33

บทท 2

วธการทดลอง

2.1 วสด สารเคม และอปกรณ 2.1.1 วสด

วสดทใชเปนสารตงตนในงานวจยไดแก ฟางขาวของขาวหอม พนธปทมธาน 1 จากจงหวดเชยงใหม

2.1.2 สารเคม สารเคมทใชในงานวจยแสดงดงตาราง 2.1

ตาราง 2.1 สารเคมทใชในการทดลอง

สารเคม สตรโมเลกล เกรด บรษทผผลต เอทานอล C2H5OH AR Carlo Erba Reagents เบนซน C6H6 AR Penreac Sintesis

โซเดยมคลอไรด NaCl AR Merck กรดไฮโดรคลอรก HCl AR Carlo Erba Reagents

ออซนอล CH3C6H3(OH)2 AR Fluka เฟอรรกคลอไรด FeCl3.6H2O AR Carlo Erba Reagents

ไซโลส C5H10O5 AR Himedia กรดซลฟรก H2SO4 AR Lab-Scan Analytical Sciences กรดอะซตก CH3COOH AR Carlo Erba Reagents

โซเดยมคลอไรท NaClO2 AR Ajax Finechem อะซโตน C2H4O AR Fisher Scientific

โซเดยมไฮดรอกไซด NaOH AR Carlo Erba Reagents 3,5 ไดไนโตรซาลไซลก C7H4N2O7 AR Fluka

ฟนอล C6H5OH AR J.T Baker

34

ตาราง 2.1 สารเคมทใชในการทดลอง (ตอ) สารเคม สตรโมเลกล เกรด บรษทผผลต

โซเดยมซลไฟท Na2SO3 AR Scharlau โพแทสเซยมโซเดยมทารเทรต KNaC4H4O6 AR Carlo Erba Reagents

ยสตเอกซแทรก - AR Hardy Diagnostics เพปโทน - AR Hardy Diagnostics กลโคส C6H12O6 AR Ajax Finechem

แอมโมเนยมซลเฟต (NH4)2SO4 AR BDH Laboratory Supplies ไดโพแทสเซยมฟอสเฟต K2HPO4 AR Ajax Finechem

แมกนเซยมซลเฟต MgHO4.7H2O AR Merck แคลเซยมคลอไรด CaCl2.2H2O AR Merck

กรดซตรก C6H8O7.H2O AR Merck โซเดยมซเตรต Na3C6H5O7.2H2O AR Ajax Finechem ทรปโตน C4H11NO3·HCl AR Hardy Diagnostics

คารบอกซเมททลเซลลโลส [C6H7O2(OH)2 CH2COONa]n

AR Hardy Diagnostics

ทวน 80 C64H124O26 AR ศรจนทรสหโอสถ เมทลไอโซบวทวคโตน C6H12O AR Ajax Finechem

2.1.3 เครองมอและอปกรณ

เครองมอและอปกรณทใชในการท าวจย แสดงดงตาราง 2.2

ตาราง 2.2 อปกรณและเครองมอทใชในการท าวจย เครองมอและอปกรณ รน บรษทผผลต

เครองชงละเอยด BA 21OS Sartorius Basic

เครองบด - Retch

เครองรอน AS 200 basis Retch

35

ตาราง 2.2 อปกรณและเครองมอทใชในการท าวจย (ตอ) เครองมอและอปกรณ รน บรษทผผลต

ตะแกรงรอน - Retch

ภาชนะดดความชน - Nalgene

เตาอบ PV-110 Taibai Espect Corp.

เตาเผา 2-525 Series II Eurotherm Electric Furnace

Bomb washing calorimeter No. 1341 Parr Instrumentation Company,

Inc.

CHNS/O Analysis CHN 2000 Leco

SEM JSM 5910 LV JEOL

UV HP 8453 UV-VIS Hewlett Packard

Autoclave 25X-2 Allamerican

ครซเบล - -

ซอกหเลต - Pyrex

รฟลกซ - Pyrex

ชดกลน - Pyrex

กรวยบชเนอร - HCT

ไมโครปเปต Transferpette Brand

เครองปนเหวยง D-78532 Hettich

ตยว SCV-4A1 Streamline

ไวเอล - Agilent

Hot Plate - LMS

ตควบคมอณหภม LIB-080M Jlabtech

36

ตาราง 2.2 อปกรณและเครองมอทใชในการท าวจย (ตอ) เครองมอและอปกรณ รน บรษทผผลต

เครองวอรเทซ MS1 IKA

เครองเขยา SK2DO CTLaboratory

เครองแกสโครมาโตกราฟ G1530A Agilent

2.2 วธการทดลอง

2.2.1 การเตรยมวตถดบ น าฟางขาวไปตากแดดเพอไลความชนออกไปบางสวน และอบทอณหภม 60

องศาเซลเซยส ประมาณ 1 ชวโมง จากนนบดฟางขาวดวยเครองบดดงรป 2.1 และท าการรอนผานตะแกรงคดขนาดดงรป 2.2 ซงฟางขาวทใชมขนาดอนภาคอยในชวง 250-420 ไมโครเมตร แสดงดงรป 2.3

รป 2.1 เครองบด รป 2.2 เครองรอนคดขนาด

37

รป 2.3 ฟางขาว

2.2.2 การวเคราะหปรมาณกลมสาร (24-26)

วธการวเคราะหปรมาณกลมสารของฟางขาวท าการวเคราะหตาม ASTM E 870-82 ซงวธการทดลองและการค านวณแสดงดงภาคผนวก ก

2.2.3 การวเคราะหแบบแยกธาต (27) วธการวเคราะหแบบแยกธาตของฟางขาวท าการวเคราะหตาม ASTM D 3176

2.2.4 การวเคราะหหาคาความรอน และหาปรมาณซลเฟอร (28-29)

2.2.4.1 การวเคราะหหาคาความรอน 1.ชงฟางขาวทผานการคดขนาดแลวประมาณ 1.0000 กรม ใสในแคปซล

(Combustion Capsule) 2.น าแคปซลใสในบอมบ รอยลวด (Fuse Wire) ยาวประมาณ 10

เซนตเมตร ผานตวอยางฟางขาว 3.ปดบอมบแลวเตมออกซเจน 25-35 ความดนบรรยากาศ จากนนไลแกส

ออก แลวเตมออกซเจนเขาไปใหมอกครง 4.ใสบอมบลงในแคลอรมเตอร บคเกต (Calorimeter Bucket) ซงอยใน

แจคเกต (Jacket) 5.ตอวงจรส าหรบการฟวส (Fuse) และใบกวน 6.เตมน ากลนประมาณ 2 ลตร ลงในบคเกต (Bucket)

38

7.ปดฝาแคลอรมเตอร แลวหยอนเทอรโมมเตอรลงไป เรมกวนใบกวนใหอณหภมคงท รอประมาณ 5 นาท

8.เมอถงทสมดล (อณหภมคงทหรอเปลยนแปลงเลกนอย) ใหเรมอานอณหภมทกๆ 1 นาท นาน 5 นาท

9.กดปมอกนชน (Ignition) เรมเกดการเผาไหมในนาทท 6 บนทกอณหภมและเวลาทอานคา (อานคาทก 15 วนาท หรอทก 30 วนาท) ในชวงนอณหภมจะเพมขนอยางรวดเรว จากนนอานคาทกๆ 1 นาท อานตอไปใชเวลาทงหมด 18-20 นาท อณหภมจะเรมคงท ใหบนทกอณหภมทคงทตดตอกน 5 นาท

10.หยดใบกวนแลวเปดฝาแคลอรมเตอร ยกบอมบออก คอยๆปลอยความดนในบอมบใหลดลงจนไมมเสยงอากาศออก

11.ลางภายในบอมบดวยน ากลนใหสะอาด เกบน าทลางไดทงหมดไวในบกเกอร แลวน าไป ไตเตรทกบ 0.0725 นอรมอล (N) โซเดยมคารบอเนต (Na2CO3) ใชเมธลเรด (Methyl Red) หรอเมธลออเรนจ (Methyl Orange) เปนอนดเคเตอร

12.น าสารละลายทไตเตรทแลวไปหาปรมาณซลเฟอร 13.วดลวดทไมถกเผาไหม จากนนน าคาตางๆมาค านวณหาคาความรอน

ของฟางขาว แสดงดงภาคผนวก ข เครองบอมบแคลอรมเตอร แสดงในรป 2.4

2.2.4.2 วธหาปรมาณซลเฟอรในสารตวอยาง 1.น าสารละลายทไตเตรทแลวมาปรบใหมคาความเปนกรดดาง (pH) 5.5-7.0 ดวยแอมโมเนยมไฮดรอกไซด (NH4OH dil.) ใหความรอนกบสารละลายจนเดอด แลวกรองผานกระดาษกรอง ลางดวยน ารอน 5-6 ครง 2.ปรบใหสารละลายมปรมาตร 250 มลลลตร และท าใหเปนกลางดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH 2.5 M) หรอโซเดยมคารบอเนต (Na2CO3 2.0 M) 3.เตมกรดไฮโดรคลอรก (HCl 1:9) 1 มลลลตร ตมใหเดอด 4.เตมสารละลายแบรเลยมคลอไรด (BaCl2 100 กรมตอน า 1 ลตร) 10 มลลลตรอยางชาๆ จากปเปต ตมตอเปนเวลา 15 นาท และตงทงไวอยางนอย 2 ชวโมง หรอตลอดคนทอณหภมต ากวาจดเดอด 5.กรองสารละลายทไดผานกระดาษกรอง Whatman No.42 หรอใกลเคยง เตมสารละลายซลเวอรไนเตรท (AgNO3) 1 หยด ลงไปในของเหลวทกรองได ลางกระดาษกรองดวยน ารอนจนกระทงของเหลวใส

39

6.ใสกระดาษกรองเปยกทมตะกอนของแบเรยมซลเฟต (BaSO4) ในถวยพอสเลนส เผาในเตาไฟฟา (Muffle Furnace) ทอณหภม 800-850 องศาเซลเซยส และใหความรอนจนน าหนกคงท ชงน าหนกกากทเหลอ จากนนค านวณหาปรมาณซลเฟอรของฟางขาว ดงแสดงในภาคผนวก ข

รป 2.4 เครองบอมบแคลอรมเตอร (Bomb Calorimeter)

2.2.5 การวเคราะหองคประกอบทางเคม (30-34) วธการวเคราะหองคประกอบทางเคมของฟางขาว ท าการเตรยมตวอยางฟางขาวท

ปราศจากสารแทรก* ตามวธ TAPPI T264 cm-88 จากนนท าการวเคราะหปรมาณเพนโตแซน (เฮมเซลลโลส) ตามวธ TAPPI T223 cm-84 วเคราะหปรมาณแอลฟาเซลลโลส ตามวธ TAPPI T203 om-88 และวเคราะหปรมาณลกนนโดยวเคราะหตาม TAPPI T222 om-88 ซงแสดงวธการทดลอง และการค านวณแสดงในภาคผนวก ค

หมายเหต *สารแทรก คอ สารทไมใชองคประกอบของโครงสรางของผนงเซลล อาจเปนกรดหรอเปนกลางกได มตงแต สารไอโซพรน เทอรฟน เฮตเตอโรไซคลก กรดเรซนสารโพลฟนอลตางๆ และอลคาลอยด เปนตน และเปนสารประกอบทเปนคณสมบตของพนธไมแตละชนด สารประกอบเหลาน จะท าใหพชแตละชนดมส กลน รส และความแขงทแตกตางกนออกไป สารพวกนมประมาณรอยละ 5 - 30 โดยมวล ซงรวมไปถง สารสวนนอย (Minor Constituent) เปนสารประกอบทกอใหเกดเถา อนไดแก สารประกอบแคลเซยม โปแทสเซยม ฟอสเฟส และซลกา เปนตน สารพวกนมประมาณรอยละ 0.1 – 3 โดยมวล

40

2.2.6 การวเคราะหสณฐานวทยา วเคราะหสณฐานวทยาของฟางขาวโดยใชกลองจลทรรศนอเลกตรอนแบบสอง

กราด (Scanning Electron Microscope; SEM) ทศนยวจยและบรการจลทรรศนศาสตรอเลกตรอน คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม 2.3 การปรบสภาพวตถดบ

1. น าฟางขาวแชน าเปนเวลา 24 ชวโมง 2. ปรบสภาพฟางขาวดวยไอน า ดงรป 2.5 ทความดนประมาณ 1-2 บาร อณหภมประมาณ

100-130 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2, 4, 6 ชวโมง 3. น าฟางขาวทปรบสภาพดวยไอน า มาปรบสภาพตอดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด

เจอจางความเขมขนรอยละ 1, 2, 3 โดยน าหนก ทอณหภมประมาณ 75-90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

4. วเคราะหองคประกอบทางเคมและสณฐานวทยาในสวนของแขง และวเคราะหน าตาลรดวซในสวนทเปนของเหลว

รป 2.5 เครอปรบสภาพดวยไอน า 2.4 การวเคราะหน าตาลรดวซ (35) 1. น าตวอยางปรมาตร 3 มลลลตร ใสลงในหลอดทดลอง

41

2. เตม 1% สารละลายกรดไดไนโตรซาลไซลก (Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution; DNS) ปรมาตร 3 มลลลตรลงในหลอดทดลอง ปดปากหลอด แลวผสมใหเขากน 3. ตมใหเดอนเปนเวลา 5 นาท 4. เตม 40% สารละลายโพแทสเซยมโซเดยมทารเทรต 1 มลลลตร แลวผสมใหเขากน 5. ท าใหเยนโดยผานน าไหล จากนนน าไปวดคาการดดกลนแสงท 575 นาโนเมตร หมายเหต วธการเตรยมสารดงแสดงในภาคผนวก ง 2.5 การหมกน าตาลกลโคส 2.5.1 สภาวะทใชในการหมกน าตาลกลโคส เนองจากจลนทรยทใชในการทดลองนมหลายชนดดงตาราง 2.3 จงตองท าการปรบเปลยน เพอคดเลอกสภาวะทเหมาะสมในการเปลยนน าตาลกลโคสเปนเอทานอลใหไดปรมาณทมากทสด สภาวะทใชในการทดลองน แสดงดงตาราง 2.4

ตาราง 2.3 ชนดของจลนทรยทใชในงานวจย

ประเภท ชอ สญลกษณ ยสต Saccharomyces cerevisiae V1116 S1

Saccharomyces cerevisiae S2 แบคทเรย Zymomonas sp. TISTR1102 Z1

Zymomonas mobilis TISTR550 Z2 รา Mucor indicus M

ตาราง 2.4 การทดลองเพอเลอกสภาวะทสามารถผลตเอทานอลจากน าตาลกลโคสไดใหไดปรมาณสงสด

สภาวะ

จลนทรยแตละชนด

1. S1 2. S2 3. Z1 4. Z2 5. M

42

ตาราง 2.4 การทดลองเพอเลอกสภาวะทสามารถผลตเอทานอลจากน าตาลกลโคสไดใหไดปรมาณสงสด (ตอ)

สภาวะ การท างานรวมกนของยสตและแบคทเรย 6. S1+Z1

7. S2+Z1 การท างานรวมกนของยสตและรา

8. S1+M 9. S2+M

การท างานรวมกนของแบคทเรยและรา 10. Z1+M การท างานรวมกนของยสต แบคทเรย และรา

11. S1+Z1+M 12. S1+Z2+M 13. S2+Z1+M 14. S2+Z2+M

2.5.2 การเพาะเลยงเชอ และการหมก 1. เตรยมอาหารเลยงเชอแสดงดง ภาคผนวก จ 2. น าอาหารทเตรยมในแตละสตรใสขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร ปรมาตร 50

มลลลตร แลวปดดวยจกส าล พรอมหมดวยกระดาษฟอยด 3. น าอาหารเลยงเชอไป Autoclave ท 121 องศาเซลเซยล เปนเวลา 15 นาท 4. น าอาหารทไดมาเตมจลนทรย โดยปรมาตรทใชคอ ยสต 150 ไมโครลตร

แบคทเรย 300 ไมโครลตร และรา 450 ไมโครลตร ในขนตอนนใหท าในต UV Transilluminater จากนนปดดวยจกส าล และฟอยดเหมอนเดม

5. น ามาเขยาท 150 รอบตอนาท เปนเวลา 30 ชวโมง โดยทแตละเชอจะควบคมอณหภม คอ ยสต ท 30 องศาเซลเซยล แบคทเรยและรา ท 28 องศาเซลเซยล

6. เมอครบ 30 ชวโมง น าเชอแตละชนดทเพาะไวมาใสลงในหลอดทดลองขนาด 50 มลลลตร ภายในต UV Transilluminator

7. น าไปเหวยงท 6000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท 8. เทสวนทเปนสารละลายทงและน าสวนทเปนตะกอนเซลลมาผานเครอง Vortex

เพอทจะน าตะกอนเซลลไปใชงายขน

43

9. ชงน าตาลกลโคส 10 กรม ใสในขวดรปชมพขนาด 250 มลลลตร เตม Tween 80 0.1 กรม พรอมทงเตมตะกอนเซลล และปรบปรมาตรดวยน ากลนเปน 100 มลลลตร แลวปดดวยพาราฟลม

10. น ามาเขยาท 150 รอบตอนาท โดยควบคมอณหภมท 28 องศาเซลเซยล 11. น าไปวเคราะหหาปรมาณเอทานอล ในแตละระยะเวลาการหมกท 2, 3, 4, 5,

วน ดวยวธแกสโครมาโตกราฟ ซงในแตละครงของการวเคราะหท าซ า 2 ชดการทดลอง

2.6 การผลตเอทานอลจากฟางขาว ท าการทดลองเชนเดยวกบ 2.5.2 แตท าการเปลยนน าตาลกลโคสเปนฟางขาวทผานการปรบสภาพแลว โดยใชสภาวะทดทสดของจลนทรยทสามารถเปลยนน าตาลกลโคสเปนเอทานอลไดในปรมาณทสงทสด และท าการเตมแบคทเรยทใชในการเปลยนเซลลโลสใหกลายเปนน าตาลกลโคสดวย ซงแบคทเรยทใชม 4 ชนด คอ แบคทเรยทง 4 ชนดทใชในงานวจยนไดมาจากการคดกรองจากธรรมชาต ซงไดรบความอ น เ คร า ะ ห จ าก ห อ งป ฏบ ต ก า รอ ณ ช ว ว ท ย า ภ าคว ช า ช ว วท ย า คณะว ทย า ศ าสต รมหาวทยาลยเชยงใหม 1. pumilus 2. bacilus sp. (1) 3. bacilus sp. (2) 4. bacilus sp. (3) 2.7 วเคราะหหาปรมาณเอทานอล 2.7.1 การท ากราฟมาตรฐานเอทานอล ในขนตอนนใชเมทลไอโซบวทวคโตนเปนตวท าละลาย ซงผลการท ากราฟมาตรฐาน แสดงดงภาคผนวก ฉ 2.7.2 การวเคราะหปรมาณเอทานอลในตวอยาง 1. ปเปตสารละลายปรมาตร 3 มลลลตร ลงในหลอดทดลอง 2. เตมสารละลายเมทลไอโซบวทวคโตน 3 มลลลตรลงในหลอดทดลองปดฝา แลวเขยาใหเขากน

44

3. ปเปตสารละลายสวนบน ปรมาตร 1.5 มลลลตรลงในไวเอล (Vial) แลวปดฝาใหสนท 4. น าไปฉดวเคราะหหาปรมาณเอทานอลดวยเครองแกสโครมาโตกราฟ 2.8 สรปวธการทดลองในงานวจย ในงานวจยนสามารถแบงขนตอนการทดลองไดเปน 2 ขนตอนหลกไดแก

1. ขนตอนในการปรบสภาพ (Pretreatment) 2. ขนตอนการหมก (Simultaneous Saccharification and Fermentation) 2.1 การหมกน าตาลกลโคส 2.2 การหมกฟางขาวทผานกระบวนการปรบสภาพแลว แผนผงสรปงานวจย แสดงดงรป 2.6

45

รปท 2.6 แผนผงสรปงานวจงานวจย

ฟางขาวขนาด 0.25-0.42 มลลเมตร

- ปรมาณกลมสาร

- แบบแยกธาต

- คาความรอน

- ปรมาณซลเฟอร

- องคประกอบทางเคม

- สณฐานวทยา

ปรบสภาพดวยไอน า

2 ชวโมง

- องคประกอบทางเคม

- สณฐานวทยา

-น าตาลรดวซ

4 ชวโมง 6 ชวโมง

46

รปท 2.6 แผนผงสรปงานวจยงานวจย (ตอ)

เลอกสภาวะการปรบสภาพทสามารถลดปรมาณลกนนไดมากทสด

ปรบสภาพดวยโซเดยมไฮดรอกไซด

1 %wt/v 2 %wt/v

3 %wt/v

- องคประกอบทางเคม

- สณฐานวทยา

-น าตาลรดวซ

เลอกสภาวะการปรบสภาพทสามารถลดปรมาณลกนนไดมากทสด

47

+

แบคทเรย

น าตาลกลโคส

ท าการหมก เพอคดหาจลนทรยทสามารถผลตเอทานอล

จากน าตาลกลโคสไดปรมาณมากทสด

จลนทรยแตละชนด

ยสต + แบคทเรย + รา

ยสต + แบคทเรย ยสต + รา

แบคทเรย + รา

เลอกสภาวะทสามารถผลตเอทานอลจากน าตาลกลโคสไดปรมาณมากทสด

เลอกสภาวะการปรบสภาพทสามารถลดปรมาณลกนนไดมากทสด

หมกฟางขาวทผานการปรบสภาพดวยกระบวนการ SSF

วเคราะหปรมาณเอทานอล

รปท 2.6 แผนผงสรปงานวจยงานวจย (ตอ)