ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK
-
Upload
murphy-williams -
Category
Documents
-
view
55 -
download
0
description
Transcript of ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK
ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ
PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK
Immunaffinitás kromatográfia
ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé
ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal a
szubsztrát hozzáadását követően
ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal az
enzimreakció leállítását követően
AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE
ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN
oszlop polimer gyöngyök
rákötött antigének
oszlop töltelék
„affinity purified antibody” : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják
1) Tisztítandó ellenanyagok hozzáadása
2) Kötődés3) Mosás4) Elúció
A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI
hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok
oszlop
oszlop töltelék
Tisztított antigén
ANTIGÉNTISZTÍTÁS1) Tisztítandó oldat felvitele
2) Kötődés
3) Mosás
4) Elúciópolimer gyöngy
IMMUNPRECIPITÁCIÓ
• egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból
• fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata)
ELISA plate (lemez)
lyuk avagy kút
Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz
ELISAEnzyme Linked Immune Sorbent Assay
enzyme linked immune sorbent
ellenanyaghoz konjugált enzim
enzim
felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok
AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk
Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI
Direkt módszer Indirekt módszer
Antigén
Primer ellenanyag
Jelzés
Jelzés
Szekunder ellenanyagok
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI
Enzim-antienzim rendszer
PAP – peroxidáz / anti-peroxidázAPAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz
Antigén
Primer ellenanyag
Szekunder ellenanyag
(faj v. izotípus specifikus)
A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus
ellenanyag
Enzimek
AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI
Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerekAz avidin nagy affinitással képes a biotint kötni
Egyszerű ABC
Antigén
Biotinált ellenanyagAvidin
Avidin-enzim komplexek
Biotin-enzim komplex
Avidin Biotin Complex
Jel felerősítése
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor).
nem kötődő anyagok kimosása
telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével
felesleges fehérjék kimosása
eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok
hozzáadása
felesleges ellenanyagok kimosása
avidinnel konjugált enzim hozzáadása
színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása
citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása
citokin tartalmú minta hozzáadása
felesleges konjugátum kimosása
KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA
EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI
Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához
az antigén kitapasztása(coating avagy fedés)
felesleges antigén kimosása
telítés: a szabad plasztikfelület beborítása
aspecifikus fehérjével
felesleges fehérjék kimosása
specifikus ellenanyagok hozzáadása
enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása
felesleges ellenanyagok kimosása
színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása
Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével
HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid
KOMPETITÍV ELISAÉrzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez.
- A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás
- Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása
- Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés
- Mosás
- Kromogén anyagok hozzáadása
koncentráció
1000 50
0
250
125 62 31 16 7.8
3.9
1.9
0.97
0.49
0.24
0.12
0.03
0
0.06
1
0.00
7
0.01
5
0.00
4
0
Ismeretlen koncentrációjú minta
ODA standard hígítási sora
Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne
?
Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat
kell csinálni!
Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző
értékeket ad
Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.
BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek
Tumor antigének kimutatása
Citokinek, hormonok kimutatása
doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása
szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel
TUMORDIAGNOSZTIKA
A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikábanSzendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak
Tumor antigén (pl. a beteg szérumából)
Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része)
Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület
Prosztata daganatok
prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas)
hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból
AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS
ANALITIKAI MÓDSZEREK
immunoblot (Western blot)immunhisztokémia
WESTERN BLOT
Lépések:1) minta előkészítés (szöveti vagy
sejtes)2) gél elektroforézis3) blotolás4) jelölés5) előhívás
Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására
Anode(+)
Cathode(-)
• Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak• SDS-PAGE gél a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges)• Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik
StandardProtein minta
SDS-PAGE Membrán Western blot
Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján
WESTERN BLOT
• Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában
• Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát-Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják
• Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához
• Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT
Kimutatási eljárások:
Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria)
Kemilumineszcens (ECL)
Radioaktív (izotóp – RTG)
Fluoreszcens (jelölés – CCD camera)
Fab
Fc
Epitóp a protein felszínén
Primer ellenanyag
Szekunder ellenanyag
Torma- peroxidáz
Immobilizált proteinek
Membrán
H2O2
H2O
luminol
enhancer
h
detektálás
MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA/Enhanced chemiluminescence (ECL)/
• H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol)• Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba• A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható• A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer)
luminol
IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA
Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban
• Immunfluoreszcencia• fluoreszcensen jelzett ellenanyag
FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga)PE – fikoeritrin (narancssárga)
• Immunoenzim módszer• enzimmel konjugált ellenanyag
P – peroxidázAP – alkalikus foszfatáz(a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)
Szövetminta
FIXÁLÁS
Festés előtti metszetFAGYASZTÁS
METSZÉS
IMMUNHISZTOKÉMIA
IMMUNHISZTOKÉMIA
Avidin
Szövetmetszet
Sejtek (sejttenyészetek)
Tárgylemez
Primer antitest
Biotin
Szekunder antitest
EnzimABC komplex:• biotinált ellenanyag• avidin• biotinált enzim
Hagyományos hisztokémiaAkut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés)
Viszonylag kevés sejttípus azonosítható
Immunhisztokémia(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)
Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-
2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)
Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC)
Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)
Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt
Mitokondrium F-aktin Sejtmag
Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejtPeroxiszóma Mitokondrium Sejtmag