第四章： DNA 纯化后的利用

在基因克隆实验中，一旦纯净 DNA 样品被制备出来，接下来的一步就是重组 DNA 分子的构建。为了得到重组分子，载体分子和将要被克隆的 DNA 都必须在特定的位点被切开并以可控的方式连接一起。切开和连接是 DNA 操作的两个基本技术。除了切开和连接外， DNA 分子还能够被切短、延长，或被转录、复制，或通过添加和去除一些化学基团而被修饰。所有这些操作能够在试管中进行。

几乎所有的 DNA 操作技术都需要使用纯净的酶。在细胞中，这些酶参与诸如 DNA 复制和转录，多余的或外来的 DNA 的降解，突变的修复，以及 DNA 重组等过程。从细胞提取物中纯化后，很多这样的酶能够在人工条件下催化其天然反应，或非常类似的反应。尽管这些反应都是直接的，但界大多数无法用化学方法实现。因此，纯化的酶对于基因工程是非常关键的，同时，其制备、性质的研究和市场买卖已经形成了一个重要的产业。

4.1 DNA 操作酶的种类

DNA 操作酶根据其催化的反应可以分为 5大类：（ 1）核酸酶（ nucleases ），切开或降解核酸分子。

（ 2）连接酶（ ligases ），将核酸分子连接起来。（ 3）聚合酶（ polymerases ），复制核酸分子的酶。

（ 4）修饰酶（ modifying enzyme ），去除或添加化学基团的酶。

（ 5）拓扑异构酶（ topoisomerases ），向共价闭合环状 DNA 分子中引入或消除超螺旋。

4.1.1 核酸酶

核酸酶通过打断 DNA 分子中相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键来水解 DNA 分子。它们可以分为两类：

（ 1）外切核酸酶，从 DNA 分子的末端一个一个地切除核苷酸。

（ 2）内切核酸酶，从 DNA 分子内部打断磷酸二酯键。而内切酶可以在多核苷酸链内的不同位置水解磷酸二酯键。

外切核酸酶又分为两种，一种能够从双链 DNA 分子的两条链上同时切除核苷酸，比如 Bal31 ，用 Bal31 作用于 DNA 分子的时间越长，所制得的 DNA 片断就越短。相反，大肠杆菌外切酶 III 只能够切开DNA 双链中的某一条链。（ Exonuclease III 具有从双链 DNA 的 3'-OH末端降解生成 5'-单核苷酸的3'→5' 外切酶活性。本酶对双链 DNA 具有高度特异性，能降解平滑末端、 3'凹陷末端及有切口的 DNA ，但是不能降解 3'- 突出末端。通过部分降解双链 DNA 片段，产生一部分单链 DNA 片段，作 DNA 聚合酶的底物。）

5'P

P5'3'HO

OH3'

核酸酶 Bal31 的活性

5'P 5'P

5'P 5'P

5'P

3'HO 3'HO

3'HO

3'HO

3'HO

3'HO3'HO

3'HO

OH3' OH3'

OH3'

OH3'

P5'

P5' P5'

P5'

P5'P5'

P5'

3'HO

P5'

OH3'

P5'

RNaseH

ExoIII 的外切酶和 RNaseH 的作用

同样的规则也适用于内切核酸酶， S1 内切核酸酶只切断单链，然而从牛胰腺中制得的脱氧核糖核酸酶I（ DNaseI ）既能够切断单链也能够切断双链。 DNaseI 是一种非特异的内切酶，能够打断 DNA 内部的任意磷酸二酯键，另一方面，称作限制性内切酶的一组特殊的酶能够在特定的位点切开双链 DNA 分子。

ExoIII

S1

S1 S1

S1

S1

S1

Poly(A)

Poly(A)

5'

5'

5'

5'

5'

5'

核酸酶 S1 活性

Mn++ 存在时 Mg++ 存在时

DNaseI作用特点

DNaseI

HO P5’ 3’

5’ 3’5’ 3’

DNaseI 与Pol I 的

切口移位 Pol I

4.1.2 连接酶

细胞中连接酶作用是修复单链上的切口（断裂），这些断裂是在 DNA 分子复制的过程中形成的。

DNA 聚合酶能够合成一条与已知模板 DNA 或 RNA互补的 DNA 链，通常只有当模板上具有引物时，聚合酶才能发挥作用。 基因工程中通常用到 4种 DNA 聚合酶。第一种是 DNA 聚合酶 I，它是从大肠杆菌中制得的。当双链 DNA分子中存在一个短的单链区时， DNA 聚合酶 I会以单链区为模板，合成互补链填补缺口。 DNA 聚合酶 I具有多种酶活性它除具备 5’至 3’的合成酶活性，还具备 5’至 3’DNA 水解酶活性。

4.1.3 聚合酶

DNA 聚合酶 I的聚合酶活性和水解酶活性受到酶分子上不同部位的控制。其中，水解酶活性包含在多肽链前 223 个氨基酸中，因此切掉此部分后所得到的经过修饰的酶仍保留 DNA 聚合酶的活性，但已经不能再水解 DNA 了。这种修饰后的酶称作 Klenow片段。

在 PCR中使用的 Taq DNA 聚合酶是细菌 Thermus aquaticus 中的 DNA 聚合酶 I。这种细菌生活在温度很高的温泉中，因此它的许多酶都是热稳定性的，包括Taq聚合酶。这就意味着它们能够在热处理的条件下保证不会发生变性。正是这一特殊性质使得 Taq聚合酶适用于 PCR反应。如果它不具有热稳定性，当温度升到 94 C使 DNA 变性时，聚合酶也会因变性而失活。 基因工程中最后一种 DNA 聚合酶是逆转录酶。这是一种参与一些病毒基因组复制的酶。这种酶以 RNA 为膜板合成一条互补的 DNA （ cDNA ）。

4.1.4 DNA 修饰酶

通过添加或删除化学基团来修饰 DNA 分子的酶，统称为 DNA 修饰酶。下面将对其中一些最重要的酶加以介绍：（ 1）碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ）（从大肠杆菌、牛肠组织、北极虾中提取），去除 DNA 分子的 5’磷酸基团。（ 2）多核苷酸激酶 (polynucleotide kinase)（从T4噬菌体侵染的大肠杆菌细胞中提取），和碱性磷酸酶的活性相反，在 DNA 分子 5’游离末端添加磷酸基团。

4.1.5 拓扑异构酶最后一类 DNA 操作酶是拓扑异构酶，它能够通过引入或去除超螺旋来改变共价闭合环状 DNA 的构象。尽管它的重要性主要体现在 DNA 复制的研究中，但是在基因工程中也占有一席之地。

（ 3）末端转移酶（ terminal transferase ）（从小牛胸腺组织中提取），在 DNA 分子的 3’末端添加一个或多个脱氧核苷酸。一种不需要模板而催化脱氧核糖核苷酸加到 DNA 链的 3’－羟基端。

4.2 限制性内切酶

在进行重组 DNA 分子的构建时，每一个载体必须在一个单一位点被切断，以打开环状 DNA 分子使新的 DNA片断能够插入到载体中。同时也要对要克隆的 DNA 进行切割。

有两点原因：首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因可能仅仅包含 2 或 3 KbDNA ，则这个基因不得不从大的 DNA 分子中切割下来；其次，大的 DNA 分子不得不被切割成小的能够被载体携带的片断，绝大多数载体所能够承载的 DNA 片断处于特定的大小范围内，比如，以 M13噬菌体为基础构件的载体所能携带的 DNA 片断一般不能超过 3 Kb。 纯化后的限制性内切酶使生物学家能够以一种可重复的方式切割 DNA 。限制性内切酶的发现是基因工程发展过程中的一项突破性进展。

4.2.1 限制性内切酶的发现及其功能

在 20 世纪 50 年代初，人们观察到有一些细菌对噬菌体的侵染有免疫力，这种现象被称为宿主调控性限制，它的最终导致了限制性内切酶的发现。 限制性机制其实并不复杂，尽管全面了解它花费了 20多年的时间。限制的发生是因为细菌产生了一种降解噬菌体 DNA 的酶，这种酶能够在噬菌体 DNA进行复制以前将其降解掉。细菌本身的 DNA却不受这种攻击，因为其携带的甲基基团阻断了酶的活动。

这种酶被称作限制性内切酶，能够为很多细菌所合成。现如今已经有超过 1 200种不同的限制性内切酶被发现。

4.2.2 限制性内切酶 II 在特定的核苷酸序列处切割 DNA

限制性内切酶 II（以后简称限制性内切酶）都有一段特定的识别序列，在这段序列上它们才能切割 DNA分子。特定的酶在特定的识别序列上切割 DNA 而不会在其他地方切割。如， PvuI 只在 CGATCG这 6核苷酸处切割 DNA 。相对应地，从同一细菌中分离出的另一种酶，称作 PvuII ，在 CAGCTG 处切割 DNA 。

很多限制性内切酶 6核苷酸序列，而另一些则识别 4 、5、甚至 8核苷酸序列。 Sau3A 能够识别 GATC，而 AluI 在 AGCT位点进行切割。 HinfI 能够识别 GANTC，即能够在 GAATC， GATTC， GAGTC和 GACTC位点进行切割。 几乎所有的识别序列都是回文结构。

Here's an example: There is an enzyme called BamHI that searches for the sequence GGATCC in double-stranded DNA (by which I mean that the bottom strand is also present): When the sequence is located, the enzyme BamHI digests the phosphodiester backbone in two specific places - between the pair of G nucleotides on each strand.That leaves us with a four nucleotide single stranded 5' end on each side after separation. 5'-GGATCC-3' 5'-G -3' 5'- GATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 3'-CCTAG -5' 3'- G-5'

In reality there are more than six nucleotides on

each strand, of course. The Bam HI just looks for the

specific sequence it's interested in, and will accept no

substitutes:

4.2.3 平末端和黏末段

当限制性内切酶去切割双链 DNA 分子上的靶序列时，如果它在两条链的对应位置上切断磷酸二酯键，则会产生平末端（ blunt end）。

5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

5’-CCC-OH3’-GGG- p

p -GGG-3’OH-CCC-5’+

SmaI

然而，还有还有大量的限制性内切酶以一种稍微不同的方式切割 DNA 。在这些酶的作用下， DNA 的两条链在不同的位置被切开，形成一种交错切口，两条链上的切口通常会相隔 2 或 4个核苷酸，这样所得的 DNA 片段会具有短的 5’或 3’ 单链突出，突出的单链末端称为黏性末端 (cohesive ends)。

5’ protruding ends 3’ protruding ends

黏性末端（ Cohesive/sticky ends)

In biology, sticky end (cohesive end) and blunt end are the two possible configurations resulting from the breaking of double-stranded DNA. If two complementary strands of DNA are of equal length, then they will terminate in a blunt end, as in the following example:

5'-CTGATCTGACTGATGCGTATGCTAGT-3'

3'-GACTAGACTGACTACGCATACGATCA-5‘However, if one strand extends beyond the complementary region, then the DNA is said to possess an overhang: 5'-ATCTGACT-3'

3'-TAGACTGACTACG-5'

If another DNA fragment exists with a complementary overhang, then these two overhangs will tend to associate with each other and each strand is said to possess a sticky end:

5'-ATCTGACT + GATGCGTATGCT-3'

3'-TAGACTGACTACG CATACGA-5'

which can form complementary base-pairs:

GATGCGTATGCT-3'

5'-ATCTGACT CATACGA-5'

3'-TAGACTGACTACG

黏末端之间的碱基配对能够将 DNA 分子重新连接起来。不同的限制性内切酶可以产生出相同的粘性末端。 Bam I （识别序列是 GGATTC）和 Bgl II （识别序列 AGATCT）都能够产生 GATC 黏末端。相同的黏末端还能够被 Sau3A 产生出来，而它识别的序列是 GATC，经这些酶切割的 DNA 片断，都能够通过互补的黏末端连接在一起。

Factors that influence restriction efficiency

1. Buffer composition:

Different restriction enzymes have differing preferences for ionic strength (salt concentration)

and major cation (sodium or potassium).

but some enzymes are more fussy Battery of 4 commercial buffers overlaps whole spectrum

2. Temperature conditions

best at 37C, but there are many exceptions.

-- Enzymes from termofilic organisms cut best at 50-65 C

-- Some enzymes are unstable, so better use them at 25 C

Factors that influence restriction efficiency3. Methylation

a number of restriction endonucleases will not cleave methylated DNA !!!

Most E.coli strains contain Dam methylase (GmATC) and Dcm methylase CmC(A/T)GG

if DNA unexpectedly does not cut or cuts only partially, check that the enzyme in question is not methylation-sensitive.

arbl.cvmbs.colostate.edu

Factors that influence restriction efficiency

4. Star activity

Cleavage can occur within a number of sequences that differ from the canonical GAATTC by a single base substitutions

In the non-standard conditions:

-- High pH (>8.0) or low ionic strength (e.g. if you forget to add the buffer)

-- Glycerol concentrations > 5% (you took too much enzyme from 50% gly stock)

-- Presence of organic solvents in the reaction (e.g. ethanol, DMSO)

Sticky ends and blunt ends

5’ overhangs

3’ overhangs

blunt ends

arbl.cvmbs.colostate.edu

4.2.4 DNA 分子中识别序列出现的频率

对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的 DNA 分子中识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。一个 4核苷酸序列（比如 GATC）每 44=256个核苷酸出现一次。这一算法假定以一种随机的方式排列而 4个不同的核苷酸以相同的频率出现。实际上，这种假设不可能完全有效。比如说， λDNA 分子， 49 Kb，对一个 6核苷酸识别序列的限制性内切酶来说，本应该有 12个酶切位点，而实际上，这些识别位点出现的频率要小一些，比如说，对 BglII 有 6个 ,BamHI 有 5个，对SalI 只有两个。

4.2.4 在实验室条件下进行限制性酶切

我们以 Bgl II 为例考虑限制性酶对 λDNA 样品的消化。 首先，将所需要用量的 DNA 转移到离心管中。要进行限制酶切的 DNA 用量取决于实验本身的要求：在这里将消化包含在 16 μl 样品中 2 μg λDNA 。反应中另外一种主要成分是限制性内切酶，它是从供应商那里获得的纯的酶夜。但是在加入酶之前，必须对包含 DNA的溶液进行调整，为内切酶发挥最大活性提供最合适的条件。

绝大多数限制性内切酶的最适 pH在 7.4左右，但是不同的酶对离子强度（通常由氯化钠提供）和镁离子浓度的要求不尽相同。

加入一种还原剂也是一种很好的做法，比如二硫苏糖醇（ DTT），它能够使内切酶稳定并防止其失活。为内切酶提供合适的环境非常重要——不当的氯化钠和镁离子浓度不但会降低限制性内切酶的活性，还会导致酶的专一性的改变，使其切割非标准的识别序列。

假设反应混合液的最终体积是 20 μl ，我们加入 2μl 的 10×BglII缓冲液到 16μl DNA溶液中。 现在可以加入限制性内切酶了，根据惯例， 1个酶单位被定义为在 1 h内切割 1μg DNA 所需的酶量，因此我们需要 2个单位的 BglII 来切割 2μg 的 λDNA 。BglII 通常为 4单位 /μl ，因此 0.5μl 就足够切割 DNA 了。所以反应混合液中最终加入 0.5μl 的酶和 1.5μl 的水，这样就构成了 20μL的最终体积。

最后一个要考虑的因素是反应温度。绝大多数限制性内切酶，包括 BglII ，在 37℃ 时活性达到最大，但是还要注意还有一小部分酶需要不同的工作温度。比如 Taq I 是从中提取的限制性内切酶，像 Taq DNA聚合酶那样具有很高的最适工作温度。使用 TaqI 进行消化要在 65 ℃ 下进行，此时酶的活性最高。

What does a restriction enzyme need in order to do its duty?

1. A double-stranded DNA sequence containing the recognition sequence.2. Suitable conditions for digestion.

For example, BamHI has the recognition sequence: GGATCC and requires conditions similar to this: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)5 mM Magnesium chloride100 mM NaCl1 mM 2-mercaptoethanolReaction conditions: 37 C

限制性酶切经过 1 h的反应就该结束了。如果酶切下来的 DNA 片断要用于克隆实验，则需要消除反应液中的酶活性，以保证它不会以外消化掉那些将在以后步骤中加入的其他 DNA 分子。

在很多情况下，在 70 ℃保存很短一段时间就足够使限制性内切酶失活。而对于其他无法通过提高温度灭活的酶，需要使用苯酚抽提或者加入乙二胺四乙酸盐（ EDTA ），它能够螯合酶离子以阻止限制酶的作用。

4.2.6 对酶切结果进行分析

通过限制性酶切可以得到一定数量的 DNA 片断，酶切片断的大小取决于初始 DNA 分子中内切酶识别序列的确切位置。 DNA带负电荷，因此，当 DNA 分子被置于电场中时它们就会向阳极迁移。这样就可以通过凝胶电泳（ gel electrophoresis ）对不同大小的 DNA 片段进行分离。

凝胶通常是由琼脂糖、聚丙烯烯胺制成的，含有复杂的孔道网络， DNA 必须通过这些孔道才能到达阳极。小的 DNA 分子，在凝胶中迁移得更快。因此，利用凝胶电泳可以把不同大小的 DNA 分子分开。

使凝胶中的 DNA 分子可视化染色 观察凝胶电泳结果的最简单的方法，就是利用可以使 DNA显色的化合物对凝胶进行染色。溴乙锭可以用来对琼脂糖凝胶中的 DNA 进行染色。经 EtBr染色后，大小不同的 DNA 片断在紫外灯照射下呈现出不同的条带。用溴乙锭进行染色必须十分小心，因为它是非常强的致癌物。目前，把 DNA染成蓝色或绿色的非致癌染料越来越多地被用于实验室中。

用溴乙锭对 DNA 进行染色的一个缺点是受到灵敏度的限制，如果每条带中 DNA 的含量少于 10 ng，则很有可能染色后仍看不到条带。对于微量的 DNA就需要更加灵敏的检测手段。

放射自显影就为这种微量 DNA 的检测提供了一个很好的方法。如果在电泳前对 DNA 进行标记，电泳后放射性 DNA会使胶片曝光，显示出条带的位置。

对放射性标记的 DNA 进行放射自显影

有许多方法可以对 DNA 分子进行方式性同位素标记，其中最常用的是缺口平移法（ nick translation ）和末端填平法 (end filling)。

DNase I

5’

5’3’

3’

5’

5’3’

3’

DNA pol I + 32P-dNTP

in vitro DNA synthesis using the Klenow fragment (DNA pol I)

5’

5’3’

3232PP

Experimental Uses:a. Fill-in reaction to label ends of DNAb. DNA sequencing

4.2.7 通过作图标出一个 DNA 分子上的不同限制性酶位点

限制酶作图 (restriction mapping) 最简单的方法是比较一个 DNA 分子被两种识别不同的靶序列的限制酶切割所产生的两套片段的大小。在图所示的例子中，首先用 EcoRI 和 BamHI 分别消化一个 4.9 Kb的片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分别检测消化片段的大小。这些结果可以使我们搞清楚 DNA 分子上每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。将 DNA 分子用两种酶同时进行切割 (double digestion)可以获得更多的信息。

如图所示，双酶切可以定位三个酶切位点。但是，较大的 EcoRI 片段由于含有两个 BamHI 切点而产生了问题，其中一个切点有两种排列可能性。为了解决这一问题，可将该 4.9 Kb的 DNA 分子进行部分限制酶酶解（ partial digestion ），即利用较短的反应时间或使用亚反应温度等方法，使消化进行不完全。这样会产生一套更为复杂的产物，除了完全消化的，还有部分消化的产物，它们含有一个或多个未切割的 BamHI 位点。通过测定一个不完全消化片段的大小，构建了正确的图谱。

Question 6A linear DNA fragment is cleaved with the individual restriction enzymes HindIII and SmaI and then with a combination of the two enzymes. The fragments obtained are:

HindIII 2.5 kb; 5.0 kb

SmaI 2.0 kb; 5.5 kb

HindIII + SmaI 2.5 kb; 3.0 kb; 2.0 kb

Draw the restriction map.

HindIII SmaI

2.5 kb 3.0 kb 2.0 kb

The mixture of fragments produced by the combined enzymes is cleaved with EcoRI, resulting in the loss of the 3.0 kb band and the appearance of a band at 1.5 kb. Mark the EcoRI restriction site on the map.

HindIII SmaI

2.5 kb 3.0 kb 2.0 kb

EcoRI

4.3 连接 —— 将 DNA 分子连接在一起

连接重组 DNA 分子构建的最后一步是将载体分子和将要被克隆的 DNA 片段连接到一起，这一过程称作连接，而催化这一反应的酶称作 DNA 连接酶。

4.3.1 DNA 连接酶的作用方式

所有的活细胞都能产生 DNA 连接酶，但用在基因工程中的连接酶主要是从被 T4噬菌体侵染的大肠杆菌细胞中纯化制得的。在双链 DNA 分子上，如果一条链上两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂， DNA连接酶则能催化该磷酸二酯键重新形成。 在试管中，纯化的 DNA 连接酶，不但能够修复单链上的断裂，还能将两个 DNA 分子或同一 DNA 分子的两个末端连接在一起。

4.3.2 粘末端可增加连接的效率

DNA 连接酶能够将两个平末端 DNA 片段连接在一起。尽管这一反应能够在试管中进行，但反应效率并不高。这是因为 DNA 连接酶不能够主动捕获将要连接的分子，而是等待随机的机会将两个末端连接在一起。如果可能的话，平末端连接反应应在高的 DNA浓度的溶液中进行，以增加分子末端结合在一起的机会。

If the DNA is very concentrated, inter-molecular ligation is more likely. If the DNA is dilute in solution, then intra-molecular ligations are more likely.

Sticky ends are easier, but blunt ends could be done too….

bioweb.wku.edu/courses/Biol350/ enzymes/ligasesFig.html

相对来说，发生在粘末端之间的连接反应要高效的多，这是因为黏末端能够通过氢键结合在一起，构成相对稳定的结构，有利于连接酶的作用。如果磷酸二酯键不能够很快地生成，则黏末端将会再次分开。然而正是这一碱基配对形成的短暂过程，增加了末端间相互联系的时间，从而提高了连接反应的效率。

Restriction – ligation

From Amy B. Vento and David R. Gillum

University of New Hampshire

4.3.3 将黏末端加在平末端分子上

在基因克隆实验中，最希望出现的是要被连接在一起的 DNA 分子拥有互补的黏末端。这些黏末端可以通过使用同一种限制性内切酶，或者具有同一酶切结果的不同的酶，同时消化载体和要克隆的 DNA 分子而得到。但是，情况并非总是这样。通常的情况是，载体具有粘性末端，而待克隆的 DNA 片段带有平末端。在这种情况下，就需要用到以下 3种方法之一进行连接。

DNA 接头 (linker)

第一种方法是使用 DNA 接头。它们是一些短的人工合成的双链 DNA 片段，有已知的核苷酸序列。 DNA 接头是平末端片段，但包含限制性位点，在该例中是 BamHI 的限制性位点。 DNA 连接酶能够把接头连接到平端 DNA 分子上。尽管也是平端连接，但是这一特殊的反应可以高效进行，因为人工合成的寡核苷酸序列能够被大量制备，所以可在反应混合物中加入高浓度的人工接头。 一个以上的人工接头可以连接到 DNA 分子的两端，但是当用 BamHI 消化时，可以得到我们所期望的结果，即初始 DNA 片段的两端各具一个 BamHI粘性末端。

Suppose you have a collection of DNA fragments with blunt ends, and you want to introduce them efficiently into a vector that is linearized at an EcoRI site. From what you have learned so far, you might think that the best thing to do would be to make the vector ends blunt as well so that they will be compatible. You could...but that would not give you a high efficiency of ligation (meaning fewer candidate colonies per transformation). It may also be the case that you would like your product to retain EcoRI sites. If you make the vector ends blunt, you will destroy those EcoRI sites.

One solution is to ligate a small double-stranded DN

A containing an EcoRI site to the end of the blunt D

NA fragments. Since this small DNA can be added t

o the ligation reaction in great excess, it is an efficie

nt reaction. Then the DNA can be digested with Eco

RI to create the proper overhanging ends that will be

compatible with the vector. We call this small piece

of DNA a linker.

Ligation and digestion of linker

NNNNN

NNNNN

Blunt end - before addition of linker

GCCGGAATTCCGGNNNNNN

CGGCCTTAAGGCCNNNNNN After ligation of linker

AATTCCGGNNNNNN

GGCCNNNNNN

After digestion of linker

Note that if the linker has 5' phosphates (i.e. if it is phosphory

lated) then a great many linkers may be ligated to the fragme

nt in a tandem repeat. These will all be digested away by the

enzyme, leaving only the proximal sequence as shown.

寡核苷酸接头 (adaptor)寡核苷酸接头，就像 DNA 接头那样，也是短的人工合成的寡核苷酸。但和 DNA 接头不同的是，寡核苷酸接头具有一个平末端和一个黏末端。接下来我们要做的是将寡核苷酸接头的平末端连接到 DNA 分子的平末端上，以产生一个新的带有粘末端的 DNA 分子。为了避免寡核苷酸接头黏末端之间的连接，寡核苷酸接头5’末端缺少磷酸基团。这样做的结果是，寡核苷酸接头黏末端之间可以发生碱基配对，但是不能发生连接反应。因此，寡核苷酸接头能够连接到 DNA 分子上，而不会自身形成而聚体。

在结合体被连接上以后，非正常的 5’-OH末端在经过多聚核苷酸激酶的处理后，被重新转化成正常的 5’-P末端。

通过附加同聚物反应产生黏末端 附加同聚物反应技术提供了一个完全不同的、在平末端上产生黏末端的方法。同聚物是由一种脱氧核苷酸聚合而成的。附加同聚物反应需要使用末端脱氧核苷酸转移酶，将一种核苷酸连续加到双链 DNA 分子的 3’-OH末端，产生同聚物尾部。 当然，为了让两个加上尾部的 DNA 分子连接在一起，多聚物必须互补。比如多聚脱氧胞嘧啶核苷酸尾部被连接到载体上，而多聚脱氧鸟嘌呤核苷酸被连接到要被克隆的基因上。但两种 DNA 分子被混合时，两个尾部发生碱基配对。

实际上，多聚（ dG）和多聚（ dC）尾部的长度通常不是完全相同的，得到的重组 DNA 分子会存在缺口。修复缺口需要两个步骤，分别用 Klenow聚合酶来填满缺口，然后再用 DNA 连接酶生成最后的磷酸二酯键。在试管中，修复缺口的反应并非必须的步骤。如果互补的同聚物的长度超过了 20个核苷酸，形成的碱基配对就已经非常稳定了，能够在接下来的克隆试验中被引入宿主细胞。一旦进入宿主细胞，细胞自身的 DNA聚合酶和 DNA 连接酶会自动修复 DNA 分子。