FLUORESZCENS IN SITU FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓHIBRIDIZÁCIÓ

Készítette: Hajdu CsillaKészítette: Hajdu Csilla

Módszer elveMódszer elve

Fluoreszcens Fluoreszcens festékkel jelölt festékkel jelölt oligonukleotid próba oligonukleotid próba a sejt a sejt morfológiájának morfológiájának változása nélkül változása nélkül bejut a sejtbe, ahol bejut a sejtbe, ahol specifikusan köt a specifikusan köt a komplementer komplementer target target szekvenciáhozszekvenciához

AlkalmazásaAlkalmazása

Mikroorganizmusok gyors és pontos Mikroorganizmusok gyors és pontos mennyiségi és minőségi meghatározásra mennyiségi és minőségi meghatározásra alkalmasalkalmas

Speciális gének expressziójáraSpeciális gének expressziójáraMorfológiáról, szerkezetről,térbeli Morfológiáról, szerkezetről,térbeli

elhelyezkedésről ad információtelhelyezkedésről ad információt

Alkalmazásának előnyeiAlkalmazásának előnyei

Látható, de nem tenyészthető Látható, de nem tenyészthető mikroorganizmusok vizsgálatamikroorganizmusok vizsgálata

Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a fluoreszcencia intenzitása kisebbfluoreszcencia intenzitása kisebb

Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre többféle mikróbaközösség vizsgálhatótöbbféle mikróbaközösség vizsgálható

mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek termelését végző sejtek detektálhatóktermelését végző sejtek detektálhatók

Alkalmazásának hátrányaiAlkalmazásának hátrányai Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis

intenzitású jelet kapunkintenzitású jelet kapunk Élő és holt sejteket nem tudunk Élő és holt sejteket nem tudunk

megkülönböztetnimegkülönböztetni Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj)

autofluoreszceniiája gondot okoz autofluoreszceniiája gondot okoz speciális speciális szűrőkszűrők

rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a hozzáférés nem azonos valószínűségűhozzáférés nem azonos valószínűségű

Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny sávú filter)sávú filter)

Hibridizáció meneteHibridizáció menete

1. A minta fixálása1. A minta fixálása• Sejt átjárhatóvá tételeSejt átjárhatóvá tétele• Sejt épségének fenntartásaSejt épségének fenntartása• RNS-ek védelmeRNS-ek védelme

2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez 2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez rögzítésrögzítés

• Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, 80, 100%-os)80, 100%-os)

Hibridizáció meneteHibridizáció menete

3. Hibridizáció3. Hibridizáció• A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer

próba mintához adásapróba mintához adása4. A nem hibridizált próba eltávolítása 4. A nem hibridizált próba eltávolítása

mosássalmosással• 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel

mosás, majd szárításmosás, majd szárítás5. A minták értékelése mikroszkóppal5. A minták értékelése mikroszkóppal• Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos

mikroszkóppal, kamerával a képek mikroszkóppal, kamerával a képek digitalizálásadigitalizálása

Fluoreszcens festékekFluoreszcens festékek Fluoreszcein származékok (pl.: Fluoreszcein származékok (pl.:

fluoreszcein izotiocianát)fluoreszcein izotiocianát) Rhodamin származékokj(pl.: Rhodamin származékokj(pl.:

tatrarhodamin izotiocianát)tatrarhodamin izotiocianát) Cianin származékok: Cy3 – Cianin származékok: Cy3 –

rRNS-hez kötődik, gerjesztés: rRNS-hez kötődik, gerjesztés: 550 nm, emisszió: 570 nm 550 nm, emisszió: 570 nm

DAPI – DNS-hez kötődik, DAPI – DNS-hez kötődik, gerjesztés: 358 nm, emisszió: gerjesztés: 358 nm, emisszió: 461 nm461 nm

RNS-hez is kötődik: emisszió kb.: RNS-hez is kötődik: emisszió kb.: 400 nm400 nm

Hibridizált Hibridizált Escherichia coliEscherichia coli

Hibridizált Hibridizált Escherichia coliEscherichia coli

DAPI-val festett DAPI-val festett Trichosporon Trichosporon cutaneumcutaneum

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteniEzeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum

Saccharomyces cereviciae

Bacillus subtilis

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteniEzeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum

Bacillus subtilis

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteniEzeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneumSaccharomyces cereviciae

Bacillus subtilis

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteniEzeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteniEzeket a sejteket fogjuk megfesteni

Trichosporon cutaneum

Saccharomyces cereviciae

Ezeket a sejteket fogjuk megfesteniEzeket a sejteket fogjuk megfesteni