·基础研究论著·

ＤＯＩ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ０２５３９８０２２０１７０５００７　基金项目：国家自然科学基金 （８１３６０１３７，８１６００６５４）；广东省自然科学基金 （２０１４Ａ０３０３１００６０，２０１６Ａ０３０３１３４９０）　作者单位：５１０１８０广州，广州市第一人民医院肾内科　通讯作者，傅君舟，Ｅｍａｉｌ：ｆｕｊｚｈｏｕ＠１６３ｃｏｍ

微小 ＲＮＡ１３５ｂ调控 Ｓｍａｄ５在糖尿病肾病发病中的作用研究

何凤　周姗姗　关昌杰　黄俊　陈浩雄　刘日光　傅君舟

【摘要】　目的　探讨微小ＲＮＡ１３５ｂ（ｍｉＲ１３５ｂ）在糖尿病肾病（ＤＮ）发病中的作用及可能机制。方法　应用荧光定量 ＰＣＲ及原位杂交检测 ｍｉＲ１３５ｂ在 ＤＮ肾组织中的表达。采用生物信息学预测ｍｉＲ１３５ｂ的靶基因，并通过蛋白免疫印迹法及检测双荧光素酶报告基因活性进行验证。同时行蛋白免疫印迹法检测ＤＮ系膜细胞增殖及系膜基质相关标志蛋白的表达。结果　实时定量ＰＣＲ显示，ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织中表达较正常肾组织升高（Ｐ＜００５）。原位杂交显示，ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织中表达较正常肾组织增强，且其表达主要位于肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞的胞浆和胞核中。人肾小

管上皮细胞ＨＭＣ及人系膜细胞ＨＫ２在高糖培养２４ｈ时均能上调 ｍｉＲ１３５ｂ的表达，４８ｈ升高更显著，与同时点正常对照培养的ＨＭＣ及ＨＫ２比较差异均有统计学意义（Ｐ均 ＜００５）。人源和鼠源的Ｓｍａｄ５３非翻译区与ｍｉＲ１３５ｂ种子序列的８个碱基 ＵＵＵＣＧＧＵＡ完全互补。ｍｉＲ１３５ｂ模拟物可下调Ｓｍａｄ５的蛋白表达水平，而ｍｉＲ１３５ｂ抑制物对Ｓｍａｄ５的蛋白表达无影响。将Ｓｍａｄ５３非翻译区野生型和突变型质粒分别转染入ＨＭＣ及ＨＫ２，并同时转染ｍｉＲ１３５ｂ模拟物，发现ｍｉＲ１３５ｂ模拟物能抑制Ｓｍａｄ５３非翻译区野生型荧光素酶活性，但对 Ｓｍａｄ５３非翻译区突变体的荧光素酶活性无影响。ｍｉＲ１３５ｂ促进系膜细胞增殖及系膜基质增加 ＨＭＣ细胞转染 ｍｉＲ１３５ｂ模拟物，可有效下调其靶蛋白Ｓｍａｄ５的表达，同时上调增殖核抗原（ＰＣＮＡ）和细胞周期蛋白（ＣｙｃｌｉｎＤ１）表达，且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白ｐ２１表达降低（Ｐ均 ＜００５），但转染 ｍｉＲ１３５ｂ抑制物对 ＰＣＮＡ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１的表达无影响（Ｐ均＞００５）。结论　ＭｉＲ１３５ｂ通过调控Ｓｍａｄ５基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化。

【关键词】　微小核糖核酸１３５ｂ；糖尿病肾病；Ｓｍａｄ５；肾脏纤维化

ＥｆｆｅｃｔｏｆｍｉＲＮＡ１３５ｂｏｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｍａｄ５　ＨｅＦｅｎｇ，ＺｈｏｕＳｈａｎｓｈａｎ，ＧｕａｎＣｈａｎｇｊｉｅ，ＨｕａｎｇＪｕｎ，ＣｈｅｎＨａｏｘｉｏｎｇ，ＬｉｕＲｉｇｕａｎｇ，ＦｕＪｕｎｚｈｏｕＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０１８０，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ＦｕＪｕｎｚｈｏｕ，Ｅｍａｉｌ：ｆｕｊｚｈｏｕ＠１６３ｃｏｍ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ１３５ｂ（ｍｉＲ１３５ｂ）ｏｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ（ＤＮ）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ１３５ｂｉｎｔｈｅｋｉｄｎｅｙｔｉｓｓｕｅｏｆＤＮｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＴｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｏｆｍｉＲ１３５ｂｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈｗａｓｖａｌｉｄａｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｄｏｕｂｌｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓａｄｏｐｔｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍａｒｋｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｅｓａｎｇｉａｌｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅｓａｎｇｉａｌｍａｔｒｉｘＲｅｓｕｌｔｓ　ＲｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ１３５ｂｉｎｔｈｅｋｉｄｎｅｙｔｉｓｓｕｅｏｆＤＮｐａｔｉｅｎｔｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｋｉｄｎｅｙｔｉｓｓｕｅ（Ｐ＜００５）ＩｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ１３５ｂｉｎｔｈｅＤＮｋｉｄｎｅｙｔｉｓｓｕｅｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｋｉｄｎｅｙｔｉｓｓｕｅＩｔｗａｓｍａｉｎｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｔｈｅｇｌｏｍｅｒｕｌｕｓｍｅｓａｎｇｉａｌｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｎｕｃｌｅｕｓｏｆｒｅｎａｌｔｕｂｕｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍｉＲ１３５ｂｗｅｒｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＨＭＣａｎｄＨＫ２ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２４ｈ，ａｎｄｍｏｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｆｏｒ４８ｈ，ｗｈｉｃｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｄｆｒｏｍｔｈｏｓｅｉｎＨＭＣａｎｄＨＫ２ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ａｌｌＰ＜００５）ＨｕｍａｎａｎｄｍｏｕｓｅＳｍａｄ５３ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅ８ｂａｓｅｓｏｆＵＵＵＣＧＧＵＡｉｎｔｈｅｍｉＲ１３５ｂｓｅｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅＭｉＲ１３５ｂｓｉｍｕｌａｎｔｃｏｕｌｄｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆ

７１３新医学２０１７年５月第４８卷第５期

Ｓｍａｄ５ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｅｒｅａｓｍｉＲ１３５ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｘｅｒｔｅｄｎｏｅｆｆｅｃｔｕｐｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｍａｄ５ｐｒｏｔｅｉｎＨＭＣａｎｄＨＫ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｗｉｌｄｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔＳｍａｄ５３ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ，ａｎｄｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ１３５ｂｓｉｍｕｌａｎｔＭｉＲ１３５ｂｓｉｍｕｌａｎｔｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅｎｚｙｍｅｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅＳｍａｄ５３ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ，ｗｈｅｒｅａｓｅｘｅｒｔｅｄｎｏｅｆｆｅｃｔｕｐｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｍｕｔａｎｔＳｍａｄ５３ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎＭｉＲ１３５ｂｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｍｅｓａｎｇｉａｌｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｍｅｓａｎｇｉａｌｍａｔｒｉｘＨＭＣｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ１３５ｂｓｉｍｕｌａｎｔｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎＳｍａｄ５，ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）ａｎｄＣｙｃｌｉｎＤ１ａｎｄｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐ２１ｐｒｏｔｅｉｎ（ａｌｌＰ＜００５）Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｉＲ１３５ｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｘｅｒｔｅｄｎｏｅｆｆｅｃｔｕｐｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＣＮＡ，ＣｙｃｌｉｎＤ１ａｎｄｐ２１（ａｌｌＰ＞００５）ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＭｉＲ１３５ｂｐｒｏｍｏｔｅｓｍｅｓａｎｇｉａｌｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｋｉｄｎｅｙｆｉｂｒｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳｍａｄ５ｇｅｎｅ

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　ＭｉｃｒｏＲＮＡ１３５ｂ；Ｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ；Ｓｍａｄ５；Ｋｉｄｎｅｙｆｉｂｒｏｓｉｓ

　糖尿病是一种严重危害公众健康的慢性代谢性疾病，累及全身多个器官，致死率和致残率高［１］。

糖尿病肾病 （ＤＮ）是糖尿病常见的微血管并发症，也是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一［２］。微

小ＲＮＡ（ｍｉＲ）是一种内源性非编码的小分子 ＲＮＡ，通过碱基配对与靶 ｍＲＮＡ的３非翻译区结合，形成 ＲＮＡ诱导的基因沉默复合体 （ＲＩＳＣ），降解靶ｍＲＮＡ或阻遏其转录后翻译，抑制基因表达［３］。

研究已证实，ｍｉＲ在个体发育、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等多种生理和病理过程发挥调控作

用［４５］。既往多项研究显示，多种 ｍｉＲ在肾脏表达，并且其异常调控与肾脏功能失调和肾脏疾病密

切相关［６７］。尤其是近几年，ｍｉＲ在 ＤＮ发生、发展过程中的重要作用受到了广泛关注。已发现

ｍｉＲ１３５ｂ在糖尿病患者血清中高表达，但 ｍｉＲ１３５ｂ在 ＤＮ中的表达及作用未见报道［６］。为此，

本研究探讨 ｍｉＲ１３５ｂ在 ＤＮ发病中的表达水平、作用及机制，现报告如下。

材料与方法

一、标本来源

本研究的肾组织病理蜡块来源于广州市第一人

民医院病理科。本研究经医院伦理委员会批准。人

肾小管上皮细胞株 ＨＫ２和人系膜细胞株 ＨＭＣ均购于美国ＡＴＣＣ公司。

二、主要试剂

ｍｉＲ１３５ｂ模拟物、ｍｉＲ１３５ｂ抑制物及 ｈａｓｍｉＲ１３５ｂ和 Ｕ６的引物均购于广州锐博生物公司。ｍｉＲＶａｎａＴＭＰＡＲｌＳＴＭＫｉｔ购于美国 ＡＢＩ生物公司。ｉＳｃｒｉｐＴＭｃＤＮＡＳｙｎｔｈｓｉｓＫｉｔ购于美国 ＢＩＯＲＡＤ生物公司。ＱＰＣＲ的 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭｉｘＫｉｔ购于日本Ｔａｋａｒａ公司。葡萄糖、甘露醇均购于美国 Ｓｉｇｍａ公司。双荧光素酶报告基因的载体 ｐｍｉＲＲＢＲＥ

ＰＯＲＴＴＭｖｅｃｔｏｒ及人源Ｓｍａｄ５３非翻译区的 ＷＴ及ＭＵＴ克隆均购于广州锐博生物公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Ｓｉｇｍａ公司。原位杂交试剂盒购于美国 Ｅｘｉｑｏｎ公司。小鼠抗 Ｓｍａｄ５单克隆抗体、小鼠抗 ｐ２１单克隆抗体购于美国 ＣＳＴ公司。小鼠抗 βａｃｔｉｎ单克隆抗体、山羊抗小鼠ＩｇＧ、山羊抗兔 ＩｇＧ购于美国 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；小鼠抗 Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ单克隆抗体、小鼠抗 ＣｏｌｌａｇｅｎⅠ（ＣｏｌⅠ）单克隆抗体购于美国 ＢＤ公司；小鼠抗ＰＣＮＡ单克隆抗体、兔抗细胞周期蛋白 Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１）多克隆抗体购于美国Ａｂｃａｍ公司。

三、方　法１ｍｉＲ１３５ｂ表达水平的检测采用实时定量 ＰＣＲ检测 ｍｉＲ１３５ｂ在 ＤＮ肾组

织中的表达，对照来自于临床肾癌切除时选取的远

离癌旁的正常肾组织，另外采用正常培养（含５５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）、甘露醇高渗（５５ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖加１９５ｍｍｏｌ／Ｌ甘露醇）培养和高糖（３０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）培养ＨＭＣ及ＨＫ２细胞１２、２４、４８ｈ，各组均有６份样品，每份样品重复检测３次。先利用ｍｉＲＶａｎａＴＭ ＰＡＲｌＳＴＭＫｉｔ提取包括 ｍｉＲ在内的总ＲＮＡ。采用 ｉＳｃｒｉｐＴＭ ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｓｉｓＫｉｔ逆转录为模板ＤＮＡ，然后使用 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭｉｘＫｉｔ进行定量ＰＣＲ，每份样本设３个复孔，具体按说明书操作。所有反应均应用ＡＢＩ７５００实时定量ＰＣＲ仪完成。２ｍｉＲ１３５ｂ的表达及定位检测采用原位杂交法，取ＤＮ肾组织及正常肾组织

石蜡标本切片，常规脱蜡至水，３％Ｈ２Ｏ２室温作用１０ｍｉｎ，水洗２次，然后加入３％柠檬酸２ｍｌ和４滴胃蛋白酶浓缩液，混匀，３７℃消化 １０～２０ｍｉｎ暴露 ｍｉＲ片段。磷酸盐缓冲液水洗后依次按照原位杂交试剂盒说明书步骤进行预杂交和杂交，然后

依次封闭、滴加生物素化鼠抗地高辛置室温１ｈ、

８１３ 新医学２０１７年５月第４８卷第５期

滴加生物素化过氧化酶置室温３０ｍｉｎ、二氨联苯胺（ＤＡＢ）显 色 并 苏 木 素 染 核。使 用 ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＲｅｌ４６（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）拍摄图像。采用生物信息学预测ｍｉＲ１３５ｂ的靶基因，生物信息学预测网站 ｍｉＲａｎｄａ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ；ＰｉｃＴａｒ：ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒｍｄｃｂｅｒｌｉｎｄｅ／；Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ ｔａｒｇｅｔｓｃａｎｏｒｇ／。３Ｓｍａｄ５报告基因载体的构建利用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计人源 Ｓｍａｄ５基因（ＮＭ＿

００１００１４１９２）３非翻译区的引物，两端分别引入ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ的酶切位点序列，提取 ＨＭＣ细胞基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增并克隆人 Ｓｍａｄ５基因的３非翻译区，序列测定确认后，将片段插入到荧光素酶报告载体 ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ的 ＭＣＳ区域，构建Ｓｍａｄ５荧光素酶报告野生型基因载体 ｐＧＬ３Ｓｍａｄ５ｗｔ。同时采用类似的方法构建突变型基因载体ｐＧＬ３Ｓｍａｄ５ｍｕｔ，仅将预测的 ｍｉＲ１３５ｂ的结合位点 ＡＡＡＧＣＣＡ突变为 ＵＵＵＣＧＧＵ，使 ｍｉＲ１３５ｂ与Ｓｍａｄ５３非翻译区不能互补。４报告基因的活性检测分别设为 ｍｉＲ１３５ｂ＋ｐＧＬ３、ｍｉＲ１３５ｂ＋ｐＧＬ３

Ｓｍａｄ５ｗｔ（２０、５０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ｍｉＲ１３５ｂ＋ｐＧＬ３Ｓｍａｄ５ｍｕｔ（２０、５０ｎｍｏｌ／Ｌ）组，每组设６个复孔，分别加入各组转染好的 ＨＭＣ及 ＨＫ２细胞，在 ６孔板中每孔加入１倍稀释的裂解液２５０μｌ，室温下轻轻振摇 ２０ｍｉｎ，摇匀后把裂解物转吸至 ＥＰ管中，高速离心３０ｓ。把上清转至新的 ＥＰ管中，检测荧光素酶活性：在５０μｌ的底物溶液１（荧光素酶分析试剂Ⅱ）内加入１０μｌ细胞裂解液，用枪尖轻轻混匀２～３次 （每个样品混匀的次数一致）后

加仪器内检测。取出检测管，加入５０μｌＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ试剂，混合后检测双荧光素酶报告基因活性，记录

比值，保存数据。分析数据时将对照组归一化，比

较实验组与对照组的报告基因活性。

５蛋白免疫印迹检测分别在 ＨＭＣ和 ＨＫ２细胞中转染空白载体、

ｍｉＲ１３５ｂ模拟物和ｍｉＲ１３５ｂ抑制物，浓度均为５０ｎｍｏｌ／Ｌ，４８ｈ后采用蛋白免疫印迹法检测 Ｓｍａｄ５的蛋白表达。收集转染好的 ＨＥ２和 ＨＭＣ细胞裂解液，冰中静置３０ｍｉｎ，离心，取上清，加蛋白载样缓冲液，煮沸１０ｍｉｎ，瞬时高速离心，分别取不同样品的总蛋白５０μｇ经１０％聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）凝胶电泳后，转移至聚偏氟乙烯

（ＰＶＤＦ）膜上，用５％脱脂奶粉溶液室温封闭１ｈ，加入相应的抗体，４℃过夜。洗膜后，再加辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的二抗，室温孵育１ｈ，洗膜后进行显色，曝光于 Ｘ线胶片上，图像分析系统进行灰度扫描，用ＩｍａｇｅＪ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。以 βａｃｔｉｎ为内参，用目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值代表目的蛋

白的相对表达含量。同法检测 ＨＭＣ的细胞周期和细胞外基质相关蛋白的表达水平，包括增殖核抗原

（ＰＣＮＡ）、ＣｙｃｌｉｎＤ１、细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白ｐ２１、纤维粘连蛋白 Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和胶原成分ＣｏｌＩ。

四、统计学处理

采用ＳＰＳＳ１７０分析数据。计量资料以珋ｘ±ｓ表示。２组样本均数的比较采用ｔ检验。多组间样本均数的比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较

采用ＬＳＤｔ检验。Ｐ＜００５为差异有统计学意义。

结　　果

一、ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织及高糖刺激的条件下表达情况

实时定量 ＰＣＲ显示，ｍｉＲ１３５ｂ在 ＤＮ肾组织中表达较正常肾组织升高（Ｐ＜００５），见图 １Ａ。原位杂交显示，ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织中表达较正常肾组织增强，且其表达主要位于肾小球系膜细胞

及肾小管上皮细胞的胞浆和胞核中，见图１Ｂ。高糖培养的 ＨＭＣ及 ＨＫ２在 ２４ｈ时均能上调 ｍｉＲ１３５ｂ的表达，４８ｈ升高更显著，与同时点正常对照及甘露醇高渗培养的 ＨＭＣ及 ＨＫ２比较差异均有统计学意义 （Ｐ均＜００５），见图１Ｃ～Ｄ。

二、ｍｉＲ１３５ｂ对 Ｓｍａｄ５基因的靶向调控生物信息学显示，人源和鼠源的 Ｓｍａｄ５３非

翻译区与 ｍｉＲ１３５ｂ种子序列的８个碱基 ＵＵＵＣＧＧＵＡ完全互补，见图２Ａ。ｍｉＲ１３５ｂ模拟物可下调Ｓｍａｄ５的蛋白表达水平，而 ｍｉＲ１３５ｂ抑制物对Ｓｍａｄ５的蛋白表达无影响，见图 ２Ｂ。Ｓｍａｄ５３非翻译区的荧光素酶报告基因载体见图 ２Ｃ。将Ｓｍａｄ５３非翻译区野生型和突变型质粒分别转染入ＨＭＣ及 ＨＫ２，并同时转染 ｍｉＲ１３５ｂ模拟物，发现ｍｉＲ１３５ｂ模拟物能抑制 Ｓｍａｄ５３非翻译区野生型荧光素酶活性（Ｐ均 ＜００５），但对 Ｓｍａｄ５３非翻译区突变体的荧光素酶活性无影响（Ｐ均 ＞００５），见图２Ｄ。

９１３新医学２０１７年５月第４８卷第５期

图１　ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织及高糖刺激条件下的表达情况Ａ：实时定量ＰＣＲ，与正常肾组织比较，Ｐ＜００５；Ｂ：原位杂交，箭头所示为ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织的表达及定位；

Ｃ：实时定量ＰＣＲ，ｍｉＲ１３５ｂ在ＨＭＣ正常培养、甘露醇高渗培养及高糖培养条件下中的表达，与正常培养及甘露醇高渗培养比较，Ｐ!

００５；Ｄ：实时定量ＰＣＲ，ｍｉＲ１３５ｂ在ＨＫ２正常培养、甘露醇高渗培养及高糖培养条件下中的表达，与正常培养及甘露醇高渗培养比较，Ｐ!

００５

图２　ｍｉＲ１３５ｂ对 Ｓｍａｄ５的靶向调控Ａ：人和鼠源ｍｉＲ１３５ｂ的Ｓｍａｄ５３非翻译区的结合位点；Ｂ：ＨＭＣ和 ＨＫ２细胞中转染空白载体、ｍｉＲ１３５ｂ模拟物、

ｍｉＲ１３５ｂ抑制物后Ｓｍａｄ５的蛋白表达情况；Ｃ：Ｓｍａｄ５３非翻译区的野生型和突变型的序列；Ｄ：ｍｉＲ１３５ｂ对 Ｓｍａｄ５３非翻译区野生型和突变型的双荧光素酶活性的影响，与ｍｉＲ１３５ｂ＋ｐＧＬ３及ｍｉＲ１３５ｂ＋ｐＧＬ３Ｓｍａｄ５ｍｕｔ比较，Ｐ＜００５

　三、ｍｉＲ１３５ｂ对ＨＭＣ细胞周期和细胞外基质相关蛋白表达的影响

ｍｉＲ１３５ｂ促进系膜细胞增殖及系膜基质增加ＨＭＣ细胞转染ｍｉＲ１３５ｂ模拟物，可有效下调其靶蛋白 Ｓｍａｄ５的表达，同时上调 ＰＣＮＡ和 ＣｙｃｌｉｎＤ１

表达，且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白

ｐ２１表达降低 （Ｐ均＜００５），但转染 ｍｉＲ１３５ｂ抑制物对 ＰＣＮＡ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１的表达无影响 （Ｐ均＞００５）。ｍｉＲ１３５ｂ可促进纤维粘连蛋白 Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和胶原成分ＣｏｌＩ的表达，见图３。

０２３ 新医学２０１７年５月第４８卷第５期

图３　ｍｉＲ１３５ｂ对ＨＭＣ细胞周期和细胞外基质相关蛋白表达的影响Ａ：ｍｉＲ１３５ｂ对Ｓｍａｄ５、ＰＣＮＡ、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和ＣｏｌＩ表达影响的蛋白免疫印迹检测结果；Ｂ～Ｇ：定量

分析结果，与无 ＲＮＡ、正常对照及 ｍｉＲ１３５ｂ抑制物组比较，Ｐ＜００５

讨　　论

ｍｉＲ在各种组织和细胞中都有表达，且存在组织特异性［４］。ｍｉＲ１３５ｂ具有促进肝癌的侵袭和转移，促进气道炎症介质（白三烯）分泌，通过靶向

调控ＬＡＴＳ２促进乳腺癌细胞周期进展等作用。目前的研究表明，ｍｉＲ１３５ｂ在肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中呈高表达［８１２］。ｍｉＲ１３５ｂ在肾脏疾病中的表达及作用的相关报道较少。本研究应用实时定量 ＰＣＲ和原位杂交检测 ＤＮ患者肾组织中 ｍｉＲ１３５ｂ的表达，发现 ｍｉＲ１３５ｂ在ＤＮ肾组织中表达较对照组升高，且表达主要位于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，提示 ｍｉＲ１３５ｂ可能参与ＤＮ的发病过程。

ｍｉＲ是通过与靶基因的３非翻译区不完全或者完全互补，降解 ｍＲＮＡ或抑制其翻译，进而抑制靶基因的表达。通过目前已有的软件分析发现，

１／３的蛋白编码基因可能为ｍｉＲ的靶基因［３］。本研

究利用 ｍｉＲａｎｄａ、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ和 ＰｉｃＴａｒ等生物学信息网站预测分析，发现 Ｓｍａｄ５是多个数据库共同命中的ｍｉＲ１３５ｂ靶基因，并找出其可能结合的位点。Ｓｍａｄ５主要通过骨形成蛋白（ＢＭＰ）受体磷酸

化，介导 ＢＭＰ７信号转导，具有保护肾功能及肾脏纤维化的作用［１３］。本研究通过转染 ｍｉＲ１３５ｂ的模拟物和抑制物，发现 ｍｉＲ１３５ｂ与 Ｓｍａｄ５的表达有关。研究进一步构建 Ｓｍａｄ５３非翻译区荧光素酶报告基因的野生型载体和突变型载体，并分别转

染ＨＭＣ和ＨＫ２细胞，通过检测荧光素酶活性以明确 ｍｉＲ１３５ｂ和 Ｓｍａｄ５的靶向关系。结果显示，ｍｉＲ１３５ｂ通过与Ｓｍａｄ５的３非翻译区特异位点的结合抑制其表达，进一步证实了 ｍｉＲ１３５ｂ靶向调控Ｓｍａｄ５的表达，提示 ｍｉＲ１３５ｂ可能通过靶向下调Ｓｍａｄ５表达促进肾脏纤维化。

ＤＮ的主要特征包括：肾小球肥大、肾小球系膜细胞增殖及系膜区细胞外基质增生、肾小球毛细

血管基底膜增厚、肾小管间质纤维。本研究使用高

糖分别刺激 ＨＭＣ和 ＨＫ２细胞，发现均能上调ｍｉＲ１３５ｂ的表达。研究并在ＨＭＣ细胞中转染正常对照、ｍｉＲ１３５ｂ模拟物和 ｍｉＲ１３５ｂ抑制物，发现ｍｉＲ１３５ｂ靶向下调 Ｓｍａｄ５的表达，上调增殖核抗原ＰＣＮＡ和细胞周期蛋白 ＣｙｃｌｉｎＤ１表达，且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白 ｐ２１表达下调，并且 ｍｉＲ１３５ｂ还能上调 Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ和 ＣｏｌＩ的表达，使细胞外基质增加。因此，ｍｉＲ１３５ｂ可能通

１２３新医学２０１７年５月第４８卷第５期

过靶向调控 Ｓｍａｄ５基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化，研究结果为深入认识 ＤＮ的发病机制提供了科学依据。

参 考 文 献

［１］ ＴｓａｉＳ，ＣｌｅｍｅｎｔｅＣａｓａｒｅｓＸ，ＲｅｖｅｌｏＸＳ，ＷｉｎｅｒＳ，Ｗｉｎｅｒ

ＤＡＡｒｅｏｂｅｓｉｔｙｒｅｌａｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓａｕ

ｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ？Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１５，６４（６）：１８８６１８９７

［２］ ＨｅＦ，ＸｉａＸ，ＷｕＸＦ，ＹｕＸＱ，ＨｕａｎｇＦＸＤｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ

ｉｎｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅ

ｔｅｓａｎｄｒｅｎａｌｄｉｓｅａｓｅ：ａｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓＤｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２０１３，５６

（３）：４５７４６６

［３］ ＬｅｅＹ，ＫｉｍＭ，ＨａｎＪ，ＹｅｏｍＫＨ，ＬｅｅＳ，ＢａｅｋＳＨ，ＫｉｍＶＮ

ＭｉｃｒｏＲＮＡｇｅｎｅｓａｒｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｂｙＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩＥＭＢＯ

Ｊ，２００４，２３（２０）：４０５１４０６０

［４］ ＫｌｏｏｓｔｅｒｍａｎＷＰ，ＰｌａｓｔｅｒｋＲＨＴｈｅｄｉｖｅｒｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｍｉｃｒｏＲ

ＮＡｓｉｎａｎｉｍａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｄｉｓｅａｓｅＤｅｖＣｅｌｌ，２００６，１１

（４）：４４１４５０

［５］ ＳｔｅｆａｎｉＧ，ＳｌａｃｋＦＪＳｍａｌｌｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓｉｎａｎｉｍａｌｄｅｖｅｌｏｐ

ｍｅｎｔＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００８，９（３）：２１９２３０

［６］ ＬｏｒｅｎｚｅｎＪＭ，ＨａｌｌｅｒＨ，ＴｈｕｍＴＭｉｃｒｏＲＮＡｓａｓｍｅｄｉａｔｏｒｓａｎｄ

ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅＮａｔＲｅｖＮｅｐｈｒｏｌ，

２０１１，７（５）：２８６２９４

［７］ ＨｅＦ，ＰｅｎｇＦ，ＸｉａＸ，ＺｈａｏＣ，ＬｕｏＱ，ＧｕａｎＷ，ＬｉＺ，ＹｕＸ，

ＨｕａｎｇＦＭｉＲ１３５ａｐｒｏｍｏｔｅｓｒｅｎａｌｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｎｅｐｈｒｏｐａ

ｔｈｙｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＴＲＰＣ１Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２０１４，５７（８）：１７２６

１７３６

［８］ ＪｕｎｇＨＳ，ＳｅｏＹＲ，ＹａｎｇＹＭ，ＫｏｏＪＨ，ＡｎＪ，ＬｅｅＳＪ，ＫｉｍＫＭ，

ＫｉｍＳＧＧα１２ｇｅｐｏｎｃｏｇｅｎｅｉｎｈｉｂｉｔｓＦＯＸＯ１ｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ

ｃａｒｃｉｎｏｍａａｓａｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｍｉＲ１３５ｂａｎｄｍｉＲ１９４ｄｙｓｒｅｇｕ

ｌａｔｉｏｎＣｅｌｌＳｉｇｎａｌ，２０１４，２６（７）：１４５６１４６５

［９］ ＮｅｚｕＹ，ＨａｇｉｗａｒａＫ，ＹａｍａｍｏｔｏＹ，ＦｕｊｉｗａｒａＴ，ＭａｔｓｕｏＫ，Ｙｏ

ｓｈｉｄａＡ，ＫａｗａｉＡ，ＳａｉｔｏＴ，ＯｃｈｉｙａＴｍｉＲ１３５ｂ，ａｋｅｙｒｅｇｕｌａ

ｔｏｒｏｆｍａｌｉｇｎａｎｃｙ，ｉｓｌｉｎｋｅｄｔｏｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｈｕｍａｎｍｙｘｏｉｄ

ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａＯｎｃｏｇｅｎｅ，２０１６，３５（４８）：６１７７６１８８

［１０］ ＨｕａＫ，ＪｉｎＪ，ＺｈａｏＪ，ＳｏｎｇＪ，ＳｏｎｇＨ，ＬｉＤ，ＭａｓｋｅｙＮ，Ｚｈａｏ

Ｂ，ＷｕＣ，ＸｕＨ，ＦａｎｇＬｍｉＲ１３５ｂ，ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｂｒｅａｓｔ

ｃａｎｃｅｒ，ｐｒｏｍｏｔｅｓｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｓｒｕｐｔｓｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｂｙｒｅｇｕ

ｌａｔｉｎｇＬＡＴＳ２ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ，２０１６，４８（５）：１９９７２００６

［１１］ ＶｉｄａｌＡＦ，ＣｒｕｚＡＭ，ＭａｇａｌｈｅｓＬ，ＰｅｒｅｉｒａＡＬ，ＡｎａｉｓｓｉＡＫ，

ＡｌｖｅｓＮＣ，ＡｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅＰＪ，ＢｕｒｂａｎｏＲＭ，ＤｅｍａｃｈｋｉＳ，Ｒｉｂｅｉ

ｒｏｄｏｓＳａｎｔｏｓ?ｈｓａｍｉＲ２９ｃａｎｄｈｓａｍｉＲ１３５ｂｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘ

ｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｉｏｍａｒｋｅｒｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓＷｏｒｌｄＪ

Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１６，２２（６）：２０６０２０７０

［１２］ ＦｅｔａｈｕＩＳ，ＴｅｎｎａｋｏｏｎＳ，ＬｉｎｅｓＫＥ，ＧｒｓｃｈｅｌＣ，ＡｇｇａｒｗａｌＡ，

ＭｅｓｔｅｒｉＩ，ＢａｕｍｇａｒｔｎｅｒＰａｒｚｅｒＳ，ＭａｄｅｒＲＭ，ＴｈａｋｋｅｒＲＶ，

ＫáｌｌａｙＥｍｉＲ１３５ｂａｎｄｍｉＲ１４６ｂｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｃａｌ

ｃｉｕｍｓｅｎｓｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｔｕｍｏｒｓＩｎｔＪＣａｎｃ

ｅｒ，２０１６，１３８（１）：１３７１４５

［１３］ ＹｕＺ，ＺａｉＣｈｕｎＸ，ＷｕｎＬｕｎＨ，ＹｕｎＹｕｎＺＢＭＰ７ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ

ＴＧＦβ１ｉｎｄｕｃｅｄｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＮＲＫ５２Ｅ

ｃｅｌｌｓｂｙｔｈｅｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲＮＡ２１ＯｎｃｏｌＲｅｓ，２０１６，２３

（４）：１４７１５４

（收稿日期：２０１７０１１６）

（本文编辑：林燕薇）

２２３ 新医学２０１７年５月第４８卷第５期