. Weiz-mannovým procesem, vyvinutém na počátku dvacáté-ho století, může vznikat ethanol, butanol a aceton(ABE). Butanol může být přidáván do paliv, v porovná-ní s ethanolem má dokonce výhodnější vlastnosti (vyššíspalné teplo, nižší tlak nasycených par a nižší rozpust-nost ve vodě). Zlepšování Weizmannova procesu vedlo

k markantnímu snížení procesních nákladů. Další slibnou technologií je extrakce butanolu biodieslemz palmového oleje, poskytující biodiesel s obsahem 18 % ABE. Tato směs může být bez dalšího čištění použita jako palivo.

Zemědělství Agrochemikálie, zejména pesticidy a hnojiva jsou

hojně využívány po celém světě ke zvýšení výnosů.Kvůli tomuto masivnímu užívání představují agroche-mikálie důležitý zdroj znečištění, zdravotní rizikoa jejich výroba je spojena s velkou spotřebou energie.Proto je značná pozornost věnována přípravě tzv. bio-pesticidů a biofertilizérů. Biopesticidy jsou mikrobiálníagens nebo látky odvozené od mikroorganismů, kteréregulují hmyzí škůdce, plevely nebo hlodavce. Jejichaplikace je podobná aplikaci chemických pesticidů.Biopesticidy obecně vykazují vyšší specifitu, nezane-chávají v prostředí škodliviny a snižují riziko vzniku resi-stence u škůdců. Z mikrobiálních biopesticidů je nej-používanější Bacillus thuringiensis, který brání rostlinypřed napadením hmyzem. Vnesením jeho genu, jehožprodukt je pro hmyz toxický, do rostlinného genomubyly vytvořeny plodiny, které se samy brání napadení.Dále jsou používány tzv. biochemické pesticidy na báziferomonů, které působí na škůdce odpudivě.

Většina biofertilizérů funguje na principu přeměnyvzdušného dusíku na amonné soli v půdě a zvýšenídostupnosti fosforu pro plodiny. V praxi se využívázejména mykorhiza – symbióza plísně s kořeny rostliny.Rostlina poskytuje plísni některé intermediáty metabo-lizmu a plíseň umožňuje rostlině lepší příjem fosforua zajišťuje jistou ochranu proti suchu a vysoké salinitěpůdy. Dalším používaným systémem je symbióza bakteriálního kmene Rhizobium s kořeny bobovitýchrostlin, při které bakteriální buńky fixují vzdušný dusíka poskytují jej rostlině. Pro zůrodnění alkalických zeminv Indii byly úspěšně použity modrozelené řasy. Bylo takvyužito jejich schopnosti fixovat vzdušný dusík a sou-časně fotosynteticky produkovat organické látkya dodávat je do půdy.

PolymeryPlasty jako velkovýrobní produkty petrochemického

průmyslu a současně špatně degradovatelné sloučeni-

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 12

ny jsou pro biotechnologii velikou výzvou. V roce 1941známý americký vynálezce Henry Ford představil proto-typ vozu, jehož karoserie byla kompletně vyrobenaz plastů pocházejícího ze sojových bobů. Fordovi sebohužel nikdy nepodařilo uvést do provozu výrobu plastu ze sojovových bobů tak, aby mohl cenou konku-rovat plastům petrochemického průmyslu.

Produkce biodegradovatelných polymerů – polyhyd-roxyalkanoátů (PHA) – v bakteriích (Rastonia eutrop-ha) byla dobře známa již ve 20. letech minulého stole-tí. Japonští vědci vnesli vybrané geny této bakterie do E.coli, ve kterých poté tvořil PHA 96 % sušiny. V porovná-ni např. s polypropylenem (cena 1 USD za kg) je pro-dukce tohoto biopolymeru (cca 4 USD za kg) stále eko-nomicky nevýhodná. Redukci nákladů na výrobu bymohlo přinést vnesení potřebných genů do rostlin,které, na rozdíl od bakterií vyžadujících vhodný dodáva-ný substrát, získávají všechny potřebné organické látkypomocí fotosyntézy. Firmy DuPont a Genencor připravi-ly geneticky modifikovanou bakterii E. coli (do níž bylyvneseny geny ze tří různých organizmů), která je schop-ná fermentačním procesem produkovat propan-1,3-diol z glukózového sirupu získaného z kukuřičnéhoškrobu. Propan-1,3-diol je používán k výrobě kopoly-merního polyesteru Sorona, v němž druhou monomer-ní složku tvoří tereftalát, dosud získávaný z ropy. Tentonový typ polyesteru vykazuje dobré vlastnosti – pruž-nost, pevnost a je lehce barvitelný. Cargill-Dow Chemi-cal Company otevřela v roce 2002 továrnu na Ingeo(polymléčná kyselina – PLA), jejíž monomery jsou pro-dukovány bakteriemi využívajícími opět jako substrátkukuřičný škrob. Tento bioplast nebyl taktéž schopencenou konkurovat petrochemickým plastům, nicméněspolečnost jej uvedla na trh jako zboží šetrné k životní-mu prostředí, které je standardně prodáváno s vyššícenou.

EnzymyEnzymy jsou biokatalyzátory vykazující oproti tradič-

ním katalyzátorům vyšší selektivitu a účinnost za mír-nějších reakčních podmínek. Ačkoliv jejich použití např.v produkci sýrů je známo už mnoho let, kvůli jejich slo-žité a nákladné izolaci došlo k širší aplikaci enzymův průmyslu až v posledních 20. letech. V roce 1988 bylpřipraven první transgenní enzym (lipáza pro použitív detergentech) a byla tak zahájena éra využití metodgenového inženýrství k rychlé a méně náročné přípravěenzymů v transgenních bakteriálních buňkách. Dnes jižexistuje ohromný celosvětový trh s enzymy a dle před-pokladů poroste každý další rok o 5 – 10 %. V tabulcejsou uvedeny nejvýznamnější průmyslové enzymya jejich aplikace. Většina z průmyslových enzymů jsouhydrolázy, přičemž kolem 75 % je slouží k výrobě deter-gentů, v potravinářství a zpracování škrobu. Přibližně 10 % trhu s enzymy tvoří speciální enzymy, které majívýznam zejména ve farmacii a syntéze organickýchlátek. Jejich aplikace výrazně snižuje počet reakčníchkroků, které by byly vyžadovány při tradiční syntéze,a zvyšuje účinnost výroby.

Další výhodou použití biokatalyzátorů je jejich ste-reospecifita umožňující selektivní produkci enantio-merů. Různé enantiomery mají obecně i různé biolo-gické účinky – jedna forma vykazuje požadovanou akti-vitu, zatímco druhá může být nebezpečná. Známý jepříklad thalidomidu, jehož jeden enantiomer pomáhátěhotným ženám při ranních potížích, zatímco druháforma zapříčiňuje deformace vyvíjejícího se plodu.Jiným příkladem aplikace enzymů je syntéza antibioti-ka cephalexinu. Chemická syntéza vyžaduje 10 krokůza vzniku cca 50 kg odpadu na kilogram vyrobenéhoantibiotika. Použití čtyřkrokového enzymového postu-pu produkuje pouze 15 kg odpadu na kilogram anti-biotika a nově vyvinutý fermentační proces produkujepouze 2 kg odpadu na kg výrobku. Dalším úspěš-ným použitím biotechnologického postupu namístochemického je výroba akrylamidu. Namísto tradičníchemické výroby vyžadující velké množství energie jepoužíván imobilizovaný enzym nitrilhydratáza. Z násle-dující tabulky jsou zřejmé výhody bioprocesu.

Stále větší uplatnění v průmyslu nacházejí enzymyizolované z extremofilních organismů, které majíschopnost udržet si aktivitu i za nepříznivých podmínek(vyšší teplota, vyšší iontová síla). Enzymy vykazující aktivitu v nevodných prostředích našly použití v pro-dukci modifikovaných tuků a olejů. Při hledání dalšíchenzymů extremofilních organizmů může v budouc-nosti pomoci i nově vzniklá disciplína – metagenomika.

MetagenomikaVýzkumníci na palubě lodi Sorcerer II plující kolem

východního břehu USA, skrz Panamský průplav a dále

8

Enzymy Katalyzovaná reakce Průmyslová aplikace

Proteázy ProteolýzaDetergenty, potravinářství,farmaceutický a chemický

průmysl

LipázyHydrolýza tuků na mastné

kyseliny a glycerolPotravinářství, detergenty

Pektinázy Klarifikace ovocných šťáv Potravinářství

Celulázy Hydrolýza celulózyDetergenty, krmivářství,

textilní průmysl

Amylázy Hydrolýza škrobu na cukru Potravinářství

Vybrané průmyslové enzymy a jejich aplikace(dle Gavrilescu M., Christi Y., 2005)

Parametr Chemický proces Bioproces

Reakční teplota 70 °C 0 – 15 °C

Výtěžek 70 – 80 % 100 %

Koncentraceakrylamidu

30 % 48 – 50 %

Požadovaná energie(MJ/kg akrylamidu)

1.9 0.4

Produkce CO2/kg

akrylamidu1.5 0.3

Porovnání parametrů chemické a biotechnologické výroby akrylamidu (dle Gavrilescu M., Christi Y., 2005)

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 13

9

kolem Galapág, odebírají každých 200 mil 200 litrůmořské vody, jejíž filtrací získávají mikroorganismya posílají je do laboratoře v USA. Cílem projektu jesekvenace genomu každého organismu v každém vzor-ku. Zjištění DNA organismů v jednotlivých životníchprostředích – metagenomika – pomůže lepšímu poro-zumění vztahů mezi organizmy a projevy jejich genů.Na živiny chudý vzorek vody ze Sargasového moře byljiž touto technikou zpracován: bylo objeveno 1800druhů (z toho 150 dosud neznámých) a 1,2 milionunových genů. Díky metagenomice mohou být objevenygeny, jejichž projevy najdou využití v nových průmyslo-vých aplikacích, výrobě antibiotik (nové antibiotikumturbomycin bylo objeveno právě díky metagenomice)a nových degradačních drahách.

ZávěrUvedené příklady ukazují postupné úspěšné začleňo-

vání biotechnologie do výrobních procesů. Současnýmohutný rozvoj biologických věd a technik vede k dal-šímu usnadňování zavádění biotechnologií do velko-provozních měřítek. Tento proces však vyžadujei změnu dosavadního ekonomického náhledu na světsměrem k doceňování dopadů výroby na životní prostředí, neboť zatím v mnoha případech není bio-technologie schopna konkurovat zavedeným, k životní-mu prostředí však zcela nešetrným postupům. Biotech-nologie nabízí velmi slibnou cestu k udržitelnému rozvoji.

Geneticky modifikované plodiny – ano či ne?Na naší planetě žije v současné době asi 6 miliard lidí

a toto číslo neustále stoupá. Již nyní existují oblasti trpící hladomorem. Bude v budoucnu dostatek potravypro všechny? Idea geneticky modifikovaných organis-mů (GMO) vznikla, aby bylo v zemědělství dosaženo co nejlepších výsledků, tj. kvality a výnosů. Při klasic-kém šlechtění dochází k nekontrolované změně sta až tisíce genů na náhodném úseku DNA šlechtě-ného jedince, zatímco u metody genetické modifi-kace je modifikovaný organismus obohacen o jeden,maximálně několik genů, které jsou vkládány na urče-né místo molekuly DNA. Jde tedy o urychlené šlechtění.

Geny, které se vkládají do GMO, dávají většinoumodifikovanému jedinci odolnost proti chemikáliímužívaných v zemědělství (herbicidy, pesticidy) nebovyvolávají tvorbu látek, které jsou toxické pro škůdcedané plodiny.

GMO se po genetické modifikaci dlouho sledují. Gen,který má být vnesen do molekuly DNA modifikovanézeleniny, nesmí být podobný žádnému genu pro známýtoxin. Po modifikaci má upravená molekula DNA svépůvodní vlastnosti, ale nový gen zajišťuje při proteosyn-téze vznik bílkoviny, která v plodině dříve nevznikala.Tato bílkovina se zkoumá. Všechny GMO, u kterých seobjeví jakákoliv vada, jsou zlikvidovány.

Nebezpečí geneticky modifikované zeleniny rezis-tentní vůči herbicidu spočívá v tom, že se tato zeleninamůže zkřížit s plevelem, který by se tak mohl stát nezni-

čitelným. To se může stát jen ve zvláštním případě, protože většina geneticky modifikované zeleniny jezcela odlišná od plevele, který je likvidován při jejímpěstování. V úvahu to přichází u řepky olejky, která semůže zkřížit s planou ředkvičkou, planou vodnicí neboplanou kapustou. Ve Velké Británii byla objevena planáodrůda řepky olejky odolná proti třem herbicidům. To se mohlo stát pouze nesprávným zacházeníms touto plodinou, protože řepka se sklízí po prvnímroce pěstování a nevykvete. Také u geneticky modifiko-vané rýže je hlavní problém v tom, že rýže má mnohoplaných odrůd.

Druhým problémem je zkřížení geneticky modifiko-vané zeleniny s nemodifikovaným druhem. Proto jsoupevně stanoveny hranice mezi poli s geneticky modifi-kovanou a nemodifikovanou zeleninou.

Další otázkou je, zda si plevel nemůže častým použí-váním herbicidů vytvořit odolnost proti těmto látkám.Většina herbicidů však pracuje na systému, kterému siplevel nikdy nemůže přivyknout. První GMO bylvyšlechtěn asi před 20 lety a dosud nebyl zjištěn jedinýpřípad nebezpečnosti1.

Současné formy GMO zajišťují především zvýšenívýnosů. V budoucnosti přijdou na řadu také typy s vyššíkvalitou. Nové GM odrůdy budou např. odolnější k bio-tickým i abiotickým stresovým faktorům, přijdou nařadu plodiny se zvýšenou nutriční hodnotou (vitaminy,antioxidanty aj.), transgeny pro farmakologické využitíprodukující protilátky a samozřejmě transgeny pro prů-myslové využití2.

Literatura1. Gavrilescu M., Chisti Y.: Biotechnol. Advance, 23, 471

(2005).2. Sasson A.: Biotechnology: Current Achievments and

Prospect, Social Acceptance of Biotechnology-deri-ved Products, 2004.

3. Willke T., Vorlop K. D.: Appl. Microb. Biotechnol. 66,131 (2004).

4. Návrh strategie udržitelného rozvoje ČR, Český eko-logický ústav (www.ceu.cz).

GENETICKY MODIFIKOVANÉ PLODINYJana ZlámalíkováÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 14

10

Geneticky modifikovaná kukuřice MON810Tato kukuřice si díky genetické modifikaci vyrábí tzv.

Bt-toxin a je proto odolná proti zavíječi kukuřičnému.Pokud housenka tohoto motýla napadne rostlinu, otráví se. Zavíječe kukuřičného není snadné zničit -jeho housenky se brzy zavrtají do rostliny a jsou tamdokonale chráněny. Člověk se Bt-toxinu nemusí bát.Důkladné testy prokázaly, že škodí právě jen housen-kám motýlů. Lidem ani zvířatům neubližuje aniv nejmenším. Navíc když kukuřice není prožraná zavíje-čem, tak se do ní nepouštějí plísně a rostlina díky tomuneobsahuje mykotoxiny, které jsou na rozdíl od Bt-toxi-nu skutečně nebezpečné. Jejich konzumace je totižspojena kromě jiného se vznikem rakoviny jater.

Bt-toxin byl objeven na počátku 20. století v bakteriiBacillus thuringiensis. Už desetiletí se používá v podo-bě sušených spor bakterií jako ekologický pesticid, kte-rým se „práškují“ rozsáhlé plochy. V bakterii vznikáv netoxické formě. Na toxickou se přeměňuje ve střevuhmyzu (zásaditém prostředí). Účinným se stává povazbě na receptor, který má ve střevní stěně jen vybra-ná skupina organismů. Dnes je k dispozici široké spekt-rum Bt-toxinů, které mají specifický účinek (na housen-ky motýlů, na brouky, na háďátka, aj.). Běžné insektici-dy takovou specifitu nevykazují a účinkují tak na velkémnožství hmyzu. Díky tomu nenarušuje pěstování tzv. Bt-kukuřic biodiverzitu polí. Na polích s genetickymodifikovanou Bt-kukuřicí žije pestřejší společenstvíorganismů než na polích s tradičními odrůdami kukuři-ce. Prokázaly to výzkumy ve Velké Británii a potvrdila topro naše středoevropské podmínky i studie Entomolo-gického ústavu AV ČR3.

V letošním roce bylo zahájeno pěstování Bt-kukuřicetaké v České republice. Byla vyseta na celkovou plochu270 ha půdy. Jde jen o nepatrnou plochu, ale v příštímroce by se tato plocha mohla rozšířit. Geneticky upra-venou kukuřici zkusilo jen několik pěstitelů, největšíplochy jsou na jižní Moravě, některé také ve středníchČechách. Zemědělci museli plnit předepsaná pravidla,zejména dodržovat vzdálenosti mezi dvěma poli, na kterých se pěstovala geneticky modifikovaná plodi-na a plodina konvenční nebo v režimu ekologickéhozemědělství4. Pěstitelé čekají skvělou první úrodu. Na čtyřiceti hektarech kukuřičného pole u Čejče jsourostliny jako ze škatulky. Ani jedna z nich není poláma-ná a napadená škůdci. Právě na tomto poli bez vědomímajitele pana Oldřicha Horáka Greenpeace modifiko-vanou kukuřici otestovalo. Modifikovanou kukuřicí krmísvá prasata, také on podporuje tvrzení, že tato kukuřiceje ještě zdravější, protože neobsahuje nebezpečnémykotoxiny. Geneticky upravená kukuřice by sev budoucnu mohla uplatnit při výrobě bioethanolu -alternativy pohonných hmot z ropy. V tomto případěopravdu nezáleží na tom, zda je kukuřice genetickymodifikovaná5.

Čeští zemědělci letos poprvé sklízeli geneticky modi-fikovanou kukuřici. V rámci EU jsme se připojili k dal-ším čtyřem státům, kde zemědělci zaseli kromě tradičních odrůd také geneticky modifikované odrůdy

kukuřice. K dalším evropským státům pěstující geneticky modifikovanou kukuřici patří Španělsko (cca 50 000 ha), Portugalsko (cca 750 ha), Francie (cca 500 ha) a Německo (cca 360 ha)6.

Geneticky modifikované bramboryGeneticky modifikované brambory obsahující vakcínu

proti hepatitidě typu B úspěšně zvýšily imunitu při prv-ních pokusech na lidech. Při testování efektivity vakcínyv bramborách se jednoznačně ukázalo, že pozměněnéplodiny dokážou výrazně zvýšit množství protilátekv krevním oběhu. Všichni testovaní lidé však byli před-tím proti hepatitidě B konvenčně očkováni, tedy bram-borová vakcína výrazně posílila konvenčně získanouimunitu. GM plodiny by se tak staly levným zdrojemvakcíny, který by se mohl pěstovat a upravovat takév chudších oblastech světa. Výrobci léků jsou protitomuto způsobu šíření vakcíny, hlavně pomocí dalšíchtržních plodin jako jsou banány, rajčata nebo právěbrambory. Důvodem, proč s touto formou výrobcia jejich vývojové týmy nesouhlasí je to, že pokud byk distribuci došlo, plodiny by mohly být konzumoványv neuvážených množstvích s těžko odhadnutelnýminásledky. V současnosti se výzkumné týmy zaměřují natvorbu vakcín v jedlých listech rostlin, které by seneprodávaly jako potravina. Listové pletivo by bylo potéuzavřeno v želatinových kapslích. Nejlepší výsledky seprojevily zatím u rostliny Nicotiana benthamiana7.

Geneticky modifikované brambory v ČRŠlechtitelé Sativy Keřkov navázali spolupráci s Ústa-

vem experimentální botaniky AV ČR, který měl k dispo-zici gen z Francie pocházející z bakterie Lactobacillusbulgaricus. Tento gen kóduje enzym fosfofruktokinázu,který působí v cytoplazmě při odbourávání cukrů glyko-lytickou drahou. Enzym z bakterie má jednu podstat-nou odlišnost, nevadí mu chlad. Rostlina bramboru mávlastní enzymy s aktivitou fosfofruktokinázy, ale obajsou citlivé na chlad, takže při nízkých teplotách přestá-vají fungovat. Konzumní brambory se skladují při níz-kých teplotách, aby neklíčily. V hlízách pak docházík hromadění jednoduchých cukrů, protože enzymys fosfofruktokinázovou aktivitou nepracují, a protobrambory sládnou. Při smažení pak brambory obsahu-jící více jednoduchých cukrů hnědnou, a to je jedenz problémů při výrobě lupínků. Byl připraven konstruktvhodný k použití u brambor a po mnoha experimen-tech se podařilo vnést jmenovaný gen z Lactobacillusbulgaricus do dvou odrůd brambor - Kamýk a Korela8.V roce 2001 byly různé transgenní klony těchto odrůdpěstovány v malém polním pokusu na Šlechtitelskéstanici v Keřkově. Do pokusu byly vysázené pro kontro-lu i netransformované odrůdy Kamýk a Korela.

Ve spolupráci s VÚB v Havlíčkově Brodě byla prove-dena analýza obsahu jednoduchých cukrů u transgen-ních klonů. První analýza byla provedena jeden měsícpo sklizni, kdy teplota při skladování hlíz neklesla pod10 oC. U Kamýku vykazovalo 5 klonů nižší hladinucukrů než kontrola. U Korely neměl žádný transgenní

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 15

klon nižší hladinu cukrů než kontrola. Druhá odrůdamá však vyšší přirozený obsah cukrů v hlízách a většímnožství cukrů může být výrazněji změněno při déletrvajícím působení bakteriálního enzymu. Můžemetedy očekávat, že výraznější změny v transgenních klonech obou odrůd nastanou až při dlouhodobémskladování při 4oC, což je konečná teplota skladování.Tato teplota nevadí enzymu bakterie, ale vyřazuje z čin-nosti oba enzymy rostliny8.

Rajčata produkující více ß-karotenuMezinárodní výzkumný tým zahrnující pracovníky

ze Spojeného království, Japonska a Německa, vyvinulodrůdu rajčat s trojnásobným množstvím ß-karotenuproti běžným odrůdám. ß-karoten patří do skupiny karo-tenoidů - rostlinných pigmentů, které jsou příčinou žlu-tého až červeného zbarvení ovoce, zeleniny a květin. ß-karoten se v lidském těle mění na vitamin A, jehožnedostatek může být příčinou poruch oběhového systé-mu, některých druhů rakoviny a rovněž degeneračníchzměn očí, které mohou vést až k oslepnutí. Vyšší příjemß-karotenu může příznivě ovlivňovat imunitní systéma snižovat případné poškození kůže slunečním zářením.

Jedna z možností zvýšení příjmu karotenoidů je zvý-šit jejich obsah v ovoci a zelenině. Skupina vědců podvedením prof. P. Bramleye z Londýna (Royal Holloway,Univ. of London) pozměnila syntézu karotenoidů rajča-ty přenosem genu jisté bakterie do rostliny. Tento genmění sloučeninu phytoen na lykopen, který je příčinoujasně červené barvy rajčat a dále se účastní syntézy ß-karotenu. Rajčata poté obsahují až 3,5krát více ß-karotenu. Modifikace nemá vliv na růst nebo vývojrostlin a přenáší se i na další generace. Dalším zjiště-ním je, že tepelně zpracovaná rajčata a výrobky z nichmají zvýšenou nutriční hodnotu, protože umožňujílepší absorpci karotenoidů v zažívacím traktu9.

Genetická modifikace rajčatPrvní geneticky modifikovaná rajčata byla vypěstová-

na v polovině 90. let. Měla delší skladovací dobua údajně lepší chuť. Na trh se dostala pod názvem„Flavr Savr“. V současné době se pracuje na širší modi-fikaci, která má dát rajčatům a jiným plodům látkydůležité pro lidské zdraví.

Mezinárodní vědecké konsorcium se snaží získatúplný genom rajčete. Rajče se má stát modelem propráci na jiných plodech. V čele projektu stojí vědečtípracovníci z Cornell University (Ithaca, stát New York)ve spolupráci s vědci z Kanady, Evropy i Číny. V roce2003 začala práce na „Mezinárodním projektu pro stu-dium genomu rodu Solanacea“. Podle Jima Giovanno-niho, amerického zemědělského molekulárního biolo-ga, by měl být znám úplný genom do 2 let. Cílemnásledné modifikace je, aby rajčata produkovala většímnožství vitaminů a antioxidantů jako jsou např. karo-tenoidy, které pozitivně působí proti vzniku rakoviny.Plody jiných rostlin mají vyšší obsah těchto látek, rajča-ta však byla vybrána pro poměrně jednoduchou struk-turu své DNA a pro podobnost s mnoha druhy zeleni-

ny i ovoce. Na základě poznatků získaných na rajčatechse očekává mnohem rychlejší postup při modifikacíchmelounů, banánů a dokonce kávových bobů10.

Zlatá rýžeNový druh geneticky modifikované „zlaté rýže“ tvoří,

ve srovnání se svojí čtrnáct let starou předchůdkyní,mnohonásobně více provitaminu A (ß-karotenu). Zla-tou rýži poprvé připravili v roce 1999 švýcarští a němeč-tí vědci (I. Potrykus z Technical University ve švýcarskémZurichu s kolegou P. Beyerem z německé University ofFreiburg)11. Byla vytvořena, aby produkovala ß-karoten,ze kterého vzniká v těle vitamin A. Tento vitamín máantioxidační účinky, chrání zejména buňky sliznicea kůže, kde se podílí na ochraně před UV zářením. ß-karoten je také důležitou látkou v obraně organismuproti nádorům, infekčním chorobám, dně, překyseleníorganismu a je nezbytný pro správnou funkci zraku.Hladina provitaminu v této rýži dosahuje 1,6 Ķg/g rýže.Nová odrůda ho vytvoří více - 37 Ķg/g rýže. Vyšší výkon-nost nové rýže byla dosažena výměnou genu. Původněbyl do rýže vložen gen pro tvorbu ß-karotenu z narcisu.Zmíněný gen má však svůj protějšek také v kukuřicia vědci zjistili, že právě ten dokáže u rýže výrazně zvý-šit produkci provitaminu. Tvrdí to Rachel Drakeová,která pracuje ve firmě Syngenta Seeds v anglickémCambridge, a jejíž tým novou rýži vytvořil. Rýže vzniklana požadavek humanitární organizace HumanitarienRice Board, která se snaží řešit problémy s nedostat-kem potravy v nejchudších částech naší planety11.

Rýže odolná vůči hmyzím škůdcůmPěstování geneticky modifikované rýže odolné vůči

hmyzím škůdcům přináší čínským farmářům nejen vyššíúrodu a dramaticky nižší výdaje za insekticidy, ale záro-veň jim šetří zdraví. Výzkum provedli vědci z čínské aka-demie věd s americkými kolegy z University of Californiav Davisu a Rutgers University v New Brunswicku. Využili„poloprovozních“ zkoušek geneticky modifikované rýžea prověřili nejen ekonomické, ale i zdravotní následkypěstování GM rýže pro čínské farmáře. Šlo o linie Xia-nyou 63 a Youming 86, které jsou odolné vůči hmyzímškůdcům díky modifikovanému genu pro trypsinovýinhibitor. Výnosy jsou u geneticky modifikované rýže jennepatrně vyšší, ale náklady za insekticidy jsou podstatněnižší. Také šetří čas čínským farmářům, který by strávilipostřikováním rýžoviště (viz. následující tabulka).

Ukazatel Pěstitelé GM rýže Pěstitelé konvenční rýže

Počet ošetření pesticidy(kolikrát se za rok stříkalo)

0,5krát 3,7krát

Výdaje za pesticidy(v juanech na hektar)

31 243

Množství spotřebovanýchpesticidů (kg/ha)

2,0 21,2

Práce vynaložená na postřiky (dny/ha)

0,73 9,1

Výnos rýže (kg/ha) 6 364 6151

Počet zúčastněných farmářů 123 224

11

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 16

12

Farmáři pěstující konvenční odrůdy trpí mnohem vícechorobami vyvolanými otravou pesticidy. V následujícítabulce jsou procenta farmářů, kteří utrpěli újmu na zdraví v důsledku používání pesticidů (počítají sejen problémy, které měl farmář bezprostředně popostřiku rýžoviště, nezapočítávají se možné trvalejšínásledky na zdraví). Pěstitelé geneticky modifikovanérýže na tom byli výrazně lépe12.

Káva bez kofeinuO kávu bez kofeinu je na světovém trhu stále větší

zájem, spotřebitel požaduje kávu, která by mu nezvyšo-vala krevní tlak, a po které by bez problémů usnul,i když si ji dá večer před spaním. V roce 2002 byly vysá-zeny geneticky modifikované kávovníky, které budouprodukovat kávová zrna s minimálním obsahem kofeinu. Tyto rostliny nemají gen pro tvorbu kofeinua kávová zrna obsahují o 50 až 70 % této stimulační

látky méně než zrna pocházející z klasické rostliny. Káva vyrobená ze zrn geneticky modifikované rostlinyby se dostala obsahem kofeinu na hladinu prodáva-ných produktů u nichž je kofein odstraňován fyzikál-ními metodami.

Extrakci kofeinu z kávy je možné dělat dvěma způ-soby. Buďto levnou procedurou s organickými rozpou-štědly (používaná organická rozpouštědla jsou ale kar-cinogenní a v takto připravované kávě stopy rozpou-štědla mohou zůstávat), nebo technologicky náročnýmpostupem pomocí CO2, kdy je získáván zdravotně zcela

nezávadný a aromaticky bohatší produkt. Při výroběkávy bez kofeinu z geneticky modifikovaného kávov-níku by nevznikaly další vedlejší náklady oproti jejívýrobě z klasické plodiny. Autoři výzkumu jsou z NaraInstitute of Science and Technology v Japonsku, vedou-cím týmu je Shinjiro Ogita. Kávovníkové keře se sníže-ným obsahem kofeinu náleží ke kávovníku Coffeacanephora. Na tvorbě kofeinu v rostlinách se podílí třienzymy. Výzkumníci zabránili expresi genu pro theob-rominsyntázu, neboli CaMXMT1. Nyní Japonci již pra-cují na tom, aby stejnou metodou upravili rostliny kávynáležející ke Coffea arabica13.

ROK

Farmáři pěstujícívýhradněGM rýži

Farmáři pěstujícíGM i konvenční rýži

Farmáři pěstujícívýhradně

konvenční rýžiNa pozemcích

s GM rýžíNa pozemcích

s konvenční rýží

2002 0 0 7,7 8,3

2003 0 0 10,9 3,0

Literatura1. http://www.vupp.cz

(zdroj: Spolana noviny č.7, červenec 2005).2. Geneticky modifikované organismy – současnost

a perspektivy (editor: J. Káš, 2004).3. http://www.osel.cz (J. Petr, 10. 9. 2004).4. http://www.agris.cz (zdroj: ČTK, 28.07.2005).5. Mladá fronta Dnes, 03.10.2005.6. http://www.agris.cz k (11.10.2005).7. http://www.uzpi.cz.

8. http://www.agroweb.cz (zdroj: Úroda, 18. 2. 2002).9. http://www.vupp.cz

(zdroj: FOODTODAY–EUROPIAN FOODINTERNATIONAL COUNCIL NEWSLETTER, č. 23, září 2000).

10. Britské listy, 16. 7. 2004.11. http://www.osel.cz (J. Pazdera, 3. 4. 2005).12. http://www.osel.cz (J. Petr, 2. 5. 2005).13. http://www.osel.cz (J. Pazdera, 25. 6. 2003).

GENETICKY MODIFIKOVANÁ JABLKAJitka NajmanováÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

V posledních letech a hlavně v posledním roce sehned několik vědeckých pracovišť zabývá výzkumemjabloní. Tento ovocný druh mírného pásma má několikpodstatných nevýhod pro šlechtění, jako je vysoceheterozygotní charakter genomu a dlouhý reprodukčnícyklus. Na molekulární bázi se vědci snaží vylepšovatbarvu plodů, odolnost vůči patogenům, ale třebai zavést přesné metody pro určování původu novýchodrůd vzniklých křížením.

Alely kontrolující barvu jablekBarva je jedním z nejdůležitějších parametrů pro

obchod s jablky, neboť zákazník upřednostňuje červe-

nou barvu před žlutou a zelenou. Červená barva jablkaje podmíněna množstvím antokyaninu, zelená a žlutámnožstvím a poměrem karotenoidů a chlorofylu. Barva je u jabloní řízena jedním genem a přítomnostčerveného pigmentu je dominantní. Na chromozomujsou přítomny dva fragmenty kódující červenou barvu – A1 (1160 bp) a A2 (1180 bp) a dva fragmentykódující žlutou barvu - a1 (1230 bp) a a2 (1320 bp).Melounová a kol.1 kontrolovali pomocí PCR zbarveníu 21 českých odrůd jabloní s cílem ověřit gene-tický původ jednotlivých barev, neboť variabilita červené či žluté barvy je velmi často geneticky nepodmíněna.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 17

13

Zbarvení jablek bylo hodnoceno podle Cheng a kol.2.V Tab. 1 vidíme, že pouze u 4 odrůd byla zjištěna žlutábarva. Z toho 2 jablka měla červený nebo oranžovýnádech, ačkoli PCR analýza neprokázala A-alelu. Tmavěčervené zbarvení bylo typické pro homozygoty A1A1.Alela A2 se v žádné z 21 testovaných českých odrůd jablek nevyskytovala. Tato alela pochází z odrůdy WhiteAngel z Asie.

Alely kontrolující neslučitelnost stejných genůNeslučitelnost genů je způsob, jak se rostliny chrání

před opylením jejich vlastním nebo příbuzným pylem.Neslučitelnost je řízena skupinou S-alel, které jsoulokalizovány na multifunkčním lokusu (S-lokus) na pes-tíku. Opylení a růst je inhibován, pokud pyl a pestíkmají ty samé S-alely. Do dnešní doby bylo na světěpopsáno 25 typů S-alel. Běžně se vyskytují S1 – S11,ostatní pouze u samostatných kultivarů. Pomocí PCRanalýzy Melounová a kol.1 zjišťovali typ S-alely jednotli-vých odrůd, aby tak ověřili pravost rodičovských odrůd.Např. u odrůdy Jantar byly zjištěny alely S3S7. Jako rodi-čovské odrůdy jsou udávány Golden Delicious x Jonat-han, tomu odpovídá známé složení S-alel: S2S3 x S7S9.Obě dvě rodičovské odrůdy se však podařilo ověřitpouze ve dvou případech. U většiny odrůd byl ověřenjeden z rodičů (11 odrůd), u zbylých se nepodařilo ově-řit původ S-alel vůbec.

Pomocí této analýzy je možné také určit ty odrůdyjabloní, které jsou si navzájem špatnými opylovači. Bla-žek3 popsal odrůdy Vanda a Rosana jako špatné opylo-vače, což se také PCR analýzou prokázalo. Obě odrůdy

mají S5 alelu. Z určených odrůd lze následně vybrat ty,které mají ojedinělou S-alelu, neboť ty budou dobrýmiopylovači pro druhy s obvyklou S-alelou.

Alely kontrolující rezistenci vůči strupovitostiDalší trend ve šlechtění jabloní je získávání odrůd,

které jsou rezistentní vůči strupovitosti. Původcem stru-povitosti jabloní je vřeckovýtrusná houba Venturia ina-equalis. Houba napadá listy i plody jabloní. Na plodechse objevují různě velké šedočerné skvrny, pokožkav místě napadení korkovatí a někdy praská. Silně napa-dené listy, květy a mladé plůdky předčasně opadávají.K získání této rezistence se používá dominantní Vf-alela. Častý donor této alely je Malus floribundaSieb. klon 821 (Vejl a kol.4). Pro detekci tohoto genu sepoužívá PCR metoda navržena Vejl a kol.4 a Melounováa kol.1. Opět 21 českých odrůd jabloní bylo podrobenotéto analýze. U všech rezistentních odrůd Melounováa kol.1 detekovali heterozygotní genotyp Vfvf. Ve všechcitlivých odrůdách a v odrůdách s částečnou polygennítolerancí vůči strupovitosti detekovali genotyp vfvf.Homozygotní genotyp VfVf není popsán u žádné českéodrůdy jabloní.

Další možností jak vyšlechtit rezistentní odrůdu, je vložení Vm genu z odrůdy OR 45 T 132. Tento genvšak nebyl nalezen v žádné z nových českých odrůdjabloní.

Identifikace podnoží jabloní pomocí SSR-markerůSSR („simple sequence repeat“) isolované z jabloní

se používají pro identifikaci kultivaru, pro posouzení

Tab. 1: Charakteristika barev pokožky jablek a detekované složení A-alel.

varianta barva pokožkyklasifikace podle

Cheng a kol.detekovaný genotyp

Aneta převážně tmavě červená červená A1a2

Angold žlutozelená s červeným nádechem žlutá a2a2

Biogolden čistě žlutá žlutá a1a2

Goldstar čistě žlutá žlutá a1a1

James Grieve Red převážně tmavě červená červená A1A1

Jantar převážně šarlatově červená červená A1a1

Jonalord převážně tmavě červená červená A1A1

Julia převážně tmavě červená červená A1A1

Karmína šarlatově červená po celém ovoci červená A1A1

Klára převážně tmavě červená červená A1a2

Melodie převážně nachově červená červená A1A1

Nabella převážně karmínově červená červená A1A1

Nela převážně tmavě červená červená A1A1

Otava žlutá s oranžovým nádechem žlutá a1a2

Rajka převážně jasně červená červená A1a1

Rosana převážně karmínově červená červená A1a1

Šampion červenopruhovaná červená A1a2

Selena převážně tmavě červená červená A1a1

Sparjon převážně tmavě červená červená A1a1

Vanda převážně jasně červená červená A1a1

Zuzana převážně oranžovočervená červená A1a1

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 18

14

genetické rozmanitosti a k sestavování genetickýchmap potomků roubování. Kvůli nekontrolovanému vol-nému opylování, nesprávnému určování štěpů a jedno-duchosti s jakou se rostlinný materiál přenáší mezizeměmi, je složité určit pravou identitu mnoha klonůa podnoží. Oraguzie a kol.5 provedli PCR analýzu sesedmi SSR-markery u šedesáti šesti podnožních klonůjabloní z celého světa. Sedm SSR-lokusů dávalo jedenaž dva slabé produkty u všech testovaných podnoží.Analýza původu ukázala, že všechny hybridní klony zís-kaly po jedné alele z každého rodiče, kdežto subklonyměly identický genotyp s jejich virem infikovaným rodi-čem. Výsledky také ukázaly, že klon Mpumila M1, kterýbyl považován za rodiče klonu USA Mac1, jím pravdě-podobně není, neboť se lišil ve čtyřech ze sedmi alel.Tento výzkum prokázal, že SSR-markery mohou být užitečné při ověřování původu klonů, a že příbuznostpodnoží je primárně založena spíš na genetickém nežna geografickém původu podnože. Tento výsledekkoresponduje s faktem, že se pro šlechtění využívápouze několik běžných druhů. Některé klony se bohužel nepodařilo zařadit vůbec. Pro vylepšení metody je pravděpodobně zapotřebí optimální početSSR-markerů.

PCR-RFLP analýza DNA z Candida phytoplasmaprunorum

Candidatus phytoplasma prunorum neboli fytoplaz-ma evropské žloutenky peckovin („European stone fruityellows“ – ESFY) infikuje různé druhy rodu Prunus.V minulosti dostala několik jmen podle druhu a rozdíl-ných symptomů (leptonekróza slivoní, Molierovanemoc u třešní, fytoplazma chlorotického svinovánílistů meruněk). Příbuzná fytoplazma je známá takéu hrušek (pear decline) a u jabloní (proliferace jabloní- AP). Běžné symptomy ESFY jsou žloutnutí a svinutílistů v létě, mimosezónní růst v zimě, odumírání ažúplný rozklad rostliny. Hlavním přenašečem je člověkpři vegetativním rozmnožování.

Poprvé identifikoval primery pro PCR a RFLP analýzufytoplazmy u ovocných stromů Jarausch a kol.6 v roce1994. Použil k tomu chromozomání fragment (1–8 kbp) z AP fytoplazmy. PCR ukázala, že AP fytop-lazma může být rozdělena do třech podtypů s odlišnouDNA. Některé z těchto primerů se ukázaly být schopné

amplifikovat homologní fragment u ESFY fytoplazmy.U ní však nebyly zjištěny žádné rozdíly v DNA isolátůz devíti podtypů (rozděleny podle druhu rostliny, na kterou působí). V roce 2000 analyzovali Jarauscha kol.7 175 fytoplazem (izolovaných ze čtyř jihoevrop-ských zemí, z různých druhů rodu Prunus). Jeden primer se ukázal vhodný pro všechny druhy, tvoří pro-dukt o velikosti 237 bp. Tento produkt tvořily všechnyanalyzované vzorky, což prokázalo infekci ESFY fytop-lazmou, ačkoliv se charakteristické letní symptomyu nich neobjevily. Tím byl také potvrzen výskyt tétonemoci v zemích, kde se zatím neobjevila (např. Tu-recko). Jelikož byla infekce prokázána u všech vzorků,vyplývá z toho, že nemoci meruněk a slivoní ve Španěl-sku a Itálii (fytoplazma chlorotického svinování listůmeruněk, leptonekróza slivoní) jsou také způsobenyfytoplazmou ESFY. Tento výsledek je překvapující,neboť se předpokládalo, že se fytoplazma u různýchdruhů a různých symptomů bude geneticky lišit stejnějako AP fytoplazma. Do dnešní doby není známa rezistence vůči ESFY fytoplazmě.

ZávěrVelkým problémem pěstitelů jsou stále více se rozši-

řující nemoci téměř všech ovocných stromů. To můžebýt způsobeno křížením malého počtu odrůd mezisebou. Nové odrůdy jsou méně vitální, mají abnormál-ní morfologii květů, jsou snadněji napadnutelné pato-geny a stávají se až neplodnými. Genetické manipulaceposkytují nové možnosti, jak vylepšit požadovanouvlastnost bez výše zmíněných negativních dopadů.Naděje svítá i pro alergiky, neboť se začalo pracovat na potlačení exprese genu kódujícího alergen Mal d 1,na který se váží protilátky IgE, a tím aktivuje alergickoureakci. Studie Gilssen a kol.8 prokázala významně vyššíalergickou reakci na původní klíční rostlinu než na jimipřipravené transformanty. Úplně jiné potlačení expresegenu se podařilo Bulley a kol.9. Potlačením expresegenu pro enzym syntetizující gibberelin (gibberelin-20-oxidasa) se vědcům podařilo výrazně snížit výškujabloně za použití minimálního množství chemickýchretardantů růstu. Potomek zůstane zakrslý i po narou-bování na normální specielně vyšlechtěnou podnož,která může nést například rezistenci vůči patogenu čipesticidu.

Literatura1. Melounová M. et al., Plant Soil Environ. 51, 65

(2005).2. Cheng F.S. et al., Theor. Apll. Genet. 93, 222 (1996).3. Blažek J.: Pěstujeme jabloně, Brázda, s.r.o., Praha

2001.4. Vejl P. et al., Plant Soil Environ. 49, 427 (2003).5. Oraguzie N.C. et al., Plant Breeding 124, 197 (2005).

6. Jarausch W. et al., Appl. Environ. Mikrob. 60, 2916(1994).

7. Jarausch W. et al., Mol. Cell. Probe 14, 171 (2000).8. Gilissen L.J.W.J. et al., J. Allergy Clin. Immun. 115, 364

(2005).9. Bulley S.M. et al., Plant Biotechnol. J. 3, 215 (2005).

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 19

15

AbstractAn escalating demand exists for simple, quick and

reliable screening methods in food and environmentmonitoring. Although several chemical methods suchas gas chromatography (GC), high performance liquidchromatography (HPLC), GC-MS etc. have been intro-duced for trace level detection of analytes, bio-analyti-cal methods holds an advantage in that they are fas-ter and cheaper. In bio-analysis, enzymes, antibodies,aptamers, peptides, microbial, plant and animal cellsare employed as bio-receptor molecules. Advances inbiochemistry, molecular biology, and immunochemist-ry have expanded the range of biological recognitionelements. To design the biosensors, bio-receptor mole-cules are interfaced with various transducing surfaces.By employing these receptor molecules quick detectiontools such as dipstick and protein microarrays havebeen introduced.

IntroductionThe importance of environmental and food analysis

has become increasingly evident during the last deca-de for many purposes, such as the diagnosis of patho-gens, toxins, pollutants etc. The most commonly usedmethods for the detection of harmful chemical residu-es are Gas Chromatography (GC), High Pressure LiquidChormatography (HPLC), GC-Mass Spectroscopy (GC-MS), LC-MS/MS etc. These methods are highly sensiti-ve and reliable, however, costly and time-consumingbecause they usually require complicated sample pre-paration steps. The development of new methods forrapid and inexpensive determination of analytes is the-refore required.

Bioassays are a potential alternative to the expensivechemical methods, as they are reliable, accurate, rapid,inexpensive and simple. Bioreceptors can be dividedinto three distinct groups: biocatalytic, bioaffinity, andmicrobe/cell-based systems and play a key role in bio-assays as they recognize the target analyte. Biocataly-sis-based bioassays depend on the use of enzymes tomoderate a biochemical reaction. Bioaffinity-basedbiosensors rely on the use of proteins or DNA to recog-nize and bind a particular target. Microbial / cell basedbiosensors use microorganisms as the biological recog-nition element. These cell based systems generallyinvolve the measurement of microbial respiration, or itsinhibition, using the analyte of interest. Compared toenzyme-based approaches, microorganism-based bio-assays / biosensors are relatively inexpensive to con-struct and can operate over a wide range of pH andtemperature.

EnzymesEnzymes are globular proteins that serve as catalysts.

Their folded conformation creates an area known asthe active site. The nature and arrangement of aminoacids in the active site make it specific for only one typeof substrate. Once the enzyme has bound its substrate(much like a key in a lock), a reaction occurs to modi-fy the substrate in some way. The modified substrate isthen released as a „product“ and the enzyme is free tocatalyse another reaction.

Enzymes are the most commonly used bio-receptorsin bioassays. The analyte can be the enzyme, whoseenzymatic activity is determined, or the substrate or theenzyme cofactors. Enzymatic assays are mainly basedon either inhibition of the enzyme activity or catalysis.For example variety of enzymes such as organophosp-horous hydrolase (OPH), alkaline phosphatase, ascor-bate oxidase, tyrosinase and acid phosphatase havebeen employed in design of pesticide bioassays andbiosensors. Cholinesterases, acetylcholine esterase(AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE), have beenwidely used in bioassays due to their stability and sen-sitivity and are used in bioassays against pesticides andinsecticides based on the pollutants inhibiting action.The reaction is monitored by measuring the colorintensity in spectrophotometer, by measuring acid pro-duction in potentiometric systems or direct oxidation ofthiocholine on the electrode surface in amperometricdetection systems (Kandimalla and Ju, 2006). Someamperometric based methods use duel enzyme sys-tems such as AChE and choline oxidase. OPH catalyzesthe hydrolysis of a wide range of organophosphate(OP) pesticides, and as a result of its versatility, thisenzyme has been incorporated into a number of assaysand sensors for the detection of OP compounds andnerve destroying agents. Additional enzymes can beused to detect other environmental and food contami-nants such as nitrate, nitrite, sulfate, phosphate, heavymetals and phenols. Tyrosinase is frequently used todetermine phenols, chlorophenols, cyanide, carbama-tes and atrazine.

AptamersAptamers are oligonucleic acid (DNA or RNA) sequen-

ces that bind a non-nucleic acid targets with high speci-ficity and affinity. Aptamers are generally producedthrough an in vitro evolutionary process called „systema-tic evolution of ligands by exponential en-richment“(SELEX) (Hamula, 2006). In many cases RNA librariesyield aptamers with higher binding affinities than DNAlibraries due to the ability of RNA to take on a wider

BIO-RECEPTOR BASED METHODS (BIO-ASSAYS) FOR FOOD,ENVIRONMENT AND CLINICAL ANALYSISVivek Babu Kandimalla, Nagamani Kandimalla, Milan FránekVeterinary Research Institute, Hudcova 70, Brno 621 00, Czech Republic,e-mail: franek@vri.cz

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 20

16

variety of conformations than DNA. In 1990, the discove-ry of aptamers by Tuerk and Gold and subsequently byEllington and Szostak spawned significant interest andwere entered into therapeutic and diagnostic applicati-ons and emerged as a valuable research tools. Aptamershave been selected for a wide array of targets includingproteins, carbohydrates, lipids or small molecules. Apta-mers may mimic antibodies in a number of applications,such as flow cytometry, ELISA, cell sorting, fluorescencemicroscopy, western blotting, and biosensors or chips.Aptamers have a number of advantages compared toantibodies as they are smaller in size, their sensitivity canbe increased, the possibility for in vitro production, andthus lack of immunization and animal hosts. The bindingaffinity, specificity and stability of aptamers can beimproved by rational design or molecular evolution tech-niques (Kandimalla and Ju, 2004). Due to specificity andease in labeling with fluorescence, radio isotope, ormodification of nucleic acid sequence, aptamers areexcellent receptor candidates for bioassays and biosen-sors. One of the best approaches is the development ofmolecular aptamer beacon (MAB), with which real timetarget recognition and quantification is possible. InELISA, immunoglobulins are the primary recognitionagents; using the same principle, enzyme linked oligo-nucleotide assay (ELONA) can be prepared using apta-mers as the recognition agents. MABs are similar to themolecular beacons (MBs). Like MBs the 5 and 3 ends inMABs can also be tagged or conformationally changedand/or a distance increase between quencher and fluo-rophore, leading to a detectable signal. The fluorescencesignal increased or quenched is directly proportional tothe target concentration. Li et al., (2002) reported ananti-thrombin aptamer beacon capable of recognizingthrombin, with a detection limit of 112 pM in a homoge-neous solution.

Polypeptides / Protein scaffoldNatural biopolymers such as proteins and DNAs frequ-

ently have helical conformations that contribute to thethree-dimensional ordered structure and the specificfunction of the biopolymer. As a part of the cell signalingpathways and enzymatic reactions, conformational alte-rations of biomolecules are very important in biologicalsystems. Likewise the artificially and specifically foldedpolypeptide structures are other attractive receptormolecules in biosensing and screening systems. Theseare robust and easily synthesized by well-establishedmethods and because of the huge chemical diversitythat can be generated in a short time with modest synt-hetic cost and effort. The amino acid sequence can bevaried over a wide range to provide access to a variety ofscaffold (binding domain) structures, and highly specificrecognition sites and reporter groups can be introducedpost-synthetically by orthogonal (controlled synthesis)strategies on the solid phase. Fluorescent probes, chro-mophores, oligonucleotides, sugars, lipids etc can be introduced in different configurations, turning into a veryattractive and general tool for the development of

a wide range of ligand receptor systems. Enander et al.,(2002) reported a folded ligand modified helix-loop-helix polypeptide scaffold for the detection of humancarbonic anhydrase II (HCAII), which catalyses the rever-sible hydration of carbon dioxide. The fluorescence ofthe peptide modified with a benzenesulfonamide (inhi-bitor of HCAII) derivative and a fluorescent probe wasmonitored as a function of HCAII concentration and thedissociation constant (Kd). The fluorescence of polypep-tide increases in the presence of HCAII, due to a changein the molecular environment of the dansyl group uponbinding with HCAII, whereas the probe is partially quen-ched in the absence of the HCAII.

AntibodiesAntibodies have made a substantial contribution

towards the advancement of diagnostic assays and havebecome indispensable in most diagnostic tests that areused routinely today. Antibodies are capable of exhibi-ting very specific binding capabilities for desired structu-res. The past few years have seen an increase towardsgreater use of antibody based assays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the field of foodand environmental monitoring (Fránek et al., 2006). The efficiency and accuracy of the immunoassay (IA) isdependant on the stability and affinity of the employedantibody (Tetin and Stroupe 2004). Antibodies are highly complex and made up of hundreds of individualamino acids arranged in a highly ordered sequence. Theimmune system of mammals and other vertebrates isable to recognize an extremely large number of differentmolecules and respond to immunogenic stimuli by sec-reting specific antibodies into the blood stream. Whenanimals are immunized with a strong immunogen fora relatively long period of time their blood serum willcontain high concentrations of highly specific polyclonalantibodies. Introduction of hybridomas for monoclonalantibody production in the mid 1970s revolutionizedimmunochemistry and brought antibody-based techni-ques to a higher level of specificity, sensitivity and of keyimportance, manufacturability. The recent progress inconstruction of recombinant antibodies leads to excitingnew fields of antibody design. In addition, plants andcrop species in particular, have the potential to enableextremely cost-effective and efficient production of anti-bodies (plantibodies). Phage display technology hasproved to be robust and is able to produce the recombi-nant antibody fragments, for example single-chain antibody variable region fragment (ScFv) and fragmentantigen binding region (Fab) (variable domains plus thetwo of the constant domains).

Some IAs work in homogeneous phases (in solutionor gels), whereas the majority are heterogeneous assays,involving the adhesion of antibodies and/or antigens toa solid surface. The surfaces used in the heterogeneousassays are usually the walls of microtiter plates with 96or more wells. Some assays are competitive, in whichlabeled analyte competes for the binding sites of antibo-dies with analyte in samples, where the decrease in

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 21

17

bound (or increase in free) labeled antigen is measured.Noncompetitive (sandwich) IAs, which are based on twoantibodies to different epitopes, are known to work wellfor high-molecular-weight analytes. Compared withcompetitive immunoassays they have many advantages,for example improved speed, sensitivity, and specificity.

The first IA used iodine radioisotopes (125I or 131I),however enzymatic labels are now more common suchas, horse radish peroxidase, ß-D-glucoseoxidase andalkaline phosphatase. Enzymatic labels are eco-friend-ly whereas radioisotopes are toxic and have a shorthalflife. Fluorescent materials such as fluorescene isot-hiocyanate (FITC) etc are employed as labels in fluores-cence based assays.

Chiefly, IAs provides a rapid and cost effective analy-sis for the determination of a variety of environmentalcontaminants. In addition IA provides high sensitivityand specificity due to the powerful catalytic ability ofenzyme and the extraordinary discriminatory capabiliti-es of antibodies. IA methods are fast and relativelyeasy, compared to conventional GC/MS and HPLC asthey don’t require a multi-step cleanup process. Onedisadvantage is that ELISA is usually performed ina laboratory using microtitre plates and, thus are notsuitable for on-site monitoring.

Polyclonal and monoclonal antibodies have beensuccessfully developed in the Department of AnalyticalBiotechnology, Veterinary Research Institute (VRI).Their application in ELISA and immunosensor develop-ment has been directed especially towards phenoxya-cetic acid herbicides, s-triazine herbicides, sulfonylureaherbicides, polychlorinated biphenyls, surfactants (linear alkylbenzene sulphonates) and toxic metaboli-tes (nonylphenol), and selected veterinary drugs(namely nitrofurans and sulfonamides). More informa-tion and technical discussion can be found in papersby Fránek, 1998 and Fránek and Hruska, 2005.

Whole cellsFor the biological assay of antibiotics, cup plate bio-

assay was widely used. In this method the added anti-biotic inhibits the growth of microorganisms, seeded inthe agar. The resulting inhibition zone (in the agar) isdirectly proportional to the logarithm of the concentra-tion of antibiotic. In recent years, luminescent bacteria-based bioassays have been introduced for the detecti-on of various compounds such as drugs or toxins.Depending upon the analyte action on the microbialcell, luminescence may increase or decrease. Themajor advantage with whole cell bioassay is that theycan act as a bag of enzymes, whereas protein confor-mation of the enzyme is more stable, as they are ina native environment. At the same time this techniquecan reduce the purification costs and the ease ofencapsulation. Recombinant luminescent bacteria aregenerally used in environmental pollutants analysis e.gdioxines. Stability of the cell can be increased byentrapping it in a suitable matrix (i.e sol-gel etc), whichallows for the repeated use of whole cells.

Plant cells (tissues) have also been employed in bio-assays, for the determination or organophosprorouspesticides. A study of cucumber tissue scrapings(oscorbate oxidase) were interfaced with an oxygenelectrode. In the presence of pesticide, the reducedenzyme activity was measured amperometricllay. The output voltage of the biosensor is proportional tothe pesticide concentration (Rekha et al., 2000). The physiology of the some animal cell lines changesin the presence of ligands / pathogens / viruses. Thephysiological changes in presence of viruses in Africangreen monkey kidney cell lines were correlated usingBioelectric Recognition Assay (Kintzios et al. 2004).Recombinant Mouse hepatoma cells have beenemployed for the direct detection of halogenated andpolycyclic aromatic hydrocarbons such as dioxines. In this system, the induction of firefly luciferase takesplace in presence of halogenated and polycyclic aromatic hydrocarbons (Ziccardi et al., 2000)

Applications of BioreceptorsBiosensors

For practical food and environmental monitoring,health protection and medical applications, the deve-lopment of low cost, rugged and practical biosensorsthat can be used in the field can be a major drivingforce for the expansion of biosensors. A biosensor ismade from a biological sensing element attached toa signal transducer. The sensing element may be anenzyme, antibody, DNA fragment, or microorganism,whereas the transducer may be electrochemical, opti-cal, piezoelectrical or acoustic. Electrochemical trans-ducers measure changes in current or voltage, opticaltransducers measure changes in fluorescence, absor-bance or reflectance, and acoustic transducers measu-re changes in frequency resulting from small changesin the mass bound to their surface.

Immunosensors transduce antigen-antibody interacti-ons directly into physical signals. The design and prepa-ration of an optimum interface between the biocompo-nents and the detector material is a key part of sensordevelopment. Most of immunosensors require the labe-ling of antigen or antibody, whereas piezoelectric immu-nosensors allow direct label-free and real-time monito-ring of affinity interactions and is the economic alterna-tive to the overpriced optical systems. Distinct immobili-zation methods can be employed for the attachment ofbiomolecules to the transducer surface such as cross-lin-king, covalent binding, entrapment etc. The immobiliza-tion method must be mild, should reduce steric hindran-ce and be biocompatible (Kandimalla et al., 2006).

MicroarraysMicroarray technology offers the opportunity to rapid-

ly and cost-effectively test for a wide variety of gene andprotein targets on a platform little bigger than a postagestamp, using extremely small sample volumes. Proteinarrays are rapidly becoming established as a powerfulmeans to detect proteins, pathogens and other contami-

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 22

18

nants. Protein arrays have been designed as a miniaturi-zation of familiar immunoassay methods such as ELISAand dot blotting, often utilizing a fluorescent readout,and facilitated by robotics and high throughput detecti-on systems to enable multiple assays to be carried outin parallel. Commonly used physical supports includeglass slides, silicon, microwells, nitrocellulose membra-nes, and magnetic amongst other microbeads. Miniatu-risation of detection tools facilitates easy transportation,onsite analysis, cost reduction, improved detection limitsand low volumes of reagents. DNA arrays are based onthe hybridisation technique. Oligonucleotides or PCRprobes are immobilized on a solid support (the matrix)and due to their specificity to a target gene they detectcomplementary sequences present in the sample to beanalyzed. Hybridization signals are detected, dependingupon the type of labeling, by either radiography or fluo-rescence, then quantified. Microarrays are not limited toDNA analysis; protein microarray, antibody microarray,and chemical compound microarray can also be produ-ced using biochips. It depends on the used bioreceptormolecule. A biochip consists of an array of individual bio-sensors that can be individually monitored and aregenerally used for the analysis of multiple analytes. Aspreviously mentioned a bioreceptor can be a biologicalmolecular species (e.g., an antibody, an aptamer, anenzyme etc) that utilizes a biochemical mechanism forrecognition.

Dipstick assayOn-site analysis is a more efficient approach than

taking a sample, transporting it to a laboratory andthen performing the determinations, as is the commonpractice. On-site analysis can reduces errors and elimi-nate the possibility of sample change and time delayswhich are associated with both sample transport andstorage, resulting in more accurate, precise and rapidlyavailable analytical data. Although most biosensorsoffer quick and fast analysis within a laboratory, theyare typically poorer at on-site determination due to theinfluence of environmental factors i.e temperature,humidity etc. Compared to biosensors, the dipstickmethod is simple, and an instrument-independentmethod for the visual detection and highly amicable aton-site identification / semi quantification of analytes.

Dipstick immunoassays also follow the standard ELISAprocedure, but use a membrane as the antibody-coatingsupport and the color development (colored spot orline) can be visualized with an unaided eye. Their use asa diagnostic tool for detecting pesticides and othergroups of contaminants is becoming more common.A substantial limitation of these rapid dipstick immuno-assays, however, is usually their low sensitivity.

ConclusionEnzyme and antibody-based assays have been exten-

sively used in clinical applications since the early-1970’s. Countless studies have demonstrated the cor-relation between immunoassay results and traditionalmethodologies based on the instrumental analysissuch as gas chromatography (GC) and high performan-ce liquid chromatography (HPLC). Immunoassays haveproven to be simple, rapid and inexpensive methodsfor monitoring harmful residues. Further developmentin food and environmental screening depends almostentirely on the ability to develop novel antibodies ina more cost effective way. Other bioreceptors i.e apta-mers (DNA / RNA), polypeptides, whole cells (microbi-al, plant and animal) are also offering excellent detec-tion capabilities in clinical, food and environmentalanalyses, however constructive efforts are needed toimprove bioreceptor sensitivity and stability. This maybe possible through recombinant DNA technology,allowing effective changes in the protein active site. Anincreased interest in the development of class-specific(generic) bioreceptor reagents is also being observed.Currently one of the focuses is to develop on-site devi-ces, as seen in the present trend in instrumentationresearch and developments in imaging monitoring,miniaturisation, integration, nanotechnology, compute-rised data analysis and wireless communication.

AcknowledgementsThe authors acknowledge the financial support from

the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (ProjectNo. MZE 0002716201) and from the European Commis-sion (Project No. NMP4-CT-2006-017333, CARE-MAN),and wish to thank Eloise H. Kok for careful reading of themanuscript to improve the quality of article.

References1. Enander K. et al., 2002, J. Org. Chem.67: 3120-3123.2. Fránek M., 1998, In Biosensors for direct monitoring

of environmental pollutants in field, Kluwer publis-hers, Netherlands, 115-126.

3. Fránek M. and Hruska K., 2005, Vet. Med. 50: 1-10.4. Fránek et al., 2006, Anal. Chem. 78: 1559-1567.5. Hamula C. L. A. et al., 2006, Trends Anal. Chem. 25:

681-691.6. Kandimalla V. B. and Ju H. X. 2004, Anal. Lett. 37:

2215–2233.7. Kandimalla V. B. et al., 2006, Crit. Rev. Anal. Chem.

36:73 –106.

8. Kandimalla V. B. and Ju H. X. 2006, Chem. Eur. J. 12:1074-080.

9. Kintzios S. et al. 2004, Biosens. Bioelectron. 20:907– 916.

10. Li JJ. et al. 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun.292: 31-40.

11. Rekha K et al., 2000, Biosens. Bioelectron. 15:499–502.

12. Tetin S.Y. and Stroupe S. D. 2004, Curr. Pharmaceu.Biotechnol. 5: 9-16.

13. Ziccardi M. H. et al., 2000, Toxicological Sci.54:183–193.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 23

19

ÚvodNádorové choroby ročne spečatia osudy miliónov

ľudí na celom svete. Vo vyspelých krajinách sú v poradídruhou najčastejšiou príčinou úmrtia hneď po kardio-vaskulárnych chorobách. I napriek snahe veľkéhomnožstva výskumných onkologických pracovísk sa natomto fakte za posledných niekoľko desaťročí nič podstatné nezmenilo – naopak, podľa údajov z Ameri-can Cancer Society a Svetovej zdravotnej organizácie(WHO) sa incidencia nádorov za posledných dvadsaťrokov zvýšila z 238 registrovaných prípadov (rok 1980)na 668 prípadov (rok 2004) na 100 000 obyvateľov.Každoročne pribudne 160 000 nových prípadov nádorov u detí. V dosledku chýbajúcich onkologickýchregistrov v niektorých krajinách je toto číslo pravdepo-dobne orientačné a skutočný počet detí s nádormi jeešte vačší. Výskyt niektorých nádorov má v celosveto-vom meradle neustále stúpajúcu tendenciu. Typickýmpríkladom je malígny melanóm, zhubný nádor kože,u ktorého je každoročný nárast novo diagnostikova-ných prípadov v belošskej populácii takmer 5 percent!Počet nádorových ochorení v Českej a Slovenskejrepublike, spolu s percentom mortality, zaraďuje tietokrajiny na popredné miesta v svetovom rebríčku. Štan-dardné prístupy k liečbe nádorov ako chirurgická excí-zia, chemoterapia, rádioterapia, či novšie tzv. bioche-moterapeutické prístupy (chemoterapia kombinovanás niektorými cytokínmi alebo protilátkami proti cytokí-nom) sú účinné predovšetkým v začiatočných štádiáchochorenia. K manifestácii prejavov nádorového ochore-nia však často dochádza až v štádiu diseminácie pri-márneho nádoru a tvorby sekundárnych nádorovýchložísk (metastáz), ktoré postihujú životne doležité orgá-ny. Mnoho pacientov tak vyhľadáva pomoc lekára ažv okamihu, kedy je už akákoľvek forma terapie neúčin-ná. Vzniká tak neustála potreba hľadať nové prístupyk liečbe rakoviny a poznávania ich účinkov na viacerýchzvieracích modeloch pred ich zavedením do štádia kli-nického skúšania.

Cytokíny v imunoterapii nádorovDo centra pozornosti sa v poslednom období dostá-

va výskum terapií, pri ktorých dochádza k moduláciiimunitného systému – tzv. imunoterapií. Vhodnou sti-muláciou prirodzenej protinádorovej imunity napr.pomocou nádorových vakcín, či aplikáciou autológnychimunitných buniek (dentritických buniek a cytotoxic-kých T-lymfocytov) aktivovaných in vitro dochádzak aktivácii bunkovej a hormonálnej zložky imunitného

systému. Podstatnú úlohu v procese imunologickejodpovede na nádory zohrávajú cytokíny – malé proteí-nové molekuly, sekretované leukocytmi a inými bunka-mi. Podľa účinku na rast nádoru ich možno principiál-ne rozdeliť na dve skupiny – na cytokíny, ktoré posobiaimunostimulačné (prozápalové cytokíny, so stimulač-ným účinkom na bunky imunitného systému), a imu-nosupresívne (protizápalové, potláčajúce vývoj imunit-nej odpovede).

Vzájomný pomer imunostimulačných a imunosupre-sívnych cytokínov rozhoduje o úspešnosti protinádoro-vej liečby. Pokiaľ je tento pomer v prospech imunosti-mulačných cytokínov, je prognóza vo vačšine prípadovdobrá. Imunologické štúdie ukázali, že progresia nádo-rov závisí na interakcii zložiek imunitného systémus nádorovými bunkami. Pomer cytokínov produkova-ných pri imunologickej odpovedi bunkami imunitnéhosystému a cytokínov produkovaných samotnými nádo-rovými bunkami može rozhodnúť o postupujúcej pro-gresii alebo naopak regresii nádoru. Imunosupresívnecytokíny – IL-8 (interleukín 8), IL-10, TGF-β1 (transfor-ming growth factor) – sú produkované nádorovýmibunkami a majú významnú úlohu pri prekonávaní imu-nitného dozoru (inhibujú proliferáciu T-lymfocytov – IL-10, TGF-β1) a posobia ako angiogénne faktory pri neo-vaskularizácii rastúceho nádoru (IL-8, TGF-β1). Naprotitomu protinádorové cytokíny – TNF-α („tumour necro-sis factor alpha“), IFN-γ (interferon gamma), IL-4, IL-12– inhibujú rast nádoru, zvyšujú jeho antigénne vlast-nosti a potencujú diferenciáciu imunokompetent-ných buniek. Sledovanie pomeru hladín prozápa-lových a protizápalových cytokínov v priebehu terapiea po nej má aj doležitý význam v určení prognózy ochorenia.

V posledných rokoch sa cieľom zásahu v rámci proti-nádorovej terapie stáva mikroprostredie obklopujúcenádor (tzv.“tumour microenvironment“). To produkujecelé spektrum cytokínov, ktorých prítomnosť je výsled-kom zložitých interakcií medzi nádorom, stromatickýmia endoteliálnymi bunkami, fibroblastmi a zložkamizápalového infiltrátu. Pokusy, pri ktorých sa pomocouumele pripravených špecifických protilátok zablokovalVEGF (vascular endothelial growth factor) alebo recep-tor viažúci VEGF, viedli k indukcii imunitnej odpovedena bunkovej aj hormonálnej úrovni. Konečný terapeu-tický efekt takýchto postupov na pacientoch však mnohokrát zlyháva v dosledku zložitých autoregulač-ných mechanizmov v organizme. Zásahom do jednejzložky (cytokínu) sa totiž zvyčajne vyvolá odozva

CYTOKÍNY V CHARAKTERIZÁCII PROTINÁDOROVEJIMUNITNEJ ODPOVEDE V UNIKÁTNOM ŽIVOČÍŠNOM„MeLiM“ MODELI MELANÓMUJán Strnádel1,2, Hana Reisnerová2, Jana Hlučilová1, Dušan Usvald1, Vratislav Horák1

1Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Liběchov2Česká zemědělská univerzita v Praze

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 24

20

v celej kaskáde funkčne podobných, ale i proti-chodne posobiacich komponentov cytokínovej siete.

Posobenie určitého cytokínu može byť aj celkom pro-tichodné v závislosti od podmienok, v ktorých dochád-za k jeho produkcii. Typickým príkladom je TNF-α, kto-rého vysoké lokálne koncentrácie v nádore (indukova-né napr.hypoxiou) ničia cievny systém nádoru, ale nadruhej strane, nízke hodnoty chronicky sa tvoriacehoTNF-α (pri chronickom zápale) prispievajú k remodelá-cii a rozvoju stromatickej matrice, potrebnej na rasta šírenie nádoru. TNF-α okrem toho stimuluje rast fib-roblastov, ktoré následne produkciou rastových fakto-rov možu potencovať i rast samotného nádoru v mies-te chronického zápalu. Spomenutá vlastnosť cytokínovtak značne komplikuje snahu o charakterizáciu ich úlohv imunoterapiách.

Devitalizácia - jedna z možností, ako stimulovaťprotinádorovú odpoveď

Medzi experimentálne študované terapeutické postu-py so stimulačným účinkom na imunitný systéma následnou deštruktívnou odozvou na niektoré typynádorov, kde zásadnú úlohu pravdepodobne hrajúcytokíny, možno zaradiť aj devitalizáciu. Tento originál-ny prístup k terapii solídnych nádorov vyvinul český chi-rurg MUDr.Karel Fortýn. Spočíva v ischemizácii nádorupodviazaním jeho arteriálneho a venózneho krvnéhozásobenia. Takto ošetrený nádor sa ponechá in situ beznáslednej excízie. Účinok devitalizácie bol experimen-tálne testovaný na miniatúrnych prasatách línie MeLiM(Melanoma-bearing Libechov Minipigs) s dedičnýmmalígnym melanómom na Ústavu živočišné fyziologiea genetiky (ÚŽFG) Akademie věd ČR. Nádor zbavenýkrvného zásobenia postupne zanikal bez toho, abysposobil sepsu alebo smrť jedinca. Doposiaľ získanéexperimentálne výsledky svedčia o tom, že devitalizáciavedie k aktivácii bunkami sprostredkovanej protinádo-rovej imunitnej odpovede.

Prasa línie MeLiM v biomedicínskom výskumemelanómu

Vo výskume maligného melanómu sa vo svete použí-va viacero živočíšnch modelov. Medzi najčastejšiemodelové zviera patrí myš a potkan, ale používa sai morča (Cavia porcellus) a dokonca akvarijné rybky(rod Xiphophorus). Miniprasa línie Sinclair (odvodenéod kmeňa Hormel) je model podobný MeLiM, ale narozdiel od MeLiM v tejto línii spontánne regreduje až100% postihnutých zvierat s nádorom. MeLiM minipra-sa je preto na výskum melanómu vhodnejšie.

Línia miniatúrnych prasiat MeLiM vznikla cielenouselekciou jedincov, u ktorých sa pozoroval spontánnyvýskyt maligného melanómu. Chov miniprasiat naÚŽFG v Liběchove začal v roku 1967 importovaníma krížením miniatúrnych prasiat kmeňa Hormel (Hor-mel Institute, University of Minnesota, USA) s göttin-genským miniatúrnym kmeňom (University of Göttin-gen, Germany). Postupne sa do chovu (primárne kvolivýskumu dedičnosti krvných skupín) introdukovali viet-

namské prasatá, ďalej jedince plemena Landracea Cornwall. V roku 1989 došlo k udalosti, ktorá viedlak ustanoveniu línie MeLiM. Bol pozorovaný výskyt nie-koľkých jedincov s kožnými nádormi. Čiastočným prí-buzenským krížením (inbreedingom) sa vytvorila origi-nálna línia MeLiM vyznačujúca sa genetickou predispo-zíciou k tvorbe malígneho melanómu.

Melanóm sa v tejto línii vyskytuje u takmer 50 % zvi-erat vo forme mnohopočetných, tmavo pigmentova-ných kožných nádorov na roznych častiach tela. Približ-ne jedna tretina zvierat uhynie v dosledku rozsiahlejdiseminácie melanómu a vzniku metastáz predovšet-kým na slezine, pľúcach a lymfatických uzlinách počasprvých dvoch mesiacov života. Pokiaľ sa však na takétojedince aplikuje devitalizácia, dojde k vymiznutiu pri-márneho nádoru i orgánových metastáz. Vyliečenéjedince sa stávajú základom pre ďalší chov.

V línii MeLiM je však možné pozorovať i druhú skupi-nu zvierat, u ktorej dochádza k neskoršiemu vývinunádoru s jeho následnou spontánnou regresiou.V porovnaní s ľudskými melanómami, pri ktorých sauvádza jedno percento spontánne regredujúcich nádo-rov, v prípade línie MeLiM k tomuto javu dochádza tak-mer u dvoch tretín postihnutých jedincov. Podobne akou devitalizovaných jedincov, aj pri spontánnej regresiimelanómu dochádza k lokálnemu vybieleniu kože -tzv.vitiligu. Pravdepodobne ide o autoimunitný proces(pozorovaný aj u ľudských pacientov), ktorý je možnosekundárne iniciovať u prvej (devitalizáciou ošetrenej)skupiny zvierat a ktorý sa zatiaľ neznámym mechaniz-mom uplatňuje aj v druhej skupine zvierat, spontánneregredujúcich. Mechanizmus spontánnej regresienádoru na MeLiM modele skúmajú na molekulárno-genetickej úrovni v spolupráci s liběchovským pracoviskom vedci z ústavu CEA-INRA v Jouy-en-Josas(Francúzsko).

V ÚŽFG v Liběchove sa výskumná činnosť pracovní-kov Laboratoře biologie nádorů sústreďuje na histopa-tologickú, imunohistochemickú a biochemickú charak-terizáciu línie MeLiM a na analýzu imunitnej odpovedeorganizmu po devitalizácii melanómu. Fenotypizácioulymfocytov v krvi a tumor-infiltrujúcich lymfocytovv nádore pomocou CD povrchových antigénov sa naprietokovom cytometri zisťujú zmeny v zastúpení CD8+

(cytotoxických T-lymfocytov) a CD4+ (pomocných, hel-per T-lymfocytov) po devitalizácii. Pracuje sa na rozšíre-ní použitia cytometrie na detekciu niektorých intracelu-lárnych antigénov a cytokínov. Nepriamym imunofluo-rescenčným značením kryorezov nádorov sa detekujúzmeny v expresii proteínov teplotného šoku (HSP-70,gp96 - pre ich významnú úlohu pri zahájení imunitnejodpovede), niektorých cytokínov (napr. IFN-gamma –podporuje Th1 bunkovú odpoveď proti nádoru) a pro-teínov extracelulárnej matrix (uplatňujúcich sa v metas-tatickom procese). Kvantifikácia relevantných cytokínovv krvnom sére a lyzátoch z nádorov sa realizuje pomo-cou sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immuno SorbentAssay) súprav. V procese optimalizácie je aj metódaWestern-blottingu na potvrdenie zmien v expresii vyš-

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 25

21

šie spomenutých proteínov. Pokusným zvieratám sapočas celého experimentu sledujú základné hematolo-gické parametre (množstvo lymfocytov, erytrocytov,hodnota hematokritu, množstvo hemoglobínu ) a častiodobraných nádorov sa spracuvávajú aj štandardnýmihistologickými technikami.

Záver alebo „Quo vadis, MeLiM?“ a budúcnosťprasačieho melanómového modelu

Incidencia ľudského melanómu má zrejme „vďaka“enviromentálnym faktorom (zvýšené hodnoty UV žiare-nia v dosledku defektov v ozónovej vrstve) neustálestúpajúcu tendenciu. Kedže ide o veľmi agresívnuformu nádoru, v štádiu metastáz (štádium III a IV) tak-

mer neliečiteľnú, je snaha o nájdenie nových terapeu-tických prístupov veľmi aktuálna. Prítomnosť vhodnýchživočíšnych modelov vo výskume melanómu hráv tomto procese kľúčovú úlohu. Miniprasatá línieMeLiM spĺňajú vďaka histopatologickej a biochemickejpodobnosti nádoru s ľudským melanómom požiadavkyna takýto model. V budúcnosti može tento model slú-žiť na vývoj a testovanie nových terapeutických postu-pov. Vačšie nároky na chov, manipuláciu i operačnýpersonál pri štúdiu na tomto modeli (v porovnanís drobnými laboratórnymi hlodavcami) vyvažuje vačšiamiera podobnosti a prenositeľnosti výsledkov na ľud-ských pacientov.

Literatúra1. http://www.cancer.org.2. Atkins, M.B., Clin. Cancer Res. 12, 2353s-2358s

(2006).3. Crowe, N.Y.,Coquet, J.M. et al., Exp. Med. 202,

1279-1288 (2005).4. Riemer, A.B., Forster-Waldl, E. et al., Eur.J.Immunol.

v tisku (2006).5. Atkins, M.B.:Semin. Oncol. 29 (Suppl.7), 12-17

(2002).6. Atkins, M.B., et al., Cancer J. Sci. Am. 6 (Suppl.1),

S11-14 (2000).7. Bar-Eli, M., Pathology 67: 12-18 (1999).

8. Huang, S., Mills, L., Mian, B. et al., Am. J. Pathol.161, 125-34 (2002).

9. Fortýn, K., Hradecký, J. et al., Z. Exp. Chir.Trans-plant. Knstl. Organe 18, 42-50 (1985).

10. Fortýn, K., Hruban, V., Hradecký, J., Tichý, J., Klin.Onkol. 2, 7-10 (1989).

11. Fortýn, K., Hruban, V., Horák, V., Tichý, J., Klin.Onkol. 1,11-15 (1995).

12. Horák, V., Soukupová, P., Šinkora, J. et al., PigmentCell Res. 16, 583 (2003).

13. Strnádel, J., Hradecký, J. et al., J. Appl. Biomed.,(Suppl.1), 3, 44-45 (2005).

Táto práca bola podporená finančnými prostriedkami z Výzkumného záměru MSM č.6046070901, Výzkumnéhozáměru ÚŽFG AV ČR č. AV0Z50450515, projektu GAČR 524/04/0102 a projektu IGA ÚŽFG/06/03.

ENZYMOVÉ MODIFIKACE FOSFOLIPIDŮTomáš PodzimekÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Lipidy tvoří velkou skupinu látek vyznačující se boha-tou strukturní různorodostí. Kromě energetické rolehrají, také důležitou roli u řady buněčných pochodů(buněčné rozpoznávání, intracelulární komunikaceapod.). Tato velká skupina látek se dělí na podskupiny(např. fosfolipidy, lipoproteiny, mastné kyseliny atd.).

Fosfolipidy se vyskytují jak u savců, rostlin a kvasinek,tak i u prokaryot. Zajišťují stabilitu buněčných mem-brán a pomáhají vykonávat jejich funkce. Jejichvýznamnost je dána také tím, že poruchou jejich meta-bolismu vznikají různé metabolické a neurologickénemoci, které mohou být i dědičné. Dále se účastníregulace některých biologických procesů jako signálnímolekuly. Proto je jejich výzkum důležitý pro lékařstvía farmaceutický průmysl.

Velký zájem průmyslu je dnes zaměřen na vývojnových derivátů lipidů a procesů s tím spojených. Výzkum je zaměřen hlavně na enzymové modifikacelipidů. Pro průmyslové účely se používají imobilisované

systémy lipas a fosfolipas. Fosfolipidy jsou používányv potravinářství jako emulsifikátory a ve formě liposo-mů ve farmaceutickém odvětví a v kosmetice (součástpleťových vod). Jsou získávány z přírodních zdrojů jakosměs látek obsahující různé mastné kyseliny. Příklademje směs fosfolipidů zvaná lecithin isolovaná z vaječ-ného žloutku a sojových bobů.

Charakteristika fosfolipidůFosfolipidy lze rozdělit podle toho, jaký páteřní alkohol

obsahují. V případě, že jsou tvořeny glycerolem, nazýva-jí se fosfoacylglyceroly, jestliže obsahují sfingosin, nazý-vají se sfingolipidy. Do skupiny fosfoacylglycerolů patříetherové fosfolipidy, u kterých je jeden alifatický řetězecpřipojen na glycerol etherovou vazbou namísto esterové.Všechny fosfolipidy se vyznačují amfifilní povahou, kterou způsobují na jedné straně dlouhé řetězce mast-ných kyselin a na straně druhé fosfátová polární hlavice,na kterou lze navázat další molekuly.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 26

22

Fosfoacylglyceroly, jak už bylo řečeno obsahují troj-sytný alkohol glycerol. V poloze sn-1 a 2 je navázánzbytek mastné kyseliny (nasycený nebo nenasycený)esterovou vazbou a v poloze sn-3 je vázán fosfát.U etherových fosfolipidů se nachází etherová vazba (O-alkyl nebo O-alkenyl) v poloze sn-1. Vazbou různýchmolekul (např. cholinu, serinu, ethanolaminu atd.) na fosfátovou skupinu vznikají látky s různými biologic-kými účinky.

Sfingolipidy jsou odvozeny od alkoholu sfingosinu,což je dvojsytný alkohol s dlouhým nenasyceným řetěz-cem a jednou aminoskupinou. Hydroxylové skupinyjsou v poloze 1, 3 , a aminoskupina v poloze 2. Pokudje aminoskupina acylována mastnou kyselinou, nazýváse tento derivát ceramid. Ceramidy pak mohou být fosforylovány v poloze 1. Pokud je na fosfátu navázáncholin, pak se taková molekula nazývá sfingomyelin. Je součástí myelinového pouzdra, které chrání axonynervových buněk.

Z těchto strukturních poznatků vyplývá ohromnémnožství kombinací, z kterých vznikají strukturněpodobné, ale vlastnostmi se lišící molekuly.

Něco o enzymechEnzymům, které štěpí fosfoacylglyceroly se říká fos-

folipasy. K nim ještě můžeme přiřadit lipasy, které siceobvykle štěpí triacylglyceroly (TAG), ale mají afinitui k fosfolipidům (obsahují stejně vázané mastné kyseli-ny jako TAG). Nejznámější fosfolipasy jsou fosfolipasaA1, A2, B, C, D a lysofosfolipasa. Enzymy, které zpraco-

vávají sfingolipidy jsou např. sfingomyelinasa, sfingo-myelinasa D, ceramidasa.

Fosfolipasa A1 (PLA1) – odštěpuje zbytek mastné

kyseliny z polohy sn-1 fosfoglycerolu. PLA1 z bakterie

E. coli je dimer s katalytickou triadou His-Ser-Asn. Patřído rodiny serinových hydrolas. K tvorbě dimeru a ke katalyse potřebuje Ca2+ ionty. Tato hydrolasa máširokou substrátovou specifitu (štěpí fosfolipidy i lyso-fosfolipidy).

Fosfolipasa A2 (PLA2) – odštěpuje zbytek mastné

kyseliny z polohy sn-2 fosfoglycerolu. Byla první objeve-nou a popsanou fosfolipasou. Přednostním substrátemje pro ni fosfolipid mající v poloze sn-2 navázanoukyselinu arachidonovou. Ta po uvolnění působí jako“druhý posel“ nebo slouží jako prekursor k syntheseikosanoidů. PLA2 tvoří skupinu enzymů, které se dají

rozdělit podle toho, jestli používají katalytickou amino-kyselinu serin nebo histidin. Štěpí nejenom fosfolipidy,ale i lysofosfolipidy.

Fosfolipasa B (PLB) a lysofosfolipasa – oba enzy-my hydrolysují fosfolipidy i lysofosfolipidy. Napřík-lad PLB z Cryptococcus neoformans je extracelu-lární enzym, nezávislý na iontech, hydrolyzující všechny fosfolipidy, s výjimkou kyseliny fosfati-dové.

Fosfolipasa C (PLC) – hydrolysuje vazbu mezi fosfá-tem a glycerolem. Vyskytuje se u mnoha organismů.Významný rozdíl ve struktuře a mechanismu

reakce je mezi bakteriální a savčí PLC. Zatímco bakteriální PLC se skládá z jedné domény, savčí PLC má několik různých domén. Eukaryotický enzympoužívá ke stabilizaci transitního stavu Ca2+, kdežtou bakteriálního tuto funkci vykonává arginin v analogic-ké poloze. Jedna z katalytických aminokyselin je u PLC histidin.

Fosfolipasa D (PLD) – štěpí vazbu mezi fosfátovouskupinou a alkoholem (např. cholin, ethanolamin).Předpokládá se, že konservativní aminokyseliny His-Lys-Asp jsou katalytickými skupinami. Téměř všechny PLD jsou závislé na Ca2+ iontech a vzájemně seliší potřebnou koncentrací tohoto iontu. PLD má afinitu k fosfatidylcholinu (PC), fosfatidylethano-laminu (PE), fosfatidylinositolu (PI), fosfatidylserinu(PS) atd.

Sfingomyelinasa (SM), sfingomyelinasa D (SMD)a ceramidasa –SM hydrolysuje vazbu mezi fosfátema sfingosinem. SM lze rozdělit na kyselé s pH optimemkolem 4,5 , neutrální s pH optimem 7,5 a basické s pH optimem 9,0. Pro katalysu je důležitý histidin.Stejnou specifitu k sfingolipidům vykazuje i PLC, kterárovněž obsahuje katalytický histidin. SMD štěpí vazbumezi fosfátovou skupinou a alkoholem. Tutéž reakciprovádí i PLD. Ceramidasa odštepuje zbytek mastnékyseliny z aminoskupiny sfingosinu. Tímto způsobem je možné synthesovat různé ceramidy nebo sfingo-lipidy.

Lipasy – představují velmi různorodou skupinu enzy-mů používaných v průmyslu. Jedná se o potravinářskýprůmysl (modifikace tuků a olejů), výroba detergentů,papírenský a farmaceutický průmysl. Katalytická triádase obvykle skládá z Ser-His-Asp/Glu. Tyto enzymy majíčtyři vazebná místa pro TAG. Tři z nich jsou pro jednot-livé mastné kyseliny vázané na glycerol. Zajímavýmstrukturním prvkem aktivního místa je „víčko“, kteréuzavírá aktivní místo v inaktivním stavu enzymu. Lipasybývají specifické pro polohy 1,3 TAG, což znamená, žemohou štěpit esterovou vazbu v poloze sn-1 také u fos-folipidů.

Některé z těchto enzymů (hlavně PLA1, PLA2, lysofos-

folipasy a lipasy) mají za určitých podmínek také trans-acylasovou aktivitu, tzn., že jsou schopny esterovouvazbu tvořit. Tento proces má velké uplatnění v prů-myslu k výrobě nových látek s odlišnými vlastnostminež mají původní molekuly.

Faktory ovlivňující aktivitu enzymůZásadní význam pro reakce fosfolipas a lipas má

obsah vody v reakční směsi, která se vyjadřuje jakoaktivita vody. Je to vlastně procento vody obsažené ve směsi. Pro enzymy štěpící tuky je, v porovnánís ostatními hydrolasami (glykosidasy, proteasy) výhod-nější přítomnost menšího množství vody z důvodureversní hydrolysy. Zatímco glykosidasy vyžadují hod-notu vodní aktivity nejméně 0,6 , lipasy a fosfolipasy se mohou přiblížit téměř k 0. Samozřejmě je vždynutný určitý obsah vody k udržení enzymu v aktivnímstavu.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 27

23

U lipas z Rhizopus oryzae a Candida rugosa byla stu-dována transesterifikace ethyldekanoátu na hexyldeka-noát s hydrolysou na kyselinu dekanovou jako kompe-titivním procesem. Jako reakční prostředí byl použit dii-sopropylether se stanoveným množstvím vody. Lipasaz Rhizopus oryzae měla nejvyšší transesterifikační akti-vitu při aktivitě vody 0,06. Lipasa z Candida rugosaměla nejvyšší aktivitu při aktivitě vody 0,53 a nejvyššípoměr transesterifikace/hydrolysa při aktivitě 0,11.V podobných podmínkách byly testovány některé gly-kosidasy, jejichž nejvyšší aktivita byla při aktivitě vodyblízko 1,0.

Dále záleží na tom, jestli je reakce řízena termo-dynamicky nebo kineticky. Při esterifikaci nebo transes-terifikaci mohou vznikat lysofosfolipidy, jejichž rovnovážná konstanta ovlivňuje výtěžek plně acylova-ných fosfolipidů. Rovnovážné konstanty nejsou provšechny fosfolipidy stejné. Znamená to, že některé se budou modifikovat s lepším výtěžkem a jiné s horším. Vliv zde má opět aktivita vody a také kon-centrace mastných kyselin. V souladu s výše uvedený-mi skutečnostmi, by měla být koncentrace mastnýchkyselin vyšší a aktivita vody nižší. Reakce, které jsouz hlediska termodynamického nevýhodné, jsou řízenykineticky. To je případ PLD a znamená to, že lze dosáhnout dobrého výtěžku i při vyšší aktivitě vody.Tyto reakce se dějí ve dvoufázovém systému voda-organické rozpouštědlo.

Ostatními faktory jsou vhodná teplota pro enzym,která i ovlivňuje migraci acylů a snižuje viskozitu reakč-ního média, reakční doba, donor acylu apod.

Modifikace fosfolipidůV případě výměny jedné mastné kyseliny za jinou je

možné použít jednokrokovou nebo dvoukrokovoumetodu. První metoda je založena na transesterifikacipřidáním volné mastné kyseliny do reakční směsi.K tomuto účelu jsou vhodné hlavně lipasy (např. z Rhizopus arrhizus), které jsou specifické pro polohusn-1 fosfolipidů a také PLD. Principem druhé metody jenejprve hydrolysa a poté reesterifikace fosfolipidu. Zde se využívají také lipasy.

Lysofosfolipidy (lyso-PL) je možné připravit pomocíhydrolysy, esterifikace, migrace acylu nebo alkoho-lysy.

Hydrolysa – pro tento děj jsou důležité typ enzymu,koncentrace substrátu a aktivita vody. Protože PLA1 je

termolabilní, používají se k tomuto účelu PLA2 a lipasy.

Porovnáním 19 komerčních lipas bylo zjištěno, že nej-vhodnějšími jsou enzymy z plísní Mucor a Rhizopus. Co se týče polární hlavice lyso-PL, ta může být modifi-kována PLC nebo PLD.

Esterifikace – esterifikací glycerofosfocholinu lipasoulze získat 1-acyl lyso-PC, totéž provedené enzymemPLA2 povede k 2-acyl lyso-PC. Udržování aktivity vody

a odstraňování produktů je důležité pro posunutí rov-novážného stavu. K této reakci bývá používána PLBz Candida antarctica. Reakce je prováděna v prostředí

50 % (v/v) terc-butanolu za přítomnosti vinylesterukyseliny laurové jako donoru acylu. V přebytku donorua za vhodné teploty lze dosáhnout vysokého výtěžku.Limitujícím faktorem zde je reakční doba. Pokud jereakce prováděna více než 24 hodin, dochází ke vznikuvětšího množství PC v důsledku migrace acylu v molekule.

Migrace acylu – bývá nežádoucím aspektem reakcí.Může totiž probíhat neenzymaticky, jen za katalysykyselinami nebo basemi. Někdy tento děj podporujíi nosiče, na kterých jsou imobilisovány příslušné enzy-my. Jednou z možností jak toto potlačit je přidání borá-tu, dále je možné produkt konvertovat do pevnéhostavu během reakce. Ukázalo se, že 1-acyl lyso-PC jestabilnější než 2-acyl lyso PC.

Alkoholysa – alkoholysou PL můžeme získat lyso-PLa estery mastných kyselin. Akceptorem zbytků mast-ných kyselin může být např. glycerol, methanol neboethanol. Alkoholysou pomocí lipasy z Thermomyceslanuginosa bylo dosaženo dobrého výsledku. Akcepto-rem byl oktanol. Zajímavostí je, že aktivita lipasy klesa-la s kratší délkou akceptorového alkoholu.

Další příkladyKombinací dvou enzymů (PLD a PLC) byly připraveny

tyto lyso-PL: 1-lauroyl-rac-glycerofosfát (1-LGP) a 1-lau-royl-dihydroxyacetonfosfát (1-LDHAP). Reakce probíha-la ve dvou krocích. Nejprve byla použita PLD ze Strep-tomyces sp. na reakci PC s 1-monolauroyl-rac-glycero-lem. Vznikl 1-lauroyl-fosfatidylglycerol (1-LPG) a cholin.1-LPG byl hydrolysován PLC z Bacillus cereus na 1-LGPa diacylglycerol. Stejným postupem vznikl 1-LDHAP.Dále byly studovány PLD z hlávkového zelí a burskýchoříšků. Obě se efektivně účastnily transfosfatidylačníreakce. Aplikace PLC je omezena úzkou specifitoua neschopností štěpit syntetické substráty. Substrátmusí obsahovat etherovou nebo esterovou vazbuv pozici sn-1, esterovou vazbu v pozici sn-2 a fosfocho-lin v pozici sn-3.

K přípravě lysofosfatidové kyseliny byl použit také systém dvou enzymů. Mastná kyselina bylaodštěpena PLA2 a lyso-PL byl potom hydrolysován

PLD. Pokud je substrátem přírodní fosfatidylcholin, získáme směs fosfatidátů s různými mastnými kyselinami.

Jiným příkladem přípravy lysofosfatidové kyseliny jevyužití lipasy specifické pro polohy 1,3 (lipasa z Rhizopus arrhizus). Esterifikací glycerol-3-fosfátu vinyl esterem kyseliny laurové při aktivitě vody 0,53docházelo k přednostní tvorbě lysofosfatidové kyseliny(lysoPA) a ke spontánní migraci acylu v molekule.Následnou acylací vznikla kyselina fosfatidová (PA),také ve velkém množství. Konverse činila > 95 %. Jestliže se kyselina laurová zaměnila za kyselinu olejo-vou, konverse byla 55 %. Zvýšením zastoupení glycerol-3-fosfátu ve směsi se zvýšil poměr lysoPA/PA,ale zároveň se snížilo jeho zreagované množství. Lysofosfatidovou kyselinu se podařilo přečistit jedno-duše precipitací.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 28

24

Zpracováním lecithinu z vaječného žloutku se dneszískává mnoho užitečných produktů, hlavně lysofosfoli-pidů. Používají se enzymy PLA1 a PLA2. Přitom se zlep-

šují emulsifikační, teplotní a viskozní vlastnosti produk-tů, což zvyšuje jejich aplikovatelnost v průmyslu. Jinéuplatnění těchto enzymů se nachází při rafinaci olejů.K tomuto účelu byly vybrány PLA2 z vepřového pankre-

atu a bakteriální PLA1.

Zmínil jsem zde dobré uplatnění fosfolipidů v prů-myslu, ale zatím jde především o fosfoacylglyceroly.Nynější studie o sfingolipidech se spíše zabývají jejichbuněčnými funkcemi, metabolismem a regulacemi,stejně tak jako purifikací a charakterisací příslušnýchenzymů (sfingomyelinasy) a proto zatím neexistuje širšívyužití těchto látek v průmyslu.

Literatura1. Zheng Guo, Anders F. Vikbjerg, Xuebing Xu: Biotech-

nology Advances 203-259, 23 (2005).2. Adlercreutz P. et al., J. Molec. Catal. B: Enzymatic

11, 173 (2001). 3. Xu X. , in Lipid Technology and Enzymology.4. Ma L., Persson M., Adlercreutz P., Enzyme Microb.

Technol. 31, 1024 (2002).

5. Virto C., et al., Enzyme Microb. Technol. 24, 651(1999).

6. Virto C., et al., Enzyme Microb. Technol. 26, 630(2000).

7. Virto C., et al., Chem. Phys. Lipids 104, 175 (2000).

OXIDAČNÍ STRES, LIDSKÉ CHOROBY A BIOMARKERYAlžběta HavelkováÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Organismy žijící v aerobním prostředí jsou neustálevystavovány celé řadě reaktivních molekul - volnýmradikálům (VR). Tyto částice, vznikající různými způso-by, napadají intracelulární biomakromolekuly, modifi-kují je a tím poškozují organismus. Organismy jsouproti tomuto nebezpečí vyzbrojeny efektivním a sofisti-kovaným antioxidačním systémem.

Oxidační stresOxidační stres vzniká v buňkách a tkáních v důsledku

porušení rovnováhy mezi oxidačním a antioxidačnímsystémem. Výsledkem nerovnováhy je vznik volnýchradikálů, které napadají organismus a způsobují závaž-ná poškození buněk. Oxidační stres je spojen s progre-sí řady onemocnění jako jsou kardiovaskulární choroby,atherosklerosa, poruchy centrální nervové soustavy(Parkinsonova a Alzheimerova choroba), diabetes mel-litus, záněty, nádorové bujení, poškození jater, ledvina další.

Příčiny vzniku volných radikálůMezi exogenní příčiny vzniku VR patří γ-záření, UV

záření, sluneční světlo, radiové frekvence, mikrovlny.Rentgenovo a radioaktivní záření při normálním ozařo-vání v malých dávkách nepředstavuje závažné nebez-pečí, avšak při intenzivním ozařování může vzniknouttzv. radiační syndrom, což je soubor pathologickýchjevů připomínající zrychlené stárnutí. Podle teorie Den-hama Harmana (1956, 1984, 1987) jsou VR primárnípříčinou stárnutí organismu. K zevním vlivům je nutnozapočítat i výživu.

K endogenním příčinám patří tvorba VR abnormál-ním působením cytochromoxidasy v dýchacím řetězci(uvolnění meziproduktů z aktivního centra enzymu).VR dále vznikají při zánětlivé odpovědi organismu,např. fagocyty a makrofágy využívají VR k usmrcováníbakterií, virů a kvasinek.

Volné radikályVR jsou atomy nebo molekuly s jedním či více nepá-

rovými elektrony ve vnějších orbitalech. Jedná seo velmi reaktivní sloučeniny s krátkým poločasem roz-padu. VR vznikají získáním či uvolněním elektronunebo reakcí s nějakou další sloučeninou (iniciace).Výsledkem je vždy další VR a rozbíhá se řetězová reak-ce (propagace), která je ukončena ve chvíli reakce dvouVR za vzniku stabilní molekuly (terminace), či přítom-ností zhášeče VR (scavengera), který je schopen řetězo-vou reakci ukončit.

Aktivní formy kyslíku (ROS – reactive oxygenspecies)

Hlavní sloučeninou, která iniciuje reakce VR je mole-kulární kyslík, který je konečným akceptorem elektronův dýchacím řetězci. Přeměnu O2 na H2O katalyzuje

metaloenzym cytochromoxidasa tvořící IV. kotvenýkomplex v membráně mitochondrií. Tato přeměna jeuskutečněna čtyřmi po sobě jdoucími kroky, kdy v kaž-dém kroku dochází k redukci kyslíku jedním elektro-nem za vzniku velmi reaktivních meziproduktů (Obr. 1)1. Za normálních podmínek ale nejsou mezi-produkty reakce uvolňovány z aktivního místa enzymu.

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 29

Antioxidační obranné mechanismyJako obrana proti VR v organismu slouží sofistikova-

ný antioxidační systémem, který zahrnuje tyto enzymy(Obr. 2)2: superoxiddismutasa (SOD), glutathionperoxi-dasa (GSHPx) a katalasa (CAT). A dále se obrany účast-ní celá řada dalších sloučenin (tzv. zhášeče nebo také lapače volných radikálů): vitamín C, A a E, glutat-hion, flavonoidy, fenoly, karotenoidy, ferritin a meta-lothionein.

Monitorování oxidačního poškození, biomarkeryMěření volných radikálů je velmi problematické kvůli

jejich krátké životnosti. Mezi metody využívané k měře-ní aktivity VR se řadí elektronová paramagnetická reso-nance (EPR). Jedná se však o velice pracnou a časověi finančně velmi náročnou metodu.

Další metodou je monitorová biomarkerů, produktůvzniklých působením VR. VR napadají celou řadu bio-

molekul v organismech, modifikují je a výsledky napa-dení lze detegovat. Příkladem biomarkerů jsou napří-klad produkty lipoperoxidace. Vysokoúčinnou kapali-novou chromatografii lze využít pro analýzu konjugova-ných dienů a aldehydů po derivatizaci 2,4-dinitrofenyl-hydrazinem (DNPH). Alkany (ethan, pentan), další pro-dukty lipoperoxidace, se stanovují plynovou chromato-grafií.1 Výsledkem modifikace proteinů jsou nově vznik-lé karbonylové skupiny v postranních aminokyselino-vých řetězcích proteinu. V neposlední řadě docházíi k napadení nositelky genetické informace – DNA.Hlavní poškození DNA je rozpletení dvouvláknovéstruktury a vznik modifikovaných purinových a pyrimi-dinových bazí. Nejpoužívanějším biomarkerem je 8-oxo-2ę-deoxyguanosin.

K účinnému monitorovaní oxidačního poškozeníorganismů lze využít FORM systém3 zahrnující tzv. FORTtest. Metoda měření je založena na schopnosti chro-mogenní látky tvořit barevné produkty po reakci s VR.Intenzita zabarvení je mírou oxidačního stavu měřené-ho vzorku. Výsledky lze interpretovat jako ekvivalentykoncentrace H2O2. Tato metoda je dobře reprodukova-

telná a není časově náročná (cca 8 minut). Lze ji využítpro testy v klinických laboratořích a hlavně pro monito-rování rizikových kategorií pacientů, kterými jsou kuřáci, diabetici a pacienti s vysokým krevním tlakem.

Obr. 1: Čtyřelektronová redukce molekuly kyslíku včetně meziproduktů.

Obr. 2: Enzymový obranný mechanismus buňky.

Literatura1. Joseph M.: Immunopharmacology of Platelets,

s. 209, Academic Press, New York 1996.2. Holeček V., Racek J.: Klin. Biochem. Met. 2, 137

(1994).

3. Torri C.: Oxidative stress, human diseases and bio-markers, INT- Sept. 2003.

25

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 30

ÚvodAcylací se na proteiny připojují zbytky kyseliny myri-

stové (14:0), palmitové (16:0), stearové (18:0), arachi-nodové (20:4) a dalších mastných kyselin. Nejčastěji sevyskytuje modifikace kyselinou myristovou a palmito-vou. Dochází tím ke zvýšení hydrofobicity modifikova-ných molekul, a to často vede k jejich nasměrovánía inkorporaci do biomembrán. Acylace bývá také přiči-nou konformačních změn proteinů, někdy se tím zvyšu-je jejich odolnost vůči nespecifické proteolyse.

Terapeutické využití myristoylaceNejprostudovanějším mechanismem acylace je

myristoylace. Mezi takto modifikované proteiny patří např. protein kinasa A, NADH – cytochrom b5 redukta-sa, jedna z NO synthas, většina α-podjednotek G-prote-inů a také strukturní proteiny retrovirů (např. Gag).Modifikace potom hraje zásadní roli při onkogenezi,buněčné signalizaci nebo skládání retrovirů.

MechanismusN-myristoylace je specifická k N-koncovému glycinu,

probíhá kotranslačně v endoplazmatickém retikulu. N-myristoyltranferasa (NMT) je monomerní enzym (50 – 60 kDa). Mechanismus enzymové reakce je násle-dující: 1. vazba myristoyl-CoA na NMT, 2. vazba proteinuna enzym, 3. přenos myristoylu na glycin proteinu 4. uvolnění CoA z aktivního centra enzymu, 5. uvolněnímodifikovaného proteinu. Kyselina myristová se vždyspecificky váže na N-konec za vzniku amidové vazby. Na NMT se váže také stearoyl-CoA, nedochází ale k acy-laci proteinu.

SpecifitaSubstrát NMT převážně obsahuje sekvenci Met-Gly-X-

X-X-Ser(Thr) (menší část myristoylovaných proteinůmůže obsahovat v pozici 5 některou další aminokyseli-nu). Počáteční methionin je odstraněn aminopeptida-sou a Gly se tedy stává N- koncovou aminokyselinou.Některé proteiny (např. G-proteiny) mají v sekvencimezi Gly a Ser zbytky cysteinů, které mohou podléhatpalmitoylaci. To pak hraje důležitou úlohu při inkorpo-raci do membrány. Specifita myristoylace výrazně odlišuje savce od ostatních organismů, přestože NMTvykazuje vysokou míru homologie (savci s kvasinkami

44 %).Tato rozdílná specifita umožňuje selektivní inhi-bici myristoylace, čehož se může využít při léčbě někte-rých onemocnění. Tato možnost se úspěšně studovalana dvou rodech kvasinek, které způsobují úmrtí lidís oslabenou imunitou – Candida albicans a Cryptoco-ccus neoformans.

Myristoylace je také důležitá při replikaci virových čás-tic, čehož se dá využít při antivirové terapii. Znalosti tétomodifikace se také dají využít při vývoji chemoterapeu-tik, zvláště při léčbě karcinomu tlustého střeva.

Candida albicansJedním z významných patogenů mezi kvasinkami je

Candida albicans, jež bývá častou příčinou úmrtí pacien-tů s AIDS. K léčbě se používají hlavně fungistatické tria-zoly, hrozí ale vytvoření rezistentního kmene. Alternativ-ním terapeutickým přístupem je inhibice právě NMT. Stu-die se značenou [3H] kyselinou myristovou totiž ukázaly,že NMT je důležitá pro životaschopnost Candida albi-cans. Byl kultivován kmen, u něhož byl v jednom chro-mozomu gen pro NMT deletován, v druhém potom bylazavedena mutace Gly447 � Asp. Tato záměna aminokyse-lin způsobila snížení katalytické aktivity NMT, způsobenásníženou afinitou enzymu k myristoyl-CoA. Kmens mutací potom potřebuje ke svému růstu médiumobsahující kyselinu myristovou. Tak se prokázalo, že živo-taschopnost kmene koreluje s mírou N-myristoylace pro-teinů C. albicans. Snížila se také její patogenita v oslabe-ném hostiteli. Nemutovaný kmen způsobil smrt imuno-deficientní myši za 7 dní, zatímco kmen s mutací nebylletální ani 21 dnů po intravenozním podání.

Jako inhibitory NMT byly navrženy jak analogy myristyl-CoA, tak molekuly peptidové povahy. Ukázalo se, žedoména rozpoznávající acyl-CoA je velmi konzervovanáa selektivní inhibici tímto způsobem není možné pro-vést. V úvahu tedy připadá působení molekuly podobnépeptidu, který rozpoznává NMT Candidy albicans, zatím-co aktivita lidské formy zůstává zachována. Při návrhua syntéze inhibitorů se vycházelo z N-koncového frag-mentu Arf2p (ADP ribosylační faktor), neboť myristoyla-ce je pro biologickou funkci tohoto proteinu klíčová.Kromě inhibitorů vycházejících z koncového oktapetidubyly nedávno navrženy sloučeniny obsahující jádro benz-pyranu. (Příklady látek z obou skupin níže).

ACYLACE PROTEINŮ A JEJÍ TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍAleš HnízdaÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Inhibitor na bázi benzfuranu a inhibitor odvozený z oktapeptidu

26

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 31

Junin virusJunin virus, který řadíme mezi RNA viry, je původcem

argentinské hemoragické horečky. Ta se dnes léčípomocí ribavirinu, který má ale jako analog nukleosidůřadu vedlejších účinků. Jako alternativní antivirální pro-středky byly zkoumány analogy kyseliny myristové, 2-hydroxymyristová kyselina a 13-oxamyristová kyseli-na. První z nich působí jako kompetitivní inhibitor NMT,druhá ovlivňuje strukturu modifikovaných proteinů –znemožňuje inkorporaci do biomembrán. Obě látkyinhibovaly replikaci virů a in vitro nebyly pozoroványžádné negativní účinky na hostitelské buňky.

Myristoylace a boj s HIV Myristoylace hraje také důležitou roli během rozmno-

žování viru HIV, modifikují se takto virové proteiny p17gag

a Nef. Proteinu Nef se využívá při snahách o vyvinutí vak-cíny proti HIV. Jedná se o 30 kDa molekulu, která seinkorporuje do cytoplazmatické memrány. Nef zajišťujeřadu biologických dějů, souvisejících s patogenitou viru:mění transdukci signálu, aktivuje T-lymfocyty a snižujeexpresi CD4 a MHC I. Tyto vlastnosti znemožňují použítnezměněný Nef jako imunogenní látku. Byl proto izolo-ván rekombinantní protein, u něhož byl akceptorový gly-cin zaměnen za alanin (nemůže tak docházet k myristo-ylaci) a dileucinový motiv byl deletován. Takto změněnýNef nevykazoval vlastnosti důležité pro patogenitu viru.Naneštěstí měl i nižší imunogenní reakci, což by mělavyřešit fúze s TPA (tissue plasminogen activator). NMT jepoteciálním cílem antivirálních látek i sama o sobě,neboť snížením její aktivity způsobuje nižší viabilitu hos-titelské buňky. Využívá se skutečnosti, že během chronic-ké i akutní formy infekce HIV se snižuje hladina expreseNMT v napadených T-lymfocytech. Působením derivátuserinalu docházelo k selektivnímu zneškodnění hostitel-ských buněk HIV, neboť vzhledem ke snížení expresejsou napadené buňky k působení inhibitoru citlivější.

Karcinom tlustého střevaKarcinom tlustého střeva je jedno z nejčastěji se vysky-

tujících nádorových onemocnění a Česká republika držísmutný primát země s nejvyšší incidencí. V buňkáchtlustého střeva bylo definováno několik myristoylova-ných proteinů. Zdravé buńky obsahují například pp60src,pp60c-yes a anexiny. Na význam myristoylace při onkoge-nezi upozornila práce, jež se zabývala myristoylací viro-vého onkogenního produktu pp60 v-src. Ta je nezbytnápro inkorporaci do membrány a následnou transformacibuněk. Protein potom zůstává v cytoplazmatické mem-bráně a nemůže vykonávat svoji regulační funkci. Bloko-vání modifikace lidského proteinu pp60src také vedek potlačení růstu a proliferace buněk. To, že myristoylo-vané proteiny pp60src a pp60c-yes hrají významnou úlohupři při patogenezi nádorových onemocnění, potvrdilozjištění, že jejich tyrosin kinasová aktivita je vyšší v nádo-rových buńkách v porovnání se zdravými.

Dalším důležitým objevem je to, že už v časných stá-diích karcinomu dochází ke zvýšení aktivity NMT, což jezpůsobeno zvýšením exprese enzymu. Nedávno pakbyly izolovány endogenní inhibitory z hovězího mozku.

Jejich podání inhibovalo krysí karcinom tlustého střeva.

Terapeutické využití palmitoylacePřipojení kyseliny palmitové na proteiny není ve srov-

nání s kyselinou myristovou tak důkladně prostudováno.Nedaří se totiž izolovat všechny odpovědné enzymy,zároveň také dochází v buňce k nespecifické reakci.

Palmitoylace – mechanismus a specifitaJe známo, že palmitoyl se většinou váže na thiolovou

skupinu cysteinu za vzniku thioesterové vazby. Modifi-kovaný zbytek se v primární struktuře nachází blízko N-nebo C-konce a zároveň musí být součástí nebo blízkotransmembránové domény.

Zároveń je známo, že palmitoyl-transferasa preferujemyristoylované proteiny. Připojení je dynamické, můžebýt odstraněno protein palmitoyl protein thioesterasou(PPT). PPT štěpí thioesterovou vazbu v proteinechnavázaných na plazmatickou membránu a ty jsoupotom transportovány do lysozomu.

Biologické důsledkyZměny modifikace kyselinou palmitovou mají také

významné biologické důsledky. Deficience PPT způso-buje metabolické změny, které negativně ovlivňují ner-vovou činnost (onemocnění vede ke slepotě a nakoneck úmrtí ve věku 3 let). Příčinou onemocnění je akumu-lace palmitoylovaných proteinů, které se se nacházejíhlavně v lysozomální frakci a jejich přítomnost snižujeaktivitu proteas v organele. Inhibitory tohoto enzymumohou být také použity k destrukci nádorových buněklokalizovaných v mozku. Palmitoylace též hraje důleži-tou roli při replikaci virů způsobujících chřipku. Znalos-ti v této oblasti však dosud nepostačují k tomu, aby sedaly použít k lékařským účelům.

Inhibitory PPT jako chemoterapeutika pro nádorymozku

Inhibice depalmitoylace vede k porušení mezibuněč-ných signálů a buněčné smrti. Jako inhibitory se použí-vají nehydrolyzovatelné analogy palmitoyl-thioesterů(AcG-alfa-ketoamido-palmitoyl diamino propionát-VKIKK; zkráceně DAPKA (viz strukturní vzorec na obráz-ku). Působení této látky zvyšovalo účinek doposudpoužívaných chemoterapeutik (etoposid, adriamycin).Ty vyvolávají apoptosu a aktivita PPT ji inhibuje. Sníže-ní aktivity PPT tedy zvyšuje účinek terapie. Nevýhodouinhibitorů PPT jsou jejich vedlejší účinky, mezi něž patříhlavně poškození myokardu.

DAPKA

27

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 32

ZávěrVýše uvedené přiklady ukazují, že poznaní acylace

má velké uplatnění ve vývoji nových léčiv proti řaděonemocnění. Byly vyvinuty inhibitory myristoylace,které potlačují růst Candidy albicans u pacientů s osla-

benou imunitou. Myristoylace se také studuje v souvis-losti s léčbou infekce HIV nebo karcinomu tlustéhostřeva. Důležitá je také modifikace kyselinou palmito-vou. Poznání tohoto problému má potenciál hlavněv léčbě nádorů mozku.

Literatura1. Resh, M.D., Biochimica et Biophysica Acta 1451

(1999), 1-16.2. McWherter, C.A. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997),

11874-11880.3. Sogabe, S. et al., Chemistry & Biology 9

(2002),1119-1128.4. Takamune, N. et al., FEBS Letters 527(2002),

138-142.

5. Liang, X. et al., Vaccine 20 (2002), 3413-3421.6. Cordo, S.M et al., Microbes and Infection 1 (1999),

609-614.7. Raju, R.V.S. et al., Experimental Cell Research 235

(1997), 145-154.8. Dawson, G. et al., Cancer Letters 187 (2002),

163-168.

28

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:05 Str. 33

POKYNY PRO AUTORY

Vážení přátelé, aby byla technická úprava našeho časopisu co nejlepší a s minimálním množstvím chyb, uvítali bychom dodržování některých dále uvedených zásad.

1. Texty zasílejte elektronickou formou jako “attachment” spolu s tištěnou verzí, aby bylomožno opravit chyby způsobené přenosem.

2. Texty pište v editoru WORD (formát .doc), písmo Arial, velikost 11. Nerozdělujte slova nakonci řádků. V textu lze používat zvýraznění některých termínů tučným písmem či kurzívou,a také horní a dolní index. Řádkování jednoduché. Odsazení odstavců a mezery mezi niminepoužívejte (nastavení = 0).

3. Nepoužívejte automatické číslování, tabulátory, ani „tvrdé“ definice stránek.4. Obrázky zasílejte zásadně zvlášť v některém z běžných formátů (.jpg, .tif).5. Připojte vždy svojí e-mailovou adresu či číslo telefonu, aby případné problémy bylo

možno rychle řešit.

Děkuji L. Fukal

V TOMTO ČÍSLE NAJDETE

ÚVODEM 1

PROJEKT BIOTECHNOLOGIE PRO PRAHU BILANCUJE 2

MEZINÁRODNÍ KONFERENCE NEW ASPECT IN AQUACULTURE 2

BIOTECHNOLOGIE PŘI VÝROBĚ BATERIÍ 3

BIOMIKRONANOTECHNOLOGIE 4

BIOTECHNOLOGIE JAKO ALTERNATIVA PRO CHEMICKÝ PRŮMYSL 6

GENETICKY MODIFIKOVANÉ PLODINY 9

GENETICKY MODIFIKOVANÁ JABLKA 12

BIO-RECEPTOR BASED METHODS (BIO-ASSAYS) FOR FOOD, 15ENVIRONMENT AND CLINICAL ANALYSIS

CYTOKÍNY V CHARAKTERIZÁCII PROTINÁDOROVEJ IMUNITNEJ 19ODPOVEDE V UNIKÁTNOM ŽIVOČÍŠNOM „MeLiM“ MODELI MELANÓMU

ENZYMOVÉ MODIFIKACE FOSFOLIPIDŮ 21

OXIDAČNÍ STRES, LIDSKÉ CHOROBY A BIOMARKERY 24

ACYLACE PROTEINŮ A JEJÍ TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ 26

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:35 Str. 4

BIOTECHNOLOGICKÁSPOLEČNOST

166 28 Praha 6, Technická 3

ISSN 1210-1737

Neprodejné – jen pro členy Biotechnologických společností

Podávání novinových zásilek povoleno Ředitelstvím pošt Praha, čl. NP 1177/1994 ze dne 13. 6. 1994

210x297-bio4/12.qxd 11.12.2006 11:33 Str. 1