I. Вступ

A. Загальні відомості про каллізію пахучу.

B. Морфологічний та мікроскопічний опис сировини.

C. Хімічний склад:

1. БАР, вивчені на сьогодні

2. Недостатньо вивчені БАР.

3. Методи визначення БАР, обрані нами, та описані в літературі.

D. Препарати каллізії пахучої.

II. Огляд літератури

A. Дослідження хімічного складу соку каллізії пахучої.

B. Визначення полісахаридів, фенольних сполук, каротиноїдів в

сировині каллізії пахучої.

C. Дослідження вуглеводів соку каллізії пахучої.

D. Кількісне визначення танінів каллізії.

E. Поліфеноли та флавоноїди каллізії пахучої.

F. Визначення поліфенолів, ліпідів та вуглеводів соку каллізії пахучої.

III. Експериментальна частина

A. Мікро- та макроскопічне дослідження ЛРС каллізії пахучої.

B. Визначення оптимальних умов екстрагування ЛРС.

C. Якісне визначення вмісту дубильних речовин.

D. Якісне визначення вмісту відновлюючих цукрів.

E. Визначення кількісного вмісту дубильних речовин.

F. Визначення кількісного вмісту амінокислот.

G. Кількісне визначення карбонових кислот.

H. Кількісне і якісне дослідження вмісту флавоноїдів.

I. Кількісне і якісне дослідження вмісту оксикоричних кислот.

IV.Висновки

V. Додатки

VI. Список літератури.

Вступ

Мета виконання дипломної роботи: фармакогностичне дослідження каллізії

пахучої (Callisia fragrans Wood.) та розробка способів аналізу біологічно

активних речовин для визначення показників якості лікарської сировини.

Завдання: провести фітохімічне вивчення надземної та підземної частини

каллізії пахучої, розробити методики аналізу біологічно активних речовин в

сировині каллізії пахучої, провести порівняльний аналіз вмісту БАР в різних

органах висушеної та свіжої сировини каллізії пахучої, розробити проект

методів контролю якості на сировину каллізії пахучої.

Предмет дослідження: ідентифікація БАР надземної та підземної частини

каллізії пахучої, розробка методик аналізу БАР підземної та надземної частин

каллізії пахучої.

Загальні відомості про золотий вус

Каллізія пахуча (Callisia fragrans (Lindl.) Woods), відома в народній медицині,

як золотий вус, належить до родини коммелінових (Commelinaceae), яка

налічує 50 родів та 500 видів тропічних і субтропічних рослин. У 1840 році

вид був вперше описаний під назвою Spironema fragrans, а у 1932 році був

перейменований у Rectanthera fragrans. Видову назву рослині дав

R.E.Woodson у 1942 році. Ще один синонім - Tradescantia draceaenoides.

Назва роду Callisia Loefl.походить від грецького kallos– красивий і lis–лілія.

За іншими версіями, родова назва походить від латинських слів calleo–

мозолистий (через вузлувате стебло) та callis–доріжка, стежка (через те, що

бокові горизонтальні пагони розповзаються у різні боки), або від callum–

шкірястий (що точно характеризує листя). Золотий вус має рад народних

назв:жива коса, венерина коса, кукурузка, повзуча кукурузка, домашній

женьшень, далекосхідний вус, калісія, рослина-павук, китайський вус,

японський вус та ін.

Батьківщиною каллізії є Мексика, а також тропічні райони Центральної і

Південної Америки, де вона росте в якості грунтово-покривної рослини. У

дикому стані вона зростає у мінливо-вологих тропічних лісах Мексики,

півострова Юкатан, Гватемали, у південних штатах Америки (в Каліфорнії),

Китаї, Індії.

Опис рослини.

Callisia fragrans (Lindl.) Woods – це однодольна багаторічна травяниста

рослина заввишки від 70 до 150-200 см з пагонами двох типів. Основний

пагін – ортотропний (вертикальний), 20-90 см заввишки, у базальній частині

якого утворюються плагіотропні (горизонтальні або спадисті) пагони, які не

зовсім правильно називають вусами, з редукованими вкороченими товстими

лускоподібними листками. Пагін (вус) закінчується щільною розеткою

простих сидячих листків довжиною 5-10 см і шириною 2-3 см. Листки на

пагоні розміщені почергово. Листкова пластинка видовжено-еліптична,

ланцетовидна або довгасто-ланцетна, 20-30 см завдовжки і 5-6 см

завширшки, із загостреною верхівкою. Жилкування паралельне. Колір

листків світло-зелений, іноді по краю і середині з фіолетовим відтінком.

Корені – бульбоподібні. Квітки білі або з рожевим відтінком, дрібні, з трьома

пельстками і трьома тичинками, зібрані у пазухові суцвіття у вигляді простих

або подвійних завійок. Мають приємний тонкий слолодкуватий аромат, що

ледь нагадує своїм ніжним запахом гіацинт або конвалію. Наявність аромату

у квіток каллізії і визначило видову назву рослини – „пахуча”. Плоди –

локулоподібні тригніздні коробочки.

Каллізію пахучу іноді плутають з каллізією тендітною і дихоризандрою

букетоквітковою - двома близькими видами, що відносяться до сімейства

коммелінових і зовні схожі. Відрізнити їх можна за допомогою наступних

ознак: листки каллізії тендітної з верхньої сторони оксамитові, темно-

зеленого кольору з вузькими продольними сріблясто-білими смужками по

жилкам, колір нижньої сторони листа - від фіолетово-зеленого до

фіолетового; вся рослина коротко оксамитово опушене. У дихоризандри

букетоквіткової відсутні горизонтальні стебла, а головне (вертикальне)

щороку відмирає після цвітіння.

Морфологічний та мікроскопічний опис сировини

Сировина являє собою горизонтальні стебла, що складаються з 9-12 і більше

ланок циліндричної форми діаметром до 1 см. Допускається присутність

вертикальних олистнених стебел циліндричної форми діаметром до 3 см.

Горизонтальні стебла мають недорозвинені листки довжиною 1-3 см,

розташовані між ланками по спіралі, і закінчуються розетками молодих

листків довжиною до 5-6 см. Вертикальні стебла мають крупні прості

ланцетоподібні листки довжиною до 30 см, шириною до 6 см, зидячі,

загострені на кінцях. В місцях обриву листків видно залишки нитеподібних

жилок. Колір стебел - від світло-фіолетового до коричнево-фіолетового,

колір листків - зелений, на краю листкової пластинки є світло-зелена кайма.

Запах - слабкий характерний, смак водного витягу - нейтральний.

Встановлено, що епідерміс горизонтального стебла в основному складається

з тонкостінних багатокутових, видовжених клітин (побічні клітини дрібні, зі

слабко звивистими антикліальними стінками) і продихів тетрацитного

(тетраперигенного) типу, трихоми не виявлені. На поперечному перерізі

стебло має округлу форму; в ньому можна виділити покривну тканину, кору і

центральний циліндр. Покривна тканина (епідерміс) являє собою шар

тонкостінних клітин прямокутної форми. В центрі кори клітини більші і

зменшуються в напрямку до периферії. Ендодерма не виділяється. В

центральному циліндрі розрізняються склеренхіма, провідні пучки і

паренхіма. Клітини склеренхімі дрібні, багатогранної форми, товстостінні,

прилягають до кори і розташовуються в 1-2 шари по колу, чередуючись з

провідними пучками. Центральна частина центрального циліндра

складається з клітин паренхіми (багатогранні, товстостінні, щільно

розташовані). Клітини різних розмірів, поблизу пучків вони значно дрібніші.

Провідні пучки горизонтального стебла 2 типів. По периферії центрального

циліндра, чергуючись зі склеренхімою, розташовуються дрібні, закриті,

повні, колатеральні провідні пучки. В центральній частині серцевини

розташовуються закриті колатеральні пучки різних розмірів.

Для верхнього епідермісу листової пластинки характерні великі тонкостінні

клітини багатогранної форми, що тісно прилягають одна до одної. Продихи і

трихоми відсутні. Епідерма покрита товстим шаром кутикули. Нижній

епідерміс представлений багатогранними або прямокутними основними

клітинами з тонкими стінками, дрібнішими, ніж на верхньому епідермісі.

Продихи тетрацитного типу знаходяться в одній площині з епідермісом і

розташовані поперек листової пластини; побічні клітини менші, ніж основні

клітини, зі слабо звивистими стінками. Виявлені прості багаторядні 3-, 4-

клітинні волоски зі спавшимися клітинами. Будова листкової пластинки

ізолатерального типу; вона включає покривну тканину, мезофіл і провідні

пучки.

Для покривної тканини (епідерміса) характерні великі тонкостінні клітини,

розмір яких збільшується в довжину до центру листа. Вони містять рафіди та

іноді поодинокі голки. Встановлено, що кристалічні включення

представляють собою оксалат кальцію. Присутність останнього –

таксономічна ознака коммелінових.

В нижньому епідермісі – клітини тонкостінні, багатокутної форми, щільно

прилягаючі одна до одної. Мезофіл листка – губчастий, розташовується між

верхнім і нижнім епідермісом; складається з живих тонкостінних клітин

багатогранної форми з хлоропластами, між якими є невеликі міжклітинники.

Палісадний мезофіл не виділяється. В мезофілі розташовуються закриті,

колатеральні провідні пучки округлої або овальної форми, причому більш

дрібні чергуються з більшим пучками. Ксилема в них направлена в сторону

верхнього епідермісу, флоема – в сторону нижнього епідермісу.

В загальних рисах характер анатомічної будови вертикального стебла

повторює такий горизонтального стебла. Навідміну від епідермісу

горизонтального стебла основні клітини дрібніші, продихи зустрічаються

частіше, причому кількість провідних пучків більше.

В якості діагностичних ознак стебел каллізії духмяної варто виділити

продихи тетрацитного типу на епідермісі стебла і нижній стороні листків,

рафіди і голчасті кристали в епідермісі листка, наявність простих

багаторядних волосків.

Хімічний склад

БАР, достатньо вивчені сьогодні

За літературними даними у підземних органах каллізії містяться алкалоїди

(колхіцин, кофеїн) та фенольна сполука гідрохінон. У надземній частині

каллізії пахучої містяться флавоноїди (в листі 0,1 – 0,4%, у стеблах 0,2-0,6%),

дубильні речовини (в листі 0,1-0,4%, у стеблах 2,8%), полісахариди (2,7%),

алкалоїди (1,2%), сапоніни (17,15%), органічні кислоти (0,64%), каротиноїди,

аскорбінова кислота, вітаміни групи В, ферменти, пектинові речовини (до

17% від сухої маси), фітостероли, макро- та мікроелементи (калій, кальцій,

ванадій, марганець, залізо, кобальт, нікель, мідь, цинк, бром, галій, рубідій,

стронцій, цирконій, свинець, торій, уран, хром). Вміст кальцію – до 92 мг на

1 г висушених „колінець”(пагонів).

Раніше був вивчений склад нейтральних, гліко-і фосфоліпідів листя, пагонів

і стебел, домінуючими компонентами яких є

пальмітинова, лінолева, олеїнова і ліноленова кислоти; також встановлено

присутність каротиноіїдів (α-, β-каротини, неоксантин, антераксантин),

хлорофілів (a і b), аскорбінової кислоти і антоціанів. Із застосуванням методу

газової хроматографії ідентифіковані саліцилова, ванілінова і хлорогенова

кислоти, фітол, ванілін, біформен, сквален і бетулін.

Cьогодні вивченими за кількісним і якісним вмістом є поліфенольні сполуки,

полісахариди (отримані дані про відсотковий вміст полісахаридів, а саме:

водорозчинних полісахаридів, пектинових речовин, геміцелюлози А,

геміцелюлози Б), фенольні сполуки (є дані про кількісний і якісний вміст

флавоноїдів, кількісний вміст фенолкарбонових кислот), каротиноїди

(кількісний вміст).

Надостатньо вивчені БАР

Таким чином, недостатньо вивченими залишаються сапоніни, фітостероли,

ферменти, кількісний вміст аскорбінової кислот, вітамінів групи В, мікро- та

макроелементи.

Методи визначення БАР, обрані нами, та методи, описані в літературі

Оскільки калізія пахуча є перспективною сировиною для створення

нових лікарських препаратів…., нами вивчалися наступні групи БАР та

розроблялися способи їх аналізу, а саме:

- амінокислоти, був проведений аналіз на кількісний вміст суми

амінокислот в перерахунку на аланін методом абсорбційної

спектрофотометрії забарвлених сполук з нінгідрином в УФ-області

спектру. Наявні дані про те, що якісний і кількісний вміст амінокислот

досліджувався в Інституті загальної та ексериментальної біології

(Сибірський відділ, Росія) шляхом аналізу соку каллізії, очищеного від

ліпофільних речовин та протеїнів на ААА 339 аналізаторі (Чеська

республіка), в результаті виявлені 15 амінокислот у вільному стані, 14

були в зв’язаному, обраховані відсоткові вмісти.

- карбонові кислоти, був проведений аналіз кількісного вмісту

карбонових кислот в перерахунку на яблучну кислоту методом

кислотно-основного титрування 0,05 М розчину NaOH, індикатор –

фенолфталеїн.

- дубильні речовини, був проведений якісний та кількісний аналіз вмісту

дубильних речовин.

Ідентифікацію дубильних речовин проводили шляхом якісних реакцій

з 1% розчином желатину, а також з 1% розчином залізо-амонійних

галунів, причому за кольором продукту останньої реакції, та

встановили їх належність до групи конденсованих дубильних речовин.

Кількісне визначення дубильних речовин проводили методом

спектрофотометрії з реактивом Фоліна-Чіокалтеу з використанням

порошку голевого у перерахунку на пірогалол.

- відновлюючі цукри, був проведений якісний аналіз даної групи БАР, а

саме наявність відновлюючих цукрів ми встановили якісною реакцією

з мідно-тартратним реактивом.

- флавоноїди, був проведений якісний та кількісний аналіз вмісту

кемпферолу та кверцетину, в окремих видах сировини, методом ВЕРХ.

- оксикоричні кислоти, був проведений якісний та кількісний аналіз

вмісту кавової та хлорогенової кислоти, в окремих видах сировини,

методом ВЕРХ..

Відомі дані про дослідження фенолокислот, флавоноїдів методом ВЕТШХ та

спектрофотометрії в УФ-області спектру, а також визначення галової кислоти

методом ВЕРХ. Для цього попередньо концентрували сік каллізії, очищували

від полісахаридів, демінералізовували, далі елюювали досліджувані речовини

95% спиртом етиловим.

За іншими даними, фенольні сполуки і полісахариди ідентифіковували

методами ПХ і ТШХ, проявляючи в УФ-світлі та відповідними реактивами. В

результаті були ідентифіковані кемпферол, кверцетин, ферулова, галова,

протокатехова, кавова кислоти, глюкоза, арабіноза, галактоза. Кількісний

вміст фенольних сполук визначали перманганатометричним методом, вміст

полісахаридів в сумі і за фракціями визначали гравіметричним методом.

Фенолкарбонові кислоти ідентифікували прямою спектрофотометрією без

попереднього розділення суми фенолкарбонових кислот.

Вміст поліфенолів, за іншими даними, кількісно визначали методом УФ-

спектрофотометрії після реації окислення Фоліна-Чіокалтеу, а флавоноїди –

спектрофотометрично після проведення реакції з алюмінію хлоридом.

Препарати із C. fragrans

Оскільки цілющі властивості золотого вусу відомі давно, на ринку України

наявні креми, бальзами та інші форми для зовнішнього застосування, що

містять золотий вус. Нижче наведено їхній неповний перелік :

- Крем-бальзам „Золотий вус + тамус” 75мл (ТОВ „Флора-фарм”,

Україна) – застосовується при болях, запаленнях суглобів, зв’язок і

м’язів, прострілах у спині та попереку, набряках, спортивних та інших

ушкодженнях опорно-рухового апарату, а також як засіб для

спортивного масажу.

- Бальзам "Золотий вус з мурашиним спиртом" 75 мл; 125 мл (ТОВ

"Оздоровительные биотехнологии", Росія) - рекомендується при моно-

та поліартритах, радикуліті, невралгії, міозитах, комплексному

лікуванні як допоміжний засіб.

- Бальзам "Золотий вус з сабельником" 75 мл; 125 мл (ТОВ

"Оздоровительные биотехнологии", Росія) - рекомендується при

ревматоїдних артритах, остеохондрозі хребта, радикуліті в

комплексному лікуванні як допоміжний засіб.

- Бальзам "Золотий вус з бджолиною отрутою" 75 мл; 125 мл (ТОВ

"Оздоровительные биотехнологии", Росія) - рекомендується при

радикуліті, міозиті, подагрі, в комплексному лікуванні як допоміжний

засіб.

- Бальзам "Золотий вус з бодягою" 75 мл; 125 мл (ТОВ

"Оздоровительные биотехнологии", Росія) - високоефективний засіб

при спортивних та побутових травмах, синяках і невеликих ранах.

Крім цього, випускається ряд інших препаратів:

- "Золотий вус С" - сировина д/БАД-пор., уп.10 кг;

- "Золотий вус захисник суглобів", капс. 500 мг №50; табл. 500 мг №50;

- "Золотий вус захисник суглобів", краплі, флак. 25 мл; 30 мл; 50 мл; 100

мл (ТзОВ "Фора-Фарм", Росія).

- "Золотий вус + гінкго", бальзам д/ніг, 75 мл (ТОВ "Оздоровительные

биотехнологии", Росія).

- "Золотий вус", крем-бальзам д/тіла, 75 мл;

- "Суставіт (Золотий вус)", крем-бальзам для тіла, 75 мл;

- "Чайне дерево + золотий вус", крем-бальзам д/тіла, 75 мл (ТзОВ Флора-

Фарм, Україна).

Бачимо, що представлені лише препарати для зовнішнього застосування, тож

актуальною є проблема створення внутрішніх лікарських форм, а також

створення лікарських препаратів, тобто постають такі цілі, як стандартизація

сировини, створення фармакопейної статті, проведення не лише

доклінічних, а й клінічних випробувань препаратів.

Слід зазначити, що існують застереження щодо внутрішнього застосування

препаратів золотого вуса. Протипоказаннями до його застосування є:

дитячий вік до 12 років, вагітність, загострення важких патологічних

процесів в організмі, спадкова схильність до алергії з ослабленим імунітетом.

При передозуванні спостерігається: головний біль, порушення голосових

зв'язок, набряки слизової оболонки горла, порушення ковтання, свербіж,

почервоніння шкіри, алергічні висипи, мокра екзема.

Огляд літератури

Дослідження хімічного складу соку золотого вусу

Витяг соку здійснювали в лабораторних умовах вручну: для цього сировину

подрібнювали на блендері, отриману масу віджимали через капрон і далі

фільтрували через паперовий фільтр у вакуумі. Даний сік представляв собою

прозору рідину жовтого кольору зі слабким характерним запахом. Далі

проводили фракціонування екстрактивних речовин. Сік концентрували і

піддавали рідиннофазній екстракції послідовно гексаном, хлороформом,

етилацетатом і бутанолом. До водного залишку після рідиннофазної

екстракції доливали 95% спирт етиловий (1: 5), осад полісахаридів, що випав,

центрифугували і висушували зміною розчинників. Супернатант

концентрували до повного видалення спирту та висушували.

Для демінералізації і видалення полісахаридів 100 мл соку C. fragrans

пропускали через колонку з катіонітом КУ-2-8 (Н+-форма, 1 × 20 см),

елюювали 300 мл води і концентрували елюат до обсягу 50 мл. Після чого до

водного залишку доливали 95% спирт етиловий (1: 5), а осад, що випав,

центрифугували; супернатант концентрували, висушували і використовували

в експерименті.

У роботі використовували такі зразки: кверцетин, кемпферол, решта

реактивів мали ступінь чистоти ч.д.а.

Для реєстрації УФ-спектрів поглинання використовували спектрофотометр

8453 UV-Visible (Agilent); аналіз методом ВЕРХ проводили на рідинному

хроматографі з УФ-детектором Agilent 1200.

Визначеня полісахаридів, фенольних сполук, каротиноїдів в сировині

каллізії пахучої

Загальноприйнятими якісними реакціями в надземній частині каллізії пахучої

встановлено наявність полісахаридів, флавоноїдів, каротиноїдів,

фенолокарбонових кислот, амінокислот.

Для дослідження якісного складу фенольних сполук і полісахаридів

використовували хроматографію на папері (ПХ) і хроматографію в тонкому

шарі сорбенту (ТШХ). В якості систем розчинників для ПХ використовували:

2, 15 і 60% -%-ний розчин кислоти оцтової; ізопропанол - мурашина кислота

- вода (2:5:5); н. бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:2); н. бутанол - оцтова

кислота - вода (4:1:5); 0,1 М розчин хлористо-водневої кислоти; оцтова

кислота - концентрована хлористоводнева кислота-вода (10:3:10); ацетон -

бутанол - вода (7:2: 1), етилацетат - оцтова кислота - мурашина кислота -

вода (18:3:15:4). Для ТШХ використовували: хлороформ - етанол (10:1);

хлороформ - оцтова кислота (9:1). За характерною хроматографічною

поведінкою в УФ-світлі до і після проявлення відповідними реактивами і

порівняння зі стандартними зразками були ідентифіковані кемпферол,

кверцетин, ферулова, галова, протокатехова, кавова кислоти, глюкоза,

арабіноза, галактоза.

Кількісний вміст фенольних сполук визначали перманганатометричним

методом у присутності індигосульфокислоти. Вміст полісахаридів в сумі і за

фракціями визначали гравіметричним методом.

Каротиноїди екстрагували гексаном, гексановий розчин згущували,

пропускали через колонку з оксидом алюмінію і вимірювали оптичну

щільність розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 440 нм.

Фенолкарбонові кислоти ідентифікували прямою спектрофотометрією без

попереднього розділення суми фенолкарбонових кислот у перерахунку на

кавову кислоту при довжині хвилі 325 ± 5 нм.

Таблиця 2. Кількісний вміст різних груп БАР у висушеній сировині каллізії

пахучої.

Найменування БАР Вміст БАР,% на повітряно-суху

сировину

ПСК у тому числі 11,1

Водорозчинні полісахариди (ВРПС) 9,0

Пектинові речовини (ПР) 1,03

Геміцелюлоза А (ГА) 1,04

Геміцелюлоза Б (ГБ) 0,03

Фенольні сполуки: 4,9

флавоноїди 0,26

фенолкарбонові кислоти 0,89

Каротиноїди 0,153 мг/ %

Сапоніни -

Антраглікозіди -

Алкалоїди -

Примітка: «-» - відсутність речовини, «+» - наявність речовини.

Досдідження вуглеводів соку золотого вусу

Вивчення складу вуглеводних компонентів Callisia fragrans проводили за

схемою послідовної обробки рослинної сировини різними розчинниками,

запропонованою Оводовою Р.Г. зі співавторами, обмежившись екстракцією

при кімнатній температурі.

Виділення низькомолекулярних цукрів, пігментів та інших супутніх речовин

здійснювали кип'ятінням свіжозрізаних ортотропних пагонів Callisia fragrans

в 96% етиловому спирті. Далі вичерпною екстракцією дистильованою водою

при температурі 20 ± 2°С екстрагували водорозчинні полісахариди.

Екстракти об'єднували і концентрували до мінімального обсягу.

Водорозчинні полісахариди, що перейшли в розчин, осаджували трикратним

об'ємом 96% етилового спирту в холоді. Осад відокремлювали

центрифугуванням, перерозчиняли в мінімальному об'ємі дистильованої води

і піддавали очистці та фракціонуванню методом гель-фільтрації на колонці з

Sephadex G-50. У ході хроматографування суміш полісахаридів розділялася

за молекулярними масами. Окремі фракції об'єднували і ліофільно

висушували. Кількісний вміст вуглеводів в екстрактах на кожній стадії

вичерпного вилучення контролювали фенол-сірчанокислим методом.

Отримали, що сумарний вихід водорозчинних вуглеводів складає 1,54% від

маси повітряно-сухої сировини та 0,1072% від маси свіжозрізаної сировини, а

вихід олігосахаридів, отриманих кип'ятінням з етиловим спиртом — 12,7% та

0,89% відповідно.

Отримані на кожній стадії екстракти об'єднували і очищували від супутніх

домішок методом проникаючої гель-фільтрації. Хроматографування

показало, що в ході очищення об'єднаних екстрактів вуглеводи в них

розділяються ще на 2 фракції. Першою елююється фракція препарату з

високою молекулярною масою і вузьким молекулярно масовим розподілом

(їхній вміст в свіжозрізаній сировині 0,031% та 0,0258%, а у сухій сировині

0,44% та 0,369% відповідно). Другою - деяка кількість низкомолекулярних

вуглеводів (0,0126% та 0,012% в свіжозрізаній сировині, та відповідно

0,179% і 0,172% у висушеній).

Обидві фракції водорозчинних полісахаридів гідролізували і визначали

якісний моносахаридний склад у гідролізаті методом паперової

хроматографіі. Паралельно визначали склад моносахаридів спиртової

фракції. У результаті в спиртовому екстракті встановлено наявність глюкози,

манози, глюкуронової кислоти, глюкоз- і галактозаміну. У гідролізаті водних

екстрактів виявлені глюкоза та аміноцукри.

Поліфеноли та флавоноїди золотого вусу

Наявні дані про дослідження вмісту фенолових сполук. Свіже листя каллізії

висушували на сонці за температури 32ºС протягом 30 годин, висушену

сировину подрібнювали за допомогою міксеру, далі чотири наважки по 20 г

розчинили в етанолі абсолютному, етанолі 75%, суміші етанол:ацетон 1:1, та

ацетоні 75%, настоювали 1 місяць. Далі фільтрували і проводили з витягами

наступні визначення. Визначення загального вмісту поліфенолів. 0,4 мл

екстракту зразка (або стандартний розчин) змішували з 2 мл реагенту

Фоліна-Чіокалтеу, розведеного в пропорції 1:10. Через 3 хвилини додали 1,6

мл 7,5% розчину Na2CO3, продукт реакції термостатували протягом 30

хвилин при кімнатній температурі. Зразки підлягали колориметричному

вимірюванню при 765 нм на UV-Vis спектрофотометрі. Загальний вміст

фенолів було виражено в мг/100 г сухої сировини в перерахунку на галлову

кислоту. Визначення сумарного вмісту флавоноїдів проводилося

колориметричним аналізом з хлоридом алюмінію. Аліквоти (1 мл) екстрактів

або стандартні розведення катехінів (20, 40, 60, 80, 100 мг / л) додавали у

колбу на 10мл із 4 мл дистильованої деіонізованої води. У колбу додавали 0,3

мл 5% розчину NaNO2. Через 5 хвилин додали 0,3 мл 10% розчину lCl3, на

шостій хвилині додали 2 мл 1М NaOІ і довели об'єм до 10 мл дистильованою

деіонізованою H2O. Розчин ретельно перемішали і вимірювали спектр

поглинання за λ=510 нм. Отримано дані про вміст флавоноїдів у мг/кг сухої

маси в перерахунку на катехін. Аналіз проводили двічі. Дані представлені у

таблиці 3.

Таблиця 3. Загальний вміст поліфенолів та флавоноїдів у витягях із каліззії запашної,

зроблених різними розчинниками.

Розчинник Кількісний вміст поліфенолів та флавоноїдів залежно від

обраного розчинника

Вміст поліфенолів у мг/кг сухої

сировини в перерахунку на

галову кислоту

Вміст флавоноїдів у

мг/кг сухої сировини в

перерахунку на

пірокатехін

Етанол

абсолютний

25,4 89,33

Етанол 75% 27,4 65,33

Етанол: ацетон

1:1

40,9 118,67

Ацетон 75% 45,7 196

Визначення поліфенолів, ліпідів та вуглеводів соку каллізії

Вміст поліфенолів у вусах каллізії. Свіжі вуса подрібнювали в блендері,

отриманий сік проціджували через тканину, потім проводили вакуум-

фільтрацію через паперовий фільтр. Концентрували сік (Об'єм соку був

зменшений з 21,5 л до 3 л) і екстрагували послідовно гексаном,

хлороформом, етилацетатом. В результаті були приготовані відповідно

гексановий, хлороформний, етилацетатний витяги, які в подальшому

піддавали колонковій хроматографії для розділення речовин. Далі елюювали

метанолом окремі сполуки метанолом, концентрували і рекристалізовували.

В результаті проведеного аналізу отриманих сполук були ідентифіковані

алое-емодин, умбеліферон, скополетин, кверцетин, цикорієва, галова і кавова

кислоти.

Досліджувався вміст ліпідів. За допомогою колонкової хроматографії на

силікагелі ліпіди були розділені на нейтральні, гліколіпіди і фосфоліпіди

шляхом послідовного елюювання хлороформом, ацетоном, метанолом.

Кількісний міст різних груп ліпідів визначали гравіметрично. Результати

подані в таблиці.

Таблиця 4. Відсотковий вміст ліпідів у різних видах сировини каллізії

пахучої.

Відсоткова частка

відносно усієї маси

ліпідів у листках, %

Відсоткова частка

відносно усієї маси

ліпідів у вусах, %

Нейтральні ліпіди та

пігменти

58,6 56,4

Гліколіпіди та

пігменти

28,8 24,2

Фосфоліпіди 12,6 19,4

Всього були ідентифіковані:

І. Нейтральні ліпіди, в тому числі:

Парафіни

Ароматичні вуглеводні

Каротиноїди

Стеролу ацетат, тритерпенацетат

Триацилгліцериди

ІІ. Вільні жирні кислоти

ІІІ. Стероли

IV. Тритерпени

V. Тритерпенові кислоти

VI. Хлорофіл

Визначення вмісту вуглеводів. Полісахариди ізолювали із концентрованого

соку (21,5 л соку із 27 кг свіжої сировини був сконцентрований до 1,5 л)

послідовно гексаном, хлороформом, етилацетатом, далі преципітували

етанолом (95%, 1:4), центрифугували, висушували зміною розчинників, в

результаті чого отримали 45,11 г полісахаридного комплексу, що становить

9,42% від сухої маси соку та 0,17% від маси свіжої сировини.

Зола становила 54,3 % від маси полісахаридного комплексу. В таблиці 5

приведений кількісний вміст деяких елементів золи.

Таблиця 5. Кількісний склад золи із полісахаридного комплексу, триманого із

соку каллізії пахучої.

Ком

пон

ент

золи

Кількісн

ий вміст

у золі, %

Ком

поне

нт

золи

Кількіс

ний

вміст у

золі, %

Ком

поне

нт

золи

Кількісний

вміст у золі,

%

Комп

онент

золи

Кількісний

вміст у

золі, %

Al 0,11 Ba 0,2 Ca 24,47 Cr 0,264

Cu 0,304 Fe 0,22 K 9,14 Mg 9,22

Mn 0,1 Mo 0,207 Na 2,77 Ni 0,0106

P 7,04 Pb 0,0871 Si 2,7 Sn 0,0202

Ti 0,01 V 0,262 Zn 0,02 Проте

їни

12,4

Кількісний вміст вуглеводів в полісахаридному комплексі складає 28,2 %, із

них гексозаміни становлять 16,5%, а уронові кислоти – 4,3%.

Експериментальна частина

1. Мікро- та макроскопічне дослідження сировини каллізії пахучої

Висушена сировина являє собою шматочки листя, стебел, пагонів різної

форми, від зеленого до зелено-коричневого кольору зі специфічним запахом.

Мікроскопічні дослідження проводили у відповідності з вимогами статей

"Методи аналізу лікарської рослинної сировини" і "Техніка мікроскопічного і

мікрохімічного дослідження лікарської рослинної сировини" ДФ ХІ.

Перегляд зрізів і фотографування виконували за допомогою мікроскопу

"Motic" з цифровою насадкою (зб.900). Отримані зображення редактували з

використанням програм "Motic Image 2000" і "Adobe Photoshop 7.0".

Під час мікроскопічного дослідження в якості діагностичних ознак ЛРС КП

виділено продихи тетрацитного типу на епідермісі стебла і нижній стороні

листків, рафіди і голчасті кристали в епідермісі листка, наявність простих

багаторядних волосків.

Рис 1. Продих тетрацитного типу на нижній стороні листка каллізії пахучої

(х900)

Рис 2. Рафіди оксалату кальцію (х900)

Визначення оптимальних умов екстракції сировини

Для визначення оптимальної концентрації екстрагенту проводили

екстрагування 40%, 50% і 70% спиртом етиловим при співвідношенні

сировини і екстрагенту 1:10 й 1:5, нагріваючи на киплячій водяній бані зі

зворотним холодильником одноразово протягом 45 хвилин.

У отриманих витягах визначали кількісний вміст карбонових кислот методом

кислотно-основного титрування за наступною методикою:

5 мл екстракту переносили у фарфорову чашку, додавали 0,5 мл

хлористоводневої кислоти Р, випаровували на киплячій водяній бані і

сушили в сушильній шафі при температурі 100-105˚С 20 хв. Водорозчинний

сухий залишок кількісно переносили в мірну колбу ємністю 100 мл,

фільтруючи через фільтрувальний папір. До одержаного фільтрату додавали

15 мл води Р, 0,5 мл розчину фенолфталеїну і титрували 0,05 М розчину

NaOH до появи рожевуватого забарвлення, що не зникало протягом 30 с.

1 мл 0,05 М розчину NaOH відповідає 0,00335 г C 4 H 6 O5 (кислоти яблучної).

Вміст суми карбонових кислот у перерахунку на кислоту яблучну визначали

за формулою;

x=V титранта×Т ×КП ×V колби×100

mнаважки×V піпетки, де

V титранта - об’єм 0,05 М розчину NaOH, що пішов на титрування,

Т - титр, Т =0,00335,

К П =0,8172,

V колби - об’єм вихідної витяжки, V колби =50 мл,

mнаважки - маса вихідної рослинної сировини в г,

V піпетки - об’єм витяжки, взятої на аналіз, V піпетки =5 мл.

Титрування проводилося тричі, одержані результати наведені в таблиці 6.

Таблиця 6.

Результати кількісного визначення карбонових кислот у сухих вусах каллізії

пахучої в залежності від концентрації екстрагенту у перерахунку на яблучну

кислоту.

Екстрагент Кількісний вміст карбонових кислот у сухих вусах (Х), в %,

, n = 5

при співвідношенні сировина-екстрагент

(1:10) (1:5)

70% спирт етиловий 1,198±0,05 0,873±0,02

50% спирт етиловий 0,637±0,03 0,541±0,04

40% спирт етиловий 0,691±0,08 0,549±0,01

Результати проведеного досліду свідчать про те, що найбільша кількість

карбонових кислот була виявлена у витязі, отриманому екстрагуванням

сировини 70% спиртом етиловим при співвідношенні сировина-екстрагент

1:10.

Виявлення дубильних речовин

Приготування водного витягу: 1 г подрібненої рослинної сировини заливали

100 мл води. Нагрівають на водяній бані 20-30 хв, проціджують через вату і

отриманий витяг використовують для проведення якісних реакцій:

1. До 2-3 мл витягу додають по краплям 1% розчин желатину, з’являлось

помутніння, яке зникало при додаванні надлишку желатину.

2. До 2-3 мл витягу додають декілька крапель 1% розчину залізо-

амонійних галунів, спостерігають темно-зелене забарвлення, що

свідчить про наявність конденсованих дубильних речовин.

Висновок. За допомогою якісних реакцій виявлені в надземній частині

каллізії дубильні речовини конденсованої природи.

Виявлення відновних цукрів

Випробування проводили за методом описаним в ДФУ І, 2001р., с.230.

До 2 мл витягу додавали 2 мл мідно-тартратного розчину Р, нагрівали на

киплячій водяній бані протягом 5 хв. Охолоджували до кімнатної

температури, утворювався осад цегляно- червоного кольору, що свідчив про

наявність відновлюючих цукрів.

Рівняння хімічної реакції наведено нижче:

Висновок. Якісною реакцією з мідно-тартратним реактивом ідентифіковані

відновлюючі цукри у водному витязі золотого вусу.

Виявлення флавоноідів методом ВЕРХ

Ідентифікацію флавоноідів проводили проводили методом ВЕРХ на

хроматографі рідинному Agilent 1200 з УФ - детектором на колонці Synergy

Hydro RP18 4,6 * 150 мм, розмір зерна 5 мкм. Рухома фаза: суміш

ацетонітрилу, води (1:1) і 0,5% оцтової кислоти; швидкість потоку елюента -

1,4 мл / хв; об’єм, проби що вводиться - 5 мкл. Детектування здійснювали

при довжинах хвиль 330 нм і 370 нм. Визначення індивідуальних

компонентів проводили з використанням зовнішніх стандартів - 0,05%

розчинів ФСЗ рутину, кверцетину, апігеніну, апігеніну-7-глікозиду

(цінарозіда), кемпферолу.

На хроматограмах випробовуваних зразків та розчинів порівняння

співпадали лише часи утримування піків кверцетину та кемпферолу.

Висновок:

Визначення кількісного вмісту дубильних речовин

10 мл екстракту поміщають у круглодонну колбу місткістю 250 мл, додають

150 мл води Р. Нагрівають протягом 30 хв на водяній бані, охолоджують під

проточною водою та кількісно переносять у мірну колбу місткістю 250 мл.

Круглодонну колбу ополіскують водою Р, промивні води переносять в мірну

колбу і доводять об’єм розчину водою Р до 250 мл. Дають осаду осісти та

рідину фільтрують крізь фільтрувальний папір діаметром 125 мм.

Відкидають перші 50 мл фільтрату.

Сума поліфенолів. 5,0 мл фільтрату доводять водою Р до 25,0 мл. Суміш 2,0

мл одержаного розчину, 1,0 мл фосфорномолібденово - вольфрамового

реактиву Р і 10,0 мл води Р доводять розчином 290 г\л натрію карбонату Р до

об’єму 25,0 мл Через 30 хв вимірюють оптичну густину (2.2.25) розчину за

довжини хвилі 760 нм(А1), використовуючи як компенсаційний розчин воду

Р.

Поліфеноли, що не адсорбуються шкірним порошком. До 10 мл фільтрату

додають 0,10 г ФСЗ шкірного порошку і енергійно струшують протягом 60

хв. Суміш фільтрують і доводять 5,0 мл фільтрату водою Р до об’єму 25,0 мл.

Суміш 2,0 мл одержаного розчину, 1,0 мл фосфорномолібденово-

вольфрамового реактиву Р і 10,0 мл води Р доводять розчином 290 г\л натрію

карбонату Р до об’єму 25,0 мл. Через 30 хв вимірюють оптичну густину

(2.2.25) розчину за довжини хвилі 760 нм(А2), використовуючи як

компенсаційний розчин воду Р.

Стандартний розчин. Безпосередньо перед випробуванням 50,0 мг пірогалолу

Р розчиняють у воді Р і доводять об’єм розчину тим самим розчинником до

100,0 мл. 5,0 мл одержаного розчину доводять водою Р до об’єму 100,0 мл.

Суміш 2,0 мо одержаного розчину, 1,0 мл фосфорномолібденово -

вольфрамового реактиву Р і 10,0 мл води Р доводять розчином 290 г/л натрію

карбонату Р до об’єму 25,0 мл. Через 30 хв вимірюють оптичну густину

(2.2.25) розчину за довжини хвилі 760 нм(А3), використовуючи як

компенсаційний розчин воду Р.

Вміст танінів, у перерахунку на пірогалол, у відсотках, обчислюють за

формулою:

x=6,25× A1− A2×m2

A3×m1, де

m1 — маса випробовуваного зразка у грамах,

m2- маса пірогалолу у грамах.

Отримані УФ-спектри:

Рис 3. УФ-спектр поглинання розчину порівняння ФСЗ пірогалолу

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.2

0.22

0.24

0.26

0.28

0.3

0.32

0.34

0.36

pyrogalol

УФ-спектри поглинання сировини, отримані в результаті

пробопідготовки без використання порошку голевого:

Рис 4. УФ-спектр поглинання сировини сухого листя Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.08

0.09

0.1

0.11

0.12

0.13

dry leaves

Рис 5. УФ-спектр поглинання сировини сухих стебел Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.0325

0.035

0.0375

0.04

0.0425

0.045

0.0475

0.05

0.0525

0.055

dry stems

Рис 6. УФ-спектр поглинання сировини свіжих листків Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.032

0.034

0.036

0.038

0.04

0.042

0.044

0.046

0.048

0.05

fresh leaves

Рис 7. УФ-спектр поглинання сировини сухих стебел Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.09

0.1

0.11

0.12

0.13

0.14

0.15

fresh stems

УФ-спектри поглинання сировини, отримані в результаті

пробопідготовки з використанням порошку голевого:

Рис 8. УФ-спектр поглинання сировини сухих листків Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.05

0.055

0.06

0.065

0.07

0.075

0.08

0.085

dry_leaves

Рис 9. УФ-спектр поглинання сировини сухих стебел Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rba

nce

(A

U)

0.05

0.055

0.06

0.065

0.07

0.075

0.08

dry_stems

Рис 10. УФ-спектр поглинання сировини свіжих листків Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rb

an

ce

(A

U)

0.0275

0.03

0.0325

0.035

0.0375

0.04

0.0425

0.045

0.0475

fresh_leaves

Рис 11. УФ-спектр поглинання сировини свіжих стебел Сallisia fragrans L.

Wavelength (nm)600 650 700 750 800 850

Ab

so

rba

nce

(A

U)

0.06

0.065

0.07

0.075

0.08

0.085

0.09

0.095

0.1

fresh_stems

Таблиця 7.

Результати кількісного визначення танінів в сировині каллізії пахучої (в перерахунку на

абсолютно суху речовину)

Сировина

Вміст танінів у перерахунку на пірогалол, %

Сума

Таніни, що

адсорбуються

порошком голевим

Таніни, що не

адсорбуються

порошком шкірним

Сухі стебла 0,31±0,02 0,45±0,01 0,01±0,06

Свіжі стебла 0,05±0,02 0,03±0,02 0,02±0,01

Сухе листя 0,98±0,03 0,64±0,02 0,38±0,02

Свіже листя 0,09±0,05 0,06±0,04 0,02±0,02

Таким чином встановлено, що відсоток поглинання танінів порошком

шкірним (голевим) складає 82-83% від сумарного вмісту поліфенолів.

Визначення кількісного вмісту суми амінокислот

Визначення було прооведено шляхом абсорбційної спектрофотометрії в УФ-

області забарвленого комплексу амінокислот з нінгідрином.

Спектрофотометрія - метод дослідження і аналізу речовин, заснований на

вимірюванні спектрів поглинання в оптичній області електромагнітного

випромінювання. Іншими словами, спектрофотометрія – вимірювання

інтенсивності монохроматичного (певної довжини хвилі) світлового потоку,

що пройшов через розчин речовини, фотоелектричними способами. Речовина

може поглинати електромагнітне випромінювання певної довжини хвилі в

одній із областей спектра. Ультрафіолетова спектроскопія (УФ

спектроскопія, УФС), розділ оптич. спектроскопії, що включає отримання,

дослідження та застосування спектрів випускання, поглинання і

відображення в ультрафіолетовій області, тобто в діапазоні довжин хвиль 10-

400 нм (хвильових чисел 2,5 · 104 - 106 см-1). Застосування спектрофотометрії

в УФ областях спектру засноване на поглинанні електромагнітного

випромінювання сполуками, що містять хромофорні (напр., С = С, С = С, С =

О) і ауксохромні (ОСН3, ОН, NH2 та ін) групи. Розчини речовин, що

поглинають в одній із видимих ділянок спектра, мають забарвлення. Колір у

цьому випадку обумивлений тією частиною світлового потоку, що не була

поглинена при проходженні через розчин речовини. Колір випромінювання

світла, що пройшло через розчин, відрізняється від кольору поглиненої

частини спектра і називається додатковим (удаваним) кольором речовини.

Таким чином, першою характеристикою розчинів речовин є їхній колір,

зв’язаний з довжиною хвилі поглиненої частини світлового потоку. Довжина

хвилі (колір) випромінювання, що поглинається, у різних речовин

відрізняється і залежить від їхньої структури. Це створює додаткові

можливості для аналітичних визначень. Другою важливою характеристикою

кольорових розчинів є кількість поглиненого світлового випромінювання, що

залежить від кількості речовини в розчині. Якщо, наприклад, кожна молекула

речовини поглинає квант світла, то кількість поглинених квантів залежить

від кількості молекул.Графічний зв’язок між оптичним поглинанням розчину

й довжиною хвилі світлового потоку називається спектром поглинання

речовини. Виникнення спектрів поглинання в УФ- та видимій областях

спектра пояснюється здатністю електронів на деяких орбіталях поглинати

кванти світла і переходити на більш високі енергетичні рівні. Визначення

проводять на спектрофотометрах, у яких світловий потік, що проходить через

кювету, монохроматичний. Розкладання білого світлав спектр на

спектрофотометрах проводиться за допомогою призм або дифракційних

решіток. Залежність поглинання розчину речовини від довжини хвилі на

графіку зображується у вигляді спектра поглинання речовини, на якому легко

виділити максимум поглинання. Вимірювання оптичної густини розчинів

проводять при довжині хвилі максимуму поглинання.

Методика базується на здатності амінокислот утворювати з нінгідрином сіль

енольної форми дикетогідринденкетогідраміну, що має синьо-фіолетове

забарвлення:

До 2 мл отриманої витяжки додавали 2 мл 0,2% розчину нінгідрину, суміш

нагрівали на водяній бані при температурі 60˚С протягом 30 хв, після чого

довели об’єм витягу до 25 мл. Оптичну густину забарвленого комплекса

визначали при λ=570 нм. Максимум поглинання визначали

експериментально за спектром продукта реакції у видимій ділянці світла.

Паралельно визначали оптичну густину комплексу стандартного зразка

аланіну, який переважає в сумі амінокислот, з нінгідрином. Приготування

розчину стандартного зразка аланіну: 0,0111 г (т.н.) аланіну RSO розчиняли в

20 мл 70% спирту етилового. Приготування розчину нінгідрину: 0,2 г (т.н.)

нінгідрину розчиняли в 100 мл 70% спирту етилового.

Отримані спектри:

Рис 12. УФ-спектр поглинання стандартного зразка аланіну.

Wavelength (nm)500 520 540 560 580 600 620

Ab

so

rba

nce

(A

U)

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

alanin-1/5

Рис 13. УФ-спектр поглинання сировини сухих вусів:

Wavelength (nm)500 520 540 560 580 600 620

Abs

orba

nce

(AU

)

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.1

0.11

0.12

dry runs

Рис 14. УФ-спектр поглинання сировини свіжих листків.

Wavelength (nm)500 520 540 560 580 600 620

Abs

orba

nce

(AU

)

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

fresh leaves

Рис 15. УФ-спектр поглинання сировини свіжих вусів.

Wavelength (nm)500 520 540 560 580 600 620

Abs

orba

nce

(AU

)

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0.24

0.26

fresh runs

Рис 16. УФ-спектр поглинання сировини свіжих стебел.

Wavelength (nm)500 520 540 560 580 600 620

Abs

orba

nce

(AU

)

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

fresh stems

Вміст амінокислот в перерахунку на аланін і абсолютно суху сировину у

відсотках визначали за формулою:

x=А досл×mст×V витягу×V суміші×100×100

А ст×mдосл×V алікв× 100−ω , де

Адосл - оптична густина досліджуваного розчину,

mст - вміст стандартного зразка аланіна з нінгідрином, mст =0,0111 г,

V витягу - об’єм вихідної спиртової витяжки із сировини, V витягу =100 мл,

V суміші - об’єм суміші, взятий безпосередньо для аналізу, V суміші =25 мл,

Аст - оптична густина комплексу стандартного зразка аланіна з нінгідрином,

mдосл - маса наважки сировини, взятої для аналізу,

V алікв - аліквота з вихідної витяжки,

ω - втрата в масі при висушуванні у відсотках.

Вимірювання проводилося тричі, результати подані у таблиці 8.

Таблиця 8. Результати кількісного визначення вмісту амінокислот у різних

видах сировини у перерахунку на аланін.

СировинаКількісний вміст амінокислот x, %

±Δ%

Сухі вуса 3,71±0,08

Свіжі стебла 0,34±0,05

Свіжі вуса 1,66±0,04

Свіжі листки 0,85±0,07

Висновок. Досліджували кількісний вміст амінокислот в сухих вусах, а також

свіжих стеблах, вусах і листках золотого вусу в перерахунку на аланін

спектрофотометричним методом. Отримані результати свідчать про те, що

найбільший вміст амінокислот (3,71%) міститься у сухих вусах, менше —

1,66% - у свіжих вусах, в свіжих листках і стеблах міститься відповідно

0,85% і 0,34% амінокислот. Отже, найперспективнішою сировиною для

подальшого дослідження і розробки лікарських форм з точки зору вмісту

амінокислот є саме сухі і свіжі вуса каллізії. Порівнювати отримані

результати із літературними ми не можемо, адже відомо про визначення

амінокислот в соку, а не конкретних видах сировини, але наші результати

про середнє значення вмісту амінокислот у свіжій сировині (0,95%) не

протирічать літературним даним про наявність амінокислот в кількості 0,07%

від маси соку із наземної частини рослини. Отже, даним дослідженням ми

підтвердили наявність у порівняно великих кількостях амінокислот у

золотому вусі, та впевнились у доцільності використання насамперед вусів

цієї рослини в лікувальних цілях.

Визначення кількісного вмісту карбонових кислот

Визначення проводили за такою методикою: 5 мл препарату переносять у

фарфорову чашку об’ємом 10 мл, додають 0,5 мл хлористоводневої кислоти

Р, випаровують на киплячій водяній бані до сухого стану і сушать в

сушильній шафі при температурі 100-105˚С протягом 20 хв. Водорозчинний

сухий залишок кількісно переносять в мірну колбу об’ємом 100 мл. Для

цього у фарфорову чашку з сухим залишком, що охолоджена до кімнатної

температури, додають 2 мл води Р, ретельно розтираючи скляною паличкою.

Одержаний розчин фітрують через попередньо змочений водою Р паперовий

фільтр діаметром 5-6 см в конічну колбу об’ємом 100 мл. Вимивання

залишку водою порціями по 1-2 мл повторюють ще 4 рази, повністю

фільтруючи кожну порцію. Потім тричі промивають чашку і фільтр водою Р

порціями по 3 мл. До одержаного фільтрату додають 15 мл води Р, 0,5 мл

розчину фенолфталеїну і титрують 0,05 М розчину NaOH до появи

рожевуватого забарвлення, що не зникає протягом 30 с. 1 мл 0,05 М розчину

NaOH відповідає 0,00335 г C 4 H 6 O5 (кислоти яблучної).

Вміст суми карбонових кислот у перерахунку на кислоту яблучну визначали

за формулою;

x=V титранта×Т ×КП ×V колби×100

mнаважки×V піпетки, де

V титранта - об’єм 0,05 М розчину NaOH, що пішов на титрування,

Т - титр, Т =0,00335,

К П =0,8172,

V колби - об’єм вихідної витяжки, V колби =50 мл,

mнаважки - маса вихідної рослинної сировини в г,

V піпетки - об’єм витяжки, взятої на аналіз, V піпетки =5 мл.

Титрування проводилося тричі, отримані результати занесені в таблицю 9.

Таблиця 9. Результати кількісного визначення карбонових кислот у різних

видах сировини у перерахунку на яблучну кислоту.

Сировина Кількісний вміст карбонових кислот x,

%±Δ%

Сухі вуса 1,193±0,078

Сухі стебла 0,128±0,031

Сухі листки 0,138±0,037

Сухі корені 0,071±0,011

Висновок. Досліджувався кількісний вміст карбонових кислот в перерахунку

на яблучну кислоту методом кислотно-основного титрування. Результати

свідчать про найвищий їхній вміст в сухих стеблах. Зі свіжої сировини

лідером з вмісту кислот є свіжі вуса — 0,138% від маси свіжої сировини

(свіжі листки і стебла містять відповідно 0,128% і 0,071%), що знову

підтверджує доцільність використання в медичних цілях саме вуса каллізії.

Середнє значення вмісту карбонових кислот в свіжій сировині, яке ми

вирахували (0,112%) відповідає даним, отриманим з літератури про вміст

вільних карбонових кислот в кількості 0,14% від маси соку з надземної

частини рослини.

Кількісне і якісне дослідження вмісту флавоноїдів

Визначення було проведено із застосуванням методу ВЕРХ. Хроматографія –

високоефективний фізико-хімічний метод розділення і аналізу, в якому

речовина розподіляється між двома фазами: рухомою і нерухомою. ВЕРХ

використовує прикладання зовнішнього тиску для прискорення проходження

рідини через колонку. Це дозволяє застосовувати наповнювач з часточками

меншого розміру й прискорює розділення. Препаративні хроматографи для

розділення органічних речовин працюють при тиску порядку 100-600 бар з

металевими колонками діаметром 0.5-4.6 мм (найчастіше використовують

диаметром 2.1 та 4.0 - 4.6 мм) та довжиною 15-300 мм. Як нерухому фазу

застосовують ліпофільно-модифікований силікагель (оберненофазна

хроматографія), тоді як рухомою фазою слугують суміші води та органічного

розчинника (найчастіше ацетонітрилу). ВЕРХ застосовують як для аналізу,

так і для розділення сумішей. Типовий час експерименту 2-30хв.

Витяги отримували із сухих листків, свіжих листків та свіжих стебел шляхом

екстрагування 70% спиртом етиловим при співвідношенні сировини і

екстрагенту 1:10 і нагріванні на киплячій водяній бані зі зворотним

холодильником одноразово протягом 45 хвилин.

Ідентифікацію і кількісний вміст флавоноїдів каллізії пахучої проводили

методом ВЕРХ на хроматографі рідинному Agilent 1200 з УФ - детектором на

колонці Synergy Hydro RP18 4,6 * 150 мм, розмір зерна 5 мкм. Рухома фаза А:

2% розчин оцтової кислоти. Рухома фаза Б: суміш ацетонітрилу, води (1:1) і

0,5% оцтової кислоти. Швидкість потоку елюента - 1,4 мл / хв; обсяг введеної

проби - 5 мкл; режим елюювання - градієнтний. Детекцію проводили при

довжинах хвиль 330 нм, 270 нм і 254 нм. Кількісне визначення

індивідуальних компонентів проводили з використанням зовнішніх

стандартів - 0,05% розчинів фармакопейних стандартних зразків (ФСЗ)

рутину, кверцетину, апігеніну, апігеніну-7-глікозиду (цинарозиду),

кемпферолу.

Час, хв Рухома фаза

А, % (об/об)

Рухома фаза Б,

% (об/об)

0→15 100→75 0→25

15→35 75→70 25→30

35→60 70→20 30→80

60→65 20→0 80→100

65→70 0 100

Нижче наведені отримані типові хроматограми витягів із сировини та

розчинів фармакопейних стандартних зразків.

Рис 17. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка кемпферолу.

Рис 18. Типова хроматограма водно-спиртового витягу із сухих вусів каллізії

пахучої

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-012.D)

54

.78

6 -

K

ae

mp

fero

l

Рис 19. Типова хроматограма водно-спиртового витягу із сухих стебел

каллізії пахучої

Рис 20. Типова хроматограма водно-спиртового витягу із сухих листків

каллізії пахучої

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-009.D)

11

.40

4 1

1.6

84

12.

788

14.

635

-

Ca

ffei

c ac

id

16.

548

16.

812

17.

364

17.

841

18.

797

28.

507

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-001.D)

15

.11

3

17

.00

8

21

.40

4 2

1.8

58

47

.45

9

50

.09

8

54

.49

6 -

K

ae

mp

fero

l

Рис 21. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка кверцетину.

Рис 22. Типова хроматограма водно-спиртового витягу із сухих листків

каллізії пахучої:

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

0

5

10

15

20

25

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-003.D)

48

.73

4 -

Q

ue

rce

tin

Рис 23. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка апігеніну.

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-2

0

2

4

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-005.D)

31.5

01

31.5

95 -

B

lank

53.8

48 -

Apig

enin

54.6

91 -

bla

nk

57.4

29

67.4

91

68.3

88

69.8

83

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-3

-2

-1

0

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-005.D)

53.8

51

67.5

09

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

020406080

100

DAD1 C, Sig=254,8 Ref=360,10 (FLAV_MON\FLAV-005.D)

7.7

77

31.6

37

65.3

22

65.9

87

66.4

64

67.4

92

69.4

34

Рис 24. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка апігенін-7-лікозиду.

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-2

0

2

4

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-006.D)

31.

430

39.

973

- A

pig

enin

-7-g

lucos

ide

54.

692

- bl

ank

67.

488

69.

909

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-3

-2

-1

0

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-006.D)

39.

974

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

020406080

100

DAD1 C, Sig=254,8 Ref=360,10 (FLAV_MON\FLAV-006.D)

7.7

67

31.

618

65.

320

65.

986

66.

461

67.

492

69.

394

Рис 25. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка рутину.

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-2

0

2

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-004.D)

28.5

53

31.6

51 -

B

lank

54.7

10 -

bla

nk

67.4

95

68.4

08

69.8

75

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-3

-2

-1

0

1

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-004.D)

28.5

48 -

R

utin

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

020406080

100

DAD1 C, Sig=254,8 Ref=360,10 (FLAV_MON\FLAV-004.D)

7.7

79

31.5

21

65.9

93

66.4

70

67.5

00

69.4

56

На основі отриманих результатів був зроблений висновок про наявність

таких флавоноїдів: кемпферол, кверцетин.

Був проведений кількісний аналіз вмісту кемпферолу й кверцетину,

розрахунки проводились за формулою:

Х=А пр∗Cст∗100

Аст∗mпр∗100−W ∗100 , де

Апр — площа піку флавоноїда на хроматограмі досліджуваного розчину;

Аст — площа піка флавоноїда на хроматограмі стандартного розчину

флавоноїда; Сст - концентрація флавоноїду в стандартному розчині, г/мл;

тпр - маса досліджуваної сировини, г; W - втрата в масі при висушуванні, %.

Результати занесені в таблицю 10.

Таблиця 10. Кількісний вміст флавоноїдів в сировині каллізії пахучої.

Сировина Сухі листки Сухі вуса Сухі стебла Свіжі листки,

вуса стебла

Кількісний

вміст

кверцетину, %0 0,002251 0 0

Кількісний

вміст

кемпферолу, %0,006045 0,007124 0,004376 0

Висновок. Методом ВЕРХ в сухій сировині були знайдені кверцетин та

кемпферол. Ряд флавоноїдів, описаних в літературі, нами знайдені не були

(рутин, апігенін та цинарозид), що свідчить про відсутність або такий їх

вміст, що виходить за межі детектування приладу за даної методики.

Кількісне і якісне дослідження вмісту оксикоричних кислот

Ідентифікацію та кількісний вміст оксикоричних кислот каллізії пахучої

проводили методом ВЕРХ на хроматографі рідинному Agilent 1200 з УФ -

детектором на колонці Synergy Hydro RP18 4,6 * 150 мм, розмір зерна 5 мкм.

Рухома фаза А: 2% розчин оцтової кислоти. Рухома фаза Б: суміш

ацетонітрилу, води (1:1) і 0,5% оцтової кислоти. Швидкість потоку елюента -

1,4 мл / хв; обсяг введеної проби - 5 мкл; режим елюювання - градієнтний.

Детекцію проводили при довжинах хвиль 330 нм, 270 нм і 254 нм. Кількісне

визначення індивідуальних компонентів проводили з використанням

зовнішніх стандартів - 0,05% розчинів фармакопейних стандартних зразків

(ФСЗ) хлорогенової та кавової кислот.

Рис 26. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка хлорогенової кислоти.

Рис 27. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі свіжих стебел

каллізії пахучої

min0 5 10 15 20 25

mAU

0

20

40

60

80

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-014.D)

13

.37

2 -

C

hlo

rog

en

ic a

cid

Рис 28. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі сухих листків

каллізії пахучої

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-002.D)

11

.13

1

13

.411

-

Ch

loro

ge

nic

aci

d

14

.58

1 -

C

aff

eic

aci

d

15

.52

3

16

.97

8

17

.70

1

19

.08

6

19

.90

3

21

.48

1

22

.59

5 2

2.7

11 2

3.2

55

24

.01

7

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-001.D)

10

.23

9

13

.35

5 -

C

hlo

rog

en

ic a

cid

14

.55

9 -

C

aff

eic

aci

d 1

5.1

10

15

.50

1

16

.96

9 1

7.2

82

17

.68

0 1

8.2

69

19

.56

4 1

9.8

72

21

.41

0 2

1.8

81

23

.58

2

24

.98

4

29

.29

5

Рис 29. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі сухих вусів каллізії

пахучої

Рис 30. Типова хроматограма 0,5% розчину фармакопейного стандартного

зразка кавової кислоти.

min0 5 10 15 20 25

mAU

0

20

40

60

80

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-013.D)

14

.62

9 -

C

aff

eic

acid

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-008.D)

10

.10

8

11

.32

1 1

1.7

01

12

.81

6 1

3.3

58

-

Ch

loro

ge

nic

aci

d

14

.63

6 -

C

aff

eic

aci

d

15

.82

6

27

.14

5 2

7.2

18

28

.51

2

Рис 31. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі свіжих вусів

каллізії пахучої

Рис 32. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі свіжих стебел

каллізії пахучої

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-002.D)

11

.13

1

14

.58

1 -

C

aff

eic

aci

d

15

.52

3

16

.97

8

17

.70

1

19

.08

6

19

.90

3 2

0.3

81

21

.48

1

22

.59

5 2

2.7

11

24

.01

7

Рис 33. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі сухих вусів каллізії

пахучої

min0 5 10 15 20 25

mAU

0

20

40

60

80

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-013.D)

14.

629

- C

affe

ic a

cid

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-008.D)

10

.10

8

11

.32

1 1

1.7

01

12

.81

6 1

3.3

58

-

Ch

loro

ge

nic

aci

d

14

.63

6 -

C

aff

eic

aci

d

15

.82

6

27

.14

5 2

7.2

18

28

.51

2

Рис 34. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі сухих листків

каллізії пахучої

Рис 35. Типова хроматограма водно-спиртового витягу зі сухих стебел

каллізії пахучої

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-009.D)

11

.40

4 1

1.6

84

12.

788

14.

635

-

Ca

ffei

c ac

id

16.

548

16.

812

17.

364

17.

841

18.

797

28.

507

Рис 36. Типова хроматограма водно-спиртового витягу із свіжих листків

каллізії пахучої.

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-2

0

2

4

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-011.D)

12.

891

14.

337

14.

546

15.

497 1

6.98

1 1

7.66

4

19.

851

21.

424

21.

880

26.

941

28.

021

29.

360

31.

702

- B

lank

41.

511

42.

355

54.

681

- b

lank

55.

822

56.

372

56.

689

60.

183

67.

484

68.

445

69.

879

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

-3

-2

-1

0

DAD1 B, Sig=370,16 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-011.D)

17.

015

21.

421

21.

874

min0 10 20 30 40 50 60

mAU

020406080

100

DAD1 C, Sig=254,8 Ref=360,10 (FLAV_MON\FLAV-011.D)

7.7

70

18.

399

18.

584

19.

888

29.

268

31.

529

65.

316

65.

991

66.

467

67.

489

69.

324

Був проведений кількісний аналіз вмісту кавової й хлорогенової кислоти,

розрахунки проводились за формулою:

min0 5 10 15 20 25

mAU

-4

-2

0

2

4

6

8

DAD1 A, Sig=330,8 Ref=off (FLAV_MON\FLAV-001.D)

10

.23

9

13

.35

5 -

C

hlo

rog

en

ic a

cid

14

.55

9 -

C

aff

eic

aci

d 1

5.1

10

15

.50

1

16

.96

9 1

7.2

82

17

.68

0 1

8.2

69

19

.56

4 1

9.8

72

21

.41

0 2

1.8

81

23

.58

2

24

.98

4

29

.29

5

, де

Апр — площа піку кислоти на хроматограмі досліджуваного розчину; Аст —

площа піка кислоти на хроматограмі стандартного розчину; Сст -

концентрація кислоти в стандартному розчині, г/мл; тпр - маса

досліджуваної сировини, г; W - втрата в масі при висушуванні, %.

Результати занесені в таблицю 11.

Таблиця 11. Кількісний вміст оксикоричних кислот в сировині каллізії пахучої.

СировинаКількісний вміст кавової

кислоти, %

Кількісний вміст

хлорогенової кислоти, %

Сухі листки 0,002281 0,002645

Сухі вуса 0,002287 0,002873

Сухі стебла 0,002074 0

Свіжі листки 0 0

Свіжі вуса 0,001853 0

Свіжі стебла 0,002017 0,001872

Висновок. Методом ВЕРХ в усіх видах лікарської сировини каллізії пахучої

були знайдені кавова та хлорогенова кислоти. У свіжих листках дані сполуки

нами знайдені не були, що свідчить про їх відсутність або такий їх вміст, що

виходить за межі детектування приладу за даної методики.

Висновок

Зототий вус — тропічна рослина родини коммелінових, поширена в усьому

світі як кімнатна рослина. В народній медицині використовується для

лікування захворювань шлунково-кишкового тракту, дихальної системи,

алергії, раку, володіє протизапальними, знеболювальними,

ранозагоювальними властивостями.

В даній роботі наведені основні морфологічні ознаки каллізії пахучої,

відмінності в будові від схожих видів. Характерною ознакою є наявність

горизонтальних пагонів з редукованими вкороченими товстими

лусководібними листками (“вусів”), за що рослина й отримала свою назву.

Наведений короткий мікроскопічний та анатомічний опис сировини.

Недостатньо вивченим сьогодні є хімічний склад каллізії. Хоча досить

дослідженими є флавоноїди, дубильні речовини, полісахариди, органічні

кислоти, деякі мікроелементи, відкритими для вивчення залишаються

фітостероли, ферменти, алкалоїди, сапоніни й пектинові речовини.

Існує досить велика кількість препаратів золотого вусу, проте, на жаль, усі

вони не є лікарськими засобами, а також серед них нема засобів для

внутрішнього застосування.

У літературі знайдені дані про раніше проведені дослідження якісного й

кількісного складу каллізії, зокрема, проводилися дослідження хімічного

складу соку рослини, визначались кількісно та якісно полісахариди,

поліфеноли, каротиноїди сухої сировини, таніни в свіжій сировині,

поліфеноли та флавоноїди повітряно-сухої сировини каллізії.

Нами також були проведені дослідження, які певною мірою підтвердили

літературні дані, зокрема, визначали вміст амінокислот, карбонових кислот,

дубильних речовин. Підтвердили наявність відновлюючих цукрів та

дубильних речовин. Характерно, що з-поміж усіх видів сировини найбільша

кількість БАР виявилась саме у вусах, що обгрунтовує застосування в

народній медицині саме цієї сировини.

Отже, в ході виконання роботи нами було проведено фармакогностичне

дослідження підземної та надземної частин каллізії пахучої. На основі

вивчення якісного складу та кількісного вмісту БАР з використанням

сучасних методів визначені показники якості та розроблені способи аналізу

сировини каллізії пахучої. За допомогою вперше розроблених нами методів

порівняно вміст БАР листя, стебел, пагонів та коренів каллізії пахучої,

встановлені показники якості сировини каллізії пахучої

Додаток

Проект методик контролю якості на лікарську рослинну сировину

каллізії пахучої

B. СПЕЦИФІКАЦІЯ

Показники

якостіДопустимі межі

Методи

контролю

1 2 3

Опис Шматочки листя, стебел, пагонів різної

форми. Колір від зелено-коричневого до

коричневого, на краю листкової пластинки

є світло-зелена кайма. Запах - слабкий

специфічний.

За п. 1 МКК,

(органоліптичн

о)

Ідентифікація

Флавоноїди

На хроматограмі випробовуваного розчину,

одержаній в умовах описаних у розділі

«Кількісне визначення», часи утримування

піків кверцетину та кемферолу мають

співпадати з часами утримування піків

кверцетину та кемферолу на хроматограмі

розчину порівняння.

(i) За п. 2 А

МКК,

(ii) ДФУ,

2.2.29

(метод рідинної

хроматографії)

Відновлюючі

цукри

Має утворюватися осад цегляно-червоного

кольору.(iii) За п. 2 В

МКК

Втрата в масі при

висушуванні

Не більше 15.0 %.(iv) За п. 3

МКК,

(v) ДФУ

2.2.32.

Загальна зола. не більше 11,03%(vi)

Зола, нерозчинна

в

хлористоводневій

кислоті

не більше 6%(vii)

Домішки

органічні

Домішки

мінеральні

не більше 1%

не більше 1%(viii)

Кількісне

визначення

Флавоноїди

не менше 0,006%(ix) ДФУ,

2.2.29

(метод рідинної

хроматографії)

Мікробіологічна

чистота

У 1 г препарату допускається наявність

життєздатних аеробних мікроорганізмів:

- не більше 100000 бактерій;

- не більше 10000 грибів.

Відсутність E. coli в 1 г.

(x) За п. 8

МКК,

(xi) ДФУ,

2.6.12, 2.6.13,

5.1.4.

Методи контролю

3. Опис

Випробування проводять органоліптично.

Шматочки листя, стебел, пагонів різної форми. В місцях обриву листків

видно залишки нитеподібних жилок. Колір стебел - від світло-

фіолетового до коричнево-фіолетового, колір листків - зелений, на краю

листкової пластинки є світло-зелена кайма. Запах - слабкий специфічний.

4. Ідентифікація

2.А. Флавоноїди

Випробування проводять методом ВЕРХ, згідно вимог ДФУ, 2.2.29.

На хроматограмі випробовуваного розчину, одержаній в умовах описаних

у розділі «Кількісне визначення», часи утримування піків кверцетину та

кемферолу мають співпадати з часами утримування піків кверцетину та

кемферолу на хроматограмі розчину порівняння.

2.В. Відновлюючі цукри

Випробування проводять візуально.

5,0 г подрібненої на порошок сировини поміщають у круглодонну колбу,

додають 100 мл 70% спирту, кип’ятять зі зворотнім холодильником

протягом 30 хв, охолоджують до кімнатної температури, фільтрують

через фільтр «червона лента». До 2 мл одержаного фільтрату додають 2

мл мідно-татратного розчину Р, нагрівають на киплячій водяній бані

протягом 5 хв і охолоджують, утворюється осад цегляно-червоного

кольору.

5. Втрата в масі при висушуванні Не більше 15.0 %.

Випробування проводять згідно вимог ДФУ, 2.2.32.

1,000 г подрібненої на порошок сировини сушать при температурі 105 оС

протягом 2 год.

6. Загальна зола. Не більше 12,0 %.

Випробування проводять згідно вимог ДФУ, 2.4.16.

7. Зола, нерозчинна в хлористоводневій кислоті Не більше 4,0 %.

Випробування проводять згідно вимог ДФУ, 2.8.1.

8. Домішки

1. Органічні. Не більше 1%

2. Мінеральні. Не більше 1%

9. Кількісне визначення

Визначення проводять методом ВЕРХ згідно вимог ДФУ, 2.2.29.

Розчинник. Суміш ацетонітрил : вода (1:1).

Випробовуваний розчин. 10,000 г подрібненої на порошок сировини

поміщають у круглодонну колбу, додають 100 мл 70% спирту,

кип’ятять зі зворотнім холодильником протягом 45 хв, охолоджують

до кімнатної температури, фільтрують через фільтр «синя лента». 2,0

мл одержаного розчину доводять розчинником до 10,0 мл.

Розчин порівняння . 50,0 мг робочого стандартного зразку кемпферолу

та 50,0 мг робочого стандартного зразку кверцетину поміщають у

мірну колбу місткістю 100 мл, додають 60 мл розчинника, витримують

на ультразвуковій бані протягом 10 хв, об’єм розчину доводять тим

самим розчинником до мітки, перемішують.

10,0 мл одержаного розчину доводять рухомою фазою до об'єму 50,0

мл, перемішують і фільтрують через мембранний фільтр 0,45 мкм.

Хроматографування проводять на рідинному хроматографі з УФ-

детектором за наступних умов:

1. колонка з нержавіючої сталі розміром 150 мм х 4,6 мм, заповнена

октадецилсилільним силікагелем для хроматографії (L1) з розміром

часток 5 мкм;

2. Рухома фаза А: 2% розчин оцтової кислоти.

3. Рухома фаза Б: суміш ацетонітрил : вода висоочищена : оцтова кислота у

співвідношенні 500:500:5.

Викоритстовують наступну програму градієнту:

Час, хв Рухома фаза А, %

(об/об)

Рухома фаза Б, %

(об/об)

0→15 100→75 0→25

15→35 75→70 25→30

35→60 70→20 30→80

60→65 20→0 80→100

65→70 0 100

швидкість потоку: 1,4 мл/хв;

температура колонки: 40ºС;

детектування за довжини хвилі: 330 нм, 270 нм і 254 нм;

об’єм проби, що вводиться: 5 мкл.

Хроматографують розчин порівняння. Хроматографічна система вважається

придатною, якщо виконуються наступні умови:

ефективність хроматографічної колонки, розрахована для піків

кверцетину або кемферолу, має бути не менше 1000 теоретичних

тарілок;

коефіцієнт симетрії, розрахований для піку кверцетину або

кемферолу, має бути не більше 2,0;

відносне стандартне відхилення, розраховане для площ піків

кверцетину або кемферолу, має бути не більше 2,0 %.

Хроматографують розчин порівняння і випробовуваний розчин. Вміст

кемпферолу або кверцетину (Хі) у відсотках, розраховують за наступною

формулою:

де: Апр — площа піку кемпферолу або кверцетину на хроматограмі

випробовуваного розчину;

Аст - площа піка кемпферолу або кверцетину на хроматограмі розчину

порівняння;

Сст - концентрація кемпферолу або кверцетину в розчині порівняння, г/мл;

тпр - маса наважки досліджуваної сировини, г;

Р – вміст основної речовини у робочому стандартному зразку кемпферолу або

кверцетину, відповідно, %;

W - втрата в масі при висушуванні, %.

10.Мікробіологічна чистота

Випробування проводять згідно вимог ДФУ 2.6.12, 2.6.13 та 5.1.4.

В 1,0 г сировини допускається наявність:

— життєздатних аеробних мікроорганізмів - не більше 10 5

бактерій і грибів - не більше 104 .

—ентеробактерій і деяких інших грамнегативних бактерій - не більше 103 .

—Escherichia соlі - відсутність.

В 10,0 г сировини має бути відсутність Salmonella.