赢润生物曾林

WWW.YRBIO.COM

赢润生物曾林

核酸提取原理及方法

http://www.yrbio.com

2011 年 7 月前言

　　　核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。


2011 年 7 月主要内容一．核酸简介二．基因组 DNA 提取三．质粒 DNA 提取四．真核细胞总 RNA 提取五．琼脂糖凝胶电泳


2011 年 7 月核酸简介

核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过 3′ ， 5′- 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸 (RNA) 和脱氧核糖核酸 (DNA) 两类。

DNA 主要储存遗传信息。 RNA 主要传递遗传信息。


2011 年 7 月核酸简介

如何分离 RNA ？

如何分离 DNA ？


2011 年 7 月核酸简介——质粒 DNA

质粒 (Plasmid) 是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 1-200 kb 不等，为双链、闭环的 DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。


2011 年 7 月

一．核酸简介二．基因组 DNA 提取三．质粒 DNA 提取四．真核细胞总 RNA 提取


2011 年 7 月基因组 DNA 提取方法

基因组 DNA 提取的几种常用方法： CTAB 法 SDS 法其他方法


2011 年 7 月

基因组 DNA 提取—— CTAB法 CTAB 法原理（植物 DNA 提取经典方法） CTAB （ hexadecyltrimethylammonium bromide ，十

六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（ >0.7 mol/L NaCl ）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。


2011 年 7 月

基因组 DNA 提取—— CTAB法 CTAB 提取缓冲液的经典配方

组份 Tris-HCl （ pH 8.0 ）

EDTA （ pH 8.0 ） NaCl CTAB β- 巯基乙醇

终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M 2% (W/V)0.1% （ V/V ）使用前加入

Tris-HCl （ pH 8.0 ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA 螯合 Mg2+ 或 Mn2+ 离子，抑制 DNase 活性； NaCl 提供一个高盐环境，使 DNP 充分溶解，存在于液相中； CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。


2011 年 7 月

基因组 DNA 提取—— CTAB法 CTAB 提取缓冲液的改进配方

组份 Tris-HCl （ pH 8.0 ）

EDTA （ pH 8.0 ） NaCl CTAB PVP40 β- 巯基乙醇

终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M 3% (W/V) 5% (W/V) 2% （ V/V ）使用前加入

PVP （聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。


2011 年 7 月 CTAB 法实验流程

基因组 DNA 提取—— CTAB法植物材料抽提

核酸沉淀

液氮研磨上层溶液

细胞裂解 DNA 溶液

干燥溶解

离心洗涤


2011 年 7 月 SDS 法原理 SDS 是一种阴离子去垢剂，在高温（ 55 ～ 65℃ ）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐 (KAc 或 NH4Ac) 浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的 DNA 用酚 / 氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中

的 DNA 。

基因组 DNA 提取—— SDS 法

注： SDS 法适用于大部分实验材料基因组 DNA 提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。


2011 年 7 月 SDS 提取缓冲液的配方

基因组 DNA 提取—— SDS 法

　组份 Tris-HCl （ pH 8.0 ）

EDTA（ pH 8.0

） NaCl SDS

　终浓度 50 mM 20 mM 0.4 M 2%

Tris-HCl（ pH8.0 ）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA ：螯合 Mg2+ 或 Mn2+ 离子，抑制 DNase 活性；NaCl ：提供一个高盐环境，使 DNP 充分溶解，存在于液相中。


2011 年 7 月基因组 DNA 提取—— SDS 法

SDS 法实验流程（以动物组织为例）动物组织抽提

酒精沉淀

液氮研磨或匀浆上层溶液

细胞裂解 DNA 溶液

干燥溶解

离心洗涤


2011 年 7 月

基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测

小鼠 gDNA 电泳图

琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。


2011 年 7 月基因组 DNA 提取常见问题

DNA样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应 DNA降解 DNA量少


2011 年 7 月基因组 DNA 提取常见问题分析

DNA样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类物质 —— 抽提纯化、高盐洗涤DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 —— 重新沉淀DNA 中残留有金属离子 —— 重新 70% 乙醇漂洗


2011 年 7 月基因组 DNA 提取常见问题分析

DNA降解材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈， DNA

被机械打断外源核酸酶污染


2011 年 7 月 DNA 提取量少实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分 —— 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全 ——低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失 DNA

基因组 DNA 提取常见问题分析


2011 年 7 月

一．核酸简介二．基因组 DNA 提取三．质粒 DNA 提取四．真核细胞总 RNA 提取五．琼脂糖凝胶电泳


2011 年 7 月质粒 DNA 提取

质粒 DNA 提取的方法：碱裂解法煮沸法


2011 年 7 月

质粒 DNA 提取——碱裂解法原理


2011 年 7 月离心柱型质粒 DNA 提取试剂盒工作原理

离心柱型质粒 DNA 提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA ，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高 pH

值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA从硅基质膜上洗脱。


2011 年 7 月质粒 DNA 提取及检测——实验准备

1. 实验器材台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2. 实验耗材无菌 2 mL/1.5 mL EP管、各规格 Tip 、一次性手套等。3. 实验试剂质粒小提试剂盒（离心柱型， YRBIO) 、 LB培养基、抗生素、琼脂糖、 DNA Loading Buffer 、 GoldView 核酸染料、 TAE 电泳缓冲液等。4. 实验材料对数期菌株（ pEGFP-N1 in DH5α ）


2011 年 7 月质粒 DNA 提取——碱裂解法

碱裂解法试剂配方　组分 1 　组分 2

Ⅰ液 25 mM Tris-HCl （ pH 8.0 ） 10 mM EDTA （ pH 8.0

）Ⅱ 液 0.2 M NaOH 1% SDS

Ⅲ 液 3 M KAc （ pH 4.2 ）RNase A 10 μg/ml RNase A

洗脱液 EB

10 mM Tris-HCl （ pH 8.0 ） 1 mM EDTA （ pH 8.0

）


2011 年 7 月质粒 DNA 提取——实验流程对数期菌体

溶液 III 中和

溶液 I 充分重悬

溶液 II裂解

上清液

过柱

干燥溶解

离心洗涤

质粒 DNA 溶液离心

详细实验步骤请参考说明书！


2011 年 7 月质粒 DNA 提取——电泳检测

琼脂糖凝胶电泳检测质粒 DNA 的三种带型：1.共价闭合环状 DNA 分子：质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度最快；2.半开环质粒 DNA 分子：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度最慢；3. 线性 DNA 分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度居中。


2011 年 7 月质粒 DNA 提取常见问题

RNA残留质粒断裂量少


2011 年 7 月质粒 DNA 提取常见问题分析

RNA残留忘记加 RNase A ？ I 液中 RNase A失效？酶量不够？



质粒断裂 II 液裂解时间过长？裂解时动作过于剧烈？



量少凝胶是否有问题？菌体量少菌体重悬不彻底裂解不完全菌株老化严谨型质粒


2011 年 7 月质粒类型

• 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；

• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每个细胞中含有 10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒 pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。


2011 年 7 月



2011 年 7 月总 RNA 提取——通用方法

异硫氰酸胍 /苯酚法（ TRIzol 法）原理：

核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下， DNA

向疏水性的酚层移动，而 RNA 由于有 -OH 的存在有亲水性，因此向水层移动。


2011 年 7 月

TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNA 进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样 RNA 与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA 便分离开。水相层主要为 RNA ，有机层主要为 DNA 和蛋白质。


2011 年 7 月

总 RNA 提取及检测——实验准备1. 实验器材台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、 marker笔、酒精喷壶、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2. 实验耗材 1.5 mL EP管（ RNase free ）、各规格 Tip （ RNase free ）、一次性手套、一次性口罩等。3. 实验试剂 TRIzol 总 RNA 提取试剂（ YRBIO) 、氯仿、异丙醇、 75% 乙醇（ RNase free ）、 DEPC H2O （ RNase free ）等。4. 实验材料新鲜 293 细胞


2011 年 7 月 RNase 是导致 RNA降解的最主要物质！RNase 的来源样品试剂多次使用的器具裸露的手说话产生的唾沫空气

RNase非常稳定，它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。


2011 年 7 月

总 RNA 提取——去除 RNase污染玻璃器皿处理：量筒、试剂瓶等玻璃器皿须 200℃烘烤 2 小时以上。塑料器皿处理： 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。试剂处理：氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后 RNA专用。 0.1%DEPC水配制 75% 的酒精。专用的 RNA 操作室、专用器械。操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。


2011 年 7 月总 RNA 提取——样本准备

植物 /动物组织样本：新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或 -80℃。为避免反复冻融，需小份分装（ 50~100 mg/ 份）。

细胞样本：新鲜收集待用或加入 TRIzol 后 -80℃冻存细胞沉淀。

血液样本：新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入 TRIzol 后 -80℃冻存细胞沉淀。


2011 年 7 月真核细胞总 RNA 提取——实验步骤

293 细胞样品为例收集细胞上层溶液

离心洗涤

裂解变性异丙醇沉淀

抽提RNA 溶液

干燥溶解

详细实验步骤请参考说明书！


2011 年 7 月总 RNA 提取——完整性检测

293细胞总 RNA

28S

18S

5S

由于动物细胞中 70-80% 的 RNA 为 rRNA ，后者又由 28S （约 4800 nt ）， 18S （约 1900

nt ）和 5.8S （约 120 nt ）三种组成，所以电泳后应该在 UV下看见三条清晰的 rRNA 带。

由于核酸长度与结合 EB 的数量成正比，所以 28S rRNA条带的荧光强度一般比 18S rRNA

条带的荧光强度强 1.5-2.3倍。如果这两条rRNA 带不清晰或比例小于此范围则表示 RNA

有降解（因为大的 RNA 被酶降解的可能更大）。

电泳检测


2011 年 7 月

总 RNA 提取——产量产率与纯度检测1.打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照仪器说明。2. 取少量待测 RNA样品，用 TE Buffer稀释 50倍（或 100倍）。3. 用 TE Buffer做空白，在 260 nm 、 280

nm 、 310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。4. 加入待测 RNA样品在三个波长处读取 OD值。


2011 年 7 月

总 RNA 提取——产量产率与纯度检测5.根据 OD值计算 RNA 的浓度： [SSRNA] = 40× (OD260 － OD310) ×稀释倍数6.RNA产量产率计算： RNA 的产量 = RNA 浓度 × 溶解体积 RNA 的产率 = RNA产量 / 细胞用量7.根据 OD值计算 RNA 的纯度纯 RNA样品的 OD260/OD280 大约在 1.8-2.0之间。


2011 年 7 月RNA 提取常见问题

RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低电泳带型异常


2011 年 7 月RNA 提取常见问题分析

RNA降解外源 RNase 的污染裂解液质量裂解液用量不足样品本身富含 RNase

环境温度过高

28S18S

5S



DNA残留样本量过多吸取到中间层及下层试剂解决办法： DNA酶（ RNase free ）消化，再抽提纯化处理。



OD260 /OD280 比值偏低蛋白污染 /苯酚残留 —— 加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力

和时间要足够。 —— 不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。

—— 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。解决办法 : 重新抽提一次，再沉淀、溶解。



电泳带型异常上样量超过 3μg

电压超过 8V/cm

电泳缓冲液陈旧均可能导致 28S 和 18S 条带分不开


2011 年 7 月



2011 年 7 月DNA 的琼脂糖凝胶电泳

1. 原理： DNA 分子在高于其等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。



2. 琼脂糖凝胶分离 DNA 的范围



3.DNA 染料 A:EB

溴化乙锭 (Ethidium Bromide, EB）可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

EB 染料优点：染色操作简便，快速，室温下 15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高， 10ng或更少的DNA即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。

EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。


2011 年 7 月

B ：新型低毒染料：如 Gold View、 SYBR GreenⅠ 、 SYBR Gold等。毒性较低，但价格较昂贵。灵敏度较好，但不如 EB。



4. 琼脂糖胶液制备（ 1% ， 50 ml ） 4.1 称取 0.5 g 琼脂糖，置于 250 ml锥形瓶中，加

入 60 ml 1×TAE 电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶解。一般需反复煮沸 3 次，琼脂糖才能充分溶解。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发；

4.2 待胶液冷却至 60℃左右时，加入 5%的 Gold

View 染料，混匀，既成琼脂糖胶液。



5. 凝胶板的制备 5.1 将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入

胶槽中，使凝胶厚度约为 0.3-0.5 cm ，赶走气泡后迅速插上梳子，让胶凝固。

5.2 待凝胶完全凝固后（约 20~30 min ），小心从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，让液面高出胶面 1 mm左右。



6. 加样取待检测样本适量，按照 5 份上样液搭配 1 份 6×DNA Loading Buffer 的比例混匀（注意不要产生气泡），用微量移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。



7. 电泳加完样后立即接通电源。控制电压小于 8 V/cm ，电

流在 100 mA 以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶 2/3 时，停止电泳。

8. 成像在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。保存图像。


2011 年 7 月内容回顾

1. 基因组 DNA 提取CTAB 法SDS 法

2. 质粒 DNA 提取碱裂解法（离心柱型）

3. 总 RNA 提取异硫氰酸胍 /苯酚法（ TRIzol 法）

4.DNA 的琼脂糖凝胶电泳


2011 年 7 月

下午实验课（ 14:30-18:00 ）《质粒 DNA 提取及琼脂糖电泳分析》


2011 年 7 月

The End！Thank You！

Any Questions ？

赢润生物曾林

Documents

Transcript of 赢润生物曾林

赢润生物 曾 林

Documents

Transcript of 赢润生物 曾 林

赢润生物曾林

Transcript of 赢润生物曾林