16SrRNA 应用的复兴

李军建10808039

摘要 16srRNA 的研究已经成为了描述细菌菌落结构特征的

重要依据。 一种更好的方法：元基因组法。 元基因组：指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

优点：提供了对群落功能潜力的全面观察，而不只是

一个菌落的详细记录。 16srRNA 应用复兴得益于以下技术的发展： 1 、更高的分辨率（可发现更多的序列） 2 、可对多重样本分析（例如跨空间及跨时间样本）。 3 、对元数据的改良，及对元数据的使用。

16srRNA 及元基因组法的对比

16srRNA 具有不寻常的特征 特征 普遍存在性，末端序列守恒，具有一个进化速率变化的区

结构。 在微生物进化和生态学研究中的作用地位： 第一，完全改变了进化的观点。 提供一个客观的系统发生的框架，并在这个框架中分类细

胞生物等级。 第二，通过对直接来自环境中的 16srRNA 的克隆和测序，

证明了微生物的差异远比我们以前基于培养研究的差异要广泛的多。

元基因组是对一个群落的功能研究： 使用高通量的鸟枪法测序 优点： 随机抽样存在于一个栖息地的所有基因而不只

是 16srRNA ，因而提供了对一个群落的功能研究，而不只是对它的种系发育的总结。

结论： 第一步：应用经典的 16srRNA 对群落成分进

行描述（在很大程度上决定了将要使用的测序技术及序列必需的数量 ）

第二步：元基因组分析

16sRNA 序列分析的数据产生和数据分析 1 、测序产生数据 2 、数据分析

数据产生

测序技术： lower Sanger 测序法， 454 pyrosequencing 测序

法及 PhyloChip 测序法（一种测量 16sRNA 的定制微点阵法）

改良的测序技术增加了通量并降低了成本 测序的必要性：虽然花费较高，仍是鉴定新的谱系的

“黄金标准” ，因为只有全长或接近全长的序列才合适来建立精确的系统树。

数据产生1 、 454 pyrosequencing 测序法 ——比按每个碱基计费的

Sanger 测序法要便宜一个数量级 ——能够提高 16s RNA测序的吞吐量和分辩率。

第一代：平均只读出 100bps, 却产生出 20Mbp 的数据，已成为历史。

第二代：平均读出 >200bps ，每次可产生 100Mbp 的数据

第二代：平均读出 >400bps ，每次可产生500Mbp 的数据

数据产生

2 、高密度的微点阵技术 ：使用种系发育的专门的探针 PhyloChip 。

举例： DeSantis et al.使用这样一种芯片对独立环境样品的种系型进行精密区分 ，这不仅证实了大量的被传统克隆测序技术鉴定的分类群，也发现了在克隆中没有被看到的种群，这些种群接着被 taxon 特异的 PCR 随后证实了。

优点：是成本低，速率高。 缺点：只能定向在芯片上鉴别种系型、不能在一个样本

中测定种系丰富的分布。

分析工具 单个样品的研究：运用多样性指数和操作分

类单位（ OTU ）评估法 1 、数据以一些相似率的设定为基础被组织

成 OTUs ， 2 、计算相似性指数，评价不同群落的相似

程度。 3 、应用回归技术，分析变化性（这些变化

性对群落的组成是有意义的，也被应用去联系环境因素下专门的种系发育群的丰度）。

OTU 应用数学方法和电子计算机来研究生物分类问题的边缘学科。又称数值分类学。数值分类学的工作方法大致分为 5 步。①选择所要研究的单位（如品系或种等），所用最低级的实体称为操作分类单位（ OTU＝ Operational Taxonomic Unit）。②选择OTU的性状（ 包括形态学、细胞学、古生物学、生物化学等各种性状）③全面计算相似性 S 。 方法是把一个 OTU与另外的每个OTU作比较，通常用百分比来表示。 S 为百分之百表示完全一致，S 为百分之零则表示没有相似。然后把每个 OTU的 S 系数列成一个相似性表或矩阵。④进行“簇分析”。把相似性矩阵加以重排，把那些彼此有高度相似性的 OTUs集在一起，形成“簇”。将这些簇分阶层地排成树状图，就可以根据具体情况选择不同的相似性水平来代表不同的等级。⑤判别。分类完成后，再倒回去重新检查一下性状，将最稳定的性状作为检索表的特征。数值分类学的方法采用的性状数量多，用计算机运算速度快，所得的结果比较客观。起初用于细菌和病毒等微生物的分类，后来又扩展到高等动植物的分类研究。

物种多样性指数

物种多样性指数是用简单的数值表示群落内种类多样性的程度，用来判断群落或生态系统的稳定性指标。在清洁或良好环境中，生物种类多样大，数量较少；在环境恶化或污染条件下，敏感种类消失，耐污种类发展，种类单纯，但数量可能很大。多样性指数可用来表示环境质量的变化。其优点是对物种名称鉴定要求不严格，应用比较方便。常用的多样性指数有以下几种：丰富度指数、辛普森多样性指数、香农多样性指数。在水质评价中上述指标多用于无脊椎动物，也可用于藻类和周丛生物。

分析工具

新技术 UniFrac 通过对一个特定的样本进行主要的等位分析来鉴别造成不同群落的环境变化。用来测定系统树中的一个独特的分支。

优点：它防止了通常 OTU的任意分配的过程，或是完全依赖基因树的量度来处理数据，因此在种及类水平的不同所占比重比门水平小，但是仍然在全部分析中被考虑到。这个方法已经被应用到环境变化及许多种的研究数据，它通常产生新的生物认识。

缺点：因只要用单一的序列，因此对变化是不敏感的，而这些变化对理解群落对环境变化的反应是很重要的。

分析工具

技术改进——weighted UniFrac 通过分配权重到物种系统进化树的分支来弥补UniFrac

的缺点 。 基于这两种方法测量种群的不同特征， UniFrac 及 wei

ghted UniFrac 应该被看作是方法互补，而不是测量的两种方法。

the main UniFrac screen

分析工具

PSV及 PSE法——基于 rRNA 研究新指标 PSV——种系发育的物种变异 PSE——种系发育的物种均匀度首先：运用这两种方法来得出环境选择的作用与种间竞争作用的对比关系。

如：假如群落的成员间没有关联，那么 PSV等于 1 ，如果所有的成员都密切相关则 PSV等于 0 。

PSE合并了大量的信息，例如当群落成员都密切相关或者群落成员不均衡时 PSE 都会下降。

分析工具

然后：应用排列测验来表明是否群落中的种是欠分散的，或者是过度分散的，例如密切联系的种类趋向于一同发生。

欠分散可能表明环境过滤作用在分生的群落结构中是一个重要的动力，说明应使用其他工具把环境变化和群落的种系联系起来。

分析工具 总之，这些方法中的每一个都有其优缺点，没有工具可以单独描述。 但是，这些实验方法和分析方法使许多实验假设被检测。

个例研究 16S 的研究 ：已从计划型发展到假设型 。 1 、具有了采集多重的跨时间、空间样本的能

力 2 、用其他的度量和深入的研究方法

个例研究个例研究 1 插喉管的病人肺中的微生物多样性及抗生素治疗的作用 发现当肺在短暂的插管期间保持无菌时，长期插管必然会长很

多菌。 有趣的是，虽然病人对呼吸器相关肺炎的主要致病因是阳性的，但是通常对其他的致病的或非致病细菌种类是易感染的。

自相矛盾的是，当病人使用抗生素时，侧面种群的多样性降低了，而目标种群则变得更优势，这可能是形成了生物被膜的结果。同时多样化的减少程度与病人的体弱程度是相关的。

结论：这个研究提供了一个完美的例子来说明在群落被单一成员优势支配时 PhyloChip 分析方法的有用性。

个例研究 到现在为止更多的多样性被通过微点阵技

术显示，而不是通过 PCR 克隆文库来采样。从治疗的过程中采取的个体病人的多重样品的可用性大大增加了群落成分和治疗及病人结果的联系。

个例研究

个例研究 2 RNA 测序已经被用来研究在相似环境中的空间多样

性 在一个对淡水湖的研究中，牛顿调查了 18 种不同的

地域的容许浓度指数的普遍性和数量 。 方法： PSV 和 PSE 的度量方法 结果：被观察到的 11 个独立的容许浓度指数是有意义的欠分散的，分散的模式显示出几乎与距离不相关，但与环境变化相关紧密。例如 PH值显示出在这种群落中环境过滤的强作用。

个例研究

个例研究 3 哺乳动物肠道微生物的研究 在这个领域中很难对进化历史和环境选择的相

对关系分类。许多的研究显示出在不同的哺乳动物肠道中，群落具有很强的相似性，但是这是宿主微生物共生的现象和习性的相似性的结果，还是简单的来自一个共同祖先的后代？

个例研究

Ley et al. 最近在一个研究中解决了这个问题，这个研究系统地描述了哺乳动物的排泄物中 59 种独立的群落，这些哺乳动物来自不同的种系发育谱系，其生活方式差异很大。

结论：研究包括来自 106 个样中的 2000 个序列。使用 UniFrac 和 PCoA 分析工具 ,他们发现宿主系统发育在群落组成上起着决定性的作用，而饮食则起第二主要作用。

结论： 一些新技术的使用保持了 16SrRNA 在微生

物生态和进化研究领域中的中心作用。

谢谢！