実践的な免疫組織染色の方法

~特に酵素抗体法を中心に~

病理診断学常山幸一、野本一博、林伸一、三輪重治、西田健志、八田秀樹

免疫染色

組織標本の中にある、或る“タンパク質”の場所を目で見えるようにするための方法。

目的とするタンパク質＇抗原（にだけくっつく事ができる物質＇抗体（を使う。

抗原＝タンパク質

抗体＝抗原とくっつく

抗原

簡単な原理

１（まず抗原に抗体＇一次抗体（がくっつく

２（くっついた一次抗体に特異的にくっつく二次抗体をapplyする。

• 二次抗体が蛍光標識されいれば蛍光で光っている場所に抗原が存在

• 二次抗体に酵素が付いていれば、基質で様々な色に発色＇酵素抗体法（

酵素と基質の組み合わせを変えれば、見たいものを何色にすることもできる。

Peroxidase ⇒ DABで茶色AECで赤色アセトニトリルで黒青色

など

Alkaline Phosphatase ⇒ Fast Redで赤色Fast blueで青色

など

酵素抗体法の場合

Peroxidase＇PO)の基質

Alkaline Phosphatase＇AP)

の基質

酵素と基質の組み合わせを変える事で何重染色も可能に！~特に、異なる細胞にそれぞれ標的とする抗原が存在する場合に有用~

＇但し、一つの染色を終えるたびに、それまでにapplyした抗体をwash outしたり、変性させたりする必要あり（

しかし実際にはうまくいかない事も多い…………..

原因（•抗原が壊れてしまっている

•抗原がマスクされてしまっている

•抗体が免疫染色に不適である

•抗体の結合性が弱い

修復不能 ×

抗原賦活ができる事も

どうしようもない＇事が多い（

感度を上げてみる

抗原賦活の方法

熱をかける オートクレーブ圧力釜電気ポット

酵素処理を行う Pepsin処理Protease K 処理Hyarulonidase 処理＇室温~３７℃、3-30分（

抗原賦活液クエン酸バッファーTRS溶液Immunosaver

L.A.B. Solution

など

Immunosaverのホームページより引用

DAKO のPascal

電子レンジ用のPressure cooker

感度を上げる工夫

ABC法LSAB法ポリマー法

iAEP法

蛍光抗体法＜＜酵素抗体法

抗原抗体反応の強化・時間短縮＇マイクロウエーブ、超音波など（

ABC法(avidin-biotinylated peroxidase complex)

一次抗体を反応した後にビオチン標識二次抗体を作用させ、引き続き標識酵素を反応させる３ステップ法。直接法に比べて感度が高いが、LSABやポリマー法には敵わない。

注意（ 熱による抗原賦活化処理で内因性ビオチンの非特異的反応が起こる

LSAB法(labeled streptavidin biotinyated antibody)

基本的にはABC法と同様であるが、ビオチンと酵素標識ストレプトアビジンの両者はきわめて親和性が高く非可逆的な結合性を示し、更なる高感度が得られる。キット商品も多数市販されている。注意（ ABC法同様、熱による抗原賦活化処理で内因性ビオチンの非特異的反応が起こる

標識酵素ポリマー法

従来の間接法と比較して著しく高感度で汎用性が高い。２ステップ法なので短時間に反応が終了できる。アビジンビオチン反応とは無関係なので内因性ビオチンによる非特異的反応がない。

Envision method (DAKO)

(hyper-sensitive polymer method)

1.Apply primary antibody

2.Apply peroxidase-Envision

3.Apply substrate for color

(DAB)

Quick (three steps)

&

Sensible

Standard method for the routine immunostaining!

DAKO Envision

マウス＆ラビット用Peroxidase標識

マウス一次抗体用Peroxidase標識

ラビット一次抗体用Peroxidase標識

マウス＆ラビットAlkaline Phosphatase標識

ニチレイ

ヤギ一次抗体用Peroxidase標識 ラット一次抗体用Peroxidase標識

iAEP法

DAKO社のホームページより 自験例

iAEP法

抗原抗体反応をマイクロウエーブを用いて迅速化する方法

Specimens are placed in a 60℃ oven beforehand.

① Deparaffinization (5 min)

② Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes)

③ Rinsed in running water

④ 100% methanol with 3% H2O2 (5 min)

⑤ Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween

⑥ Soaked in TBS with 5% BSA (5min)

⑦ Exposure to the primary antibody ( 60 min-over night)

⑧ Rinsed in TBS with shaking (5min)

⑨ Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein)

( 60 min-over night)

⑩ Rinsed in TBS with shaking (5 min)

⑪ Immersed in DAB/H2O2 solution (5-15 min)

⑫ Rinsed in TBS and running water

⑬ Counterstaining

Dehydration, mounting and cover slipping

Standard immunostaining procedure

It takes more than 3 hours (~one day!)

Specimens are placed in a 60℃ oven beforehand.

① Deparaffinization (5 min)

② Antigen retrieval (microwave; 10 min; enzyme; 6 minutes)

③ Rinsed in running water

④ 100% methanol with 3% H2O2 (5 min)

⑤ Rinsed with running water, distilled water, and TBS-Tween

⑥ Soaked in TBS with 5% BSA (1 min)

⑦ Exposure to the primary antibody with intermittent irradiation (10

min)

⑧ Rinsed in TBS with Tween with shaking (1 min)

⑨ Application of the secondary antibody (Envision or Simple Stein)

with intermittent irradiation (10 min)

⑩ Rinsed in TBS with shaking (1 min)

⑪ Immersed in DAB/H2O2 solution with intermittent irradiation (5

min)

⑫ Rinsed in TBS and running water

⑬ Counterstaining

Dehydration, mounting and cover slipping

One-hour immunostaining procedure

Our procedure

Exposure to the primary antibody with

intermittent irradiation (10 min)

Standard procedure

Exposure to the primary antibody

( 60 min-over night)

Comparison between standard procedure and ours

Step 7

Special microwave equipment

(MI-77, Azumaya, Tokyo, JAPAN)

Variable

•Power (100W-500W)

•Irradiation time

•Intermittent irradiation mode

Microwave has voltex effect.

Apply red dye on the oil, calmly

MW irradiation, 5minNo MW irradiation

(still standing)

Not mixed Mixed

Caution!

Antibodies are protein, which is easily denatured by

high-temperature.

Try to decide the best condition for the

microwave irradiation

50ｍｌ water on the bottom of moist chamber

200μPBS+５％BSA

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

250w

300ｗ

MW: power 250W, 300W, 350W

(continuous irradiation)

50ｍｌ water on the bottom of moist chamber

Temperature of the 200μliquid on the slide

350W; BSA was denatured within 5 minutes.

MW: power 250W

50ｍｌ water on the bottom of moist chamber

Temperature of the 200μliquid on the slide

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

continuous

5sec-on, 1sec-off

4sec-on, 2sec-off

4sec-on, 3sec-off

Duration

degree

Most suitable condition of irradiation to

avoid excessive temperature increase

•250W

•4-seconds-on and 3-seconds-off

10min 30min

Immunostaining of cytokeratin (CK) 5/6

with intermittent microwave irradiation

5min

Evaluation of specific positive reaction could be performed

correctly in the specimen with 10 min irradiation

Advantage of microwave irradiation

for antibodies incubation

•Incubation time: very short ＇10 min)

•Background: clear

Non-specific reaction (NS) increase in

proportion to incubation period (I.P.)

NS=αｘI.P.

Immunostaining of CD79a(Lymphnode)

10min

without MW

10 min

with MW

60 min

without MW

Low magnif. High magnif.

Immunostaining of cancer cells

10min

without MW

10 min

with MW

60 min

without MW

MIB-1 p53

同じ事が超音波を用いてできないか？

抗原抗体反応を超音波を用いて迅速化する方法

複数の抗体で使用可能

ホルマリン固定パラフィン包埋標本で免疫染色がうまくいかない時

1. 抗体のinformation sheetを確認2. 抗原賦活法を変えてみる3. より感度の高い方法を検討する4. 抗原と抗体のインキュベーションにマイクロウエーブや超音波を試す

それでもダメなら

標本の固定法を変える＇ホルマリン⇒４％PFA,アセトンなど（抗原維持に優れた各種固定法を試す＇AMEX、HOPEなど（

それでもダメなら

凍結標本でtry

皆さんのご研究で免疫染色が必要になった場合は遠慮なく相談してください。

診断用、研究用の各種抗体を所有しています。

試し染色が必要な場合はご相談ください。

病理診断用の免疫染色は随時行っています。見学等が必要な場合はご連絡ください。常山 or 八田まで