Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák •...
Transcript of Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák •...
![Page 1: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/1.jpg)
Biológiai Intézet
Immunológiai
Tanszék
Antigén–ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló
analitikai módszerek II.
Áramlási citofluorimetria
Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia
Uzonyi Barbara
2019.11.07.
![Page 2: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/2.jpg)
Fluoreszcens technikák
• érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni
• térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz
• nem veszélyes (vs. radioaktív technikák)
• egyszerre több jel mérhető ugyanabban a mintában
• élő sejtek vizsgálatára is alkalmas
Módszerek / műszerek:
spektrofluorimetria
fluoreszcens scanner
FLIA (fluorescent immunoassay)
DNS-szekvenálás és DNS-detektálás (PCR, qRT-PCR)
áramlási citometria
fluoreszcens mikroszkópia (FISH, CLSM)
![Page 3: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/3.jpg)
BD FACSCanto II
Az áramlási citométer felépítése
Beckman Coulter CytoFLEX
![Page 4: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/4.jpg)
minta
köpenyfolyadék
Az áramlási citométer felépítése
Hidrodinamikai fókuszálás:
- lamináris áramlás
- véd és irányít
- mérendő részecskék rendezéseFluidikai rendszer
Molecular Probes Tutorial
![Page 5: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/5.jpg)
Az áramlási citométer felépítése
• megvilágítás
• gerjesztés
UVközeli
UVviolett sötétkék kék zöld
sárgás-
zöldnarancs vörös
hullám-
hossz (nm)325/355 375 405/407 445/457 488 514-532 561 592 633-640
Lézer
Molecular Probes Tutorial
![Page 6: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/6.jpg)
Az áramlási citométer felépítése
optikai
rendszer
Lencsék, tükrök, szűrők
• fókuszálják a fényt
• gyűjtik és felosztják a szórt és emittált fényt
Molecular Probes Tutorial
![Page 7: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/7.jpg)
Detektorok
FL
SSC
FSC
Számítógép
• citométer vezérlése
• adatgyűjtés és -tárolás
• analízis
Detektorok
• fotodiódák vagy fotoelektronsokszorozók
• optikai jelet elektromos jellé alakítják
• jelerősítés
Az áramlási citométer felépítése
Molecular Probes Tutorial
![Page 8: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/8.jpg)
MérésFényút a mérőcellában
minta: 105 – 106 sejt/ml
áramlási sebesség: 30-60 µl/perc
~103 -104 sejt/másodperc
>10000 sejt/minta mérésenként
www.bdbiosciences.com
Molecular Probes Tutorial
![Page 9: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/9.jpg)
Fluoreszcencia
Oldalra irányuló fényszórás (SSC)
Mért paraméterek
Előre irányuló fényszórás (FSC)
1-6 (18) csatornában
Molecular Probes Tutorial
![Page 10: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/10.jpg)
Oldalra irányuló fényszórás (SSC)
Előre irányuló fényszórás (FSC)
Mért paraméterek
Előre irányuló fényszórás (forward scatter, FSC)
• fényelhajlás
• arányos a sejt méretével
• a megvilágító fény tengelyén mérjük
(megvilágító fény blokkolása!)
Oldalra irányuló fényszórás (side scatter, SSC)
• fényszórás és fénytörés
• arányos a sejt belső komplexitásával
• a megvilágító fényre merőlegesen mérjük
![Page 11: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/11.jpg)
Mért paraméterek
Fluoreszcencia
Abszorbeált fény Emittált fény
gerjesztés emisszió
Alapállapot
Gerjesztett állapot
![Page 12: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/12.jpg)
Antitest
Antigén
Fluorokróm
DNS
Fluoreszcens
nukleinsav
festékek
A fluoreszcencia forrása
1. autofluoreszcencia
aromás aminosavak, NADH, NADPH...
2. jelölés
Egyéb fluoreszcens próbák:
• pH
• intracelluláris ionok
• membránpotenciál
• reaktív oxigéngyökök
• organellum
• transzportfehérjék
• enzimszubsztrátok
• ...• sejtfelszíni
• intracelluláris
fixálás, permeabilizálás
• direkt
• indirekt
![Page 13: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/13.jpg)
emissziós spektrum
gerjesztési spektrum
hullámhossz (nm)
rela
tív
inte
nzitás
(%)
gerjesztő lézer
(488 nm) detektált hullám-
hossztartomány
A fluorofórok spektrális tulajdonságai
www.thermofisher.com
FITC (fluoreszcein-izotiocianát)
• melyik hullámhosszon optimális az adott fluorofór gerjesztése
• milyen hullámhossztartományban célszerű detektálni
![Page 14: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/14.jpg)
Előre irányuló
fényszórás (FSC)
Oldalirányú fényszórás
(SSC)
Hisztogram: egyparaméteres gyakoriság eloszlás
x-tengely: mért szignálintenzitás
y-tengely: adott intenzitáshoz tartozó eseményszám
Eloszlás
méret alapján
Eloszlás
granuláltság alapján
Az adatok ábrázolása
![Page 15: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/15.jpg)
granulociták
monociták
limfociták
Humán vérminta FSC–SSC képe a vörösvértestek lízise után
Az adatok ábrázolása
Molecular Probes Tutorial
Felhődiagram („Dot-Plot”): kétparaméteres ábrázolás
x- és y-tengelyen is egy mért paraméter intenzitás eloszlása van
![Page 16: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/16.jpg)
dot plot
density
plot
contour
plot
Az adatok ábrázolása
![Page 17: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/17.jpg)
Relatív fluoreszcenciaintenzitás
Sejtszám
Az emittált fluoreszcens fény intenzitása arányos a
sejtek által megkötött fluorokróm molekulák számával.
jelölt sejtekjelöletlen sejtek
(autofluoreszcencia)
www.bdbiosciences.com
Az adatok ábrázolása – fluoreszcencia
![Page 18: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/18.jpg)
Fluoreszcenciaintenzitás 1 (zöld)Flu
ore
szcencia
inte
nzitás
2 (
nara
ncs)
Jelölés többféle ellenanyaggal / festékkel
Az adatok ábrázolása – fluoreszcencia
![Page 19: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/19.jpg)
Kapuzás („gating”): egy adott sejtpopuláció kijelölése
CD45
SS
C
granulociták
monociták SS
C
CD3
CD3– CD3+
CD3–
CD3+
Sejtszám
Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)
CD3–
B-sejtek
NK-sejtek
CD3+
T-sejtek
CD45+ limfociták
www.bdbiosciences.com
Az adatok ábrázolása – kapuzás
Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)
![Page 20: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/20.jpg)
• alvadásgátolt vér, köldökzsinórvér, vérkészítmények
• testfolyadékok, pl.
csontvelő, gerincvelői folyadék, ízületi folyadék, tüdőváladék, ejakulátum...
• szövetek (a sejtek szuszpenzióba hozása után)
• tenyésztett sejtvonalak
• gyöngyök (latexpartikulumok kalibráláshoz, szolubilis molekulák méréséhez)
• mikroorganizmusok (baktériumok, gombaspórák, egysejtűek)
természetes vizekből, tenyészetekből, testfolyadékokból...
• exoszómák, mikrovezikulák
• kromoszómák
• ...
Citométerrel mérhető minták
Részecskék / sejtek szuszpenzióban (~300 nm – 100 µm)
![Page 21: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/21.jpg)
Kent, Stephen J (June 2017) HIV Vaccine Approaches. In: eLS. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester.
Idő (évek)
CD
4+
lim
fociták
szám
a/µ
l vér
Opportunista fertőzések
Wilcox CM & Saag MS, Gut2008;57:861–870.
Immunológiai vizsgálatok:
HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása
![Page 22: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/22.jpg)
CD4+ > CD8+ CD4+ < CD8+
Diagnózis: szerológiai vizsgálatok (pl. plazmában antitestek és virus kimutatása)
+ hematológiai vizsgálatok
www.med4you.at
Egészséges Beteg
Immunológiai vizsgálatok:
HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása
![Page 23: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/23.jpg)
Normál tartomány:
CD4+: 31-63 %, 314-1270 sejt/µl*
CD8+: 12-37 %, 147-836 sejt/µl*
Kalibrációs gyöngyök
segítségével meghatározható
az abszolút sejtszám.
Abszolút CD4+ sejtszám szükséges
- profilaktikus kezelés esetén (opportunista fertőzések)
- antiretrovirális terápia megkezdése előtt
www.bdbiosciences.com
CD3/CD4/CD8/CD45
* Bisset RL et al., 2004 Eur J Haematol. 72(3):203-12.
Immunológiai vizsgálatok:
HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása
![Page 24: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/24.jpg)
• malignus B-sejt limfóma
• monoklonális plazmasejtszaporulat a csontvelőben
• paraprotein / M-Protein (kóros immunglobulin)
Diagnosztika:
• Labor – vizelet- és vérvizsgálatok
• képalkotó eljárások
• immunfenotipizálás
• csontvelővizsgálatokTakeda Oncology
Immunológiai vizsgálatok:
Mielóma multiplex
![Page 25: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/25.jpg)
Plazmasejtek a csontvelőben
Molekuláris biológiai módszerek: allélspecifikus PCR, NGS
- érzékenyebbek lehetnek
- drágábbak
- diagnosztikai mintának kell lenni a terápia előtt
- nem rutin laboratóriumi eljárások
Jelinek et al., Blood Cancer J. 2017 Oct; 7(10):e617.
Minimális reziduális betegség kimutatása
abnormális plazmasejtek
normál plazmasejtek
többi csontvelői sejt
CD45−/CD38dim/CD19−/CD56+/CD27−/CD81−/CD117+/cyKappa+
Immunológiai vizsgálatok:
Mielóma multiplex – betegségkövetés
![Page 26: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/26.jpg)
Sejtaktivitás mérése – fagocitózisteszt
www.imd-berlin.de
Funkciózavarok:
• veleszületett immundefektus
• tumor, krónikus fertőzések, AIDS, TBC
• iatrogén funkcióvesztés
pl. immunszuppresszív kezelés
Neutrofil granulociták:
• veleszülett immunrendszer sejtjei
• fehérvérsejtek 65-70%-a
• baktériumok, gombák eliminációja
• kemotaxis, fagocitózis, reaktív oxigéngyökök
termelése
![Page 27: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/27.jpg)
Fagocitózis teszt
Heparinos vér
+ opszonizált jelölt E. coli
Inkubálás 37°C-on
A festék cask akkor fluoreszkál, ha
alacsony a közeg pH-ja – vagyis
bekerült a fagolizoszómába.
www.thermofisher.com
Sejtaktivitás mérése – fagocitózisteszt
![Page 28: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/28.jpg)
• apoptózis
• sejtciklus analízis
• ploiditás vizsgálat
• ivarsejtek válogatása
• proliferáció
DNS-festékek kötődése
• mindig sztöchiometrikusan kötnek (mennyiségi meghatározás)
• membránpermeábilis és impermeábilis festékek
beépült nukleotid-analóg jelölése
fluoreszcensen
www.thermofisher.com
DNS-tartalom mérése
![Page 29: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/29.jpg)
DNS-tartalom mérése
Hang & Fox, Methods Mol Biol. 2004;241:23-35.
se
jtszám
fluoreszcenciaintenzitás (PI)
se
jtszám
fluoreszcenciaintenzitáswww.thermofisher.com
proliferáció
sejtciklus
![Page 30: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/30.jpg)
Marie D et al., http://citeseerx.ist.psu.edu Alice Longobardi Givan: Flow cytometry: first principles (Wiley, 2001)
T0
20 hKlo
rofill
fluore
szcencia
FSC
Óceanográfia – természetes fikobiliproteinekMit eszik a kagyló?
Fitoplanktonok azonosítása
FSC SSC
SSC
fikoeritr
inF
I
fikoeritrin FI
klo
rofill
FI
klo
rofill
FI
klo
rofill
FI
![Page 31: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/31.jpg)
Antibiotikumrezisztencia mérése
Inokulálás
baktériumok növesztése
40-60 Min
Inkubálás:
antibiotikum és DiBAC4(3)
120 Min
citometria
kontroll és 6 minta
centrifugálás és
reszuszpendálás
Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5
DiBAC4(3):
fluoreszcens festék a
membránpotenciál
változásának mérésére
![Page 32: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/32.jpg)
Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5
E. coli izolátum antibiotikumrezisztencia vizsgálata
Antibiotikumrezisztencia mérése
Kirby-Bauer korongdiffúziós teszt (24 h)kontroll
antibiotikummal kezelt
![Page 33: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/33.jpg)
Multiplex áramlási citometriás mérés
• CBA – Cytokine Bead Array (Beckton Dickinson)
• Nagy számú analit mérése akár 1 mintából (vs ELISA, ahol sok mintából 1 analit mérése)
• Nem tudjuk, hogy melyik populáció termelte az adott citokint (ELISA-nál sem)
• Detektálható citokinek: IFNγ, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2, TNFα...
• Felhasználható mintatípusok: szérum, plazma, sejtkultúra felülúszója
gyöngyök minta
detektáló antitestek
mosás citometriás
mérés
koncentráció
standardgörbe
www.bdbiosciences.com
Multiplex citometria – citokinmérés
![Page 34: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/34.jpg)
citometriás
mérés
PE (FL2) +
APC (FL3)
FITC (FL1)
Multiplex citometria – citokinmérés
![Page 35: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/35.jpg)
Sejtválogatás - szortírozás
FACS: fluorescence-activated cell sorting
https://lombardi.georgetown.edu
![Page 36: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/36.jpg)
Fluoreszcens mikroszkópia
www.edmundoptics.com
fényforrás
• lézer
• lámpa
excitációs filter
• szelektív – csak a jelölt molekulákat látni
• térbeli és időbeli meghatározás
• minta: adherens és kitapasztott sejtek is
• jelölés gyakorlatilag azonos a citometriással
detektor
kamera
fotoelektronsokszorozó
emissziós filter
dikroikus
tükör
Paramecium sp.
www.leica-microsystems.com
minta
![Page 37: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/37.jpg)
Lézer pásztázó konfokális mikroszkóp (CLSM)
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu
• élő sejtek, folyamatok vizsgálata
(live cell imaging)
• pontos lokalizáció
kolokalizáció, FRET
hátrányok, nehézségek:
• kevés sejtről ad információt
(citometriához képest)
• lassabb (felbontástól függően)
adott idő alatt kevesebb sejt mérése
• fluorofórok halványodása, „kiégése”
• max. 4 paraméter
FRET: fluoreszcencia-rezonancia energia transzfer
![Page 38: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/38.jpg)
Széles mező megvilágítás (WF) vs. pont szkennelés (CLSM)
fényforrás
minta
széles mező konfokális
lyukdiafragma
„pinhole”
![Page 39: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/39.jpg)
Lézer pásztázó konfokális mikroszkópia – optikai szeletelés
www.olympus-lifescience.com
napraforgó pollen
(széles mező, epifluoreszcens kép)
20-40 µm nagy
0,5 µm-es szeletekcam.facilities.northwestern.edu
• fokális sík < minta vastagsága
• kép több fokális síkból leképezi az egész mintát
• fókuszon kívüli jelek kizárása
![Page 40: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/40.jpg)
Kontrasztfelvételek
www.olympus-lifescience.com
• Külön felvételek, digitálisan egymásra vetítve
(merge, overlay)
• A fluoreszcens jel lokalizációja
Fázis kontraszt (PC):
speciális kondenzor + fáziskontraszt objektív
megnövelt kontraszt
vékony (0,1 – 1 µm) mintáknál
Differencia interferencia kontraszt (DIC):
polarizátor + prizmák
relief-szerű kép
relatív vastag minták is vizsgálhatók így
Fibroblasztok
differencia
interferencia
kontraszt
sejtmag (DAPI) egymásra vetítve
Macska agyszövet, Criptococcus fertőzés
fázis kontraszt
neuron (FITC)
Criptococcus
(kongóvörös) egymásra vetítve
![Page 41: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/41.jpg)
Időbeli folyamatok követése:
Neutrofil extracelluláris csapda képződése
Bruns et al., PLoS Pathogens. 2010; 6: e1000873.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000873.s002
Video S1
![Page 42: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/42.jpg)
Összefoglalás
Áramlási citometria
• gyors
• multiparaméteres
• sok sejtről ad információt (statisztika)
• adherens sejtek, szövetek nem fiziológiásan
• lokalizáció nem mérhető
• időbeli folyamatok csak populációszinten
• adatok archiválása könnyű
Konfokális lézer pásztázó mikroszkópia
• lassabb (adott idő alatt kevesebb sejt mérhető)
• max. 4 paraméter
• kevesebb sejtről ad információt
• adherens sejtek, szövetek is fiziológiásan
• pontos térbeli lokalizáció
• időbeli folyamatok sejtszinten mérhetők
• adatok archiválása nehézkes (nagy méretű fájlok)
minta
(szuszpenzió)
fényszórás
fluoreszcencia
minta
(hordozón)
kontrasztkép
fluoreszcencia
![Page 43: Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló ... · Fluoreszcens technikák • érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni • térbeli](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041906/5e63630d62498911c4406b57/html5/thumbnails/43.jpg)
Köszönöm a figyelmet!
www. cellcartoons.net