(1)

การยบยงแบคทเรยของสารกนเสยชวภาพทผลตจากแบคทเรยแลคตก ทนอณหภมต า

Bacterial Inhibition of Biopreservative Producing Psychrotrophic Lactic Acid Bacteria

มฮมหมดรฎวาน สมานรตน Muhammadridwan Samanurat

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Master of Science in Microbiology Prince of Songkla University

2557 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

(2)

ชอวทยานพนธ การยบยงแบคทเรยของสารกนเสยชวภาพทผลตจากแบคทเรยแลคตก ทนอณหภมต า ผเขยน นายมฮมหมดรฎวาน สมานรตน สาขาวชา จลชววทยา อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก คณะกรรมการสอบ ...................................................................... ...........................................ประธานกรรมการ (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปรยานช บวรเรองโรจน) (รองศาสตราจารย ดร.ดวงพร คนธโชต) .......................................................กรรมการ อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปรยานช บวรเรองโรจน) ...................................................................... ........................................................กรรมการ (รองศาสตราจารยวลาวณย เจรญจระตระกล) (รองศาสตราจารยวลาวณย เจรญจระตระกล) .......................................................กรรมการ (ดร.อจฉรา เพม) บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร อนมตใหนบวทยานพนธฉบบนเปน สวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา

............................................................ (รองศาสตราจารย ดร.ธระพล ศรชนะ)

คณบดบณฑตวทยาลย

(3)

ขอรบรองวา ผลงานวจยนเปนผลมาจากการศกษาวจยของนกศกษาเอง และขอแสดงความขอบคณบคคลทมสวนเกยวของ

ลงชอ……………………………...................... (ผชวยศาสตราจารย ดร.ปรยานช บวรเรองโรจน) อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก

ลงชอ……………………………..................... (นายมฮมหมดรฎวาน สมานรตน) นกศกษา

(4)

ขาพเจาขอรบรองวา ผลงานวจยนไมเคยเปนสวนหนงในการอนมตปรญญาในระดบใดมากอน และไมไดถกใชในการยนขออนมตปรญญาในขณะน

ลงชอ…………………………….. (นายมฮมหมดรฎวาน สมานรตน) นกศกษา

(5)

ชอวทยานพนธ การยบยงแบคทเรยของสารกนเสยชวภาพทผลตจากแบคทเรยแลคตก ทนอณหภมต า ผเขยน นายมฮมหมดรฎวาน สมานรตน ปการศกษา 2556 สาขาวชา จลชววทยา

บทคดยอ

วตถประสงคของการศกษาในครงนเพอคดเลอกแบคทเรยแลคตกทนอณหภมต าทแยกไดจากอาหารทะเลแชเยน และศกษาความสามารถในการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร เพอใชในการยบยงเชอแบคทเรยในอาหารทะเล โดยแยกแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเลแชเยน 14 ตวอยาง พบวาสามารถแยกแบคทเรยแลคตกบนอาหาร MRS บมทอณหภม 35 และ 8 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 และ 15 วน ได 52 และ 22 ไอโซเลทตามล าดบ น ามาทดสอบฤทธ การยบยงเชอแบคทเรยอนดเคเตอรคอ Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 และ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313 โดยวธ Agar spot assay ทความเขมขนสดทายเทากบ 106 CFU/mL พบวามแบคทเรยแลคตก 9 ไอโซเลททสามารถยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรไดทงหมด และม 17 ไอโซเลททสามารถยบยงแบคทเรย L. monocytogenes ATCC 15313 และV. parahaemolyticus AAHRC 1 ได และจากการทดสอบแบคทเรยแลคตกทไดรบความอนเคราะห จ านวน 53 ไอโซเลท พบวาสามารถยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร V. parahaemolyticus ได 52 ไอโซเลท และ สามารถยบยง L. monocytogenes ได 31 ไอโซเลท และเมอทดสอบการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรดวยวธ Agar well diffusion ของcell free supernatant (CFS) ของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดเลยงใน MRS broth ทอณหภม 8 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5 วน พบวามแบคทเรยแลคตกทยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรอยางนอย 1 สายพนธ มทงหมด 22 ไอโซเลท และพบวามเพยง 8 ไอโซเลทเทานน ทสามารถยบยงไดทง Vibrio parahaemolyticus และ Listeria monocytogenes คดเลอกแบคทเรยแลคตกทยบยงไดด 6 ไอโซเลท มาศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการผลตสารกนเสยชวภาพทมการแปรผนอณหภมท 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส พบวาแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทกไอโซเลทมการเจรญเรวและ มคา pH ในอาหารเลยงเชอลดลง เมอเลยงทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เชอทกไอโซเลทจะเจรญไดสงเมอบมเปนเวลา 48 ชวโมง ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส และเมอทดสอบฤทธการยบยงตอแบคทเรยอนดเคเตอร พบวาไอโซเลท HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 พบฤทธ การยบยง Listeria monocytogenes ตงแตการเจรญชวโมงท 12 ของการเพาะเลยงทกอณหภม

(6)

ส าหรบฤทธการยบยง Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 นน พบวา ทกไอโซเลทของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ไม แสดงฤทธการยบยงท ชวโมงท 24 โดยใหวงใสกวางมากกวา 35 มลลเมตร และไมพบวงใสในชวโมงท 36 และ 48 น าแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 ทแยกไดจากหมกกลวย ซงเจรญและสรางฤทธยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรไดดทสด เพาะเลยงในอาหาร MRS อณหภม 25 องศาเซลเซยสเปนเวลา 24 ชวโมง น า CFS มาศกษาสมบตของสารกนเสยชวภาพทคดเลอกไดดวยการทดสอบกบอณหภม พเอช และเอนไซมยอยโปรตน ไดแก proteinase K, protease, trypsin และ alpha-chymotrypsin พบวาเมอน า CFS ไปผานอณหภมสงท 63, 80 และ 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาทนน ฤทธการยบยงแบคทเรยไมมการเปลยนแปลงเมอเทยบกบตวควบคม ยกเวน CFS ทผานอณหภม 121 องศาเซลเซยส ทฤทธการยบยงเแบคทเรย Listeria monocytogenes ลดลง และเมอน า CFS ทมการปรบ pH เปน 6.5 เทยบกบ CFS ทไมมการปรบ pH พบวาไมมความแตกตางของการยบยงแบคทเรย และCFS ทผานการบมดวยเอนไซมชนดตางๆ ไมมฤทธในการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ยกเวน CFS ทผานการบมดวยเอนไซม trypsin เทานน ทสามารถแสดงฤทธการยบยงได แตมประสทธภาพการยบยงทลดลง

จากการจดจ าแนกสายพนธแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 ดวยวธ 16S rRNA sequence พบวาแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 มความใกลเคยงกบ Carnobacterium divergens DSM 20263T ซงม % similarity เทากบ 100 % ซงตรงกบ Accesstion number คอ AB 705304.1

จากนนน าแบคทเรย Carnobacterium divergens SQL 10104 มาศกษาฤทธในการยบยงเชอกอโรคทมกจะพบในอาหารทะเล (กงขาว) โดยน ากงขาวมาท าใหปลอดเชอและเตมแบคทเรยอนดเคเตอรทความเขมขนสดทาย 106 CFU/mL เพอทจะทดสอบฤทธการยบยงโดยใช CFS ของแบคทเรย Carnobacterium divergens SQL 10104 และใชอาหารเหลว MRS เปนชดควบคม พบวาเมอลางกงใน อาหารเหลวMRS และใน CFS เปนเวลา 10, 20 และ 30 นาท พบวา เชอกอโรคในกงลดลง โดยกงทมเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 เมอลางใน MRS และใน CFS พบวา เชอลดลงประมาณ 2 log CFU/mL ส าหรบกงทมเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 เมอลางลงใน MRS เชอลดลง 1 log CFU/mL แตเมอลางลงใน CFS เชอลดลงถง 3 log CFU/mL

(7)

Thesis Title Bacterial Inhibition of Biopreservative Producing Psychrotrophic Lactic Acid Bacteria Author Mr. Muhammadridwan Samanurat Major Program Microbiology Academic Year 2013

Abstract This study aims to select psychrotrophic lactic acid bacteria isolated from seafoods and study bacterial inhibition of biopreservative producing psychrotrophic lactic acid bacteria. 52 and 22 isolates from 14 samples of chilled seafoods cultered on MRS agar medium incubated for 2 and 15 days at 35 oC and 8oC, respectively were lactic acid bacteria. All of them were investigated the inhibition of 4 strains bacteria indicators: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 and Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 incubated at 37 oC and Listeria monocytogenes ATCC 15313 incubated at 20 oC with last concentration 106 CFU/mL determined by the agar spot method. It was found that 9 isolates were inhibited all of bacteria indicators and 17 isolates were inhibited L. monocytogenes and V. parahaemolyticus. In addition, 53 isolates of lactic acid bacteria were courtesy. Found 52 isolates were inhibited Vibrio parahaemolyticus and 31 isolates were inhibited L. monocytogenes. Selected lactic acid bacteria were further investigated the inhibition of 2 strains bacteria indicator: L. monocytogenes and V. parahaemolyticus by the agar well diffusion method. Lactic acid bacteria cultured on MRS broth medium incubated at 8 oC for 5 days. Then Centrifuge and sterilization with filtration method as crude filtrate supernatant (CFS), 22 isolates of selected lactic acid bacteria could inhibited at least 1 strain of bacteria indicators and 8 isolates of selected lactic acid bacteria could inhibited both of bacteria inhibitors. 6 isolates of selected lactic acid bacteria were studied about an optimal temperature for growth and biopreservative production at 15, 20, 25 and 30 oC. All of them could decrease pH in medium, incubated at 30 oC faster decrease than another temperature. However selected lactic acid bacteria could grew fast but also entered to stationary phase fast. An optimal temperature of selected lactic acid bacteria were 25 oC except SQL 10104 can growth at 20 oC. Moreover, investigated the inhibition of bacteria

(8)

indicators: HYL 25103, SQL 10104 and SQL 10107 could inhibited Listeria monocytogenes since incubated 12 hours of all temperatures. The inhibition of Vibrio parahaemolyticus found all of selected lactic acid bacteria could inhibited at 24 hours and could not inhibited after 24 hours. The selected lactic acid bacteria (SQL 10104) were incubated on MRS at 25 oC 24 hours for studied characteristics of CFS: tested with temperature, pH and proteases (proteinase K, ptotease, trypsin and alpha-chymotrypsin). The antibacterial activity of CFS treated with 63, 80 and 100oC for 30 minutes on Listeria monocytogenes were not changed when compared with the control, except CFS treated with 121oC decrease antibacterial activity. A CFS treated with pH and without treated pH were not difference of antibacterial activity. In addition, CFS treated with proteinase K and alpha-chymotrypsin were not decreased antibacterial activity on Listeria monocytogenes when compared with the control, except the CFS treated with trypsin.

Identification of isolate SQL 10104 with 16SrRNA sequence analysis and processed in GenBank database with BLAST, SQL 10104 was Carnobacterium divergens DSM 20263T with 100% similarity and matches accestion number of AB705304.1

In addidtion, Carnobacterium divergens SQL 10104 was tested for inhibited pathogenic bacteria in seafood (White wild shrimps). The sterile shrimps were added with bacteria inhibitors before washed in CFS of Carnobacterium divergens SQL 10104 and MRS broth were a control at 10, 20 and 30 minutes. The results showed that a sterile shrimps were washed with MRS broth and CFS could decreased Vibrio parahaemolyticus about 2 log CFU/mL. and MRS broth could decreased Listeria monocytogenes about 1 log CFU/mL Moreover, CFS could decreased Listeria monocytogenes about 3 log CFU/mL

(9)

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนเสรจสมบรณไดดวยความกรณาและความอนเคราะหอยางดยงจากบคคลหลายทาน ซงไมอาจน ามากลาวไดทงหมด โดยขาพเจาขอขอบพระคณผชวยศาสตราจารย ดร.ปรยานช บวรเรองโรจน อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลกทไดกรณาใหค าปรกษา แนะน าและชวยเหลอในการศกษาคนควาดวยดเสมอมา รวมทงใหก าลงใจดวยความเมตตา หวงใย และเอาใจใสขาพเจาตงแตเรมท าวทยานพนธฉบบนจนกระทงเสรจสมบรณ ขอขอบพระคณอาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม รองศาสตราจารยวลาวณย เจรญจระตระกล ทกรณาใหค าปรกษาในการท าวจย และตรวจทานแกไขวทยานพนธฉบบนใหถกตองและสมบรณยงขน ขอขอบพระคณรองศาสตราจารย ดร.ดวงพร คนธโชต ประธานกรรมการสอบวทยานพนธ และ ดร.อจฉรา เพม กรรมการผทรงคณวฒจากคณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏสงขลา ขอขอบพระคณ คณาจารยภาควชาจลชววทยาทกทานทประสทธประสาทวชาความร ใหค าแนะน าทดทเปนประโยชนตอการเรยนและการท าวจย อบรมจรรยามารยาท รวมทงใหความเมตตาแกขาพเจา ขอขอบพระคณ คณพอกร และคณแมไลลา ทไดอยเบองหลงความส าเรจทไดใหความชวยเหลอสนบสนน และใหก าลงใจตลอดมา ขอขอบคณพๆ นองๆ เพอนๆ นกศกษา และเจาหนาทภาคจลชววทยาทกทาน ตลอดจนทกทานทไมไดกลาวนามมา ณ ทนดวย ซงไดสนบสนน และมสวนชวยใหวทยานพนธฉบบนส าเรจลลวงไปไดดวยด

มฮมหมดรฎวาน สมานรตน

(10)

สารบญ หนา สารบญ (10) รายการตาราง (11) รายการภาพประกอบ (13) สญลกษณค ายอและตวยอ (16) บทท 1 บทน า

บทน าตนเรอง 1 การตรวจเอกสาร 3 วตถประสงค 26 2 วสดอปกรณ และวธการ อาหารเลยงเชอ และสารเคม 27 อปกรณและเครองมอ 28 แบคทเรยทใชทดสอบ 29 วธการทดลอง 29 3 ผลการทดลอง 35 4 วจารณผลการทดลอง 61 5 สรปผลการทดลอง 66 เอกสารอางอง 69 ภาคผนวก 72 ประวตผเขยน 88

(11)

รายการตาราง

ตารางท หนา 3.1

จ านวนแบคทเรยสรางกรดและแบคทเรยแลคตกทแยกไดจากอาหารทะเลแชเยนบนอาหาร MRS ทเตม bromcresol purple 0.004 เปอรเซนต และ calcium carbonate 0.5 เปอรเซนต บมทอณหภม 35 และ 8 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 และ 5-15 วน ตามล าดบ

35

3.2 การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ดวยวธ Agar spot assay

37

3.3 การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของแบคทเรยแลคตกจ านวน 53 ไอโซเลททไดรบความอนเคราะหจาก นางสาว นชร ตนตสวรรณโณ ดวยวธ Agar spot assay

38

3.4 การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของแบคทเรยแลคตก ดวยวธ Agar well diffusion assay

42

(12)

รายการตาราง (ตอ)

ตารางผนวกท หนา 1 ผลการแยกเชอแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเล บนอาหาร MRS ทเตม

CaCO3 1.0 % และ Bromcresol purple 0.004% บมท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2-7 วน

77

2 ผลการแยกเชอแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเล บนอาหาร MRS ทเตม CaCO3 1.0 % และ Bromcresol purple 0.004% บมท 8 องศาเซลเซยส เปนเวลา 7-15 วน

81

3 ผลการยบยงเชอของแบคทเรยแลคตกทแยกไดจากอาหารทะเลตอแบคทเรยอนดเคเตอร

85

(13)

รายการภาพประกอบ

รปท หนา 3.1

แสดงวงใสของการยบยงเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 ดวยวธ Agar spot ของไอโซเลท SHL 10101 และ FSJ 10105

38

3.2

วงใสการยบยงของ CFS ตอเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 (ซาย) และ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1(ขวา)

42

3.3 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25103 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

44

3.4

การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25104 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

45

3.5 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 25104 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

46

3.6 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท HYL 25103 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

47

3.7 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

48

3.8 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10107ทเลยงในอาหาร MRS brothบมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

49

3.9 ลกษณะของวงใสของ CFS ทไดมาจากการเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได

50

(14)

รายการภาพประกอบ (ตอ)

รปท หนา 3.10 ฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ

แบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25103, SHL 25104, SQL 25104, HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 ทเจรญในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

51

3.11 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQ L10104 ทแชในอางน าอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาทและเขาเครอง Autoclave ทอณหภม121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท

53

3.12 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ทแชในอางน าอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาทและเขาเครอง Autoclave ทอณหภม121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท

53

3.13 แสดงฤทธการยบยง แบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313เทยบกบ CFS ทมการปรบ และไมปรบ pH

54

3.14 แสดงฤทธการยบยง แบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313เทยบกบ CFS ทมการปรบ และไมปรบ pH

54

3.15 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ทผานการ treat ดวยเอนไซม proteinase K, protease, trypsin และ alpha-chymotrypsin ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

55

3.16 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของCFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ทผานการ treat ดวยเอนไซม proteinase K, protease, trypsin และ alpha-chymotrypsin ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

55

3.17 รปรางและการจดเรยงตวของแบคทเรยแลคตก SQL 10104 56 3.18 การจดล าดบอนกรมวธานของสายพนธ SHL 10104 56

(15)

รายการภาพประกอบ (ตอ)

รปท หนา 3.19 จ านวนเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 ในกงทเหลอเมอผานการ

แชใน CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104(ขวา) และการแชใน MRS (ขวา) เปนเวลา 10 นาท

59

3.20 จ านวนเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 ในกงทเหลอเมอผานการแชใน CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 (ขวา) และการแชใน MRS (ขวา) เปนเวลา 10 นาท

59

3.21 การยบยงVibrio parahaemolyticus AAHRC 1โดยใช CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 และการแชใน MRS เปนเวลา 10 20 และ 30 นาท

60

3.22 การยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 โดยใช CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 และการแชใน MRS เปนเวลา 10 20 และ 30นาท

60

(16)

สญลกษณค ายอและตวยอ

CFU = Colony forming unit o C = Degree Celsius g = Gram (s) pH = Hydrogen ion concentration log = Logarithm µg = Microgram (s) µl = Microlitre (s) mL = Mililitre (s) % = Percent

1

บทท 1

บทน า

บทน าตนเรอง ความปลอดภยของอาหารเปนเรองส าคญอยางยงส าหรบผผลตอาหารและผทม หนาทเกยวของกบการออกกฎหมายเพอคมครองผบรโภคใหไดรบประทานอาหารทปลอดภยปราศจากเชอกอโรคและสารเคมทเปนพษตอรางกาย ในปจจบนแมวาความรทางจลชววทยาจะพฒนากาวหนาขนไปมากแตอตราการเกดโรคอาหารเปนพษทวโลกกยงคงเพมสงขนเนองจากวฒนธรรมในการบรโภคอาหารของมนษยไดเปลยนแปลงไปตามสภาพเศรษฐกจ กลาวคอมนษยเรมใชเวลาอยางเรงรบในการใชชวตในแตละวน กระทงอาหารทใชบรโภคนนกตองเรงรบเชนกน อาหารจงตองตอบสนองความเรงรบของมนษย เชนการท าอาหารส าเรจรป การยดระยะอายการเกบของอาหารเพอทจะไดซออาหารไดคราวละมากๆและลดเวลาการเดนทางในการซออาหาร ซงสามารถท าไดทงวธทางชวภาพ หรอการใชสารเคม ขณะเดยวกนผบรโภคกมความสนใจเกยวกบอาหารเพอสขภาพกนมากขนผผลตอาหารจงตองลดปรมาณการใชเกลอน าตาลและสารกนเสยและน าวธการอนเขามาชวยในการยดอายการเกบรกษาอาหารแทนเชนการใชระบบท าความเยนการใชภาชนะบรรจทดดแปลงสภาพบรรยากาศหรอท าให เกดสภาพสญญากาศเพอลดปญหาการเสอมเสยเนองจากจลนทรยรวมทงการใชสารกนเสยชวภาพเชน แบคเทอรโอซนจากแบคทเรยแลคตก (lactic acid bacteria, LAB) ทดแทนการใชสารเคมหรอสารปฏชวนะทอาจกอใหเกดผลขางเคยงทเปนอนตรายตอสขภาพของผบรโภค การปองกนการเนาเสยของอาหารนนมหลายวธ เชนการท าใหแหงโดยใชความรอนและความเยน การเกบทอณหภมเยนซงวธเหลานเปนวธทางกายภาพในการเกบรกษา แตกยงมรายงานถงความไมสมบรณในการปองกนจลนทรยปนเปอน คอมการพบจลนทรยทท าใหอาหารเนาเสยในการเกบทอณหภมต า เชน Aeromonas, Alcagines, Arthrobacter และ Corynebacterium เปนตน (บษกร ,2550) นอกจากนยงมการใชสารเคมเตมลงในอาหารเพอใชเปนสารกนเสย เชน benzoic acid และ sodium benzoate ซงสารทงสองชนดนเปนสารกนเสยทมฤทธกวาง (broad spectrum) มกใชเปนสารตานเชอ ส าหรบยาปฏชวนะ เชน natamycin ซงไดจากเชอ Streptomyces natalensis ซงมฤทธตานเชอจลนทรยแตปจจบนนกพบวามจลนทรยหลายชนดทดอตอยา (Magnusson et al, 2003) นอกจากนยงมรายงานการใชแบคทเรยแลคตกเปนสารกนเสยชวภาพตามธรรมชาตในอาหารมนษยและอาหารสตวมานานแลวไดมการศกษา

2

ถงสารตานจลนทรยทผลตโดยแบคทเรยแลคตกพบวามหลายชนด เชน organic acid, phenyllactic acid, proteinaceous compounds และ fatty acids (Magnusson et al, 2003) สารกนเสยชวภาพหมายถงสารตานจลนทรยทไดจากสงมชวต โดยสารนนจะชวยเพม shelf life ของอาหารใหนานขน และมความปลอดภยตอผบรโภคสารกนเสยชวภาพนนถอวาเปนนวตกรรมใหมในการยดอายการเกบของอาหาร สารกนเสยชวภาพทผลตไดนนจะน ามาใชกบอาหารเพอยบยงแบคทเรยไมพงประสงค โดยสารกนเสยชวภาพนนจะประกอบไปดวยสารหลายชนด เชน กรดอนทรย ไฮโดรเจนเปอออกไซด ไดอะซทล และแบคเทอรโอซน ซงแบคทเรยทผลตสารเหลานออกมามาก และนาสนใจกคอ กลมของแบคทเรยแลคตก ซงมผลในการปองกนการเนาเสยและการกอโรคได (สมใจ และคณะ, 2550) สารกนเสยชวภาพนนมกจะพบในอาหารหมกดอง แตกมรายงานเกยวกบสารกนเสยชวภาพทสามารถพบไดในอาหารทไมหมกดองไดเชนกน แตมรายงานซงเกยวของกบเรองนนอยมาก โดยเฉพาะสารกนเสยชวภาพทพบจากแบคทเรยแลคตกในอาหารทะเล และผลการยบยงเชอ Listeria spp. โดยใชแบคทเรยแลคตกหลายสายพนธทแยกไดจากผลตภณฑอาหารทะเล (Nilsson et al, 1999) และมผลการรายงานของแบคทเรยแลคตกทสามารถผลตสารกนเสยชวภาพในอณหภมต าได (Matamoros et al, 2009) มการรายงานอธบายถงแบคทเรยแลคตกทสามารถผลตสารกนเสยชวภาพเชน แบคเทอรโอซนซงเปนสารยบยงการเจรญของจลนทรยทมโครงสรางเปนโปรตนหรอ peptide ซงสรางขนโดยแบคทเรยหลายชนดแตทส าคญในอตสาหกรรมอาหารไดแกแบคเทอรโอซนทสรางขนจากแบคทเรยแลคตกเนองจากแบคทเรยแลคตกเปนแบคทเรยทเกยวของกบการผลตอาหารหมกชนดตางๆซงมนษยบรโภคมาเปนเวลานานแลว (อรอนงค, 2007) ดงนนผบรโภคสวนใหญจงยอมรบวาแบคทเรยแลคตกทแยกไดจากอาหารหมกเปน food-grade organism ทปลอดภย (generally recognized as safe, GRAS) และเนองจากแบคเทอรโอซนมโครงสรางเปนโปรตนซงถกยอยสลายไดในระบบยอยอาหารของมนษยจงมแนวโนมทปลอดภยส าหรบใชในอาหารไดแบคเทอรโอซนทสรางจากแบคทเรยแลคตกสวนใหญยบยงการเจรญของแบคทเรยสายพนธทใกลชดกบแบคทเรยแลคตกชนดทสรางแบคเทอรโอซนนนอยางไรกตามมรายงานวาแบคเทอรโอซนจากแบคทเรยแลคตกบางชนดสามารถยบยงแบคทเรยแกรมบวกทท าใหเกดโรคอาหารเปนพษไดเชน Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes และ Staphylococcus aureus โดยเฉพาะ Listeria monocytogenes เปนแบคทเรยทกอใหเกดปญหาในอตสาหกรรมอาหารแชแขงเปนอยางมาก (Guerrieri et al, 2009) ดงนนในงานวจยนจงไดศกษาเกยวกบแบคทเรยแลคตกทผลตสารกนเสยชวภาพไดจากผลตภณฑอาหารทะเลแชเยนเพอหาแนวทางในการน ามาใชเปนสารกนเสยชวภาพและเปนแนวทางในการผลตสารกนเสยชวภาพส าหรบใชในการถนอมอาหารทะเลแชเยนเพอยดอายการเกบรกษาใหนานขนตอไป

3

การตรวจเอกสาร 1. แบคทเรยแลคตก เปนกลมแบคทเรยทสรางกรดแลคตกเปนสารเมตาบอไลททตยภม พบในอาหารหลายชนด โดยเฉพาะในนม ผก และผลไม แบคทเรยนเปนแบคทเรยเจรญในสภาวะทไมมอากาศ และทนในสภาพทมอากาศ มความสามารถในการหมกน าตาลกลโคส ซงจะใหกรดแลคตกเปนผลตภณฑหลกในการหมกคารโบไฮเดรต ( Sneath et al, 1986) ลกษณะทวไปของแบคทเรยประเภทนคอ ยอมตดสแกรมบวก รปรางกลมและทอน แบคทเรยแลคตกขาดสารไซโตโครม (cytochromes) และฟอรไฟลน (porphyrins) จงไมใหเอนไซมคะทะเลส และออกซเจน (อรอนงค, 2551) แบคทเรยแลคตกจดอยในตระกล Lactobacillaceae ตองการอากาศในการเจรญเพยงเลกนอย (microaerophile) บางชนดสามารถเจรญไดในสภาวะไมมอากาศ (strictly anaerobe) สามารถเจรญไดในทอณหภมแตกตางกน และสามารถทนตอสภาวะทมอากาศ (aerotolerant) และทนกรดได (Wood and Hopzapfel, 1995) เนองจากเปนแบคทเรยทไดพลงงานจากการหมกน าตาลโดยไมตองใชออกซเจน โดยเฉพาะน าตาลกลโคสและแลกโทส แบคทเรยแลคตกเปนพวกทมความตองการอาหารคอนขางซบซอน (complex and enrichment media) เชอจะเจรญในอาหารทม growth factor เชน ใชกรดอะมโนเปนแหลงไนโตรเจน นอกจากนยงตองการวตามนและเกลอแรอกหลายชนด เชน ไบโอตน (Biotin) และไรโบฟลาวน (Riboflavin) เปนตน สวนใหญตองการสารอนนทรยในปรมาณทคอนขางสงเชน แมงกานส แมกนเซยม และฟอสฟอรส เปนตน แบคทเรยแลคตกสวนใหญเปนพวกทไมกอใหเกดโรค เชอกลมนเปนเชอประจ าถน พบไดในรางกาย เชน บรเวณเยอบภายในทอทางเดนอาหาร ชองฟน และชองคลอดของสตวเลยงลกดวยนม นอกจากนนยงพบทวไปตามธรรมชาตโดยเฉพาะในอาหาร เชน ผลตภณฑอาหารหมก ผลตภณฑนม ผลตภณฑหมกจากธญพช ผลตภณฑเนอและปลาหมก เครองในสตว และเครองดมตางๆ เปนตน(อจฉรา, 2549) แบคท เ รยแลคตกจดว า เ ปนจ ลนทรยท มค ว ามปลอดภย (Generally Regognized as Safe, GRAS) ซงมนษยไดน ามาใชประโยชนมาเปนระยะเวลายาวนาน โดยน ามาใชในการถนอมอาหาร และใชเปนจลนทรยโปรไบโอตกในอาหารหลายประเภท เนองจากแบคทเรยแลคตกมสมบตทเหมาะสมหลายประการ โดยสามารถยบยงการเจรญของเชอจลนทรยกอโรคหลายชนด เชน แบคเทอรโอซน และกรดอนทรยตางๆ เปนตน (ภวต, 2544)

4

ลกษณะส าคญของแบคทเรยแลคตก คอ ความสามารถในการยอยน าตาลใหเปนกรด ท าใหเกดรสชาตเฉพาะในผลตภณฑอาหารหมก เชน ผกดอง เนยแขง เปนตน แบคทเรยแลคตกโดยเฉพาะในกลม Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcusและ Streptococcus มบทบาทในการหมกอาหารและ เครองดมหลายชนดเชน นมเปรยว เนยชนดตางๆ ผกผลไมดอง ผลตภณฑเนอหมกชนดตางๆ และผลตภณฑหมกทไดจากธญพช เชน ขนมจน ลกแปงขาวหมาก เปนตน (สพรรณการ, 2548) แบคทเรยแลคตกแบงออกเปน 2 กลม ตามความสามารถในการหมกน าตาล คอ 1. Homofermentative lactic acid bacteria สามารถหมกน าตาลกลโคส หรอน าตาลทมคารบอน 6 อะตอมผานวถไกลโคไลซส(glycolysis หรอ Embden-Mayerhof-parnas pathway, EMP pathway) โดยมกระบวนการหมกเปนแบบ Homofermentation ซงจะไดผลตภณฑสดทายเปนกรดแลคตกเปนสวนใหญ กลไกการเกดกรดแลคตก คอ ในขนตอนแรกจะเกดการเปลยนกลโคสใหเปนglucose-6-phosphate และ fructose-6-phosphate จากนนจะถกเปลยนเปน dihydroxy-acetone-phosphate และglyceral-3-phosphate ซงเปนสารประกอบคารบอน 3 อะตอม ดวยเอนไซม lactatedehydrogenase จากนนจะเปลยนเปนกรดไพรวก (pyruvic acid) ดวยวถ glycolysisแลวจงเปลยนกรดไพรวกเปนกรดแลคตก85-95เปอรเซนต จากกระบวนการเปลยนน าตาลกลโคสเปนกรดแลคตกจะไดพลงงาน ATP 2โมเลกลตอกลโคส 1โมเลกล แบคทเรยกลมนสามารถแบงออกไดเปน 2 กลม คอ พวกทเจรญไดดทอณหภม 15 oCเรยกวา streptobacterium และพวกทไมสามารถเจรญทอณหภม 15 oCเรยกวา thermobacterium และแบคทเรยแลคตกกลมทมเมแทบอไลทแบบ homofermentative ไดแก Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Tetranococcus และบางกลมของ Lactobacillus ไดแก Lactobacillus plantarum เปนตน (สพรรณการ, 2548) 2. Heterofermentative lactic acid bacteria สามารถหมกน าตาลกลโคสและน าตาลชนดอนผานวถ phosphoketolase (PK pathway หรอ 6-phosphogluconatepathway,6-PG pathway) ซงจะมกระบวนการหมกเปนแบบ Heterofermentation โดยเปนกระบวนการหมกทเกดกรดแลคตกไดเพยง 50 เปอรเซนตเทานน ซงจะไดผลตภณฑสดทายหลายชนด เชน กรดแลคตกกรดอะซตก กรดฟอรมก เอทานอลอะซเทตกลเซอรอล และคารบอนไดออกไซด เนองจากแบคทเรยกลมนไมมเอนไซม aldolase ซงเปนเอนไซมในวถ EMP ดงนนจงเกดการหมกผานวถ phosphogluconate โดย glucose-6-phosphate จะถกออกซไดซเปน 6-phospho-gluconate จากน นจะเกดปฏกรยาดคารบอกซเลชน ได pentose-phosphateกบกาซคารบอนไดออกไซด แลว pentose-phosphate จะแตกตวโดยเอนไซมphosphoketolase เปน trihose-phosphate ซงจะเปลยนเปนแลกเตตและอะซตลจะเปลยนเปนเอธานอล แบคทเรยแลคตกกลมทมเมแทบอลซมแบบ heterofermentative เชน Leuconostoc, Oenococcus,

5

Weissella และบางกลมของ Lactobacillus ไดแก Lactobacillus bulgaricus และ Lactobacillus caseiเปนตน(สพรรณการ, 2548) นอกจากนแบคทเรยแลคตกอาจใชกระบวนการอนๆ ในการสรางผลตภณฑตางๆ เชน กรดฟอรมก และกลเซอรอล เปนตน นอกจากนพบวาแบคทเรยแลคตกกลม homofermentative บางชนดสามารถแสดงผลตภณฑสดทายเหมอนแบคทเรยแลคตกกลม heterofermentative เชน กรดฟอรมกกรดอะซตก และเอธานอล (Cogan et al., 1989) ผลตภณฑเหลานจะผลตขนเมอมระดบของ fructose-1,6-diphosphate ภายในเซลลต า โดยเฉพาะเมอเจรญอยในสภาวะทมน าตาลกลโคสปรมาณจ ากด (Thomas et al, 1979) ดงนนเรยกแบคทเรยกลมนวา facultative homofermentation (De Vuyst and Vandamme, 1994) 1.1 อนกรมวธานของแบคทเรยกรดแลคตก การนยามและการจดจ าแนกแบคทเรยกรดแลคตกมการเปลยนแปลงอยางตอเนองโดยเฉพาะชวง 10–20 ปทผานมาในอดตนนหมายถงกลมแบคทเรยทท าใหน านมเปรยวจากการผลตกรดซงรวมถงแบคทเรยแกรมลบกลมโคลฟอรมดวยปจจบนแมไมมนยามทชดเจนและเปนเอกฉนทแตลกษณะพนฐานซงยอมรบทวไปของแบคทเรยกลมนคอเปนกลมแบคทเรยแกรมบวกซงไมสรางสปอร ขาดเอนไซมคะตะเลส ขาดไซโตโครมทนตอสภาวะมอากาศ (aerotolerant) ทนตอความเปนกรดตองการสารอาหารสงในการเจรญ และผลตกรดแลคตกเปนผลตภณฑหลกจากการหมกน าตาล (ปนมณ, 2543) สวนการจดจ าแนกระดบสปชสของแบคทเรยแลคตก อาศยลกษณะทางสรรวทยา และ ชวเคม การทนตอน าด ความสามารถในการสลายเมดเลอดแดง ลกษณะของการเจรญในน านม และชนดของเซรมเปนตน นอกจากนมการน าวธการตรวจสอบถงระดบสารทมโมเลกลขนาดใหญตางๆ ภายในเซลลเพอพเคราะหถงความสมพนธและลกษณะทางพนธกรรม โดยเฉพาะกรดนวคลอก โดยใชเทคนคทางพนธศาสตรรวมดวย เชน อตราสวนเบสในดเอนเอ องคประกอบของกรดไขมนและการเคลอนทผานสนามไฟฟาของเอนไซมแลกเทตดไฮโดรจเนส (Axelsson, 1998) เปนตน 1.2 ลกษณะทใชในการจดจ าแนกแบคทเรยแลคตก 1.2.1 ลกษณะทางสนฐานวทยา (Morphology)

6

เปนการศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาภายใตกลองจลทรรศน โดยพจารณาจากรปรางเซลล การจดเรยงตว การเคลอนท การยอมตดสแกรม การสรางแคปซล การสรางสปอร หรอ แฟลกเจลลา เปนตน พบวา จนส Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus และ Enterococcus มลกษณะทางสณฐานวทยาทใกลเคยงกนสามารถแยกออกจากจนสอนไดในขณะทจนส Lactobacillusแและ Carnobacterium ไมสามารถแยกออกจากกนได จนสLactobacillus มลกษณะทางสณฐานวทยาแตกตางออกไปจากกลม Bifidobacterium และแบคทเรยแลคตกจนส Streptococciซงแบงออกเปน 3 จนส คอ Lactococcus, Enterococcusและ Streptococcusอยางไรกตามสภาวะการเจรญและระยะเวลาในการเจรญของเซลล อาจมผลตอลกษณะทางสณฐานวทยาของเซลล (De Vuystand and Vandamme, 1994) เชน Leuconostoc เมออยในอาหารทมกลโคส ขนาดของเซลลจะยดยาวออกและมรปรางเปนทอนใกลเคยงกบลกษณะทางสณฐานของ Lactobacillus แตเมอเจรญในน านมเซลลจะมรปรางกลม อยเปนเซลลเดยว หรอค หรอเรยงตอกนเปนสายสน ในขณะทเจรญบนอาหารแขงเซลลมลกษณะเปนทอนยาว นอกจากนยงพบบางสายพนธอาจผลตเมอก (slime) เชน Leuconostoc mesenteroides (Dellagilo et al., 1995) 1.2.2 ลกษณะทางสรรวทยา (Physiology) โดยศกษาความสามารถในการเจรญทอณหภมตางๆ ในสภาวะความเปนกรด -ดาง ในสภาวะทมหรอไมมออกซเจน ในสภาวะทมความเขมขนของอออน ความสามารถในการทนเกลอ และ Hydrostatic pressure เชนใชความตองการออกซเจน อณหภม ความเขมขนของอออน pH และ Hydrostatic pressure ในการแยกความแตกตางระหวาง Lactobacillus และ Carnobacterium พบวา Carnobacterium ไมสามารถเจรญไดท pH 4.5 และบนอาหารเพาะเชอแขงอะซเทต แตสามารถเจรญไดท pH 9.0 (Hammes et al., 1991) นอกจากนยงพบวา Lactobacillus สามารถเจรญไดทอณหภม 45 องศาเซลเซยส ขณะท Carnobacterium ไมสามารถเจรญได (Kandler and Weiss, 1986) ส าหรบการแยกความแตกตางของเชอในกลมใหญ โดยวธการทดสอบทางสรรวทยาอาจไม เพยงพอ อาจจะตองใชวธการทดสอบอนๆ เพมเตมดวย (De Vuyst and Vandamme, 1994) 1.2.3 การหมกแหลงคารโบไฮเดรต (Carbohydrate fermentation) ศกษาความสามารถของแบคทเรยแลคตกแตละชนด ในการใชสารอาหารและการสรางผลตภณฑทไดจากกระบวนการเมแทบอลซมโดยศกษาการเปลยนแปลงทางชวเคมทเกดขนและรปแบบการหมกสารประเภทคารโบไฮเดรต จากการเลยงเชอชนดตางๆ ในอาหารเพาะเชอทใสสารอาหารชนดตางๆลงไปแลวสงเกตการเปลยนแปลงทเกดขนในอาหารเลยงเชอ เชน การเปลยนแปลงสของอาหารเลยงเชอเนองจากกรด การเกดกรด การเกดแกส และการเกด

7

สารบางชนด เปนตน รวมทงการศกษารปแบบของการหมกสารประเภทคารโบไฮเดรต (De Vuyst and Vandamme, 1994) 1.2.4 สวนประกอบของผนงเซลล (cell wall composition) องคประกอบทางเคมของผนงเซลลของแบคทเรยแลคตก ซงเปนแบคทเรยแกรมบวก จะประกอบดวยเพปตโดไกลแคน ไลโพพอลแซกคารไรดไลโพโปรตน กรดไทโคอก และกรดอะมโนหลายชนด เปนตน ซงความแตกตางดานโครงสรางของเพปตโดไกลแคน ปรมาณและชนดของกรดอะมโนทเปนองคประกอบของผนงเซลล มความแตกตางกนตามชนดของแบคทเรย (Schleifer and Kandler, 1972) 1.2.5การเคลอนทผานสนามไฟฟาของเอนไซมแลกแตทดไฮโดรจเนส (Electrophoretic mobility of lactate dehydrogenase) ในกระบวนการหมกแบคทเรยแลคตกสามารถผลตกรดแลคตกไดเปนชนด D, L หรอทง 2 ชนดทงนขนกบการมเอนไซม NAD+-dependent lactate dehydrogenase (nLDH) ชนด D-nLDHหรอ L-nLDHซงแบคทเรยแตละชนดจะมรปแบบของเอนไซมแตละชนดตางกน (Axelsson, 1998) ดงน นจงสามารถจ าแนกแบคทเรยได โดยอาศยหลกของวธ gel electrophoresis เพอจ าแนกเอนไซม lactate dehydrogenase (LDH) บน starch gel หรอ polyacrylamide gel ใชจ าแนกความแตกตางของเชอทมสายพนธใกลเคยงกนมาก เชน Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseriและ Lactobacillus johnsonii (Pot et al., 1994) 1.2.6 SDS-PAGE ของโปรตนทงเซลล อาศยหลกการเชอทมสายพนธตางกนจะใหรปแบบของโปรตนทไมเหมอนกน โดยการเปรยบเทยบลกษณะของโปรตนทงหมดภายในเซลลซงใช sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) สามารถท าไดงายรวดเรวใหผลถกตองแมนย าในระดบสปชสและสบสปชสสามารถชวยในการจ าแนกเชอทมปญหาในการแบงหมวดหมได (Pot et al., 1994) 1.2.7 การศกษาเบสองคประกอบของด เอนเอ (DNA base composition/DNA-DNA hybridization) เปนการศกษาลกษณะทางพนธกรรมของแบคทเรย โดยการเปรยบเทยบเบสองคประกอบของดเอนเอ ซงแสดงในรปของ mol% G+C พบวาแบคทเรยทอยในสปชสเดยวกน

8

มคา mol% G+C ใกลเคยงกน (Pot et al., 1994) แตบางครงแบคทเรยทไมสมพนธกนอาจมคา mol% G+C ใกลเคยงกนได ดงนนวธการจ าแนกชนดของแบคทเรยทถกตองและแมนย ากวา คอการวเคราะหล าดบนวคลโอไทด โดยการศกษาดเอนเอทสามารถเขาคกนได อาศยหลกการ คอ ดเอนเอจากสงมชวตชนดเดยวกนจะมความเหมอนกน และสามารถเขาคกนไดวธนท าโดยน าชนสวนดเอนเอทจะใชเปน probe มาตดฉลาก ซงอาจตดโดยใชสารกมมนตรงส (radioactive label) หรอสามารถใชสารปลอดรงส (non-radioactive label) จากนนน า probe ทไดไปท า hybridization กบดเอนเอตวอยางทตองการตรวจสอบถาสามารถเขาคกนไดจะปรากฏสญญาณ (signal) ขนมาและวดเปอรเซนตความเหมอนหรอคลายกน (Stiles and Holzapfel, 1997) 1.2.8 การศกษาวเคราะหล าดบเบสของ rRNA (rRNA sequence) วธนใชจ าแนกเชอในระดบสปชส โดยการวเคราะหล าดบของ rRNA (rRNA sequence) มการน ามาใชหลายรปแบบ เชน การวเคราะหล าดบเบสของยนส 16S rRNAและ 23S rRNA นอกจากน Schillinger et al., (1996) ไดศกษาความสมพนธระหวาง Leuconostoc sp. และ Lactobacillus sp. บางสายพนธโดยวธนเชนกน 1.2.9 ปฏกรยาลกโซพอลเมอเรส (Polymerase Chain Reaction; PCR) วธนนยมใชกนในปจจบนโดยอาศยการเพมปรมาณ DNA ทมอยใหมปรมาณเพมขนรวมทงสารพนธกรรมชนดอนๆดวย ปจจบนไดมการพฒนาวธการ PCR ใหมประสทธภาพมากยงขน เชน การใชเอนไซม reverse transcriptase เพอเปลยน RNA ใหเปน DNA กอนการเขาสข นตอน PCR นอกจากนวธ RandomLy Amplified Polymorphic DNA (RADP) เปนอกรปแบบหนงทมการใชไพรเมอรเดยวแบบอสระเพอจบกบสาย DNA template ทต าแหนงใดกไดทสามารถเขาคกนได และเพมจ านวน DNA ไดทนท ท าใหเกดแบบแผนของ DNA ทเกดขน (Welsh and McClelland, 1990) 1.2.10 เซรมวทยา (serology) เปนวธการส าคญในการแยกและจ าแนกเชอในจนส Streptococcus ทกอใหเกดโรคในมนษยและสตวโดยอาศยคณสมบตการเปนแอนตเจนทจ าเพาะของผนงเซลลทแตกตางกน ซงท าใหจดแบงเปนกลม ซงขนอยกบคณสมบตการเปนแอนตเจนขององคประกอบของเซลลแบคทเรย เชน การมแอนตเจนทเปนสารประกอบพอลแซคคาไรดทผนงเซลลจดจ าแนกไดเปนกลม A และ G หรอการมกรดไทโคอกระหวางชนของเยอหมเซลล และผนงเซลลชนใน จดจ าแนกไดเปนกลม D เชน Streptococcus pyrogenes เปนแบคทเรยทท าใหเกดอาการเจบคอจดอยในกลม A สวน S. faecalis เปนเชอทท าใหเกดการตดเชอในทางเดนปสสาวะจดอยใน

9

กลม D สวน Lactobacillus เมอใชลกษณะทางเซรมวทยาสามารถแบงกลมได 7 กลม ตงแตA-G ตามชนดของแอนตเจน (Kandler and Weiss, 1986) 1.2.11 การศกษารปแบบพลาสมด (plasmid profile) แบคทเรยแลคตกบางชนดจะมพลาสมดอยในเซลล ซงจะควบคมสมบตพเศษบางอยางของเชอ เชน การผลตเมอก การผลตสารยบยงจลนทรยชนดตาง ๆ เปนตน โดยพลาสมดของเชอ ชนดเดยวกนจะมจ านวน ขนาด และล าดบเบสทเหมอนกน เมอแยกพลาสมดออกจากเซลลน ามาตดโดยใชเอนไซมตดจ าเพาะททราบการตดต าแหนงทแนนอนจงน ามาท าเจลอเลกโทรโฟลซส (gel electrophoresis) โดยถาเปนเชอชนดเดยวกนจะมรปแบบการเคลอนททเหมอนกน ความหลากหลายของจ านวนและขนาดของพลาสมดของแบคทเรยแลคตกในชนดเดยวกนใชเปนลกษณะส าคญส าหรบการก าหนดลกษณะและใชจ าแนกแบคทเรยแลคตกออกจากกน (Josephson and Nielson, 1988) 1.2.12 hemotaxonomic markers การจดจ าแนกดวยวธนพจารณาจากการสรางสารประกอบทางเคมทจ าเพาะเพอใชเปนตวบงช ไดแก สาร quinine เชน menaquinones และ ubiquinones แบคทเรยแลคตกในกลม streptococci สวนใหญจะขาด menaquinones ซงจะตรวจสอบปรมาณของสารชนดน โดยวธ High Pressure Liquid-Chromatography (HPLC) (Pot et al., 1994) และการวเคราะห Fatty Acid Methyl Ester (FAME) โดยวธ Gas-liquid Chromatography (GC) สามารถใชในการจ าแนกแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบได (Moss et al., 1974) 1.3 จนสของแบคทเรยแลคตก แบคทเรยกรดแลคตกสามารถจ าแนกไดเปน 12 สกล ไดแก 1. Streptococcus เซลลมรปรางกลมหรอรปไขขนาดเสนผานศนยกลาง 0.8–1.2 ไมครอนจดเรยงตวเปนสายโซหรอคผลตกรดแลคตกชนด L (+) เปนผลตภณฑหลกเทานนจากการหมกกลโคส(Homofermentative) ตองการสารอาหารสงในการเจรญมหลายสายพนธกอโรคในคนหรอสตวและบางสายพนธสามารถท าใหเกดโรคไดเจรญทอณหภม 20-41 องศาเซลเซยสปจจบนประกอบดวย 39 สายพนธม mol % G+C ระหวาง 34-46 % (Hardie and Whiley, 1995) Streptococcus ทมความส าคญทางดานอาหาร (วลาวณย, 2539) ดงน

10

1. กลมไพโอจนก (Pyogenic) เปนพวกทไมสามารถเจรญทอณหภม 10 หรอ 45 องศาเซลเซยส ประกอบดวยพวกทท าใหเกดโรค เชน S. agalactis และ S. pyognes สามารถสรางสารพษได ซงเชอ S. pyoganes มระยะพกตว 1-3 วน อาการทพบหลงจากไดรบเชอ คอ เจบคอ คอแดง ปวดศรษะ มไขสง คลนไสอาเจยน วงเวยน อาหารทพบแบคทเรยกลมน คอ นม ไอศครม ไข กง สลด อาหารทมไข และนม 2. กลมวรแดน (Viridan) ไดแกเชอ S. thermophiles มความส าคญในการผลตเนยแขงและผลตภณฑนมพวกโยเกรต แบคทเรยกลมนทนตอความรอน และสามารถเจรญไดทอณหภม 45 องศาเซลเซยส แตไมเจรญทอณหภม 10 องศาเซลเซยส 3. กลมเอนเทอโรคอคคส (Enterococcus) เปนพวกทสามารถเจรญไดทอณหภม 10 และ 45 องศาเซลเซยส สวนใหญสามารถเจรญไดทอณหภมสงถง 48-50 องศาเซลเซยส บางชนดสามารถเจรญไดท 5-8 องศาเซลเซยส แบคทเรยกลมนเปนพวกทนความรอน สามารถอยรอดไดในนมทผานการพาสเจอรไรส สามารถทนเกลอได 6.5 เปอรเซนต หรอมากกวา สามารถเจรญไดในสภาวะทเปนดาง pH 9.6 แบคทเรยกลมนไดแก S. feacalis และ S. faecium ทางอตสาหกรรมอาหารเรยกแบคทเรยกลมนวา ฟคลสเตรปโตคอคไค (Fecal streptococci) ซงใชเปนดชนบงชคณภาพของอาหาร 2.Vagococcus เปนแบคทเรยกรดแลคตกรปกลม ไข หรอทอนสน มขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5-1.2 x 0.5-2.0 ไมโครเมตร มการเรยงตวแบบเดยวๆ หรอเปนค หรอสายสนๆ ไมสรางสปอร เคลอนทไดโดยใชแฟลกเจลลาตองการอากาศแบบ Facultative anaerobe มการผลตกรดในการหมกคารโบไฮเดรต แตไมเกดแกส อณหภมทเหมาะสมในการเจรญ คอ 25-35 องศาเซลเซยส แยกไดจากน าหรอจากปลาแซลมอนทเปนโรค เปนแบคทเรยซงเคลอนทได(ไมทกสายพนธ)ประกอบดวย 2 สายพนธคอ Vagococcusfluvialis ซงเดมอยใน Streptococci กลม N และ V. Salmoninarum ซงแยกไดจากปลาแซลมอนทเปนโรค (Stiles and Holzapfel, 1997) 3. Lactococcus เซลลมรปรางกลมหรอรปไขขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5-1ไมครอนจดเรยงตวเปนเซลลเดยวเปนคหรอตอกนเปนสายโซผลตกรดแลคตกชนด L (+) จากการหมกกลโคสมกใชเปนกลาเชอ (starter) ในผลตภณฑนมสามารถเจรญไดท 10 องศาเซลเซยส แตไมเจรญท 45 องศาเซลเซยสพบในแหลงตางๆเชนผกกาดถวหญามนฝรงน านมดบประกอบดวย 5 สายพนธไดแก L. Lactis ssp. lactic, L.lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp.hordniae, L. garvieae, L. plantarum, L. raffinolactis และL. pisciumมmol % G + C ระหวาง 34 – 43% (Teuber, 1995)

11

4. Enterococcus เซลลมรปไขจดเรยงตวเปนเซลลเดยวหรอสายโซสน ๆผลตกรดแลคตก ชนดL (+) เปนผลตภณฑหลกเทานนจากการหมกกลโคสตองการสารอาหารสงในการเจรญเคลอนทไดโดยใชแฟลกเจลลา (Flageella) ไมมแคปซล ตองการอากาศแบบ Facultative anaerobe และสารอาหารทสมบรณในการเจรญ สามารถเจรญไดในชวง pH 4.2-4.6 และสามารถเจรญไดท pH 9.6 สวนใหญเจรญไดดทอณหภม 10 องศาเซลเซยส และอณหภม 45 องศาเซลเซยส ยงสามารถหมกน าตาลแลกโตสได บางสายพนธผลตเอนไซมคะตะเลสเทยมไดและบางสายพนธท าใหเกดโรค ปจจบนประกอบดวย 5 กลมสายพนธ ไดแกกลม Enterococcus faecalis, กลม E. avium, กลม E. gallinarum ,E. solitaries และกลม E. cecorum ม mol % G + C ระหวาง 37–40 (Devriese and Pot, 1995) 5. Pediococcus เซลลมรปรางกลมขนาดเสนผานศนยกลาง 0.36–1.43 ไมครอน แบงตวลกษณะ 2 ทศทางบนระนาบเดยวกนโดยแบงตวครงท 2 ในทศดานขวามอของครงแรกท าใหเกดลกษณะเฉพาะเปนเซลล 4 เซลลตดกนคลายจตรส (tetrad formation) ในสภาวะไมมอากาศ ผลตกรดแลคตกชนด DL และ L(+)จากการหมกกลโคสบางสายพนธท าใหเบยรและไวนเสยประกอบดวย6สายพนธ ไดแก Pediococcus acidilactici, P. damonosus, P. dextrinicus, P.inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceusม mol % G + C ระหวาง 34–44 % 6. Tetragenococcus มลกษณะการแบงตวเหมอน Pediococcus เนองจากเดมคอ สายพนธ P. Halophilus ซงจดจ าแนกใหมจากการเจรญในอาหารซงมเกลอโซเดยมคลอไรคสงถง 18% และมล าดบเบสบน 16SrRNA ใกลเคยงกบเชอสกล Enterococcus และ Carnobacterium มากกวาสกลเดม 7. Aerococcus มลกษณะการแบงตวเหมอน Pediococcus ประกอบดวย 2 สายพนธคอ Aerococcus viridians และ A. Urinae ซงเปลยนแปลงจาก P. homari และ P. urinaeequi ตามล าดบ โดย A. viridians ท าใหกงลอบสเตอรเกดโรคและเกยวของกบการตดเชอในคน (Stiles and Holzapfel, 1997)

12

8. Leuconostoc เซลลมสณฐานขนกบอาหารเลยงเชอในอาหารซงมกลโคสเซลลมลกษณะยดออกคลายกลม Lactobacilli แตในน านมเซลลจะมรปรางกลมการจดเรยงตวเปนเซลลเดยวอยเปนคหรอเปนสายโซสนถงปานกลางผลตกรดแลคตกชนด D (-) เอทานอลคารบอนไดออกไซดและสารหอมระเหยจากการหมกกลโคส (heterofermentative) จงชวยสรางกลนรสในอาหารหมกดองการเจรญตองการสารอาหารสงปจจบนประกอบดวย8สายพนธ Leuconostoc mesenteroides, Leuc. lactis, Leuc.gelidum, Leuc. carnosum, Leuc. pseudomesenteroides, Leuc. citreum, และ Leuc. fallax, Leuc. argentinum มmol % G + C ระหวาง 37-40 % (Dellaglio et al, 1995 ) แบคทเรยในจนสนมความสมพนธกบจนส Lactobacillus และ Pediococcus ในแงสรรวทยา ลกษณะทางสณฐานวทยาของเซลลขนกบอาหารเพาะเชอ ในอาหารทมกลโคส เซลลจะยดออกคลาย Lactobacilli แตเมอเจรญในน านมเซลลจะมรปรางกลม การหมกกลโคส สามารถผลตกรดแลคตกชนด D(-) เอทานอล คารบอนไดออกไซดและสารหอมระเหย จงชวยสรางกลนรสในอาหารหมกดอง จด เ ปนแบคทเ รยกล ม heterofermentative ป จจบนประกอบดวย 8 สปชส ไดแก L. mesenteroid, L.lactis, L. pseudomesenteroids, L. citreum, L. argentinum และ L. fallax (สพรรณการ, 2548) คณสมบตทส าคญบางอยางทท าให Leuconostoc มความส าคญทางดานอาหาร (บษกร, 2547) ไดแก 1. การผลตไดอะซตล และผลตภณฑทมกลนอนๆ เชน L. cremoris เปลยนไพรเวตเปนไดอะซโตอน และไดอะซตล น าไปใชในการท าใหเกดกลนในเนย 2. ความสามารถในการทนเกลอ เชน L. mesenteroides เปนแบคทเรยทพบในอาหารหมกประเภทผกดอง เชน กะหล าปลดอง มการสรางกรดออกมาจนมความเขมขน 0.7-1.0 เปอรเซนต (อยในรปของกรดแลคตก) 3. ความสามารถในการทนตอน าตาล โดยสามารถเจรญไดในทมน าตาลความเขมขนสงเชน L. mesenteroides สามารถทนน าตาลใน sugar syrup ทมความเขมขนสงถง 55–60 เปอรเซนต 4. การผลตสารเมอก เชน L. mesenteroides จะผลตสารเมอกพวกเดกซแทรน (dextran) จากน าตาลซโครสได อณหภมทเหมาะในการสรางเมอก คอ 20-25 องศาเซลเซยส เชอ L. dextranicum สามารถสรางเดกซแทรนจากน าตาลซโครสไดเชนกน แตนอยกวา ดงนนการผลตเดกซแทรนในระดบการคาจะใช L. Mesenteroides โดยใชกากน าตาลเปนวตถดบ แตในขณะเดยวกนการสรางสารเมอกเหลาน ท าใหเปนผลเสยตออาหาร เชน ท าใหน าออยเกดเมอก ท าใหตกผลกไมได ความหวานของน าออยลดลง และสารเมอกเหลานไปท าใหทอตางๆ อดตน เชอนยงท าใหไวนไสกรอก และแฮมเกดเมอกเปนตน

13

5. ความสามารถในการผลตกาซคารบอนไดออกไซดจากน าตาล ท าใหอาหารตาง ๆ เกดเนาเสย เชน การเกดกาซในแตงกวาดอง และ การท าใหไสกรอกบวม เปนตน 6. ความสามารถในการเรมตนหมกไดเรวกวาแบคทเรยชนดอนๆ เชน ในการหมกกะหล าปลดองพบวา L. mesenteroides เปนแบคทเรยแลคตกพวกแรกทเจรญ และมบทบาทในการหมก โดยสามารถผลตกรดแลคตกออกมาในปรมาณ 0.7-1.0 เปอรเซนตท าใหจลนทรยชนดอนๆ เจรญไมได 9. Oenococcus ประกอบดวยสายพนธ เดยวคอ Oenococcusoeni ซงเปลยนมาจาก Leucoenos ดวยสมบตการทนตอกรดและเอทานอลปรมาณสงรวมทงขอมลพนธกรรมจากดเอนเอ :ดเอนเอไฮบรไดเซซนและล าดบเบสของ 16SrRNA ตางจากสายพนธอนในสกล Leuconostoc อยางชดเจน (Dellaglio et al, 1995) 10. Weissella ประกอบดวยแบคทเรย 7 สายพนธซงลกษณะคลาย Leuconostoc (Leuconosdoc–like bacteria) รปรางเซลลเปนแทงและกลมมสายพนธซงเดมอยในสกลLeuconostoc และLactobacillus คอ Leuc. paramesenteroides (Weissella paramesenteroides), Lactobacillus confusus (W. confusus), Lb.halotolerans (W. halotoleran ), Lb. kandleri (W.kandleri), Lb. minor (W. minor), Lb. viridescens (W. viridescen )และสายพนธใหมซงแยกไดจากไสกรอกหมกคอ W. hellenica (Stiles and Holzapfel, 1997) 11. Lactobacillus เปนแบคทเรยกรดแลคตกกลมใหญทสดมความหลากหลายของลกษณะทางฟโนไทปสมบตทางชวเคมและสรระวทยาเนองจากความแตกตางของ mol % G + C ภายในสกลสงคอระหวาง 32- 53 % พบในแหลงตางๆเชนเยอเมอกของมนษยและสตวพชและน าทง เปนตนบางสายพนธ เ ปนสาเหตของโรคตดเชอในมนษยเซลลมรปรางเปนทอนหรอทรงร (coccobacilli) ตองการสารอาหารสงในการเจรญประกอบดวย 55 สายพนธซงแบงไดเปน 3 กลมคอ 1.กลม Obligately homofermentative lactobacilli หมกน าตาลแลกโทส (มากกวา85 %) เปนกรดแลคตกโดยวถ Embden–Meyerhof–Parnas (EMP) ผลตเอนไซม 1,6biphosphate–aldolase แตไมผลตเอนไซม phosphoketolase จงหมกน าตาลเพนโทสและกลโคเนทไมไดประกอบดวย 18 สายพนธ

14

2. กลม Facultatively heterofermentative lactobacilli หมกน าตาลเฮกโซสเปนกรดแลคตกผานวถ EMP มการผลตเอนไซมทง aldolase และ phosphoketolase จงหมกน าตาลเพนโทสได 3. กลม Obilgately heterofermentative lactobacilli หมกน าตาลเฮกโซสและเพนโทสผานวถฟอสโฟกลโคเนทเปนแลคเตท, เอทานอลและคารโบไฮเดรต คณสมบตทท าให Lactobacillus มความส าคญทางดานอาหาร (วลาวณย, 2539) ดงน 1. ความสามารถในการหมกน าตาลใหกรดแลคตกสามารถน าไปใชในการผลตผลตภณฑนม เชน ยาคลยใช L. casei โยเกรตใช L. bulgaricus (และ Streptococcus thermophilus) นมแอซโดฟลสใช L. bulgaricus นมบลคาเรยนใช L. delbrueckii นอกจากนในการหมกผกดองใชผลตกรดแลคตกในระดบอตสาหกรรม เชน ใชผลตกรดแลคตกจากหางนม L. pentosus (L. plantarum) ผลตกรดแลคตกจากโรงงานกระดาษ แตในขณะเดยวกนจะท าใหอาหารมรสเปรยว จากการผลตกรดแลคตกออกมา นอกจากนยงท าใหไวน ไซเดอร เบยร มรสเปรยว เปนตน 2. การผลตกาซ และผลตสารระเหยอนๆ ในพวก heterofermentative บางครงท าใหเกดความเสยหายตอคณภาพอาหาร เชน การเจรญของ L fermentum ในเนยแขงสวส L. hilgardii หรอ L. trichodesในไวน 3. ความสามารถในการสรางเมอก เชน L. plantarum ท าใหน าแอปเปล น าองน ผกดอง เกดเมอกได L. brevis ท าใหน าแอปเปลเกดเมอกได L. cucumeria ท าใหผกดองเกดเมอกได 4. ความสามารถในการทนความรอน (Thermoduric) ท าใหเชอรอดชวตจากการใหความรอนแบบพาสเจอรไรส เชน จะยงคงพบ L. bulgaricus, L. brevis รอดชวตจากการพาสเจอรไรสน านม จากนนเชอนจะหมกน าตาลแลกโตสใหกรดแลคตกออกมา ท าใหนมมรสเปรยว นอกจากนอาจพบเชอนในอาหารกระปองทใหความรอนไมเพยงพอ เชน ผลตภณฑมะเขอเทศ ถว และผลไมอนๆ 5. ความสามารถในการเจรญทอณหภมต าเปนสาเหตใหเนอ และผลตภณฑเนอ เชน แฮม ไสกรอก เกดการเนาเสยโดยมกลนเปรยว 6. แบคทเรยกลมนไมมความสามารถในการสงเคราะหวตามนทตวมนเองตองการได ท าใหเชอไมสามารถเจรญไดดในอาหารทมวตามนต า ดงนนจงใชประโยชนของแบคทเรยกลมนในการตรวจวเคราะหปรมาณวตามนในอาหาร เชน ใช L. leichmannii ในการตรวจวเคราะหปรมาณวตามน B12

15

12. Carnobacterium Carnobacterium เปนแบคทเรยรปรางกลมหรอแทง มขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5-0.7 x 1.0-2.0 ไมโครเมตรเซลลมการจดเรยงตวค หรออยเดยวๆ บางครงมการเรยงตวเปนสายสนๆ ม %mol G+C อยระหวาง 31.6-37.2 เปอรเซนตสามารถเจรญไดทอณหภม 10 องศาเซลเซยสแตไมเจรญทอณหภม 45 องศาเซลเซยส อณหภมทเหมาะสมในการเจรญ คอ 37 องศาเซลเซยส พบในผลตภณฑเนอ และปลา และพบวา C. piscicola เปนเชอทกอโรคในปลาเซลมอน (Holt et al., 1994) จดเปนแบคทเรยกลม heterofermentative ผลตกรดแลคตกชนด L(+) กรดอะซตกเอทานอล และคารบอนไดออกไซดจากการหมกน าตาลกลโคส ประกอบดวย 6สปชส คอC. divergens, C .pisicola, C. gallinarum, C. mobile, C. funditum และ C.alterfunditum ม mol % G+C ระหวาง 31.6-37.2 %(สพรรณการ, 2548) 2 สารกนเสยชวภาพทผลตจากแบคทเรยแลคตก สมบตยบยงจลนทรยของแบคทเรยแลคตกผลตภณฑอาหารหลายชนดทไดจากการหมกกรดแลคตกเชนนมเปรยว ผก ผลไมดองผลตภณฑเนอและอาหารทะเลหมกสามารถเกบไวไดนานและปลอดภยเมอน าไปบรโภคทงนเปนเพราะ LAB มสมบตยบยงจลนทรยดงนท าให pH ของอาหารลดลง เกดกรดอนทรย เกดแบคเทอรโอซน เกดไฮโดรเจนเปอรออกไซด เกดเอทานอลโดยแบคทเรยแลคตกจะมการสรางสารกนเสยชวภาพมากมายเพอยดอายการเกบรกษาอาหารใหยาวนานขน (Schnurer et al, 2005) เชน 2.1 กรดอนทรย (Organic acid) ในกระบวนการหมกของ LAB นนจะม 2 แบบคอ homofermentative และ heterofermentative โดย lactic acid เปนสารหลกทไดจากกระบวนการหมกแบบ homofermentative โดย lactic acid นนจะมผลท าให pH ของอาหารลดลงซงกมผลใหเชอจลนทรยอนไมสามารถเจรญเตบโตได เพราะ ไฮโดรเจนอออนจะซมผาน cell membrane เขาสภายในเซลลของจลนทรยท าให cytoplasm มสภาพเปนกรดสง ซงสงผลให electrochemical proton gradient ภายในเซลลจลนทรยเสยไปดวย ส าหรบกระบวนการหมกแบบ heterofermentative ของ LAB จะได acetic acid เปนสารหลก และผลต propionic acid ในปรมาณเลกนอย แตกรดทงสองชนดจะมคา pKaทสงมากกวา lactic acid โดยกลไกการออกฤทธยบยงเชอจลนทรยกจะเหมอนกบของ lactic acid คอจะมผลตอ electrochemical proton gradient

16

กรดแลคตก (Lactic acid) เปนกรดทเกดจากแบคทเรยแลคตกสามารถเปลยนน าตาลในอาหาร ท าให pHของอาหารลดลง มผลยบยงการเจรญของจลนทรยชนดอนทท าใหอาหารเนาเสย นอกจากนยงใชในทางเภสชกรรม และอตสาหกรรมเคมอนๆอกดวย กรดแลคตกทเกดจากกระบวนการหมกอาจอยในรป L หรอ D เปนกรดทนยมน ามาใชในอาหารโดยเฉพาะในผลตภณฑอาหารหมกดองประเภทตางๆ เพอเปนสารใหกลนรส ควบคม pH ของอาหาร และชวยในการถนอมอาหาร(อรวนท, 2532) กรดอะซตก (Acetic acid) เปนกรดทไดจากการหมกโดยแบคทเรยพวก heterofermentative Lactobacilli ซงกรดอะซตกนจะมผลในการยบยงจลนทรย แบคทเรยแลคตกทมรายงานวาสามารถยบยงจลนทรยทกอใหเกดโรคสวนใหญจะเปน Lactobacillus sp. ซงไดแก L. sake ทแยกจากเนอและผลตภณฑเนอ สามารถสรางกรดอนทรยมายบยงการเจรญของSalmonella Typhimurium และ Staphylococcus aureus ได นอกจากน Bearso et al., (1997) มขอสนนษฐานเกยวกบกลไกการยบยง คอ กรดอนทรยแพรผานเยอหมเซลลได เพราะสามารถละลายไดในไขมน การสะสมของกรดอนทรยทแบคทเรยแลคตกสรางขนในระหวางการเจรญสงผลใหคา pH ในชวงแรกของการเจรญลดลงและมผลยบยงการเจรญของจลนทรยกลมทไมทนกรด นอกจากนยงมขอเสนอแนะจากผท าการศกษากลมอนๆวาการยบยงการเจรญของเชออนเกดจากการสะสมประจลบ ซงจะไปลดอตราการสงเคราะหสารโมเลกลใหญ และมผลกระทบตอการเคลอนยายสารบรเวณเหนอเยอหมเซลล ดงนนจงมการประยกตใชแบคทเรยแลคตกซงสามารถผลตกรดอนทรยในอตสาหกรรมอาหารหมกเพอวตถประสงคในการถนอมอาหาร นอกจากนการควบคมสภาวะการผลตกรดอนทรยในกระบวนการหมกมความส าคญอยางมากจ าเปนตองอาศยปจจยหลายอยาง เชน การควบคมพเอชเรมตนในการหมก สภาพบฟเฟอรและองคประกอบของสารอาหาร ชนดของจลนทรย อตราการเจรญของแบคทเรยแลคตก และจลนทรยเปาหมาย เปนตน (Montville and Winkonwski, 1997) 2.2 Reuterin

Reuterin เปนสารตานจลชพทมฤทธกวาง (broad-spectrum) พบครงแรกจากเชอ Lactobacillus reuteri โดย reuterinเปนสารทไดจากการ oxidize glycerol โดย LAB ในสภาพ anaerobic โดยทวไป LAB จะไมม oxidative pathway ส าหรบ glycerol หรอ glycerol ไมสามารถถกใชเปน C-source เดยวไดดงนนวธการเดยวทจะใช glycerol ของ LAB ได คอ การท าให LAB เขาส intermediate state ของ 3-hydroxypropionaldehyde (reuterin, 3-HPD)

17

พบวา reuterin มฤทธย บยงการเจรญของจลนทรยหลายชนด เชน แบคทเรยแกรมบวกแบคทเรยแกรมลบยสต รา โดยเชอวา รทรนมฤทธไปยบยงการท างานของเอนไซมบางชนด เชนribonucleotidereductase จงท าใหการสงเคราะห DNA เสยไป 2.3 Fatty acids จากการแยกสารทไดจากการเลยงเชอ Lactobacillus plantarum MiLAB 14 ในอาหารเหลว พบวาม fatty acid เชน 3-hydroxylated fatty acid ทมฤทธยบยงการเจรญของเชอราไดโดยฤทธตานเชอราจะเพมขนตามความยาวของ chain ทเพมขน โดยพบวา caprylic (C8) acid และสายทยาวกวานจะมประสทธภาพในการยบยงเชอจลนทรยไดสงสด 2.4 Acetaldehyde เปนสารท เกดขนในกระบวนการแมแทบอลซมของคารโบไฮเดรตโดย Heterofermentative lactic acid bacteria ซงในทสดกจะถกเปลยนเปนเอทานอลโดยเอนไซมalcohol dehydrogenase ถาแบคทเรยทสรางกรดแลคตกขาดเอนไซม alcohol dehydrogenase หรอเอนไซมนถกกดการสรางจะท าใหมอะเซทาลดไฮดหลงออกมานอกเซลล อะเซทาลดไฮดเปนสารทใหกลนโดยเฉพาะของโยเกรต 2.5 Diacetyl เปนผลผลตสดทายทไดจากกระบวนการเมทาบอลซมของแบคทเรยกลมทสรางกรด แลคตกไดอะซทลเปนสารทใหกลนเฉพาะในผลตภณฑนมหมก (อรวนท, 2532) ไดอะซทลเปน aroma component ซงมความสมพนธโดยตรงกบกลนของเนยผลตโดยการใชซเตรตของแบคทเรยแลคตก ซงมผลยบยงการเตบโตของแบคทเรยแกรมลบโดยมผลตอ arginine utilizationพบวาแบคทเรยแกรมลบไวตอไดอะซทลมากกวาแบคทเรยแกรมบวก โดยใชเพยง200 ไมโครกรมตอมลลลตร และไดอะซทลความเขมขน 344 ไมโครกรมตอมลลลตร สามารถยบยง Listeria, Salmonella, Yersinia, Escherichia coli และ Aeromonas 2.6 Carbondioxide (CO2) คารบอนไดออกไซดเปนผลตภณฑหลกของ heterofermentative lactic acid bacteria กลไกการยบยงเชอของคารบอนไดออกไซด ปจจบนยงไมทราบแนชด แตอยางไรกตาม CO2 อาจมบทบาทในการเพมสภาวะไรออกซเจน ซงสงผลยบยงการท างานของเอนไซม enzymatic decarboxylation และท าใหเกดการสะสมของคารบอนไดออกไซดบรเวณ membrane lipid bilayer

18

2.7 Hydrogenperoxide ไฮโดรเจนเปอรออกไซดเปนสารทไดจากกระบวนการเมแทบอลซมในระหวางการเจรญของแบคทเรยแลคตกทไปเรงปฏกรยาเปลยนไฮโดรเจนเปอรออกไซดเปนน า ท าใหไฮโดรเจนเปอรออกไซดทสรางนนถกสะสมในอาหารเลยงเชอ และมผลในการยบยงจลนทรยชนดอน แบคทเรยแลคตกสรางไฮโดรเจนเปอรออกไซดไดในสภาวะทมออกซเจนในกระบวนการขนสงอเลกตรอน โดยการท างานของฟลาโวโปรตน (flavoprotein) ของเอนไซมเอนเอดเฮชออกซเดส (NADH oxidase) และซปเปอรออกไซดดสมวเทส (superoxide dismutase) ในสภาวะทไมมเหลก แบคทเรยแลคตกจะไมมเอนไซม catalase ซงท าหนาทในการสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซดเปนน าและออกซเจน แตจะมระบบอนทใชในการจ ากดปรมาณของไฮโดรเจนเปอรออกไซด (Condon, 1987) นอกจากน ถาไมมการสะสมไฮโดรเจนเปอรออกไซดภายในเซลล เนองจากถกยอยสลายโดยเอนไซมเปอรออกซเดส (peroxidase), ฟลาโวโปรตน และซโดคะตะเลส (pseudocatalase) ไฮโดรเจนเปอรออกไซดเปนตวออกซไดสทรนแรงและสามารถท าลายเซลลแบคทเรยได โดยหมซลไฮดรล (sulfhydryl) ภายในโมเลกลโปรตนของเซลล และในชนไขมนในเยอหมเซลลถกออกซไดสได ท าใหโครงสรางของกรดนวคลอกและโปรตนในเซลลเปลยนไปจนไมสามารถท าหนาทไดตามปกต และในปฏกรยาการสรางไฮโดรเจนเปอรออกไซดจะมการขนสงออกซเจน ท าใหเกดสภาวะขาดออกซเจน สงผลใหแบคทเรยชนดอนไมสามารถเจรญได นอกจากนไฮโดรเจนเปอรออกไซดยงสามารถรวมตวกบสารประกอบอนเกดเปนสารทมคณสมบตในการยบยงจลนทรยอนได เชน ในน านมดบ มทงเอนไซมแลกโตเปอรออกซเดส (lactoperoxidase) ไทโอไซยาเนต (thiocyanate, SCN-) และไฮโดรเจนเปอรออกไซด เอนไซมแลกโตเปอรออกซเดส จะเรงปฏกรยาออกซเดชนของไทโอไซยาเนต ใหเปลยนเปนไฮโปไทโอไซยาไนต (hypocyanite, OSCN-) และหากมไฮโดรเจนเจนเปอรออกไซดสงจะเปลยนเปน O2SCN- และ O3SCN- ตามล าดบ ซงไฮโปไทโอไซยาไนตจะมผลตอเยอหมเซลลปฏกรยา อยางไรกตามกลไกหลกในการยบยงแบคทเรยอน คอ ขดขวางกระบวนการไกลโคไลซส โดยจะไปขดขวางการขนถายกลโคสรวมทงกจกรรมของเอนไซมเฮกโซไคเนส (hexokinase) และกลเซอรอลดไฮด -3-ฟอสเฟตดไฮโดรจเนส (G-3-P dehydrogenase) เนองจากเอนไซมเหลานมหมซลไฮดรลเปนองคประกอบซงถกออกซไดซได ซงไฮโดรเจนเปอรออกไซดทผลตโดยแบคทเรยแลคตก สามารถยบยงการเจรญของแบคทเรยชนดอนได นอกจากนไฮโดรเจนเปอรออกไซดยงมผลในการท าลายแบคทเรยแกรมลบอยางรวดเรว ในอาหารหมกจะมการสรางไฮโดรเจนเปอรออกไซดในปรมาณนอย เนองจากมการหมกในสภาวะทไมมออกซเจน แตมขอดตรงทจะไมเกดไฮโดรเจนเปอรออกไซดมากเกนไป ซงอาจจะไปยบยงแบคทเรยแลคตกทเปนตวการของการหมกได (สมณฑา, 2545)

19

จากการทดลองของ Edward (1980) พบวา ไฮโดรเจนเปอรออกไซดเปนสารทใชในการถนอมอาหาร มการเตมลงในน านมดบโดยใสทความเขมขน 0.02-0.05% จะฆาเชอแบคทเรยทท าใหเกดการเนาเสย และมการใชไฮโดรเจนเปอรไซดความเขมขน 0.04-0.08% รวมกบความรอนทอณหภม 53 องศาเซลเซยส นาน 30 นาทในนมพาสเจอไรซ ปรากฏวาสามารถลดจ านวนแบคทเรยทงหมด และโคลฟอรมแบคทเรยทพบได 2.8 Proteinaceous compounds Ribosome ของ LAB สามารถสงเคราะห peptide หรอ protein ได ซงจากการศกษาฤทธในการยบยงเชอแบคทเรยของ LAB จะสญเสยไปเมอมการยอยดวย proteolytic enzyme ซงตอมาพบวาสารทมฤทธในการยบยงจลนทรยเปนพวก proteinaceous compounds โดยสารทมฤทธนเปนสารกลม peptide มฤทธตานเชอไดกวางทนความรอน และออกฤทธไดดท pH 3-6 แตจะถกท าลายไดดวย proteinase ซงใน proteinaceous compounds นนจะประกอบดวย โปรตนหลายชนดทมฤทธยบยงจลนทรย เชน 2.9 Bacteriocin แบคเทอรโอซนหมายถงเปปไทดหรอโปรตนทสงเคราะหจากไรโบโซม และมฤทธในการยบยงแบคทเรย แบคเทอรโอซนแตกตางจากสารปฏชวนะ (antibiotics) คอ แบคเทอรโอซนมฤทธการยบยงแคบและเปนพษกบแบคทเรยทมความสมพนธใกลเคยงกน แบคเทอรโอซนสามารถสรางไดจากแบคทเรยกลมแกรมลบและแกรมบวกหลายสายพนธ แต แบคเทอรโอซนทสรางจากกลมแบคทเรยแลคตก (lactic acid bacteria)ไดรบความสนใจมากทสด กลมแบคทเรยแลคตกทสรางแบคเทอรโอซนไดมกแยกมาจากอาหารดงนนจงเหมาะทจะน ามาใชในการประยกตทางดานอาหารการสรางแบคเทอรโอซนนมขอดแกแบคทเรยแลคตกเองคอแบคเทอรโอซนสามารถฆาหรอยบยงแบคทเรยอนทอยในแหลงอาหารนนๆ แบคเทอรโอซนทสรางขนโดยแบคทเรยแลคตกบางชนดมฤทธในการยบยงคอนขางกวางการน าแบคเทอรโอซนไปใชในอตสาหกรรมอาหารจะชวยลดการใชสารกนเสยทเปนสารเคมรวมทงลดการใชความรอนท าใหอาหารยงคงอดมไปดวยคณคาของสารอาหารซงเปนทางเลอกหนงทผบรโภคตองการเนองจากมความปลอดภยมรสชาตสดใหมและพรอมรบประทาน(สมณฑา, 2545) โครงสรางในสายพอลเพปไทดของแบคเทอรโอซน สามารถแบงออกไดเปน 4 สวน ซงแตละสวนท าหนาทตางกน ดงน

20

2.6.1 binding peptide ท าหนาทชวยใหโมเลกลของแบคเทอรโอซนจบกบ receptor บนผวเซลลของแบคทเรย 2.6.2 active protein ท าหนาทท าลายแบคทเรยโดย active protein จะยบยงการสงเคราะหโปรตนและสงเคราะหโมเลกลขนาดใหญภายในเซลลของแบคทเรย 2.6.3 immunity protein ท าหนาทจบกบ active peptide อยางจ าเพาะซงจะปองกนไมใหเกดการท าลายแบคทเรยทม immunity protein เหมอนกน 2.6.4 translocation peptide ชวยใหมการเคลอนยายสารเชงซอนของแบคเทอรโอซนผานเขาไปในเยอหมเซลลของแบคทเรยเปาหมาย กลไกในการท าลายเซลลแบคทเรยเปาหมาย เกดจากการทแบคเทอรโอซนเขาจบกบเซลลแบคทเรยเปาหมายท าใหเยอหมเซลลถกรบกวนท าใหเกดรหรอชองวางทมลกษณะคลายชนไมทน ามาประกอบกนเปนถงมรตรงกลาง (barrel-stave) สงผลใหเกดการรวขององคประกอบภายในเซลล เชน กรดอะมโน สารประกอบอนนทรยในกลมฟอสเฟตซงเปนสารใหพลงงานของเซลล และไอออนของสารทจ าเปนตอการด ารงชวตของเซลล ในกรณสปอรพบวาเยอหมเซลลจะถกท าลายอยางรวดเรว ในระหวางทสปอรงอกขนมา และแบคเทอรโอซนทความเขมขนสงๆ สามารถยบยงการสรางเพปตโดไกลแคน (peptidoglycan) ซงเปนสวนประกอบทส าคญของผนงเซลลของ Bacillus stearothermophillus และ Eshcherichia coli ได(De Vuyst and Vandamme, 1994) 3.สารกนเสย (Preservative) และอนตรายจากการใชสารกนเสย สารกนเสยคอสารเคมหรอของผสมของสารเคมทใชในการถนอมอาหาร โดยอาจจะใสลงในอาหาร พนหรอฉาบรอบๆผวของอาหารหรอภาชนะบรรจสารดงกลาวจะท าหนาทยบยงหรอท าลายจลนทรยทท าใหอาหารเนาเสยโดยอาจจะไปออกฤทธตอผนงเซลลรบกวนการท างานของเอนไซมหรอกลไกทางพนธกรรม (genetic mechanism) ในเซลล เปนผลท าใหจลนทรยไมสามารถเพมจ านวนไดหรอตายในทสด(ศวาพร, 2535 ) สารกนเสยทดควรจะออกฤทธท าลายจลนทรยทเปนสาเหตท าใหอาหารเนาเสยมากกวาทจะออกฤทธยบยง โดยเฉพาะอยางยงพวกทท าใหอาหารเปนพษ ทงนเพอปองกนการเกดสายพนธตานทาน (resistant strain) นอกจากนสารกนเสยไมควรจะเสอมคณภาพเมอใสลงในอาหาร ยกเวนสารกนเสยประเภททฆาเชอได ควรจะถกเปลยนสภาพใหเปนสารไมมพษหรอถกท าลายไดดวยการหงตม การใชวตถเจอปนอาหารซงรวมถงวตถกนเสยดวย จะตองใชในปรมาณเหมาะสมทท าใหเกดผลตามตองการ คอไมใสเกนขนาด เพราะผบรโภคจะไดสารเหลานนมากเกนความจ าเปน ดงนนจงมประกาศกระทรวงสาธารณสข หามใชวตถกนเสยในอาหารทไม

21

จ าเปนทตองใชสารกนเสยคออาหารกระปองทผานการฆาเชอจลนทรยเรยบรอยแลว ส าหรบอาหารอนผบรโภคจะอานไดจากฉลากอาหารวามการใชวตถกนเสยหรอไม มสวนประกอบอยางไร (บษกร, 2550) 1. กรดและเกลอของกรดบางชนดเชน กรดเบนโซอก กรดซอรบก กรดโปรปโอนก ฯลฯ และเกลอของกรดเหลานสวนใหญนยมใชในรปเกลอของกรด เพราะละลายน าไดงาย เมอใสในอาหารเกลอเหลานจะเปลยนไปอยในรปของกรด หากอาหารนนมความเปนกรดสง กรดจะคงอยในรปทไมแตกตว ซงเปนรปทมประสทธภาพสงสดในการท าลายหรอยบยงจลนทรย (วลาวณย, 2537) ดงนนอาหารทจะใชสารกนเสยชนดนควรจะเปนอาหารทมความเปนกรด ประมาณ 4-6 ทงนขนกบชนดของกรด เชน น าผลไม เครองดม แยม ผกดองชนดตางๆ ขนมปง ฯลฯ สารกลมนสวนใหญจะใหผลยบยงราและ ยสตมากกวาแบคทเรย ขอดของสารกลมนคอมความเปนพษต า เพราะรางกายคนสามารถเปลยนแปลงเปนสารอนทไมมพษและขบถายออกจากรางกายได 2. พาราเบนส (parabens)เปนสารกนเสยทมประสทธภาพยบยง หรอท าลายราและยสตไดดกวาแบคทเรย และจะมประสทธภาพสงในชวงความเปนกรดดางกวางกวาสารกลมแรกคอประมาณ 2-9 อาหารทนยมใสพาราเบนส ไดแก น าหวานผลไม น าผลไม แยม ขนมหวานตางๆ สารปรงแตงกลนรส ฯลฯ รางกายคนจะมกระบวนการขจดพษของพาราเบนส ไดโดยปฏกรยาไฮโดรลซส 3. ซลเฟอรไดออกไซดและซลไฟตกลไกในการท าลายเชอของสารกนเสยชนดนจะคลายคลงกบสารกนเสยกลมแรกและจะมประสทธภาพสง ในอาหารทมความเปนกรดดางปรมาณนอยกวา 4 ลงมา จงนยมใสในไวน น าผลไมตางๆ ผกและผลไมแหง ฯลฯ ส าหรบความปลอดภยตอผบรโภคนน พบวาแมสารนจะถกขบออกมาจากรางกายได แตหากรางกายไดรบสารน มากเกนไป สารดงกลาวจะไปลดการใชโปรตนและไขมนในรางกายได นอกจากนสารกนเสยกลมนยงท าลายไธอามน (thiamine) หรอวตามน B1 ในอาหารดวย 4. สารปฏชวนะขอดของสารปฏชวนะคอ ความเปนกรดดางของ อาหาร ไมมผลตอประสทธภาพของสาร ซงอาหารทนยมใสสารปฏชวนะ สวนใหญจะเปนพวกเนอสตวตางๆ อาจจะพบวาใชกบผกและผลไมสดดวย สารปฏชวนะจะท าลายหรอยบยงจลนทรยไดหลายชนดขนกบชนดทใช ขอเสยของสารกนเสยชนดนคอมกจะกอใหเกดสายพนธตานทานขน

22

ส าหรบปรมาณของสารกนเสยทใชนนจะแตกตางกนออกไป ขนกบชนดของอาหาร ซงกระทรวงสาธารณสขจะเปนผก าหนดปรมาณทอนญาตใหใสในอาหารได โดยทวไปปรมาณทอนญาตใหใชจะมฤทธแคเพยงยบยงการเจรญของจลนทรยในอาหารเทานน ดงนนในระหวางกรรมวธผลต จะตองระมดระวงการปนเปอนของจลนทรยสอาหารใหนอยทสด 4. การเนาเสย และเกดพษของอาหารทะเลแชเยน และแบคทเรยทเกยวของ การเนาเสยของสตวน าจะเกดทนทหลงจากสตวน าตาย และเกยวของกบปจจย ตาง ๆ เชน วธการจบ แหลงจบ การเนาเสยจะมสาเหตทส าคญ 3 ประการคอ 1.จากปฏกรยาของเอนไซมในตวเอง 2.จากปฏกรยาของเอนไซมในแบคทเรยทตดในตวสตว 3.จากปฏกรยาทางเคมของสารประกอบตาง ๆ ทมในตวสตวเชนปฏกรยาจากออกซเจนกบไขมนท าใหสตวน ามกลนหนและรสชาตไมด 4.1 แบคทเรยทท าใหเกดการเนาเสย โดยทวไปแบคทเรยมกจะมการเจรญในสตวน าไดดเน องจากสตวน าสวนใหญมคาพเอชทเปนกลาง มคา aw สง ท าใหจลนทรยจ านวนมาก สามารถเจรญไดดในสตวน า และ สตวน าแตละชนดนนมองคประกอบทางเคมแตกตางกน ดงนนสตวน าแตละชนดจงมแบคทเรยทท าใหเกดการเนาเสยแตกตางกนดงน (Matamoros et al, 2009) 4.1.1ปลา แบคทเรยทท าใหปลาเนาเสยมกจะอยบรเวณผวและทางเดนอาหารของปลา แบคทเรยทมบทบาทส าคญทสดคอ Pseudomonas พวกทส าคญรองลงมา Acenitobactor และ Flavobacterium โดยจลนทรยกลมนจะเจรญบรเวณผวและเขาสเนอปลา ท าใหเกดสารพวก ไตรเมทลามน แอมโมเนย เอมน กรดไขมน เปนตน ท าใหเกดกลนเหมน 4.1.2 ป จลนทรยทปนเ ปอนในปมแหล ง เชนเดยวกบปลา โดยสวนใหญเ ป นBacillus,Micrococcus, Pseudomonas, Morexella และ Flavobacteriumโดยปจะมกลนเนองจากแอมโมเนยทจลนทรยผลตขน 4.1.3 หอย มกจะเกดการเนาเสยทนทหลงจากการตาย โดยแหลงทมาของแบคทเรยมกมาจากโคลน โดยเกดกลนเนองจากการสลายของโปรตน และเกดกรดจากการหมกน าตาลโดยมกมแบคทเรยทเกยวของคอ Pseudomonas, Acenitobactor และ Flavobacterium

23

4.1.4 กง แหลงจลนทรยของกงมทมาเชนเดยวกบปลา ชนดของจลนทรยทพบในก งไดแกAcenitobactor, Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Morexellaและ Flavobacteriumกงมกจะเนาเสยเรวเนองจากมกรดอะมโนอสระจ านวนมาก โดยแบคทเรยจะเขาไปสลายอะมโนท าใหเกดกลนเหมน (วลาวณย, 2537) 4.2 แบคทเรยทกอโรคทพบในอาหารทะเล 4.2.1 Listeria monocytogenes เปนแบคทเรยแกรมบวกทมลกษณะรปทอนสนมกเรยงตวเปนสายตอกน 3-5 เซลลหรอมากกวานนเปนแบคทเรยทไมสรางสปอรหรอแคปซลอณหภมทเหมาะสมส าหรบการเจรญคอ 37 องศาเซลเซยสแตสามารถเจรญไดทกอณหภมแมทอณหภมต าถง 2.5 องศาเซลเซยสสามารถอยรอดในทมโซเดยมคลอไรด 20% ท 4 องศาเซลเซยสนานถง 8 สปดาหและสามารถทนความรอนไดด แหลงทมาของเชอListeria monocytogenes Listeria monocytogenes พบไดทวไปในน า น าเสย อจจาระคนและสตวจงสามารถปนเปอนลงไปในอาหารไดงายในระหวางขนตอนการบรรจการขนสงและการวางจ าหนาย การเขาสรางกาย Listeria monocytogenes เปนแบคทเรยทท าใหเกดโรคและสามารถถายทอดเขาสรางกายไดโดยการรบประทานอาหารทมเชอนปนเปอนอาหารทพบวามการปนเปอนของเชอไดแกนมเนอไกอาหารทะเลสวนในผกไมพบหรอพบนอยมาก นอกจากน เชอ Listeria monocytogenes ยงสามารถเจรญไดทอณหภมตเยนและทนความรอนไดดกวาแบคทเรยทไมสรางสปอรชนดอนจงสามารถมชวตอยรอดไดในผลตภณฑอาหารตางๆเชน นมเนอสตวผกและไสกรอก อนตรายของเชอ Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes เปนแบคทเรยทกอใหเกดโรค Listeriosis ซงมอาการโลหตเปนพษและเยอหมสมองอกเสบมกพบในผปวยทมระบบภมคมกนออนแอหรอทารกทเกดจากมารดาทไดรบเชอขณะตงครรภและยงมรายงานวามผเสยชวตเนองจากบรโภคอาหารทมเชอปะปนอย Listeria monocytogenes จงเปนดชนตวหนงทแสดงถงความปลอดภยของอาหารดวย (สมณฑา, 2545)

24

4.2.2 Vibrio parahaemolyticus เปนแบคทเรยแกรมลบ รปแทง ม flagella อยทปลายขางหลง บางสายพนธมอยรอบเซลล ไมสรางแคปซลและสปอร สามารถเคลอนทได เจรญไดตงแตอณหภม 15-42 องศาเซลเซยส สามารถเจรญในทมเกลอไดตงแต 0.5 - 8.0 เปอรเซนตกอโรคอาหารเปนพษหรอ กระเพาะและล าไสอกเสบพบระบาดครงแรกในประเทศญปนเดมเรยกเชอนวา Pasteurella parahaemolyticus ประเทศญปน จน ไตหวน อนเดย และหลายๆประเทศทางเอเชยรวมทงอเมรกามรายงานวา มากกวา 50% ของอาหารเปนพษมสาเหตจากเชอ V. parahaemolyticus ความทนทานของเชอ 1.ถกท าลายทอณหภม 60 °C ในเวลา 15 นาท 2. ถกท าลายโดยกรด มผศกษาพบวาเชอนถกท าลายดวยกรดมะนาว (Citric acid) พเอช 4.4 ในเวลา 30 นาท 3. ในฤดหนาวเชอสามารถอาศยในตะกอนใตพนน า 4. สามารถมชวตอยในอาหารหรอน าทม NaCl ตงแต 1-8% ถามากกวา 10% เชอจะตาย การเจรญ เจรญไดในชวงอณหภม 9.5-45 °C, ชวงพเอชเทากบ 5 -11 และสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอทมเกลอ NaCI ความเขมขน 0.5–8 เปอรเซนต การท าใหเกดโรค เกดจากการกนอาหารทมเชอปนเปอนเขาไปโดยเฉพาะอาหารทะเลพวกกง ป ปลา หอย จ านวนเชอตองมมากพอทต งแต 106-109โคโลนตอกรม จงสามารถท าใหเกดอาหารเปนพษได อาการมกปรากฏหลงจากกนเชอเขาไป 10 ถง 12 ชวโมง บางรายแสดงอาการภายใน 4 ถง 96 ชวโมงขนอยกบความเปนกรดหรอดาง ภายในระบบทางเดนอาหารเชอนจะเพมจ านวนเปนเทาตวทกๆ 10 ถง 15 นาท ทอณหภม 37 °C เมอเขาสรางกายเชอจะทวจ านวนขนในล าไส มอาการปวดทอง อาจปวดเกรงทองเดน อจจาระเปนน ามกลนเหมนเหมอนกงเนา บางรายคลายเปนบดอจจาระมมกเลอด มไขต า ปวดศรษะ คลนไส อาเจยน อาการทเปนอาจหายเองภายใน 2 ถง 5 วน อตราตายต า โรคนมกพบในฤดรอน ไมคอยพบในฤดหนาว (บศกร, 2550) 5. งานวจยทเกยวของ วลาวณย (2543) ไดศกษาแบคทเรยแลตคกทแยกไดจากอาหารหมกพนบานภาคใต ทดสอบฤทธยบยงแบคทเรย Bacillus cereus, S. aureus, E. coli และ Salmonella

25

typhimurium ซงพบแบคทเรยแลคตกทสามารถยบยงเชอทดสอบนได โดยสามารถผลตสารยบยงทเปนกลมโปรตน ทนอณหภมสง ซงแบคทเรยแลคตกสามารถผลตสารยบยงไดดในอาหาร MRS สมใจ (2550) มการแยกเชอแบคทเรยแลคตกจากอาหารหมก ซงมฤทธยบยงแบคทเรย S. aureus โดยการใชวธ agar spot assay และวธ agar well diffusion ในการทดสอบฤทธยบยง ซงสามารถยบยงไดด และมสมบตทนาสนใจเชน ทนความรอนท 100 องศาเซลเซยสไดนาน 10 นาท มความคงตวดในชวงพเอช 4-7 ม antibacterial spectrum คอนขางกวาง และไดมการศกษาเปรยบเทยบกบไนซน ทใชในทางการคา ซงใหผลการยบยงทใกลเคยง จงมความเหมาะสมจะใชเชอทคดแยกไดเปนหวเชอในการหมกอาหาร หรอน าไปใชในการผลตสารยบยงจลนทรยกอโรคอาหารเปนพษได Anastasiadou et al, (2008) คดแยกแบคทเรย Pedicoccus pentosaceus จากตวอยางไสกรอก ซงสามารถผลตแบคเทอรโอซนชนด pediocin ได Gao et al, (2009) คดแยกแบคทเรย Lactobacillus sake C2 จากตวอยางกะหล าปลดอง ซงไดมการจ าแนกชนดโดยการใช 16 S rRNA ซงสามารถผลตแบคเทอรโอซนทมฤทธกวางออกมายบยงS. aureus และ E. coli ได และสามารถทนความรอนถง 121 องศาเซลเซยส 15 นาท Guerrieri et al, (2008) พฒนาไบโอฟลมทใชควบคม Listeria monocytogenes โดยไดใชแบคทเรยแลคตกทผลตแบคเทอรโอซนสองสายพนธคอ Lactobacillus plantarum 35d และ Enterococcus casseliflavus และแบคทเรยแลคตกทไมผลตแบคเทอรโอซนคอ L. plantarum 396/1 และ Enterococcus faecalis JH2-2 ซงไดแสดงผลไววา Lactobacillus plantarum 35d มฤทธยบยงเชอ Listeria monocytogenesไดสงถง 5.4 log Einarsson and Lauzon (1994) ทดลองผลของการใชสารกนเสยชวภาพในกงทะเล โดยไดใชแบคเทอรโอซนทไดจากแบคทเรยแลคตก ไนซน และ สารละลายเบนโซเอต-ซอเบต เทยบกบตวควบคมทไมมสารใดๆ พบกงทไมมสารกนเสยสามารถคงสภาพได 10 วน กงทใชแบคเทอรโอซนจากแบคทเรยแลคตกสามารถคงสภาพได 16 วน กงทใชไนซนคงสภาพได 31 วน และกงทใชสารละลายเบนโซเอต-ซอเบตคงสภาพไดถง 59 วน Matamoros et al, (2009) ไดมการคดแยกแบคทเรยแลคตกจากตวอยางอาหารทะเล เพอคดเลอกแบคทเรยแลคตกทนอณหภมต า เพอใชในการยบยงเชอกอโรคและเชอทท าใหอาหารเนาเสย ไดเชอกลมแบคทเรยแลคตกทมฤทธการยบยงดทงหมด 7 กลม และมกลมททางผวจยสนใจมากคอ Lactobacillus piscium ซงมฤทธยบยงเชอทดสอบไดกวาง คอ C. sporogenes, L monocytogenes, L. farciminis, B. thermosphacta, S. aureus, Psychrobactersp.,S. putrefaciens, Pseudomonas sp.,S. liquefaciens, P. phosphoriumและ S. entericแตผท าการทดลองยงไมทราบแนชดถงกลไกการยบยงเชอทดสอบ

26

วตถประสงค

1. เพอแยกแบคทเรยแลคตกจากตวอยางอาหารทะเลแชเยน

2. เพอคดเลอกแบคทเรยแลคตกทมประสทธภาพในการยบยงแบคทเรยทท าใหอาหาร

เนาเสย และแบคทเรยกอโรค โดยวธ agar spot assay และ agar well diffusion

3. ศกษาสภาวะทเหมาะสมทมตอการผลตสารกนเสยชวภาพของแบคทเรยแลคตกท

คดเลอกได

4. ศกษาสมบตของสารกนเสยชวภาพจากแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได

5. จ าแนกชนดแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได

6. ศกษาแนวทางการน าไปใชประโยชนในอาหารทะเลในระดบหองปฏบตการ

27

บทท 2

วสดอปกรณและวธการทดลอง

1 อาหารเลยงเชอและสารเคม 1.1 อาหารเลยงเชอ ชออาหารเลยงเชอ บรษทผผลต 1. Agar Merck 2. Brain Heart Infusion broth (BHI) Difco 3. De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS agar) Difco 4. De Man, Rogosa and Sharpe broth (MRS broth) Difco 5. Tryptone Difco 6.Tryptic Soy agar (TSA) Bacto 7. Tryptic Soy broth (TSB) Bacto 1.2 สารเคม ชอสารเคม บรษทผผลต 1. Acetic acid Merck 2. Bromocresol Purple LabChem 3. Calcium Carbonate 4. Ethanol

Merck Reagent

5. Glycerol Sigma 6. Iodine 7. Hydrochloric acid

Merck Merck

8. Sodium chloride Merck 9. Sodium hydroxide Merck

28

1.3 เอนไซม ชอเอนไซม บรษทผผลต 1. โปรตเนสเค (Proteinase K ) 2. แอลฟา – ไคโมทรปซน (alpha-chymotrypsin) 3. ทรปซน (Trypsin) 4. โปรตเอส (Protease)

Sigma Sigma Sigma Sigma

2.อปกรณและเครองมอ อปกรณ ยหอ/บรษทผผลต 1. เครองวดการดดกลนแสง รน UV-1800 Shimadzu, Japan 2. เครองชงสาร 3 ต าแหนง Denver Instrument, Germany 3. อางควบคมอณหภม (Water Bath) รน TW 20 Shel-Lab, USA 4. เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH meter) Mettler Toledo seven easy 5. เครอง Hot Plate and Stirrer รน PC-420D Fisher scientific, USA 6. ตบมเชอ (Incubator) Heraeus, Germany 7. เครองนงฆาเชอ (Autoclave) Tomy, Japan 8. ตอบลมรอน (Hot Air Oven) Venticell 9.ตปลอดเชอ (Laminar airflow cabinet) ASTEC microflow, UK 10. เครอง Vortex Mixer Genie II 11. ไมโครปเปต ขนาด 2-20, 20-200 และ 1000µl Eppendorf Research 12. ตเยน 4 °C Sanden intercool, Japan 13. เครองกรองสญญากาศ (vacum filter) Gelman Sciences, Germany 14. กลองจลทรรศน Olympus 15. กระดาษกรอง (Cellulose Acetate Filter) Sartorius 16. กระดาษกรองเบอร 1 Whatman 17. เครองหมนเหวยง (Refrigerated Centrifuge) Sorvall RC 5C Plus 18. ไมโครเวฟ Sanyo 19. ตเยนแชแขง -80 °C Sanyo, Japan 20. เวอรเนยคาลเปอร (Vernia caliper)

29

3. แบคทเรยอนดเคเตอร 3.1 Staphylococcus aureus ATCC 25923 3.2 Escherichia coli ATCC 25922 3.3Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 3.4 Listeria monocytogenes ATCC 15313 แบคทเรยทกสายพนธทใชเปนแบคทเรยทดสอบไดร บมาจากภาควชา จลชววทยา มหาวทยาลยสงขลานครนทร 4 วธการทดลอง 1.การคดแยกแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเล 1.1 การเกบตวอยาง เกบตวอยางอาหารทะเลแชเยน จากเขตเทศบาลนครหาดใหญและเทศบาลเมองนราธวาส ตวอยางทงหมดเกบไวในถงพลาสตกปราศจากเชอ บรรจลงในถงน าแขงและเกบตวอยางทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอรกษาสภาพตวอยางกอนน าไปวเคราะหทางจลชววทยา โดยตวอยางทใชในการทดลองคอ ปลาใชบรเวณเนอ และผวของตวอยาง กงใชตวอยางทงตว หอยใชเนอหอยตวอยาง และหมกใชบรเวณล าตวเปนตวอยาง 1.2 การแยกแบคทเรยแลคตกจากอาหารแชเยน

น าตวอยางอาหารมาเจอจางใหเหมาะสมดวย tryptone broth 1% แลวน าไป pour ลงบนอาหาร MRS (de Man-Rogosa-Sharpe) agar ทเตม CaCO3 0.5 % บมเชอทอณหภม 8 องศาเซลเซยส ดผลและคดเลอกโคโลนทมบรเวณใส ทกๆ 5 วน เปนเวลา 15 วนและอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 วนเลอกโคโลนเดยวทมบรเวณใสรอบโคโลนน าไปrestreakบนอาหารแขง MRS agar เพอใหไดเชอบรสทธ จ าแนกเชอแบคทเรยแลคตกโดยการตรวจสอบการตดสแกรม และทดสอบคะตะเลส ถาพบโคโลนเกดฟองอากาศแสดงวาแบคทเรยนนใหผลบวกสวนโคโลนทไมเปลยนแปลงจะใหผลลบบนทกผลพรอมจดรหสไอโซเลทของเชอแบคทเรยแลคตกทแยกได โดยเกบเชอแบคทเรยในอาหารหลอด MRS ทเตม CaCO3 1.0 % ทอณหภม 4 องศาเซลเซยสเพอใชในการศกษาตอไป

30

2. การทดสอบความสามารถในการผลตสารกนเสยชวภาพตอการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร 2.1 การเตรยมแบคทเรยแลคตก น าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได เลยงใน MRS btoth บมเปนเวลา 2 วนทอณหภม 8 องศาเซลเซยส และ 35 องศาเซลเซยเปนเวลา 24-48 ชวโมง เพอน าแบคทเรย แลคตกทบมใน MRS broth ใชในการทดลองตอไป 2.2 การเตรยม inoculum ของแบคทเรยอนดเคเตอร

น าแบคทเรยแลคตกทแยกไดทดสอบฤทธการยบยงเชอตวทดสอบตอไปน คอ (Staphylococcus aureus ATCC 25923 และ Escherichia coli ATCC 25922 เลยงในอาหาร BHI อณหภม 37 องศาเซลเซยส Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 เลยงในอาหาร TCBS อณหภม 37 องศาเซลเซยสและ Listeria monocytogenes ATCC 15313 เลยงในอาหาร BHI อณหภม 37องศาเซลเซยสมา streak บนจานอาหารเลยงเชอและบมทอณหภมทเหมาะสมกบเชอชนดนนๆ เปนเวลา 16-18 ชวโมง แลวใช loop เขยเชอทเปนโคโลนเดยวๆมา 4-5 โคโลนลงในtryptic soy broth (TSB) จากนนน าไปเขยาในเครองเขยาโดยใชความเรว 150 รอบตอนาท อณหภมทเหมาะสม เปนเวลา 3-6 ชวโมง แลวน ามาปรบความขนโดยใช sterile normal saline solution (NSS) ใหไดเทากบ 0.5 McFarland standard

2.3 การทดสอบดวยวธ agar spot assay

ท าโดย spot เชอ LAB ทเตรยมไดจากขอ 2.1 ลงบนอาหาร MRS บมทอณหภม 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 วนทอณหภม 8 องศาเซลเซยส และ 35 องศาเซลเซยส(บมตามอณหภมทแยกได) เปนเวลา 24-48 ชวโมง จากนนเททบดวย soft agar ทเหมาะสมตอเชอนน (วน 0.7%) ทผสมแบคทเรยอนดเคเตอร 7 มล.ทมความเขมขนสดทาย 106 CFU/mL บมตอทอณหภมทเหมาะสมเปนเวลา 18-24 ชวโมงตรวจผลโดยดการเกดบรเวณใสรอบโคโลนของ LAB วดความกวางของวงใสโดยใชเวอเนยรคาลปเปอร และคดเลอกแบคทเรยแลคตกทใหความกวางของวงใสมาก เพอเกบไวศกษาตอไป 2.4 การทดสอบดวยวธ agar well diffusion assay

น า LAB ทคดเลอกไดไปเลยงใน MRS broth ทอณหภม 8 องศาเซลเซยสเปนเวลา5 วนป นเหวยงแยกเซลลออกกรองใหปราศจากเชอโดยใชกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมโครเมตรไดเปน cell free supernatant (CFS) น าแบคทเรยอนดเคเตอรผสมลงในอาหารกง

31

แขงแลวเททบบนผวหนาอาหาร MRS ตงทงไวใหอาหารแขง ท าการเจาะหลมขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 4 มลลเมตร จากนนปเปต CFS ปรมาตร 70 ไมโครลตรหยด CFS ทตองการทดสอบลงไป แลวน าไปบมทอณหภมทเหมาะสม เปนเวลา 24 ชวโมง วดขนาดขอบวงใสของการยบยง เพอดความสามารถในการยบยง

3. การศกษาอณหภมและเวลาทเหมาะสมตอการผลตสารกนเสยชวภาพ

ของแบคทเรยแลคตก

3.1 อณหภมทเหมาะสม เพาะเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ในอาหารเหลว MRS บมทอณหภมท

แปรผนท 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยสเปนเวลา 48 ชวโมงมาท าการป นเหวยงแยกเซลลทความเรว 8000 รอบ/นาทเปนเวลา15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส น าสารทป นไดกรองผานแผนเยอขนาด 0.45 ไมโครเมตร แลวน าไปทดสอบฤทธการยบยงเชอ

3.1.1 วดการเจรญของเชอดวยการวดคาการดดกลนแสงท 600 nm โดยปเปตตวอยางจากอาหารเหลวทมเชอแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทเวลา

0, 6, 12, 18, 24, 30, 36 และ 48 ชวโมงแลวบนทกคาการดดกลนแสงโดยใชเครองวดการดดกลนแสง

3.1.2 วดคา pH โดยปเปตตวอยางจากอาหารเหลวทมเชอแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทเวลา

0, 6, 12, 18, 24, 30, 36 และ 48 ชวโมงแลวบนทกคา pH โดยใช pH meter 3.1.3 วดการยบยงเชอแบคทเรยอนดเคเตอรดวยวธ agar well diffusion

assay โดยปเปตตวอยางจากอาหารเหลวทมเชอแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทเวลา

12, 24, 36 และ 48 ชวโมง มาท าการป นเหวยงแยกเซลลทความเรว 8000 รอบ/นาทเปนเวลา15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส น าสารทป นไดกรองผานแผนเยอขนาด 0.45 ไมโครเมตร แลวน าไปทดสอบฤทธการยบยงเชอ น าแบคทเรยอนดเคเตอรผสมลงในอาหารกงแขงแลวเททบบนผวหนาอาหาร MRS ตงทงไวใหอาหารแขง ท าการเจาะหลมขนาดเสนผาศนยกลางประมาณ4มลลเมตร จากนนปเปต CFS ปรมาตร 70ไมโครลตรหยด CFS ทตองการทดสอบลงไป แลว

32

น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา24 ชวโมง วดขนาดขอบวงใสของการยบยง เพอดความสามารถในการยบยง

4. การศกษาสมบตของสารกนเสยชวภาพทคดเลอกได เพาะเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ในอาหารเลยงเชอ MRS ทบมทอณหภมและเวลาทเหมาะสม มาท าการป นเหวยงแยกเซลลทความเรว 8000 รอบ/นาทเปนเวลา15 นาท น าสวนใสทไดกรองผานแผนเยอขนาด 0.45 ไมโครเมตร น าสวนใสไปทดสอบสมบตไดแก 4.1 ผลของอณหภมตอสารกนเสยชวภาพ

น า CFS ผานอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสใน water bath เปนเวลา 30 นาทและ autoclave 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาทกอนน าไปทดสอบ antibacterial activity โดยวธ agar well diffusion assay เปรยบเทยบกบตวอยางทไมไดผานความรอนโดยการวดวงใสทเกดขน

4.2 ผลของ pH ตอสารกนเสยชวภาพ

น า CFS ทไมไดปรบ pH และ CFS ทน ามาปรบ pH โดยใชโซเดยมไฮดรอกไซดเปน 6.5 แลวจงน าไปทดสอบ antibacterial activity โดยวธ agar well diffusion assay

4.3 ผลของเอนไซมโปรตเอสตอสารกนเสยชวภาพ น า CFS ทเตรยมได ผสมกบเอนไซมยอยโปรตน ไดแก protease, proteinase K, trypsin และ alpha-chymotrypsin โดยใหความเขมขนสดทายเปน 1 มก/มล. โดยใชฟอสเฟตบฟเฟอรเปนตวท าละลาย น า CFS ทผสมกบเอนไซม protease, protenase K, trypsin และ alpha-chymotrypsin วางไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 1 ชวโมง น า CFS ดงกลาวมาทดสอบการยบยงแบคทเรย โดยวธ agar well diffusion assay เปรยบเทยบผลกบวงใสทไมไดผานการทดสอบเอนไซม 5. การจดจ าแนกชนดแบคทเรยแลคตกทสรางสารกนเสยชวภาพได ตรวจสอบทางพนธศาสตรโมเลกลของแบคทเรยทคดเลอกได ท าการสกดดเอนเอ เพมปรมาณ 16 SrRNA gene ดวยเทคนค PCR (polymerase chain reaction) และหาล าดบเบสของ 16S rRNA ดวยเครองหาล าดบเบสอตโนมต ตามวธของ Arahal et al,(1996) โดยท าการสงตรวจทบรษท MacroGen ประเทศเกาหลใต น าขอมลล าดบเบสของแบคทเรยท

33

แยกไดมาเปรยบเทยบกบขอมลทมอยในฐานขอมล GeneBank EMBL และ DDBJ โดยใชโปรแกรมเปรยบเทยบท http://www.ncbi.nlm.nih.gov

6. การน าไปใชการยบยงเชอแบคทเรยในอาหารทะเลในระดบหองปฏบตการ 6.1 การเตรยมตวอยางอาหารทะเล (หสยาณย, 2556) ในการทดลองนไดใชกงขาว (Litopenaeus vannamei) โดยคดเลอกกง ทมขนาดประมาณ 30-50 กรมตอตว โดยจะใชกงทปอกเปลอกผาหลงในการทดลอง โดยน ากงไปแชใน 3 เปอรเซนตฟอมลดไฮดนาน 3 นาท และ น ากงไปลางฟอมลดไฮดดวยการแชใน NSS อก 10 ครง(เปนอยางนอย) จงจะไดกงปลอดเชอเพอใชในการทดลองขนตอไป 6.2 การเตรยมแบคทเรยอนดเคเตอร ใชเชอกอโรคทมกพบในอาหารทะเล คอ Listeria monocytogenes และ Vibrio parahaemolyticus เปนตวอยางการศกษา โดยน าไปเลยงใน 5 มล. TSB บมท 37 องศาเซลเซยส 6 ชวโมง และน าไปถายลงในฟลาสกทม 45 มล. TSB 37 องศาเซลเซยส 1 ชวโมง ใหมเชอสทธประมาณ 107–108cfu/mL

6.3 การเตมเชอลงในกง น ากงจากขอ 6.1 ปรมาตร 500 กรม น ามาบมกบเชอตวทดสอบทเตรยมจาก

ขอ 6.2 ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท มเชอสทธประมาณ 106cfu/g และมการนบเชอทงกอนและหลงลางกง เพอเทยบวาเชอเจรญไปเทาใดและมผลตอประสทธภาพการยบยงหรอไม

6.4 การทดสอบการลางกงโดยใช CFS และ MRS น ากงทเตรยมไดไปแชใน MRS broth (ควบคม) และ CFS ทไดจากการ

เพาะเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ในอาหารเลยงทบมทอณหภมและเวลาทเหมาะสมซงไดจากการทดลองท 3(ซงวธการแยกจะท าดวยท าการป นเหวยงแยกเซลลมความเรว 8000 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท กรองผานแผนเยอขนาด 0.2 ไมโครเมตร) เปนเวลา 10, 20 และ 30 นาท

34

6.5การทดสอบประสทธภาพการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร น ากงทผานการลางดวย CFS และลางดวย MRS broth ในอตราสวน 1:1 และ

น าไปเขาใน stomarcher และเจอจางในน าเกลอ NSS และน าไปเลยงในอาหารเลยงเชอ ทจ าเพาะตอ Listeria monocytogenes และ Vibrio parahaemolyticus เทยบกบตวควบคม เพอพจารณาถงประสทธภาพ ของการยบยงเชอโดยการนบเชอทเหลอรอดอย ส าหรบเชอ Listeria monocytogenes จะนบในอาหาร TSA บมท 20 องศาเซลเซยส 48 ชวโมง และ Vibrio parahaemolyticus ท าการนบเชอทเหลอรอดอยในอาหาร TSA ทเตม NaCl 1 เปอรเซนตบมท 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 24 ชวโมง

35

บทท 3

ผลการทดลอง

1.การแยกแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเลแชเยน จากการเกบตวอยางอาหารทะเลแชเยนไดแก ปลา กง หอย และหมก จ านวน 14 ตวอยาง สามารถแยกเชอแบคทเรยทผลตกรดซงสงเกตไดจากการเหนวงใสรอบโคโลน และมโคโลนสเหลองบนอาหาร MRS ทเตม bromcresol purple 0.004 เปอรเซนต และ calcium carbonate 0.5 เปอรเซนต 195 ไอโซเลท และน าเชอแบคทเรยแลคตกทผลตกรดไดไปทดสอบดวยการยอมแกรม และทดสอบการสรางเอนไซมคะตะเลส พบวาสามารถแยกเชอแบคทเรย แลคตกทเจรญทอณหภม 8 และ 35 องศาเซลเซยสได 22 และ 52 ไอโซเลท ตามล าดบรวมแบคทเรยแลคตกทแยกไดทงหมดได 74 ไอโซเลท โดยตวอยางทสามารถแยกแบคทเรยแลคตกไดมากทสด คอ ปลา (ตารางท 3.1) จากตารางจะเหนไดวา เชอทแยกไดแมจะแยกไดมาจากอาหารทะเลแชเยน แตเชอทแยกไดสวนใหญ เปนเชอทเจรญทอณหภม 35 องศาเซลเซยส ตารางท 3.1จ านวนแบคทเรยสรางกรดและแบคทเรยแลคตกทแยกไดจากอาหารทะเลแชเยนบนอาหาร MRS ทเตม bromcresol purple 0.004 เปอรเซนต และ calcium carbonate 0.5 เปอรเซนต บมทอณหภม 35 และ 8 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 และ 15 วน ตามล าดบ

ตวอยางอาหารทะเล

จ านวนตวอยาง

จ านวนแบคทเรยทผลตกรดจากการบมทอณหภม

8 และ 35 ºC (ไอโซเลท)

แบคทเรยแลคตกทแยกไดจากการบมทอณหภม

8 และ 35 ºC (ไอโซเลท)

8 35 8 35 ปลา 9 55 63 15 32 กง 2 17 13 2 3 หอย 1 4 11 3 11 หมก 2 11 11 2 6

ทงหมด 14 87 108 22 52

36

2.การทดสอบความสามารถในการผลตสารกนเสยชวภาพตอการยบยงเชอทดสอบดวยวธ Agar spot assay

น าแบคทเรยอนดเคเตอร (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1และ Listeria monocytogenes ATCC 15313)มาปรบความขนโดยใช sterile normal saline solution (NSS) ใหไดเทากบ 0.5 McFarland standard และน าแบคทเรยแลคตกทแยกไดทงหมด 74 ไอโซเลทมา spot ลงบนอาหาร MRS แลวบมทอณหภม 8 องศาเซลเซยส และ 35 องศาเซลเซยส (บมตามอณหภมทแยกได) เปนเวลา 24-48 ชวโมง จากนนเททบดวย soft agar ทเหมาะสมตอแบคทเรยอนดเคเตอรนน (วน 0.7%) ทผสมเชอทดสอบ 7 มลลลตรบมตอทอณหภมทเหมาะสมเปนเวลา 18-24 ชวโมง

พบวามเชอแบคทเรยแลคตก9 สายพนธทสามารถยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรไดทงหมด (ตารางท 3.2) และพบวาม 17 สายพนธทสามารถยบยงแบคทเรย V. parahaemolyticus AAHRC 1 และ L. monocytogenes ATCC 15313 ได นอกจากนพบวา แบคทเรยแลคตก C 103 ซงแยกไดจากปลาสกน จากการบมทอณหภม 8 องศาเซลเซยส มผลการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรไดทกสายพนธ และใหวงใสทแสดงถงการยบยงเชอแบคทเรย L. monocytogenes ATCC 15313 ไดสงทสดถง 17.05 มลลเมตร และจากการศกษาครงนไดมการคดเลอกแบคทเรยแลคตกทใหความกวางของวงใสสง เพอเกบไวศกษาตอไป

37

ตารางท 3.2 การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ดวยวธ Agar spot assay ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ

บมทอณหภม (ºC)

ขนาดวงใสการยบยงของแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร)* E. coli ATCC 25922

S. aureus ATCC 25923

V. parahaemolyticus AAHRC 1

L. monocytogenes ATCC 15313

ปลาสกน C 205 35 18.05 12.05 8.60 10.20 ปลาอนทรย

E 208 35 12.20 15.20 12.25 13.10

ปลากะพงแดง

F 202 35 13.05 - 14.00 15.80

ปลาทราย G 230 35 - 10.50 11.25 10.10 ปลาทราย G 204 35 12.10 - 11.50 11.10 หอยหวาน

H 201 35 15.05 - 11.10 12.45

หมกกลวย

I 203 35 12.20 12.25 12.25 13.10

ปลาไข J 201 35 13.10 15.25 13.25 12.25 ปลาไข J 203 35 11.80 - 11.20 12.10 ปลาท K 201 35 14.10 12.25 12.40 11.40 ปลาท K 204 35 12.10 13.35 11.55 10.15 ปลาโอ L 210 35 - 14.80 13.20 12.30 หมกหอม M 204 35 11.10 15.50 13.15 11.10 หมกหอม M 207 35 - 13.15 12.15 11.20 ปลาสกน C 103 8 19.00 16.20 12.05 17.05 ปลาไข J 103 8 11.00 - 12.40 14.30 ปลาโอ L 102 8 18.50 12.50 17.20 11.20 หมายเหต: (-) คอ ไมมประสทธภาพในการยบยง (*) คาเฉลยของการทดลอง 2 ซ า

38

นอกจากน ยงไดรบความอนเคราะหแบคทเรยแลคตกจาก นางสาว นชร ตนตสวรรณโณ จ านวน 53 ไอโซเลท (ตารางท 3.3) เพอใชในการทดลองขนตอน Agar spot assay ท าการทดสอบการยบยงโดยการ ปรบลดชนดของเชอแบคทเรยตวทดสอบ ใหเปนแบคทเรยกอโรคคอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และListeria monocytogenes ATCC 15313และทดลองโดยใชแบคทเรยทแยกไดจากอณหภม 8 องศาเซลเซยส จากตารางพบวา แบคทเรยแลคตกทไดรบความอนเคราะหคอนขางมประสทธภาพดในการยบยงเชอVibrio parahaemolyticus AAHRC 1 ซงสวนใหญมกแสดงวงใสทไมสามารถวดคาได นอกจากนยง พบวาแบคทเรย แลคตกรหส SQL 10104 และ SQL 25108 ซงแยกไดจากหมกกลวย แสดงวงใสในการยบยงเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 สงทสดและจากการศกษาครงนไดมการคดเลอกแบคทเรยแลคตกทสามารถยบยงแบคทเรยตวทดสอบทงสองสายพนธ เพอเกบไวศกษาในขนตอน Agar well diffusion ตอไป

รปท 3.1 แสดงวงใสของการยบยงเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 ดวยวธ Agar spot ของไอโซเลทSHL 10101 และ FSJ 10105 ตารางท 3.3 การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของแบคทเรยแลคตกจ านวน 53 ไอโซเลททไดรบความอนเคราะหจาก นางสาว นชร ตนตสวรรณโณ ดวยวธ Agar spot assay

ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ ขนาดวงใสการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร) L. monocytogenes

ATCC 15313 V. parahaemolyticus

AAHRC 1 ปลากะพงขาว FSK L 25103 - N กงขาว SHL 25103 1.50 N กงขาว SHL 25104 1.25 N

39

ตารางท 3.3(ตอ)

ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ ขนาดวงใสการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร) L. monocytogenes

ATCC 15313 V. parahaemolyticus

AAHRC 1 หมกกลวย SQL 25103 0.75 N หมกกลวย SQL 25104 1.10 N หมกกลวย SQL 25108 8.05 N ปมา POL 25101 0.50 N ปมา POL 25102 1.00 N ปมา POL 25104 - N ปมา POL 25107 1.75 N ปมา POL 251010 4.50 N หอยหวาน HYL 25101 1.25 N หอยหวาน HYL 25102 0.50 N หอยหวาน HYL 25103 4.50 N หอยหวาน HYL 25104 - N หอยหวาน HYL 25105 3.50 N หอยหวาน HYL 25106 0.55 N หอยหวาน HYL 25108 - N หมกกลวย SQL 30107 - N หมกกลวย SQL 30109 - 2.70 ปลาโอ FSOL 31103 0.50 N กงขาว SHL 31107 - N กงขาว SHL 311010 1.60 N ปลาจะละเมด FSJ 10101 - N ปลาจะละเมด FSJ 10102 - N ปลาจะละเมด FSJ 10105 3.50 N ปลาจะละเมด FSJ 10109 1.00 1.25

40

ตารางท 3.3(ตอ)

ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ ขนาดวงใสการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร) L. monocytogenes

ATCC 15313 V. parahaemolyticus

AAHRC 1 หมกกลวย SQL 10104 8.55 0.50 หมกกลวย SQL 10107 4.65 3.60 หมกกลวย SQL 10108 - N กงกามกราม SHK 10101 5.50 N กงกามกราม SHK 10102 - N กงกามกราม SHK 10103 - N กงกามกราม SHK 10104 - N กงกามกราม SHK 10105 1.85 N กงกามกราม SHK 10107 5.90 N กงกามกราม SHK 10108 1.05 - กงกามกราม SHK 10109 - N หอยลาย HYL 10101 - N หอยลาย HYL 10102 - N หอยลาย HYL 10103 - N หอยลาย HYL 10105 - 5.05 หอยลาย HYL 10106 - N หอยลาย HYL 10107 - N หอยลาย HYL 10108 5.50 N หอยลาย HYL 10109 3.60 N หอยลาย HYL 101010 - N ปลาเกา FSK 10102 4.55 8.80 ปลาเกา FSK 10103 1.25 N ปลาเกา FSK 10106 2.50 N ปลาเกา FSK 10107 6.10 4.50

41

ตารางท 3.3 (ตอ)

ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ ขนาดวงใสการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร) L. monocytogenes

ATCC 15313 V. parahaemolyticus

AAHRC 1 ปลาเกา FSK 10108 4.65 N ปลาเกา FSK 10109 - N

หมายเหต: N = ขนาดของวงใสกวางเกน 25 มลลเมตร 3.การทดสอบความสามารถในการผลตสารกนเสยชวภาพตอการยบยงเชอทดสอบดวยวธ Agar well diffusion น าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดไปเลยงใน MRS broth ทอณหภม 8 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5 วน ป นเหวยงแยกเซลลออกกรองใหปราศจากเชอโดยใชกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมโครเมตรไดเปน cell free supernatant (CFS) น าเชอทดสอบคอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313ผสมลงในอาหารกงแขงแลวเททบบนผวหนาอาหาร MRS ตงทงไวใหอาหารแขง ท าการเจาะหลมขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 4มลลเมตร จากนนปเปต CFS ปรมาตร 70ไมโครลตรหยด CFS ทตองการทดสอบลงไป แลวน าไปบมทอณหภมทเหมาะสม เปนเวลา 24ชวโมง วดขนาดขอบวงใสของการยบยง เพอดความสามารถในการยบยง

จากแบคทเรยทงหมดทคดเลอกไดจากขอ 2 พบวามแบคทเรยแลคตกทยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรอยางนอย 1 สายพนธ มทงหมด 22 ไอโซเลท และพบวามเพยง 8 ไอโซเลทเทานน ทสามารถยบยงไดทง Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และListeria monocytogenes ATCC 15313ซงไอโซเลททใหขนาดของวงใสกวางทสด คอ SQL10104 แยกไดจากหมกกลวยซงเปนไอโซเลทเดยวกนกบทใหผลการยบยงดวยวธการ Agar spot assay สงทสดเชนกน (ตารางท 3.4 และ รปท 3.2) คดเลอกแบคทเรยแลคตกทมฤทธการยบยงเชออนดเคเตอรไดสงทสด ไดแก SHL 25103, SHL 25104, SQL 25104, HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 เพอใชในการทดลองขนตอนตอไป

42

รปท 3.2 วงใสการยบยงของ CFS ตอเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 (ซาย) และ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 (ขวา) ตารางท 3.4 การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของแบคทเรยแลคตก ดวยวธ Agar well diffusion assay

ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ ขนาดวงใสการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร) L. monocytogenes

ATCC 15313 V. parahaemolyticus

AAHRC 1 กงขาว SH 25103 15.50 10.25 กงขาว SH 25104 13.75 12.75 หมกกลวย SQ 25103 - 10.50 หมกกลวย SQ 25104 11.00 16.60 หมกกลวย SQ 25108 - 12.25 หอยหวาน HY 25102 - 14.00 ปมา PO 25101 - 14.50 หอยหวาน HY 25102 - 10.25 หอยหวาน HY 25103 17.25 14.15 หอยหวาน HY 25105 - 12.00 หอยหวาน HY 25106 - 12.75 ปลาโอ FSO 31103 - 11.50

43

ตารางท 3.4 (ตอ)

ตวอยางอาหารทะเล

รหสเชอ ขนาดวงใสการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (มลลเมตร) L. monocytogenes

ATCC 15313 V. parahaemolyticus

AAHRC 1 ปลาจะละเมด FSJ 10109 - 12.75 หมกกลวย SQ 10104 17.55 14.00 หมกกลวย SQ 10107 18.55 14.00 กงกามกราม SHK 10104 - 16.10 กงกามกราม SHK 10105 - 10.05 หอยลาย HYL 10108 10.00 10.25 หอยลาย HYL 10109 8.75 11.20 ปลาเกา FSK 10102 - 11.20 ปลาเกา FSK 10107 11.45 18.25 ปลาเกา FSK 10109 7.50 - หมายเหต: (-) คอ ไมมประสทธภาพในการยบยง 4. การศกษาอณหภมและเวลาทเหมาะสมตอการผลตสารกนเสยชวภาพของแบคทเรยแลคตก

น าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได 6 สายพนธ ไดแก SHL 25103, SHL 25104, SQL 25104, HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 มาศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการผลตสารกนเสยชวภาพทมการแปรผนอณหภมท 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส โดยตรวจสอบทก 6 ชวโมง จนถง 48 ชวโมง

พบวาแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทกสายพนธ มคา pH ในอาหารเลยงเชอลดลง ซงเชอทเลยงทอณหภม 30 องศาเซลเซยสทกสายพนธนน มคา pH ในอาหารเลยงเชอลดลงเรว และมากทสด แตในขณะเดยวกน เมอมการวดคาการเจรญดวยการวดดดกลนแสงท 600 นาโนเมตร พบวาเชอทคดเลอกทกสายพนธ เจรญไดเรวเมอเลยงทอณหภม 30 องศาเซลเซยส โดยเขาสระยะ stationary phase เรวเชนกน และเชอทกสายพนธเจรญไดสงทสดทอณหภม 25 องศาเซลเซยส (รปท 3.3-3.8) ยกเวนสายพนธ SQL 10104 ทสามารถเจรญไดดทงท 20 และ 25 องศาเซลเซยส (รปท 3.7)

44

รปท 3.3 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25103 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

45

รปท 3.4 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25104 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

46

รปท 3.5 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 25104 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

47

รปท 3.6 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท HYL 25103 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

48

รปท 3.7 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 ทเลยงในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

49

รปท 3.8 การเจรญและคาพเอชของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10107 ทเลยงในอาหาร MRS brothบมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

50

จากรปท 3.3-3.8 พบวาการเจรญของเชอทง 6 สายพนธนนจะเจรญไดดทอณหภมเดยวกน แต ฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 นนมความแตกตางกน แมแตในไอโซเลทเดยวกน ถาเลยงทอณหภมทแตกตางกน ฤทธการยบยงเชอกแตกตางกนดวย (รปท 3.9) นอกจากนยงพบวาแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25103 ทเจรญทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส ไมพบฤทธยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 (รปท 3.10 A) แตแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25104 และ SQL 25104 ไมพบฤทธยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 เมอเจรญเปนเวลา 12 ชวโมงทกอณหภมทเพาะเลยง แตจะพบฤทธการยบยงตงแตชวโมงท 24 เปนตนไป ยกเวนเชอทเจรญทอณหภม 30 องศาเซลเซยส ไมพบฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 (รป 3.8 B, C) รป 3.10 (D, E และ F) ไอโซเลท HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 พบฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ตงแตการเจรญชวโมงท 12 ของการเพาะเลยงทกอณหภม และผลของการยบยงเชอพบวา เชอทเจรญทอณหภม 20 และ 25 องศาเซลเซยส แสดงผลการยบยงทไมแตกตางกน ส าหรบฤทธการยบยง Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 นน พบวาทกสายพนธของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได แสดงฤทธการยบยงทช วโมงท 24 วงใสทเกดขนกวางกวา 35 มลลเมตร และไมพบฤทธการยบยงเมอบมตอชวโมงท 36 และ 48

รปท 3.9 ลกษณะของวงใสของ CFS ทไดมาจากการเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได การยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรของไอโซเลท SQL 25104 (ซาย) ไอโซเลท SQL 10104 (กลาง) และไอโซเลท SHL 25104 (ขวา)

51

รปท 3.10 ฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของแบคทเรย แลคตกไอโซเลท SHL 25103, SHL 25104, SQL 25104, HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 ทเจรญในอาหาร MRS broth บมทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง โดยวธ Agar well diffusion assay

5. การศกษาสมบตของสารกนเสยชวภาพทคดเลอกได เพาะเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดไอโซเลท SQL10104 ในอาหารเลยงเชอ MRS ทบมทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง มาท าการป นเหวยงแยกเซลลท

HYL 25103

52

ความเรว 8000 รอบ/นาทเปนเวลา 15 นาท น าสวนใสทไดกรองผานแผนเยอขนาด 0.45 ไมโครเมตร แลวน าไปทดสอบสมบตดงน 5.1 ผลของอณหภมตอสารกนเสยชวภาพ

น า CFS แชในอางน าอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาทและเขาเครอง Autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาทกอนน าไปทดสอบฤทธการยบยงแบคทเรยโดยวธ agar well diffusion assay เปรยบเทยบกบตวอยางทไมไดผานความรอนโดยการวดวงใสทเกดขน

พบวาเมอน า CFS ไปท าใหมอณหภมสงขนนน ฤทธการยบยงแบคทเรยไมมการเปลยนแปลงเมอเทยบกบตวควบคม ยกเวน CFS ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ทฤทธ การยบยงเแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ลดลง ตามขนาดของวงใสทเกดขน กลาวคอเมอน า CFS ไปท าใหมอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาทและ 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท มขนาดของวงใส ดงน 20.75, 20.73, 20.47 และ 16.88 (มลลเมตร) ตามล าดบ (รปท 3.11 และรปท 3.12)

5.2 ผลของ pH ตอสารกนเสยชวภาพ

น า CFS ทไมไดปรบ pH และ CFS ทน ามาปรบ pH เปน 6.5 แลวจงน าไปทดสอบฤทธการยบยงแบคทเรยโดยวธ agar well diffusion assay

เมอน า CFS ทมการปรบ pH เปน 6.5 เทยบกบ CFS ทไมมการปรบ pH (คา pH เทากบ 5.9) พบวาไมมความแตกตางของการยบยงแบคทเรย ซงขนาดของวงใสทเกดขนจาก CFS ทมการปรบ และไมมการปรบ pH มขนาดเทากบ 20.67 และ 20.55 (มลลเมตร) ตามล าดบ (รปท 3.13 และรปท 3.14)

5.3 ผลของเอนไซมโปรตเอสตอสารกนเสยชวภาพ น า CFS ทเตรยมได ผสมกบเอนไซมยอยโปรตน ไดแก proteinase K, trypsin, protease และ alpha-chymotrypsin โดยใหมความเขมขนสดทายเทากบ 1 มก/มล. บมไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 1 ชวโมง น าสวนใสดงกลาวมาทดสอบการยบยงแบคทเรย โดยวธ agar well diffusion assay เปรยบเทยบผลกบสวนใสทไมไดผานการทดสอบเอนไซมทงสชนด CFS ทผานการ treat ดวยเอนไซมชนดตางๆ ไมมฤทธในการยบยงแบคทเรยListeria monocytogenes ATCC 15313 ยกเวน CFS ทผานการ treat ดวยเอนไซม trypsin เทานน ทสามารถแสดงฤทธการยบยงได แมวาจะมประสทธภาพการยบยงทลดลงมากกตามเมอเทยบกบชดควบคม (รปท 3.15 และรปท 3.16)

53

รปท 3.11 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104ทแชในอางน าอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาทและเขาเครอง Autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท

รปท 3.12 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ทแชในอางน าอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาทและเขาเครอง Autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท

54

รปท 3.13 แสดงฤทธการยบยง แบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 เทยบกบ CFS ทมการปรบเปน 6.5 และไมปรบ pH

รปท 3.14 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของ CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ทมการปรบเปน 6.5 และไมปรบ pH

55

รปท 3.15 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของCFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ทผานการ treat ดวยเอนไซม proteinase K, trypsin, protease และ alpha-chymotrypsin ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

รปท 3.16 ฤทธการยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 ของCFS ของแบคทเรย

แลคตกไอโซเลท SQL10104 ทผานการ treat ดวยเอนไซม proteinase K, trypsin, protease

และ alpha-chymotrypsinทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

56

6. การจดจ าแนกแบคทเรยแลกตก

การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอแบคทเรยแลคตกทไดคดเลอก เปนแบคทเรยแกรมบวก รปแทง (รปท 3.17) ยงมการจดจ าแนกเชอในระดบสปชส โดยการตรวจสอบล าดบนวคลโอไทดของดเอนเอโดยวธ 16S rRNA sequence analysis แลวท าการประมวลผลดวยขอมลใน GenBank database โดยใช BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) จากนนน าขอมลทไดมาสราง Phylogenetic tree โดยใชโปรแกรม MEGA 4 แสดงดงรป ดงนน ผลการจดจ าแนกแบคทเรยแลคตกพบวา แบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 มความใกลเคยงกบ Carnobacterium divergens DSM20623T ซงม %similarity เทากบ 100 % ซงตรงกบ Accesstion number คอ AB705304.1 (รปท 3.18)

รปท 3.17 รปรางและการจดเรยงตวของแบคทเรยแลคตก SQL 10104 ทก าลงขยาย 100x เทา

57

รปท 3.18 การจดล าดบอนกรมวธานของสายพนธ SHL 10104

7. การน าสารกนเสยไปใชยบยงเชอแบคทเรยในอาหารทะเลในระดบหองปฏบตการ การทดสอบประสทธภาพการยบยงแบคทเรยทดสอบ น ากงทผานการลางดวย CFS และลางดวย MRS broth ไปเขาใน stomacher และเจอจางในน าเกลอ 0.85% NSS และน า Listeria monocytogenes และ Vibrio parahaemolyticusไปเลยงในอาหารเลยงเชอ TSA เทยบกบตวควบคม (รปท 3.19 และ 3.20) เพอพจารณาถงประสทธภาพ ของการยบยงเชอโดยการนบเชอทเหลอรอดอย

ไดมการผนแปรเวลาทใชในการลางกงเปนเวลา 10, 20 และ 30 นาท เพอศกษาปจจยทางเวลาวามผลในการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรหรอไม โดยส าหรบเชอ Listeria monocytogenes จะนบในอาหาร TSA บมท 20 องศาเซลเซยส 48 ชวโมง และ Vibrio parahaemolyticus ท าการนบเชอทเหลอรอดอยในอาหาร TSA ทเตม NaCl 1 เปอรเซนตบมท 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 24 ชวโมง

58

เมอลางกงใน MRS และใน CFS พบวา เชอกอโรคในกงลดลง โดยกงทมเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 เมอลางใน MRS และใน CFS พบวา เชอลดลงประมาณ 2 log CFU/mL ส าหรบกงทมเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 เมอลางลงใน MRS เชอลดลง 1 log CFU/mL แตเมอลางลงใน CFS เชอลดลงถง 3 log CFU/mL :ซงจากการผนแปรเวลาทใชในการลางกงพบวา เวลาทใชในการลางกงในเวลาตางๆใหผลการยบยงทไมตางกนอยางมนยส าคญ (p-value>0.05)ดงแสดงในรปท 3.21 และ 3.22

59

รปท 3.19 จ านวนเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 ในกงทเหลอเมอผานการลางใน CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 (ซาย) และการลางใน MRS (ขวา) เปนเวลา 10 นาท

รปท 3.20 จ านวนเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 ในกงทเหลอเมอผานการลางใน CFS ของแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 (ซาย) และการลางใน MRS (ขวา) เปนเวลา 10 นาท

60

รปท 3.21 การยบยงVibrio parahaemolyticus AAHRC 1โดยใช CFS ของแบคทเรยแลคตก ไอโซเลท SQL10104 และการลางใน MRS เปนเวลา 10 20 และ 30 นาท

รปท 3.22 การยบยง Listeria monocytogenes ATCC 15313 โดยใช CFS ของแบคทเรย แลคตกไอโซเลท SQL10104 และการลางใน MRS เปนเวลา 10 20 และ 30นาท

CFS

CFS

61

บทท 4 วจารณผลการทดลอง

แบคทเรยแลคตกเปนแบคทเรยทพบไดทวไปในสงแวดลอม พบในอาหารหลายชนด

โดยเฉพาะในนม ผก และผลไม แบคทเรยนเปนแบคทเรยเจรญในสภาวะทไมมอากาศ และทนในสภาพทมอากาศ และมรายงานการพบแบคทเรยแลคตกในอาหารทะเลเชนกน (Huss, 1995) การศกษาในครงนมวตถประสงคเพอคดเลอกแบคทเรยแลคตกทแยกไดจากอาหารทะเลแชเยนเพอใชในการยบยงแบคทเรยกอโรค

ในขนตอนแรก ท าการเกบตวอยางอาหารทะเลแชเยนชนดตางๆจากสถานทตางๆเพอน ามาแยกแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเลแชเยน จากการศกษาตวอยางอาหารทะเลแชเยนทง 14 ตวอยาง และแยกทการบม 2 อณหภมทแตกตางกนคอ ท 8 องศาเซลเซยสและ 35 องศาเซลเซยส โดยคดเลอกไอโซเลททเปนแบคทเรยแลคตกดวยการการตรวจสอบการตดสแกรม เปนแกรมบวก และทดสอบคะตะเลสทใหผลลบ พบวาแมแยกมาจากอาหารทะเลแชเยน แตเชอทแยกไดสวนใหญมกแยกไดจากอณหภม 35 องศาเซลเซยส (52 ไอโซเลทจาก 74 ไอโซเลท) ซงแบคทเรยทแยกไดทอณหภมต าพบนอยกวา และจากการทดลองของ Matamoros et al, 2009 ไดมการทดลองแยกแบคทเรย psychrotrophic lactic acid จากตวอยางอาหารทะเลเชน ปลาแซลมอนรมควนแชเยน แซลมอนบรรจแบบดดแปรบรรยากาศ เปนตน พบเชอแบคทเรยทแยกไดในขนตน 5,575 ไอโซเลท แตเมอน ามาทดสอบการยบยงเชอและทดสอบสมบตของแบคทเรยแลคตกพบวา มเพยง 52 ไอโซเลทเทานน

เมอน าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดมาทดสอบฤทธการยบยงแบคทเรย ดวยวธ Agar spot assay โดยใชแบคทเรยอนดเคเตอร ดงน Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313 พบวามเแบคทเรยแลคตก 17 ไอโซเลททสามารถยบยงเชอ V. parahaemolyticus AAHRC 1 และ L. monocytogenes ATCC 15313 ได ซงเปนเชอทแยกไดจากอณหภม 35 องศาเซลเซยส 14 ไอโซเลท และแยกไดจากอณหภม 8 องศาเซลเซยส 3 ไอโซเลท

นอกจากนยงไดรบความอนเคราะหแบคทเรยแลคตกจาก นางสาว นชร ตนตสวรรณโณ จ านวน 53 ไอโซเลท เพอใชในการทดลองขนตอน Agar spot assay และไดปรบวธการทดลองโดยการ ปรบลดชนดของแบคทเรยอนดเคเตอร ใหเปนแบคทเรยกอโรค คอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313 และทดลองโดยใชแบคทเรยทแยกไดจากอณหภม 8 องศาเซลเซยส พบวาแบคทเรยแลคตก 52 ไอโซเลททคดเลอกไดสามารถยบยงเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และมแบคทเรยแลคตก 31 ไอโซเลทสามารถยบยงเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 และการยบยงเชอกอโรคทผลตจากแบคทเรยแลคตกอาจมาจาก กรดอนทรย ไดอาซทล ไฮโดรเจนเปอรออกไซด คารบอนไดออกไซด และ แบคเทอรโอซน (Lindgren and Dobrogosz 1989)

62

น าแบคทเรยแลคตกทสามารถยบยง Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313 มาทดสอบความสามารถในการผลตสารกนเสยชวภาพดวยวธ Agar well diffusion พบวามแบคทเรยแลคตกทยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรอยางนอย 1 สายพนธ มทงหมด 22 ไอโซเลท และพบวามเพยง 8 ไอโซเลทเทานน ทสามารถยบยงไดทงสองสายพนธ ซงไอโซเลททใหขนาดของวงใสกวางทสด คอ SQL 10104 ซงเปนไอโซเลทเดยวกนกบทใหผลการยบยงดวยวธการ Agar spot assay สงทสดเชนกน แบคทเรยแลคตกทสามารถยบยงแบคทเรยทงสองสายพนธในขนตอน Agar spot assay ม 32 ไอโซเลท และเมอน าแบคทเรยทคดเลอกไดมาทดสอบในขนตอน Agar well diffusion ปรากฏวา มเพยง 8 ไอโซเลทเทานนทยงยบยงได ทงสองสายพนธ เนองจากขนตอน Agar spot assay เปนการเพาะเลยงเชอบนอาหารเลยงเชอ และเชอยงคงมชวตสามารถเจรญและสรางสารยบยงตางๆได ในขณะทวธ Agar well diffusion assay ไมมเซลลมชวตของแบคทเรยแลคตก มเพยง supernatant ทเชอผลตออกมาเทานนโดยไมไดใชตวเซลลของแบคทเรยในการยบยง ซงเชอแตละไอโซเลท อาจผลตสารกนเสยชวภาพออกมามากนอยแตกตางกน ท าใหไอโซเลททยบยงในขนตอน Agar spot assay อาจไมอาจยบยงในขนตอน Agar well diffusion ได อยางไรกตามในบางไอโซเลททยบยงในขนตอน Agar spot assay สามารถยบยงในขนตอน Agar well diffusion ไดสงเชน ไอโซเลท SQL 10104

หลงจากคดเลอกแบคทเรยแลคตกทมความสามารถในการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรไดแก SHL 25103, SHL 25104, SQL 25104, HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 เพอมาศกษาสภาวะทเหมาะสมตอการผลตสารกนเสยชวภาพ โดยบมทอณหภมทแปรผนท 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยสเปนเวลา 48 ชวโมง โดยมการวดคาการเจรญของเชอ ดวยการวดคาการดดกลนแสงท 600นาโนเมตร ท เวลา 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36 และ 48 ชวโมง แลวบนทกคาการดดกลนแสง วดคา pH ทเวลาดงกลาว แลวบนทกคา pH และวดการยบยงเแบคทเรยอนดเคเตอรทเวลา 12, 24, 36 และ 48 ชวโมง โดยท าการป นเหวยงแยกเซลลทความเรว 8000 รอบ/นาทเปนเวลา 15 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส น าสารทป นไดกรองผานแผนเยอขนาด 0.45 ไมโครเมตร แลวน าไปทดสอบฤทธการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร น าเชอทดสอบผสมลงในอาหารกงแขง แลวเททบบนผวหนาอาหาร MRS ตงทงไวใหอาหารแขง ท าการเจาะหลมขนาดเสนผาศนยกลางประมาณ 4 มลลเมตร จากนนปเปต CFS ปรมาตร 70 ไมโครลตร หยด CFS ทตองการทดสอบลงไป แลวน าไปบมทอณหภมทเหมาะสม เปนเวลา 24 ชวโมง วดขนาดเสนผานศนยกลางของการยบยง เพอดความสามารถในการยบยง พบวาเชอทคดเลอกไดนนทงหมดแยกไดจากทอณหภม 8 องศาเซลเซยส พบวาเชอทกไอโซเลทเจรญไดเรวทอณหภม 30 องศาเซลเซยส แตแสดงการเจรญไดสงทอณหภม 25 องศาเซลเซยสเมอบมเปนเวลา 48 ชวโมง และคา pH ทวดไดมความสมพนธกบคาการเจรญของเชอ คอ เมอการเจรญของเชอมากขน คาpH กลดลงอยางสมพนธกน เมอเทยบผลการทดลองของ Min Jung Kim et al, 2012 พบวาเมอมการเลยงเชอแบคทเรยแลคตก แบคทเรยแลคตกผลตกรดเปน primary metabolite ท าใหระยะแรกของ growth phase ซงจ านวนเชอเพมสง คา pH กลดต าลงโดยสมพนธกน

63

นอกจากน ฤทธการยบยงเชอแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 พบวาการเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทอณหภม 20 และ 25 องศาเซลเซยส สามารถให CFS ทมความกวางวงใสสงทสด และประสทธภาพในการยบยงลดลงเมอเลยงทอณหภมสงกวา หรอต ากวาอณหภมทเหมาะสม แมวาการเลยงทอณหภม 30 องศาเซลเซยสท าใหคา pH ใน CFS ต ากวาการเลยงทอณหภมอนๆ แตประสทธภาพในการยบยงเชอแบคทเรยไมไดมประสทธภาพทดข น ซงแสดงวา ฤทธ การยบยงของสารกนเสยชวภาพทผลตไดหลกๆ ไมไดมาจากกรดเพยงอยางเดยว ซงสารกนเสยทผลตออกมาอาจเปน diacetyl, hydrogen peroxide, CO2 หรอ แบคเทอรโอซน (Daeschel 1989) และพบวาสารกนเสยทผลตได มฤทธสงตงแต ชวโมงท 24 ส าหรบชวโมงท 36 และ 48 มฤทธเพมกวาเดมเพยงเลกนอยเทานน

ส าหรบการทดสอบฤทธการยบยงเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 นนพบวา ทกไอโซเลททคดเลอกมานน พบการยบยงเชอทช วโมงท 24 ซงขนาดวงใสกวางจนไมสามารถวดคาได และ ไมเหนวงใสอกครงในชวโมงท 36 และ 48 และจากขอมลการคดเลอกสภาวะของแบคทเรยแลคตก อณหภมและเวลาทเหมาะสม จงคดเลอกไอโซเลท SQL 10104 เลยงทอณหภม 25 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง และท าการศกษาสมบตของสารกนเสยชวภาพตอไป

สมบตการทนอณหภมสง ท าโดยน า CFS แชทอณหภม 63, 80, 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท และ เขาเครอง autoclave ท 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาทกอนน าไปทดสอบโดยวธ Agar well diffusion กบเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 พบวา CFS ทแชทอณหภม 63, 80 และ 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ประสทธภาพของการยบยงเชอเมอเทยบกบตวควบคม (ทไมผานการแชทอณหภมใดๆ) ไมลดลง แต CFS ทผานความรอน 121 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท ประสทธภาพในการยบยงลดลงไป 20 เปอรเซนต (เมอเทยบขนาดวงใสของ CFS ทผานอณหภม กบ CFS ของตวควบคม) ซงแสดงวาสารกนเสยชวภาพทผลตไดคอนขางทนอณหภมสง

ผลของพเอชตอการยบยง ท าโดย น า CFS ชดท 2 ทไมไดปรบ pH (pH 5.98) และ CFS ทน ามาปรบ pH เปน 6.5 แลวจงน าไปทดสอบโดยวธ Agar well diffusion กบเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 พบวา CFS ทงทผานการปรบ และไมปรบ pH ใหผลทไมแตกตาง (ขนาดของวงใส 20.55 และ 20.67 ตามล าดบ) แสดงวาการยบยงเชอของแบคทเรยทผลตได ไมไดมาจากกรดเปนสารหลกเพยงอยางเดยว

และเมอน า CFS ผสมกบเอนไซมยอยโปรตน ไดแก protease, protenase K, trypsin และ alpha-chymotrypsin โดยใหความเขมขนสดทายเปน 1 มก/มล บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 1 ชวโมง น า CFS ดงกลาวมาทดสอบการยบยงแบคทเรย โดยวธ agar well diffusion assay เปรยบเทยบผลกบ CFS ทไมไดผานการผสมดวยเอนไซมมาทดสอบ Agar well diffusion กบเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 พบวา ประสทธภาพของ CFS ถกยบยง เมอน าไปทรทดวย protease, protenase K และ alpha-chymotrypsin ยกเวน CFS ทผานการผสมดวย trypsin ทยงมประสทธภาพในการยบยงเชอกอโรคอย แตขนาดของวงใสเลก เมอเทยบกบ CFS ทไมไดผานการผสม

64

ดวยเอนไซม (ขนาดของวงใส 18.08 และ 20.48 มลลเมตร ตามล าดบ) แสดงวาการยบยงเชอทเกดขน นามาจากสารออกฤทธกลมโปรตน ซงอาจเปนแบคเทอรโอซน (Pilar et al, 2007)

การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาของเชอแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได ยงมการจดจ าแนกเชอในระดบสปชส โดยการตรวจสอบล าดบนวคลโอไทดของดเอนเอซงไดรบการเพมขยายโดยวธ 16S rRNA sequence analysis ซงการวเคราะหล าดบเบสดวยวธ 16S rRNA สามารถใชในการจดจ าแนกระดบสปชสไดถกตองมากทสด เนองจากเปนการจดจ าแนกในระดบโมเลกล และกรดนวคลอกทเปนองคประกอบในไรโบโซมชนด 16S ของเซลลโปรคารโอตเปนหนวยอนรกษสายพนธและมความคงตวสงมาก ล าดบเบสของนวคลโอไทดมการเปลยนแปลงไปนอยมากแมมการววฒนาการมานาน (Axelsson, 1998) แลวท าการประมวลผลดวยขอมลใน GenBank database โดยใช BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) จากนนน าขอมลทไดมาสราง Phylogenetic tree โดยใชโปรแกรม MEGA 4 ดงนน ผลการจดจ าแนกแบคทเรยแลคตกพบวา แบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 9ตรงกบ Carnobacterium divergens DSM 20623T ซงม %similarity เทากบ 100 % ซงตรงกบ Accesstion number คอ AB705304.1 จากนน น า CFS ไปใชในการยบยงเชอแบคทเรยในอาหารทะเลในระดบหองปฏบตการ โดยอาหารทะเลทใชในการทดลองครงนคอ กงขาว (Litopenaeus vannamei) โดยคดเลอกกง ทมขนาดประมาณ30-50 กรมตอตว โดยใชกงทปอกเปลอกผาหลงในการทดลอง ซงกอนทน ากงไปใชในการทดลอง ตองท าใหปลอดเชอจากสงแวดลอมกอนทน าไปใชกบเชอกอโรค ดวยการน ากงไปแชในสารละลายฟอมลดไฮด 3 เปอรเซนตเปนเวลา 3 นาท และน ากงไปลางฟอมลดไฮดดวยการแชใน NSS อก 10 ครง (เปนอยางนอย) (หสยานย, 2556) และน ากงปลอดเชอไปทดลองเพาะในจานเลยงเชอเพอทดสอบวากง sterile จรง และเตรยมเชอกอโรคคอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313 โดยน าไปเลยงในอาหาร TSB 5 มล. บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 ชวโมง และน าไปถายลงในฟลาสกทมอาหาร TSB 45 มล. บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เพอใหมเชอสทธประมาณ 107–108 CFU/mL จากนนน าเชอทเลยงไดไปบรรจในกง ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท มเชอสทธประมาณ 10-6 CFU/mL และมการนบเชอทงกอนและหลงลางกง เพอศกษาปรมาณของเชอทตดกบกง และทลางไปแลว น ากงทไดไปลางใน MRS broth (ชดควบคม) และ CFS ทไดจากการเพาะเลยงแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได เปนเวลา 10, 20 และ 30 นาท น ากงทผานการลาง ไปทดสอบประสทธภาพการยบยงเชอดวยการ น ากงไปเขาใน stomacher และเจอจางในน าเกลอ NSS และน าไปเลยงในอาหารเลยงเชอเพอศกษาจ านวนเชอกอโรคทยงเหลอรอด เทยบกบกงทยงไมไดผานการลาง และกงทลางดวย MRS (ชดควบคม) พบวากงทเตมเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 กอนลางมเชอประมาณ 5 log CFU/mL หลงจากผานการลางดวย MRS broth (ชดควบคม) และ CFS จ านวนเชอลดลงไปเหลอ 3 log CFU/mL ไมแตกตางกน แมระยะเวลาในการลางกง แตกตางกน แตจ านวนเชอทเหลอใกลเคยงกน ซงแสดงวา CFS ไมมผลในการยบยงเชอเมอเทยบกบตวควบคม แตจ านวนเชอท

65

ลดลงมาจากการทน ากงไปลางใน MRS broth (ควบคม) และ CFS ซงเชอทเกาะกงกหลดออกมาอยในสารละลาย แตในทางตรงกนขามกงทเตมเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 กอนลางกงมเชอประมาณ 6 log CFU/mL เมอน ากงไปลางใน MRS broth (ควบคม) พบวาเชอลดลงเหลอ 5 log CFU/mL แตเมอเทยบกบการน ากงไปลางใน CFS พบวา เชอลดลงเหลอ 3 log CFU/mL ลดลงมากกวาการลางใน MRS ถง 2 log CFU/mL แสดงวา CFS มผลในการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ในกง แมวาลางกงเปนเวลา 10, 20 และ 30 นาท ผลการยบยงเชอแตกตางกนไมมาก (3.61, 3.58 และ 3.56 log CFU/mL)

66

บทท 5

สรปผลการทดลองและขอเสนอแนะ การศกษาในครงน เพอหาสารกนเสยชวภาพทผลตจากแบคทเรยแลคตกทนอณภมต าเพอใชในการยบยงเชอกอโรคในอาหารทะเลในระดบหองปฏบตการ โดยท าการเกบตวอยางอาหารทะเลแชเยนจากสถานทตางๆเพอน ามาแยกแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเลแชเยน จากการศกษาตวอยางอาหารทะเลแชเยนทง 14 ตวอยาง และน ามาแยกทการบม 2 อณหภมทแตกตางกนคอ ท 8 องศาเซลเซยสและ 35 องศาเซลเซยส โดยคดเลอกไอโซเลททเปนแบคทเรยแลคตก สามารถแยกแบคทเรยแลคตกได 74 ไอโซเลท (52 ไอโซเลทแยกจากการบมท 35 องศาเซลเซยส และ 22 ไอโซเลทแยกจากการบมท 8 องศาเซลเซยส) เพอท าการทดสอบการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313) ดวยวธ Agar spot assay พบวามเชอแบคทเรยแลคตก 9 ไอโซเลททสามารถยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร ไดทงหมด และพบวาม 17 ไอโซเลททสามารถยบยงแบคทเรย V. parahaemolyticus AAHRC 1 และ L. monocytogenes ATCC 15313 ได และไดรบความอนเคราะหเชอแบคทเรยแลคตกจากนางสาว นชร ตนตสวรรณโณ จ านวน 53 ไอโซเลท พบวาสามารถยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร V. parahaemolyticus AAHRC 1 ได 52 ไอโซเลท และ สามารถยบยง L. monocytogenes ATCC 15313 ได 31 ไอโซเลท ท าการทดสอบการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรดวยวธ Agar well diffusion โดยการน าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดไปเลยงใน MRS broth ทอณหภม 8 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5 วน ป นเหวยงแยกเซลลออก กรองใหปราศจากเชอ โดยใชกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมโครเมตร ไดเปน crude filtrate supernatant (CFS) พบวามแบคทเรยแลคตกทยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรอยางนอย 1 สายพนธ มทงหมด 22 ไอโซเลท และพบวามเพยง 8 ไอโซเลทเทานน ทสามารถยบยงไดทง Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 และ Listeria monocytogenes ATCC 15313

น าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได 6 ไอโซเลท ไดแก SHL 25103, SHL 25104, SQL 25104, HYL 25103, SQL 10104 และ SQL 10107 มาศกษาอณหภมทเหมาะสมตอการผลตสารกนเสยชวภาพทมการแปรผนอณหภมท 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส พบวาแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดทกไอโซเลท มคา pH ในอาหารเลยงเชอลดลง ซงเชอทเลยงทอณหภม 30 องศาเซลเซยสทกไอโซเลทนน มคา pH ในอาหารเลยงเชอลดลงเรวมากทสด แตในขณะเดยวกน พบวาเชอทคดเลอกทกไอโซเลทจะเจรญไดเรวเมอเลยงทอณหภม 30 องศาเซลเซยส แตจะเขาสระยะ stationary phase เรวเชนกน และเชอทกไอโซเลทจะเจรญไดดทสดทอณหภม 25 องศาเซลเซยส ยกเวนไอโซเลท SQL 10104 ทสามารถเจรญไดดท 20 และ 25 องศาเซลเซยส

67

และเมอทดสอบฤทธการยบยงตอแบคทเรยอนดเคเตอร พบวาแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25103 ทเจรญทอณหภม 15, 20, 25 และ 30 องศาเซลเซยส ไมพบฤทธยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 แตแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SHL 25104 และ SQL 25104 ไมพบฤทธยบยง แบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 เมอเจรญเปนเวลา 12 ชวโมงทกอณหภมทเพาะเลยง แตจะพบฤทธการยบยงตงแตชวโมงท 24 เปนตนไป ยกเวนเชอทเจรญทอณหภม 30 องศาเซลเซยส ไมพบฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ในขณะทไอโซเลท HYL25103, SQL10104 และ SQL10107 พบฤทธการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ตงแตการเจรญชวโมงท 12 ของการเพาะเลยงทกอณหภม และผลของการยบยงเชอพบวา เชอทเจรญทอณหภม 20 และ 25 องศาเซลเซยส แสดงผลการยบยงทไมแตกตางกน ส าหรบฤทธการยบยง Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 นน พบวาทกไอโซเลทของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได แสดงฤทธการยบยงท ชวโมงท 24 แตไมสามารถวดคาไดเนองจากมความกวางชองวงใสเกน 35 มลลเมตร แตในชวโมงท 36 และ 48 ไมพบฤทธการยบยง น าแบคทเรยแลคตกทคดเลอกไดไอโซเลท SQL 10104 เพาะเลยงในอาหาร MRS บมทอณหภม 25 องศาเซลเซยสเปนเวลา 24 ชวโมง แลวน า CFS มาศกษาสมบตของสารกนเสยชวภาพทคดเลอกไดโดยการทดสอบกบอณหภม พเอช และเอนไซมพบวา เมอน า CFS ไปท าใหมอณหภมสงขนท 63, 80 และ 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาทนน ฤทธการยบยงแบคทเรยไมมการเปลยนแปลงเมอเทยบกบตวควบคม แต CFS ทอณหภม 121 องศาเซลเซยสเวลา 15 นาท มฤทธการยบยงเแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ลดลง ตามขนาดของวงใสทเกดขน และเมอน า CFS ทมการปรบ pH เปน 6.5 เทยบกบ CFS ทไมมการปรบ pH พบวาไมมความแตกตางของการยบยงแบคทเรย และCFS ทผานการ บมดวยเอนไซมยอยโปรตน ไดแก proteinase K, trypsin protease และ alpha-chymotrypsin ชนดตางๆ ไมมฤทธในการยบยงแบคทเรย Listeria monocytogenes ATCC 15313 ยกเวน CFS ทผานการ บมดวยเอนไซม trypsin เทานนทสามารถแสดงฤทธการยบยงได แตมประสทธภาพการยบยงทลดลง

ท าการจดจ าแนกสายพนธแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL10104 ดวยวธวธ 16S rRNA sequence analysis แลวท าการประมวลผลดวยขอมลใน GenBank database โดยใช BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) พบวาแบคทเรยแลคตกไอโซเลท SQL 10104 ตรงกบ Carnobacterium divergens DSM 20263T ซงม %similarity เทากบ 100 % ซงตรงกบ Accesstion number คอ AB 705304.1

จากนนน า CFS ของแบคทเรย Carnobacterium divergens SQL10104 ทคดเลอกไดมาศกษาฤทธในการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอรในอาหารทะเล ไดแกกงขาว เหตผลทเลอกใชกงขาวเปนตวแทนอาหารทะเลเพราะ มสตวเศรษฐกจทมการสงออกไปตางประเทศ และมรายงานกลาวถงเชอทมกปนเปอนในกง โดยน ากงขาวมาท าใหปลอดเชอจากสงแวดลอม และเตมแบคทเรยอนดเคเตอร เพอทจะทดสอบฤทธการยบยงโดยใช CFS ของแบคทเรยแลคตกทคดเลอกได และใช MRS เปนชด

68

ควบคม พบวาเมอแชกงใน CFS พบวา เชอกอโรคในกงลดลง โดยกงทมเชอ Vibrio parahaemolyticus AAHRC 1 เมอแชใน MRS และใน CFS พบวา เชอลดลงประมาณ 2 log CFU/mL ส าหรบกงทมเชอ Listeria monocytogenes ATCC 15313 เมอแชลงใน MRS เชอลดลง 1 log CFU/mL แตเมอแชลงใน CFS เชอลดลงถง 3 log CFU/mL

ขอเสนอแนะ เมอท าการทดลองตอไปในอนาคต ควรเพมการทดลองเพอทดสอบความปลอดภยของ CFS ทจะน าไปใช และหาวธเพมขดความสามารถในการยบยงการแบคทเรยอนดเคเตอร

69

เอกสารอางอง บษกร อตรภชาต. 2550. จลชววทยาทางอาหาร. โครงการการสงเสรมการผลตเอกสารวชาการ ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยทกษณ. 451 น. ปนมณขวญเมอง. 2546.การแยกเชอแบคทเรยกรดแลคตกจากตวอยางแหนมของประเทศไทยเพอ ใชเปนกลาเชอ. วทยานพนธปรญญาเอก.มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. ณรงค นยมวทย และ อญชนย อทยพฒนาชพ. 2538. วทยาศาสตรการประกอบอาหาร. มหาวทยาลย เกษตรศาสตร.กรงเทพมหานคร วลาวณย เจรญจระตระกล. 2539. จลนทรยทมความส าคญดานอาหาร. กรงเทพมหานคร:โอเดยนสโตร. 257 น. วลาวณย เจรญจระตระกล.2537. การเนาเสยของอาหารเนองจากจลนทรย. โครงการสนบสนนของ คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร. ศวาพร ศวเวชช.2535 วตถเจอปนอาหารในผลตภณฑอาหาร. คณะอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 328 น. สมณฑา วฒนสนธ. 2545. จลชววทยาทางอาหาร. กรงเทพมหานคร: โรงพมพมหาวทยาลยธรรมศาสตร. 470 น. สมใจ ศรโภค, ประวต องประภาพรชย, ขจนาฏ โพธเวชกล และอรอนงค พรงศลกะ. 2550. การคดเลอก และการจดจ าแนกชนดแบคทเรยแลคตกทสรางแบคเทอรโอซนไดจากอาหารหมกและ การศกษาคณสมบตเบองตนของแบคเทอรโอซนทผลตได. วารสารวทยาศาสตรมหาวทยาลย ศรนครนทรวโรฒ. 23 (2):92–114. หสยาน บนมะแอ. 2556. ผลของอณหภมและคลอรนของการอยรอดของเชอ Vibrio vulnificus. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยสงขลานครนทร อจฉรา เพม. 2549. แบคทเรยแลคตก. โครงการต าราวชาการราชภฏเฉลมพระเกยรตเนองในวโรกาส พระบาทสมเดจพระเจาอยหวครองสรราชสมบตรครบ 60 ป. คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏสงขลา.179 น. อรวนท เลาหรชตนนท. 2532. สารกนเสยในอาหารจากแบคทเรยกลมสรางกรดแลคตก. อาหาร. 99 (3): 202-206. อรอนงค พรงศลกะ. 2550. แบคเทอรโอซนทสรางจากแบคทเรยแลคตก. วารสารวทยาศาสตร มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ. 23(2) :145–160.

70

Anastasiadou, S., Papagianni, M., Filiousis.,Ambrosiadis, I. and Koidis, p. 2008. Growth and Metabolism of a meat isolated strain of Pediococcus pentosaceusin submerged Fermentation purification, characterization and properties of the produced pediocin SM-1.Enzyme and Microbial Technology.43 : 448-454. Andrighetto, C., Angiolella L., Massimiliano F., Angelo G., Chiara C. and Giuseppe A. 2009. Lactic acid bacteria biodiversity in Italian marinated seafood salad and their interactions on the growth of Listeria monocytogenes. Food Control. 20 (5): 462-468. Audenaert, K., Klaas D., Kathy M. T. R., Peter V. and Geert H. 2010. Diversity of lactic acid bacteria from modified atmosphere packaged sliced cooked meat products at sell-by date assessed by PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Food Microbiology. 27 (1): 8-12. Axelsson, L. 1993. Lactic Acid Bacteria : Classification and physiology. In Lactic Acid Bacteria (Salminen, S. and Von Wright, A., eds.) p. 1-64. Marcel Dekker. New York. Casla, D, T. Requena and R. Gomez. 1996. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria from goat’s milk and artisanelcheeses : characteristics of a bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus IFPL105.Journal of Applied Bacteriology.81 : 35-41. Charernjiratrakul, W. 2000. Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from southern of Thailand traditional fermented food. Songklanakarin.Journal of Science and Technology, 22(2) : 177–189. Daeschel, M.A. 1989. Antimicrobial substance from lactic acid bacteria for use as food preservatives.Food Science Nutrition. 42(2), 164-167 Dellaglio, F., L. M. T. Dicks, and S. Torriani. 1995. The genus Leuconostoc, p. 235-278. In B. J. B. W. a. W. H. Holzapfel (ed.), The Genera of Lactic Acid Bacteria, vol. 2. Blackie Academic & Professional, London. Delves-Broughton, J. 1990. Nisin and Its Use as Food Preservative. International Journal of Dairy Technology. 43(3) : 73-76. Devriese, L. A. And B. Pot. 1995. The genus Enterococcus, pp. 327-367. In B.J. B. Wood and W. H. Holzapfel (eds.).The Genera of Lactic Acid Bacteria. Chapman and Hall, Glasgow.Eijsink, V. G. H., Skeie, M., Middelhoven, P. H., Bruberg, M. B. And Nes, I. F.

71

1998. Comparative studies of class IIabacteriocins of lactic acid bacteria. Applied and Enviromenthal Microbiology. 64: 3275-3281. Einarsson, H. and Lauzon, H. 1994. Biopreservation of Brined Shrimp (Pandalus borealis) by Bacteriocin from Lactic Acid Bacteria. Applied and Enviromental Microbiology. 61 (2): 669-676. Ercolini, D, F. Russo, A. Nasi, P. Ferranti, and F. Villani. 2009. Mesophilic and Psychrotrophic Bacteria from Meat and Their Spoilage Potential In Vitro and in Beef. Applied and Environmental Microbiology. 75 (7):1990-2001. Gao, Y, Jia, S, Gao, Q. and Tan, Z. 2010. A novel bacteriocin with a broad inhibitory Spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21: 76-81. Garneau, Sylvie, Nathaniel I. Martin, and John C. Vederas.Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria.Biochimie 84 (5-6):577-592. Guerrieri, E., Simona N., Patrizia M., Carla S., Ramona I., Immacolata A., and Moreno B. 2009. Use of lactic acid bacteria (LAB) biofilms for the control of Listeria monocytogenes in a small-scale model. Food Control 20 (9):861-865. Hardie, J. M. And R. A. Whiley. 1995. The genus Streptococcus, pp. 75-124. In B.J. B. Wood and W. H. Holzapfel( eds. ). The Genera of Lactic Acid Bacteria. Chapman and Hall, Glasgow.Huss, H.H. 1995. Quality and quality changes in fresh fish. In Huss, H.H. (Ed.), FAO fishing technical paper 348 (pp. 51). Rome, Italy: FAO Izquierdo, E., Eric Marchioni, Dalal A., Claude H., and Saad E. 2009.Smearing of soft cheese with Enterococcus faecium WHE 81, a multi-bacteriocin producer, against Listeria monocytogenes. Food Microbiology 26 (1):16-20. Klaenhammer, T. R. 1993. Genetics of Bacteriocins produced by lactic acid bacteria.FEMS Microbiology Reviews. 12: 39-68. Lindgren, S. E., and Dobrogosz, W. J. 1990.Antagonistic activities of lactic bacteria in food and feed fermentation. FEMS Microbiology Reviews, 87, 149-164.

72

Magnusson J, Strom K, Roos S, Sjogren J. and Schnurer J. 2003. Broad and complex Antifungal activity amoung environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters. 219: 129-135. Matamoros, S, F. Leroi, M. Cardinal, F. Gigout, F. K. Chadli, J. Cornet, H. Prvost, and M. F. Pilet. 2009. Psychrotrophic lactic acid bacteria used to improve the safety and quality of vacuum-packaged cooked and peeled tropical shrimp and cold-smoked salmon. Journal of Food Protection. 72 (2):365-374. Matamoros, S, M. F. Pilet, F. Gigout, H. Prvost, and F. Leroi. 2009. Selection and evaluation of seafood-borne psychrotrophic lactic acid bacteria as inhibitors of pathogenic and spoilage bacteria. Food Microbiology. 26 (6):638-644. Nilsson L, Gram L. and Huss H.H. 1999. Growth control of Listeria monocytogenes on cold- smoked salmon using a competitive lactic acid bacteria flora. Journal of Food Protection.62pp. 336–342. Pilar, C. M. Samuel, A., and Karola, B. 2007. Current Applications and Future Trends of Lactic Acid Bacteria and their Bacteriocins for the Biopreservation of Aquatic Food Produtcs. Food Bioprocess Technol. 1: 43-63 Raghunath P, Iddya K, and Indrani K. 2009.Improved isolation and detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood using a new enrichment broth.International Journal of Food Microbiology. 129 (2):200-203. Schnurer J. and Magnusson J. 2005.Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives.Trends in Food Science & Technology. 16 (1-3): 70-78. Stiles, M. E. And W. H. Holzapfel.1997.Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy.International Journal of Food Microbiology.36 : 1-29. Teuber, M. 1995. The genus Lactococcuss, pp. 134-173. In B.J. B. Wood and W. H. Holzapfel

(eds.). The Genera of Lactic Acid Bacteria. Chapman and Hall, Glasgow. Vihavainen, E, and J. Bjorkroth. 2009. Leuconostoc gasicomitatum, an ubiquitous spoilage lactic acid bacterium. Archives of Food Hygiene. 60 (2):52-55.

72

ภาคผนวก

73

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเชอ

1. De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS agar)

Proteose Peptone 10 กรม Beat extract 10 กรม Yeast extract 5 กรม Dextrose 20 กรม Tween 80 1 กรม Ammonium citrate 2 กรม Sodium acetate 5 กรม Magnesium sulfate 0.10 กรม Manganese sulfate 0.05 กรม Agar 15 กรม เตรยมโดยละลายอาหารเพาะเชอแขง MRS 70 กรม ในน ากลน 1,000

มลลลตร แลวท าใหปราศจากเชอดวยเครองนงฆาเชอความดนไอน าทความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท 2. De Man, Rogosa and Sharpe broth (MRS broth)

Proteose Peptone 10 กรม Beat extract 10 กรม Yeast extract 5 กรม Dextrose 20 กรม Tween 80 1 กรม Ammonium citrate 2 กรม Sodium acetate 5 กรม Magnesium sulfate 0.10 กรม Manganese sulfate 0.05 กรม เตรยมโดยละลายอาหารเพาะเชอเหลวMRS 55 กรม ในน ากลน 1,000

มลลลตร แลวท าใหปราศจากเชอดวยเครองนงฆาเชอความดนไอน าทความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

74

3. Brain Heart Infusion broth (BHI) Calf brain infusion solid 12.5 กรม Beef heart infusion solid 5 กรม Proteose peptone 10 กรม Glucose 2 กรม Sodium chloride 5 กรม Di-sodium phosphate 2.5 กรม เตรยมโดยละลายอาหารเพาะเชอเหลว BHI 37 กรม ในน ากลน 1,000

มลลลตร แลวท าใหปราศจากเชอดวยเครองนงฆาเชอความดนไอน าทความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาทเซลเซยส 4. Trypticase Soy agar (TSA)

Casein peptone 15 กรม Soymeal peptone 5 กรม Sodium Chloride 5 กรม Agar 15 กรม เตรยมโดยละลายอาหารเพาะเชอแขง TSA 30.0 กรม ในน ากลน 1,000 แลว

ท าใหปราศจากเชอดวยเครองนงฆาเชอความดนไอน าทความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท 5. Trypticase Soy broth (TSB)

Casein peptone 17 กรม Soymeal peptone 3 กรม Glucose 2.5 กรม Sodium chloride 5 กรม di-Potassium hydrogen phosphate 2.5 กรม เตรยมโดยละลายอาหารเพาะเชอเหลว TSB 30 กรม ในน ากลน 1,000

มลลลตร แลวท าใหปราศจากเชอดวยเครองนงฆาเชอความดนไอน าทความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

75

6. Tryptone broth tryptone 10.0 กรม Sodium chloride 8.75 กรม

ละลายสารในน ากลน 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดทดลองหลอดละ 9 มลลลตร หรอขวดสารละลายเจอจาง 225 มลลลตร มลลลตร แลวท าใหปราศจากเชอดวยเครองนงฆาเชอความดนไอน าทความดนไอน า 15 ปอนดตอตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

76

ภาคผนวก ข

ตารางและขอมลผลการทดลอง

เกบตวอยางอาหารทะเลแชเยนจากเขตเทศบาลนครหาดใหญมาท าการแยกเชอแบคทเรยแล

คตก โดยใชตวอยางในการแยกครงลาสด 14 ตวอยาง โดยใหรหสตวอยางทงหมดเปนพยญชนะ

ภาษาองกฤษตวพมพใหญ ดงน

A= ปลาลนหมา ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางโดยการตดชนเนอปลา

B= ปลาแซลมอน ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางโดยการตดชนเนอปลา

C= ปลาสกน ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางโดยการตดชนเนอปลา

D= กงกามกราม ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางบรเวณหว เปลอก และเนอ

กง

E= ปลาอนทรย ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางโดยการตดชนเนอปลา

F= ปลากะพงแดง ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางโดยการตดชนเนอปลา

G= ปลาทราย ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางโดยการตดชนเนอปลา

H= หอยหวาน ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ เกบตวอยางเฉพาะเนอหอย

I= หมกกลวย ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญเกบตวอยางบรเวณหนวด เนอ และครบ

J= ปลาไข ซอทหางเทสโกโลตส สาขาหาดใหญ ใชปลาทงตวเปนตวอยาง

K= ปลาท ซอทตลาดนดเทศบาลเมองนราธวาส ใชปลาทงตวเปนตวอยาง

L= ปลาโอ ซอทตลาดนดเทศบาลเมองนราธวาส ใชปลาทงตวเปนตวอยาง

M= หมกหอม ซอทตลาดนดเทศบาลเมองนราธวาส ใชปลาทงตวเปนตวอยาง

N= กงขาว ซอทตลาดนดเทศบาลเมองนราธวาส ใชปลาทงตวเปนตวอยาง

77

การลงรหสเชอ มการแบงออกเปน 3 ตอน คอ พยญชนะภาษาองกฤษ หมายถง เชอไดมาจากตวอยางอาหารทะเลใด ตวเลขตวแรก หมายถง เชอทไดมา บมทอณหภมใด (1= 8 องศาเซลเซยส, 2= 35 องศาเซลเซยส) ตวเลขสองตวสดทาย หมายถง เชอนนเปนเชอล าดบทเทาใดจากตวอยางนน ตวอยาง B 201 หมายถง เชอตวนแยกไดเปนล าดบท 1 จากการบมท 35 องศาเซลเซยส จากตวอยางปลาแซลมอน ตารางท 1 ผลการแยกเชอแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเล บนอาหาร MRS ทเตม CaCO3 1.0 % และ Bromcresol purple 0.004% บมท 35 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 วน ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต A 201 A 202 A 203 A 204 A 205 A 206 A 207 A 208 A 209 A 210

+ + - + + + + + + +

+

กลมร กระจดกระจาย

Discard Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard

B 201 B 202 B 203 B 204 B 205 B 206 B 207 B 208

- - + + - + + +

+ + +

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

แทง กระจดกระจาย

Discard Discard

Discard Discard Discard

78

ตารางท 1 (ตอ)

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต B 209 B 210 C 201 C 202 C 203 C 204 C 205 C 206 E 201 E 202 E 203 E 204 E 205 E 206 E 207 E 208 F 201 F 202 F 203 F 204 G 201 G 202 G 203 G 204 G 205 H 201 H 202 H 203 H 204

+ + + + - - - - - + + + + + + - + - - - - - - - - - - - -

+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

แทง กระจดกระจาย

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย กลมร กระจดกระจาย กลมร กระจดกระจาย กลมร กระจดกระจาย

กลมร เปนสาย กลมร เปนสาย

แทง กระจดกระจาย กลมร เสนสาย กลมร เสนสาย

แทง กระจดกระจาย

Discard Discard Discard Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard

Discard

79

ตารางท 1 (ตอ)

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต H 205 H 206 H 207 H 208 H 209 H 210 H 211 I 201 I 202 I 203 J 201 J 202 J 203 J 204 J 205 J 206 J 207 J 208 K 201 K 202 K 203 K 204 L 201 L 201 L 203 L 204 L 205 L 206 L 207

- - - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - + + + - + + +

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

แทง เสนสาย แทง เสนสาย

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

กลม เสนสาย กลมร เสนสาย แทง เสนสาย แทง เสนสาย กลม เสนสาย กลม เสนสาย กลม เสนสาย

แทง กระจดกระจาย แทง เสนสาย แทง เสนสาย แทง เสนสาย

แทง เสนสาย แทง เสนสาย

แทง เสนสาย

Discard Discard

Discard Discard Discard

Discard Discard Discard

80

ตารางท 1 (ตอ)

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต L 208 L 209 L 210 L 211 L 212 L 213 L 214 L 215 L 216 M 201 M 201 M 203 M 204 M 205 M 206 M 207 M 208 N 201 N 202 N 203 N 204 N 205 N 206

+ + - - + + + + - + + + - - + - + - + + + + +

+ + + + + + +

แทง เสนสาย กลม กระจดกระจาย

กลม กระจดกระจาย

แทง เสนสาย แทง เสนสาย

กลม กระจดกระจาย

แทง เสนสาย

Discard Discard

Discard Discard Discard Discard

Discard Discard Discard

Discard

Discard

Discard Discard Discard Discard Discard

หมายเหต ไอโซเลทใดทใหผลคะตะเลสเปนบวก คดเชอทงทนท ไมทดสอบการยอมสแกรมตอ

81

ตารางท 2 ผลการแยกเชอแบคทเรยแลคตกจากอาหารทะเล บนอาหาร MRS ทเตม CaCO3 1.0 % และ Bromcresol purple 0.004% บมท 8 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 วน

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต A 101 A 102 A 103 A 104 A 105 A 106 A 107 A 108 A 109 A 110 B 101 B 102 B 103 B 104 B 105 B 106 B 107 C 101 C102 C 103 C 104 C 105 C 106 C 107 C108 D 101 D 102 D 103

+ + - + - + + + + - + + + + + + + + + - + + + + + + + +

+ + + +

กลม กระจดกระจาย

แทง กระจดกระจาย

กลมร กระจดกระจาย

กลม กระจดกระจาย

Discard Discard

Discard

Discard Discard Discard Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard

82

ตารางท 2 (ตอ)

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต D 104 D 105 D 106 D 107 D 108 D 109 D 110 E 101 E 102 E 103 E 104 E 105 F 101 F 102 F 103 F 104 F 105 G 101 G 102 H 101 H 102 H 103 H 104 I 101 I 102 I 103 I 104 J 101 J 102

+ + + + + + + + + + + + + + - + - - - + - + + + + + + + +

+ + + + + + +

แทง เสนสาย

กลมร กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard

Discard

Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard

83

ตารางท 2 (ตอ)

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต J 103 J 104 K 101 K 102 L 101 L 102 L 103 L 104 L 105 L 106 L 107 L 108 L 109 L 110 L 111 L 112 M 101 M 102 M 103 M 104 M 105 M 106 M 107 N 101 N 102 N 103 N 104 N 105

- + - - - - - + + + + + + - + + - - + + + + + + + + - +

+ + + + + + + + + +

แทง กระจดกระจาย

แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย แทง กระจดกระจาย

กลมร เสนสาย

แทง กระจดกระจาย แทงกระจดกระจาย

กลมร เสนสาย

Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard

Discard Discard

Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard Discard

Discard

84

ตารางท 2 (ตอ)

ไอโซเลท คะตะเลส แกรม รปราง หมายเหต N 106 N 107

+ -

+

แทง กระจดกระจาย

Discard

หมายเหต ไอโซเลทใดทใหผลคะตะเลสเปนบวก คดเชอทงทนท ไมทดสอบการยอมสแกรมตอ

85

ตารางท 3 ผลการยบยงเชอของแบคทเรยแลคตกทแยกไดจากอาหารทะเลตอแบคทเรย อนดเคเตอร

รหสเชอ ผลการยบยงตอแบคทเรยอนดเคเตอร (mm)

S. aureus E. coli V. parahaemolyticus L. monocytogenes A 203 B 201 B 202 B 205 C 203 C 204 C 205 C 206 D 205 D 207 E 201 E 208 F 202 F 203 F 204 G 201 G 202 G 203 G 204 G 205 H 201 H 202 H 203 H 204 H 205

12.20 12.85 14.25 13.00 15.25 10.10 12.05 9.40 13.70 12.65 11.15 15.50

N 11.90 12.00 13.00 12.85 10.50

N N N

14.60 9.25 11.50 14.25

14.10 N

12.15 11.50 13.35 12.25 18.05

N 11.05 12.90

N 12.20 13.05

N N

12.50 12.75

N 12.10

N 15.05

N 13.05

N N

N N

10.20 N N

8.50 8.60 N N

11.00 10.05 12.25 14.00

N 11.15 9.90 N

11.25 11.50

N 11.10

N N N N

N 10.00

N 11.25

N N

10.20 8.70 10.25

N N

13.10 15.80 10.10

N N

11.20 10.10 11.10

N 12.45 11.50 8.65 N

12.25

86

ตารางท 3 (ตอ)

code ผลการยบยงตอแบคทเรยอนดเคเตอร (mm)

S. aureus E. coli V. parahaemolyticus L. monocytogenes H 206 H 207 H 208 H 209 H 210 H 211 I 201 I 202 I 203 J 201 J 202 J 203 J 204 J 205 J 206 J 207 J 208 K 201 K 204 L 204 L 210 L 211 L 216 M 204 M 205

13.05 N N

13.50 N

12.50 N

11.50 12.45 15.25 8.50 N N

11.90 11.25

N N

12.50 13.35 11.25 14.80 13.10

N 15.50

N

14.05 10.10 16.10 12.90

N 13.20 11.05 11.10 12.20 13.10

N 11.80 12.20 12.30

N 13.10 13.40 14.10 12.10 14.45

N 15.55 12.35 11.10 11.20

N N

13.10 12.00 6.55 N N N

12.15 13.35

N 11.20

N N N N

9.45 12.40 11.55

N 13.10

N N

13.15 N

9.05 7.75 N N N

10.35 11.00 10.20 13.10 12.25 7.25 12.10 10.20 11.20

N 10.05

N 11.40 10.25 9.30 12.30 12.00 11.10 11.10 10.00

87

ตารางท 3 (ตอ)

code ผลการยบยงตอแบคทเรยอนดเคเตอร (mm)

S. aureus E. coli V. parahaemolyticus L. monocytogenes M 207 N 201 A 103 A 105 A 110 C 103 F 103 F 105 G 101 G 102 H 101 H 103 H 104 J 103 K 101 K 102 L 101 L 102 L 103 L 110 M 101 M 102 N 104 N 107

13.13 12.25

N 12.35 11.25 16.20 13.45 12.80

N N

11.50 10.20 11.80

N 13.00 12.45 14.25 18.50 13.15 11.15 14.80

N 14.20 12.10

N 11.25 12.10

N 12.55 19.00 12.45 14.50

N 14.80

N N

12.90 11.00 14.25 12.25

N 12.50 11.35 12.25 11.25 13.45 14.80

N

12.15 12.15 11.35

N N

12.05 13.15

N N

12.10 8.70 9.15 N

19.40 N N

13.10 17.20

N 9.05 N N

13.15 N

11.20 N N

11.00 13.05 17.05

N 13.10 5.25 N N N

10.15 14.30 12.90 10.55

N 11.20 11.25

N 11.45 11.55

N N

N = ไมพบฤทธการยบยงแบคทเรยอนดเคเตอร

88

ประวตผเขยน

ชอ-สกล นายมฮมหมดรฎวาน สมานรตน รหสประจ าตวนกศกษา 5210220066 วฒการศกษา

วฒ

วทยาศาสตรบณฑต (จลชววทยา)

ชอสถาบน

มหาวทยาลยสงขลานครนทร

ปทส าเรจการศกษา

2552

ทนการศกษา (ทไดรบในระหวางการศกษา) ทนอดหนนการวจยจากบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร ประจ าปงบประมาณ 2552 ทนผชวยสอน (ประจ าปการศกษา 2553) ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร ทนอดหนนการวจย มหาวทยาลยสงขลานครนทร ประเภททวไป ประจ าป 2553

สญญาเลขท SCI530142S

การตพมพเผยแพรผลงาน

มฮมหมดรฎวาน สมานรตน,วลาวณย เจรญจระตระกล, และปรยานช บวรเรองโรจน. 2557. การยบยงแบคทเรยของสารกนเสยชวภาพทผลตจากแบคทเรยแลคตกทน อณหภมต า. การประชมวชาการระดบชาต มหาวทยาลยราชภฏภเกต “บรณาการสหวทยาการงานวจยสมาตรฐานสากล” 8 พฤษภาคม-9 พฤษภาคม 2557.