第二章 显微镜技术和显微镜

掌握常用显微镜的结构及性能特点

熟悉显微技术的基础理论，显微镜的应用

了解显微镜的维护，显微技术的进展

教 学 基 本 要 求

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内 容 提 要

第一节 光学显微镜

第二节 光学显微镜的分类及其应用

第三节 电子显微镜

第四节 显微镜的维护、常见故障及排除

第五节 显微摄影术

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第一节 光 学 显 微 镜

一、光学显微镜的工作原理

二、光学显微镜的基本结构

三、光学显微镜的性能参数

四、像差和色差

五、光学显微镜的不足之处

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一、光学显微镜的工作原理

显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（ object

lens ），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ ocular lens ）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。

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光学显微镜的工作原理图

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① ① 机械部分：镜座、镜柱、机械部分：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）物台（物镜转换器）

② ② 光学部分：目镜、物镜、光学部分：目镜、物镜、反光镜、聚光镜反光镜、聚光镜

放大倍数：放大倍数： 目镜的放大倍数目镜的放大倍数 ×× 物镜的物镜的

放大倍数放大倍数

二、光学显微镜的基本结构

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三、光学显微镜的性能参数

(一) 放大率

(二)数值孔径

(三)分辨率

(四)视野

(五) 景深与焦长

(六)镜像亮度和清晰度

(七)工作距离

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( 一 ) 放 大 率

显微镜的放大率 (amplification) 或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成 ( 放大的 ) 像的大小相对于原物体大小的比值，常记作 M 。

M=maq

M 是显微镜的总放大倍数； m 是物镜的放大倍数； a 是目镜的放

大倍率，一般表达为明视距离 ( 正常视力者为 25cm) 与目镜焦距之比；q 为在双目显微镜中所增设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为 1.6 倍。

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( 二 ) 数 值 孔 径

数值孔径 (numerical aperture) 又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率 n 与物镜孔径角的一半 (β) 正弦值的乘积，通常缩写为 NA ，即

NA=nsinβ

显微镜的数值孔径与其放大率成正比，与分辨率、景深成反比，它的平方与图像亮度成正比。

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NA=nsinβ

最高数值孔径油浸物镜

较高数值孔径干物镜

低数值孔径干物镜

油 油

( 二 ) 数 值 孔 径

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• 分辨率：显微镜的最重要参数，能够区分开两个质点的最小距离。

D=0.61λ

N•sinα/2

D ：分 辨 率λ ：光波的波长N ：介质折射率α ：物镜镜口角

N 与 D 成反比 ， λ 与 D 成正比

( 三 ) 分 辨 率

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提高显微镜分辨率的方法

（ 1 ）增大物镜的数值孔径

在物镜和盖玻片之间充以 n 较大的油，如香柏油 n =1.52, 不仅使 n 增大，而且孔径角也增大。

（ 2 ）用短波长的光照射

如紫外光显微镜，电子显微镜。

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( 四 ) 视 野

视野 (visual field) 又称视场(field) ，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。

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( 五 ) 景 深 与 焦 长

景深 (depth of field) 又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深”。

景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称“焦长”。

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( 六 ) 镜 像 亮 度 和 清 晰 度

镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显微镜等都需要足够的亮度，与照明及物镜的性能参数相关。

镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。

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(七 ) 工 作 距 离

工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。

一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。

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四、像 差 和 色 差

( 一 ) 、像差 1．球差 ( spheric aberration )

2．彗差 (broom aberration)

3．像散 (astigmatism)

4．场曲 5．畸变 (distortion)

( 二 ) 、色差

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( 一 ) 、像 差 (aberration)

像差是指透镜所成的像与理想像在形状、颜色等方面存在差异。

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1．球 差 ( spheric aberration )

透镜的球差

光轴上的点光源所发出的光锥入射到透镜的球折射面时，由于通过透镜边缘的光线不满足近轴光线的条件，因此不能和通过近轴曲面的光线会聚成一个理想的亮点，而是形成一个中间亮边缘逐渐模糊的弥散斑，这就是透镜的球面像差，简称为球差。

球差可以通过设置光阑而减小。

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2．彗 差 (broom aberration)

近光轴外的点光源发出的光束，经过透镜中央和边缘部分后在垂直于光轴的同一成像平面上也不能交于同一个像点。离光轴越近的像会聚越好，亮度越大，亮点越小。于是在成像平面上便形成一个顶端小而亮，远离光轴方向形成逐渐增宽且亮度减弱的模糊尾部，形如彗星，称为彗差。

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透 镜 的 彗 差

光轴 透镜

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3．像 散 (astigmatism)

远离光轴的物点发出的光，即使是以细光束成像也不可能会聚于一点，而是在像空间不同的成像面上或者成椭圆弥散斑，或者在特殊位置形成圆形弥散斑，甚至是形成两个垂直方向上的短亮线，这种成像缺陷称为像散。

一般来说，透镜像散随透镜形状、光阑位置而异，可以用正、负透镜适当组合而消除。

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透 镜 的 像 散

物点

物镜光轴

水平焦平面

垂直焦平面

明晰圆

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4．场 曲

一个平面的物体通过透镜成像后，虽然像平面上任意一点仍然是清晰的，但所成的像不再是一个平面，而成了一弯曲的面，这就是场曲。

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5．畸 变 (distortion)

由于像平面上各处放大率不同引起的成像缺陷称为畸变 。畸变的原因是由于透镜边缘与透镜近轴的放大率不同而引起的。

如果离光轴越远处放大率越大，则像的外部线段将比中间线段长，结果形成了枕形畸变，这种畸变称为正畸变。

反之则形成边缘放大率小而近轴放大率大的桶形畸变，称为负畸变 。

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透 镜 的 畸 变

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( 二 ) 、 色 差

色差 (chromatic aberration ) 是一种由白光或复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的不同成像效果，从而造成像和物的较大失真。

透镜的色差

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透镜的轴向色差（Ａ）和垂轴色差（Ｂ）

Ａ

B

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五、光学显微镜的不足之处

1 、放大倍数的极限： 2000

2 、分辨率的极限： 0.2m （可见光照明）

3 、景深的极限： 0.1m （要求金相准备）

4 、不能分析化学成分

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第二节 光学显微镜的分类及其应用

一、双目生物显微镜二、荧光显微镜三、相衬显微镜四、倒置显微镜五、暗场显微镜六、紫外光显微镜七、偏光显微镜八、激光扫描共聚焦显微镜九、干涉相衬显微镜十、近场扫描光学显微镜

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一、双 目 生 物 显 微 镜

双目显微镜 (binocular microscope) 的结构是利用一组复合棱镜把透过物镜后的光束分成强度相同的两束而形成两个中间像，分别再由左右目镜放大。来自物镜的光线经棱镜组分光成两束平行光束，进入目镜，双目显微镜必须满足分光后两束光的光程必须相同和两束光的光强度大小一致这两个基本要求。

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目镜

物镜

聚光器

光源

一、双 目 生 物 显 微 镜

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二、荧 光 显 微 镜

荧光显微镜 (fluorescence microscopy) 是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。

为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。

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荧光（ Fluorescence ）： 细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射

后能发出可见光线，称为荧光。 自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照

射后发出的荧光。 诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射

后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。

二、荧 光 显 微 镜

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荧 光 显 微 镜 的 种 类荧 光 显 微 镜 的 种 类A A 透射式透射式 B B 落射式落射式

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荧 光 显 微 镜 的 主 要 部 件荧 光 显 微 镜 的 主 要 部 件

透射式透射式• 汞灯光源汞灯光源• 激发滤色镜激发滤色镜• 暗场聚光镜暗场聚光镜• 吸收滤色镜吸收滤色镜

落射式落射式• 汞灯光源汞灯光源• 激发滤色镜激发滤色镜• 分色镜分色镜• 吸收滤色镜吸收滤色镜

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吸收滤色镜吸收滤色镜

暗场聚光镜暗场聚光镜

激发滤色镜激发滤色镜

汞灯箱汞灯箱

透 射 荧 光 显 微 镜 的 构 造透 射 荧 光 显 微 镜 的 构 造

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落 射 荧 光 显 微 镜 的 构 造落 射 荧 光 显 微 镜 的 构 造吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜

分色镜分色镜 汞灯汞灯

紫外线保护罩紫外线保护罩

孔径光栏孔径光栏（（ FFSS））

视场光栏视场光栏（（ AASS））

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目镜目镜

吸收滤色镜吸收滤色镜 物镜物镜

暗场聚光镜暗场聚光镜

激发滤色镜激发滤色镜

汞灯汞灯

透 射 荧 光 显 微 镜 原 理

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落 射 荧 光 显 微 镜 原 理

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三、相 衬 显 微 镜

光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见。

活细胞和未染色的标本由于光的波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。

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相衬显微镜比普通光学显微镜多了 2 个部件：

在聚光器上增加一个环形光阑； 在物镜后焦面增加一个相板，相板上有

一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后 1/4λ ，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。

三、相 衬 显 微 镜

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相衬显微镜照明原理

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光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了 1/4λ 。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的 1/4λ 的光程差。两组光在平面上成像。

三、相 衬 显 微 镜

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如相板的环形区使直射光超前 1/4λ ，加上开始直射光超前的 1/4λ ，直射光共超前 1/2 λ ，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。

如相板的环形区使直射光滞后 1/4λ ，加上开始直射光超前的 1/4λ ，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。

三、相 衬 显 微 镜

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四、倒 置 显 微 镜

倒置显微镜 (Inverted Microscope) 的组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。

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倒置显微镜

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五、暗 场 显 微 镜

暗视野显微镜（ dark field microscop

e ）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4nm~200nm 的微粒子，分辨率可比普通显微镜高 50 倍。

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暗视野照明方式

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六、紫 外 光 显 微 镜

使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。生物细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（ ultraviolet microscope ）研究单个细胞的组成与变化情况。

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七、偏 光 显 微 镜

偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性 ( 即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光 )

的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。 利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。

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偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。

七、偏 光 显 微 镜

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偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。

七、偏 光 显 微 镜

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偏光显微镜的结

构

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激光扫描共聚焦显微镜原理图

八、激光扫描共聚焦显微镜

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激光扫描共聚焦显微镜实物图

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1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理

激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。

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1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理

共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。

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在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的立体结构图像。

1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理

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2. 激光扫描共聚焦显微镜的基本结构

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1. 抑制图像的模糊，获得清晰的图像

2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片

3. 增加侧向分辨率

4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响

3. 共焦显微镜与传统显微镜的区别

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4. CLSM 在医学检验中的应用

1．细胞的三维重建 2．细胞定量荧光测定 3． 细胞内钙离子、 pH 值和其它离子的

动态分析 4． 细胞间通讯和膜的流动性

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九、干涉相衬显微镜（ interference contrast microscope ）

干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。

偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英Wollaston 棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（ x 和y ），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。

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在物镜的后焦面处安装了第二个 Wollaston 棱镜(滑行器 ) ，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（ x 和 y ）仍然存在。

最后光束穿过第二个偏振装置 (检偏器 ) ，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，使二者发生干涉。

九、干涉相衬显微镜

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x 和 y 波的光程差决定着透射光的多少，光程差值为 0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现明暗差。

九、干涉相衬显微镜

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为了使影像的反差达到最佳状态，可调节滑行器的纵行微调改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。

九、干涉相衬显微镜

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干涉相衬显微镜的光路图

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十、近场扫描光学显微镜（ near-field scanning optical microscope ）

近场扫描光学显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于 150nm ，内孔直径为 50nm 的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为50nm （可见波长的 1/10左右）的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光量。

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近场扫描光学显微镜技术的理论分辨率极限约 1

0nm 。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且既可以用在空气中（与电子显微镜必须在真空条件下相比要优越），又可以用在水中（与一般的光学显微镜相比也有优越性）。

近场扫描光学显微镜技术将对研究活体中的病毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。

十、近场扫描光学显微镜

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第 三 节 电 子 显 微 镜

一、电子显微镜的基本结构

二、电子显微镜的分类及其应用

光镜分辩极限为光镜分辩极限为 0.20.2mm，小于，小于 0.20.2mm的微细结的微细结构的光波可产生衍射现象构的光波可产生衍射现象 ,,这种光波经过物体时可这种光波经过物体时可绕过物体就象无物体经过一样绕过物体就象无物体经过一样 ,,因此无法用光镜观因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辫力的仪器来观察比察。这就需要一种更大分辫力的仪器来观察比 0.20.2mm 更小的物体的微细结构。更小的物体的微细结构。

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一、电子显微镜的基本结构

• 电子光学系统• 真空系统• 供电系统• 机械系统• 观察显示系统

照明系统

成像系统

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（一）电子光学系统——照明系统

• 照明系统主要由电子枪和聚光镜组成。• 电子枪是发射电子的照明光源。• 聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而

成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。• 照明系统的作用就是提供一束亮度高、照

明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。

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1. 电 子 枪

电子枪是电镜的电子发射源，其作用是形成电子束，并控制电子束的发射，获得一高亮度和高稳定度的照明电子光源。

常用的电子枪由常用的是热阴极三极电子枪，它由发夹形钨丝阴极、栅极帽和阳极组成。

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电子枪的结构及工作原理图

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灯 丝

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2. 聚 光 镜

聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，以最小的损失照明样品，调节照明强度、孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜系统。第一聚光镜是强激磁透镜，束斑缩小率为 10 ～ 50 倍左右，将电子枪第一交叉点束斑缩小为 1～ 5μm ；而第二聚光镜是弱激磁透镜，适焦时放大倍数为 2倍左右。结果在样品平面上可获得 2～ 10μm 的照明电子束斑。

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（一）电子光学系统——成像系统

电子透镜：能使电子束聚焦的装置 电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是利用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。

电子透镜存在各种像差（ aberration ），这是影响成像质量的主要因素。

电子透镜

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电 磁 透 镜 的 结 构

• 电子电子源

电子轨迹

铜导线

软铁壳软铁壳

焦点

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( 二 ) 真 空 系 统

主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。

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( 三 ) 供 电 系 统

供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。

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( 四 ) 机 械 系 统

机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制工作台等，这些部分都有着相当高的性能。

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( 五 ) 观 察 显 示 系 统

观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组成。

电镜通过显像管的荧光屏把电子所成的像转换成光学影像后供肉眼观察。

电子感光板是常用的记录手段之一，可以利用照相机在照相室内拍照。

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二、电子显微镜的分类及其应用

电子显微镜的分类：分类： （一）透射电镜（（一）透射电镜（ Transmission electron Transmission electron

MicroscopeMicroscope ，， TEMTEM ）） （二） 扫描电镜（（二） 扫描电镜（ Scanning electron MicrScanning electron Micr

oscopeoscope ，， SEM SEM ）） （三）扫描隧道显微镜（（三）扫描隧道显微镜（ scanning tunneliscanning tunneli

ng microscope, STMng microscope, STM ）） （四）超高压电子显微镜

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（一）透 射 电 子 显 微 镜（ Transmission electron Microscope ， TEM ）

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光镜、透射电镜和扫描电镜的工作原理图

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1.ＴＥＭ 成 像 原 理

电子束和固体样品的作用

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2. ＴＥＭ 的 工 作 原 理

透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。

透射电镜的分辨率为 0.1～ 0.2

nm ，放大倍数为几万～几十万倍。

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3. ＴＥＭ 的 结 构

• 照明系统

• 成像系统

• 放大系统

• 纪录系统

电子枪聚光镜

物镜中间镜投影镜

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3. ＴＥＭ的结构——成像系统

物镜是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。

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3. ＴＥＭ的结构——成像系统

中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在 0-20 倍范围调节。在电镜操作过程中，主要是利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。

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3. ＴＥＭ的结构——成像系统

如果把中间镜的物平面和物镜的像平面重合，则在荧光屏上得到一幅放大像，这就是电子显微镜中的成像操作。如果把中间镜的物平面和物镜的后焦面重合，则在荧光屏上得到一幅电子衍射花样，这就是电子显微镜中的电子衍射操作。

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3. ＴＥＭ的结构——成像系统

投影镜的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小，因此它的景深和焦距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。

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4. 透 射 电 镜 的 主 要 部 件

样品台的作用是承载样品，并使样品能作平移、倾斜、旋转，以选择感兴趣的样品区域或位向进行观察分析。

样品台

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4. 透 射 电 镜 的 主 要 部 件

消像散器可以是机械式的，可以是电磁式的。机械式的是在电磁透镜的磁场周围放置几块位置可以调节的导磁体，用它们来吸引一部分磁场，把固有的椭圆形磁场校正成接近旋转对称的磁场。电磁式的是通过电磁极间的吸引和排斥来校正椭圆形磁场的 。

消像散器

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4. 透 射 电 镜 的 主 要 部 件

在透射电子显微镜中有许多固定光阑和可动光阑，它们的作用主要是挡掉发散的电子，保证电子束的相干性和照射区域。

光阑

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5. 透射电子显微镜的优点

主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貎。

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（二） 扫描电子显微镜（二） 扫描电子显微镜（（ Scanning electron MicroscopeScanning electron Microscope ，， SEMSEM

））

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1. 1. 扫 描 电 镜 的 工 作 原 理扫 描 电 镜 的 工 作 原 理

扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

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2. 扫 描 电 镜 的 结 构

二次电子探测器的工作原理图

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3. 扫 描 电 镜 的 特 点

分辨率高

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3. 扫 描 电 镜 的 特 点

立体感强

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3. 扫 描 电 镜 的 特 点

放大倍率范围广

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3. 扫 描 电 镜 的 特 点

样品适应性大应用范围广

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（三）扫 描 隧 道 显 微 镜（三）扫 描 隧 道 显 微 镜（（ scanning tunneling microscope, STMscanning tunneling microscope, STM ））

样品台

探针

步进电机

双螺旋测微头

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1.扫描隧道显微镜的工作原理

扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（ 2mV~2V ），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电流获取显微图像，而不需要光源和透镜。“扫描隧道显微镜”因此而得名。

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扫描隧道显微镜的工作原理图

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2. STM 的 基 本 结 构

STM 仪器由具有减振系统的 STM 头部 (含探针和样品台 )、电子学控制系统和包括 A/D 多功能卡的计算机组成。

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2. STM 的 重 要 部 件

隧道针尖的结构是扫描隧道显微技术要解决的主要问题之一。针尖的大小、形状和化学同一性不仅影响着扫描隧道显微镜图像的分辨率和图像的形状，而且也影响着测定的电子态。

针尖、压电陶瓷 、三维扫描控制器、减震系统

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3. STM 的 工 作 模 式

恒

高

模

式

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3. STM 的 工 作 模 式

恒

流

模

式

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4. STM 的 特 点① 分辨率高：横向分辨率可达 0.1nm，纵向分辨率可达 0.01nm

②可在真空、大气、液体等条件下工作

③非破坏性测量

④可实时地得到实空间中表面的三维图像，可用于具有周期性或不具备周期性的表面结构研究。

⑤配合扫描隧道谱可以得到有关表面结构的信息

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( 四 ) 超高压电子显微镜

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第四节 显微镜的维护、常见故障及其排除

一、显微镜的使用

二、显微镜的维护

三、显微镜的常见故障及排除

四、显微镜拆装的注意事项

五、电子显微镜的维护

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( 一 ) 光学显微镜的使用方法

低倍镜的使用：

1. 对光：转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转物镜转换器，使 10 倍物镜头对准镜台孔；然后升高聚光镜，打开光圈，将反光镜的凹面对准光源，直至视野明亮为止。

2.将要观察的切片放在载物台上，固定好，并将要观察的部位移至中央。

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( 一 ) 光学显微镜的使用方法

低倍镜的使用： 3. 调焦距：旋转粗调螺旋，升高载物台，至物

镜距玻片约 0.5cm时，再缓慢降低镜台，直到看清图像为止。

4. 调节两瞳孔间的距离：一边用双眼自目镜中观察，一边用双手握住两个目镜管，前后或左右移动，直到双眼看到一共同视野为止。

5. 为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，欲使左眼图像清晰，需旋转镜管长度调节环。

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( 一 ) 光学显微镜的使用方法

高倍镜的使用： 用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的结构

移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋转物镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高聚光镜，将光线调节到最亮的程度；然后，稍微转动微调螺旋，即可观察到清晰的图像。

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( 一 ) 光学显微镜的使用方法

油镜的使用： 用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移至

视野中央，在标本所要观察的部位滴一滴镜油，旋转物镜转换器，将油镜头对准镜台孔，使油镜头下端与镜油接触，然后，轻轻转动微调螺旋，即可看清物像。使用油镜时，应把聚光镜的光圈充分开大。 用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗剂，将镜头和玻片擦净。

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（二）显 微 镜 的 维 护

1.搬动显微镜时，应该用右手握镜臂 ,左手托镜座，平贴胸前，以防撞碰。切勿用一只手斜提，前后摇摆。

2.每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部件有无缺损，发现问题，及时报告。使用时，要严格按操作程序，正确地缓慢移动有关机械部分。

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（二）显 微 镜 的 维 护

3.禁止拆卸显微镜的各个部件，更不允许与其它显微镜对换，以免安装不当影响观察效果。

4. 如镜头表面有灰尘，应该用擦镜纸擦，不允许用口吹、手指抹，或用其它纸、布擦。

5. 显微镜用完后，将 4 倍镜头对准镜台孔，升高镜台，降下聚光器，打开光圈，盖好防尘罩，放回原处。

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利用显微摄影装置拍摄显微镜 (或解剖镜 )视野中物像的技术称为显微摄影。

显微摄影术主要包括两个方面：

拍摄：需要一套完备的显微摄影装置

洗印放大：需要一个较好的暗室和成套

的洗印放大设备。

第五节 显 微 摄 影 术

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一、成像原理与常用的装置

1 、成像原理 :

光源入射光束经聚光镜有效聚焦到标本上，由标本表面的光入射到物镜上，标本经物镜放大，其光线再经照相目镜聚焦在照相暗盒的胶片上，光电转换器将标本成像的光线转换成电信号，自动曝光控制器根据信号的强弱、胶卷尺寸的大小、胶卷感光速度、胶卷倒易率失效补偿、色温大小等数据由机内电子计算机进行计算、修正，准确算出最佳曝光时间。经曝光后，就可以在胶片上获得与标本相反的实像，即潜像。

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一、成像原理与常用的装置

常用的显微摄影装置有两种：

显微照相机

照相显微镜

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二、感光材料及其暗室加工

传统显微照相技术采用胶片作为记录介质，常用的胶片有黑白负片，彩色负片，彩色反转片几种。

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三、 滤 色 镜 的 使 用

( 一 )黑白片显微摄影中滤色镜的使用

( 二 )彩色片显微摄影中滤色镜的使用

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四、数 码 显 微 摄 影 技 术

数码显微摄影以电子存储设备为载体，通过电感藕合器将光信号转换成相应模拟量的电信号，这种电信号经模拟数字转换器进行模拟及数字信号转换后，再经数字压缩记录到内存卡或闪速存储卡等一些移动式存储器中，形成数字影像文件。

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五、显微摄影的三大技术要领

1. 取景对焦

2. 正确曝光

3. 增强反差

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1. 取 景 对 焦

显微摄影通过取景器的测视目镜，确定拍摄的

范围及物体影像在底片上的大小。对焦是使影像

在底片上清晰聚集，以保证拍摄的显微照片清晰

可靠。

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2. 正 确 曝 光

曝光是显微摄影中的重要关键。曝光的正确与否决定着照片的质量。影响曝光时间的因素非常多，例如底片的性能、照明光源的强度和色温（光谱成分）、照明方法、滤色镜的种类、物镜的数值孔径和倍数、目镜的倍数、摄影机皮腔的伸长度、被摄物体的颜色和光学性质等等。实际工作中常以自动曝光或试摄测定来确定曝光时间。

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3. 增 强 反 差

（ 1 ）感光片的反差：不同的感光片具有不同的反差性能，一般而言，感光速度快的，其反差较弱，感光速度慢的，其反差较强。

（ 2 ）滤色镜的使用：一般的生物学医学标本通过显微镜照相，往往存在反差较小的弊端。因此，在光路中通过增加滤色镜来控制照明光线以及增加底片上的反差是很有必要的。

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再 见！