第四章 柠檬酸发酵机制第四章 柠檬酸发酵机制

重点：重点：了解柠檬酸生物合成的基本原理，掌握了解柠檬酸生物合成的基本原理，掌握其发酵调控手段。其发酵调控手段。

柠檬酸生物合成途径柠檬酸生物合成途径 葡萄糖葡萄糖 ↓① ↓① 6-6- 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 ↓② ↓② 1,6-1,6- 二磷酸果糖→磷酸二羟丙酮→甘油二磷酸果糖→磷酸二羟丙酮→甘油 ↓③ ↓③ 丙酮酸 →– 丙酮酸 →– COCO22→→ 乙酰乙酰 CoA CoA ↘↘ ↙↘ ↘↙↘ ↘+ + COCO2 2 →→ 草酰乙酸草酰乙酸↗↗柠檬酸柠檬酸 乙醛乙醛 ,, 乳酸乳酸 关键酶关键酶 : ①: ①己糖激酶己糖激酶 , ②, ②磷酸果糖激酶，③丙酮磷酸果糖激酶，③丙酮

酸激酶酸激酶 .. 注注 :: 乙酰乙酰 CoA+CoA+ 草酰乙酸→柠檬酸草酰乙酸→柠檬酸 ,, 进入进入三羧酸循三羧酸循

环环

柠檬酸代谢调控柠檬酸代谢调控 氧化磷酸化可产生氧化磷酸化可产生 99 个个 ATP.ATP. 理论转化率理论转化率 106.7%106.7% 11 、磷酸果糖激酶、磷酸果糖激酶 (PFK)(PFK) 是调节酶，受是调节酶，受 ATPATP

和柠檬酸的抑制和柠檬酸的抑制 ,, 而被而被 AMP,AMP, 无机磷和无机磷和 NHNH4 4 ++

激活激活 .. 这表明了 这表明了 NHNH4 4 ++ 能有效解除柠檬酸对能有效解除柠檬酸对 PP

FKFK 的抑制，而大量积累柠檬酸的抑制，而大量积累柠檬酸 .. 22 、柠檬酸合成酶、柠檬酸合成酶 , , 受受 ATPATP 抑制抑制 ,, 而在菌种细而在菌种细

胞中，胞中， ATPATP 主要以络合物主要以络合物 ATP-MgATP-Mg 的形式存的形式存在在 ,, 其抑制作用较弱其抑制作用较弱 .. 而草酰乙酸可激活此酶而草酰乙酸可激活此酶(( 通过提高此酶与乙酰通过提高此酶与乙酰 CoACoA 的亲和力实现的亲和力实现 ).).

33 、、丙酮酸羧化酶 （丙酮酸羧化酶 （ 11）也称线粒体酶，是组成酶，有四个亚基与）也称线粒体酶，是组成酶，有四个亚基与四分子生物素连接。四分子生物素连接。

（（ 22 ）生物素辅基在酶的位点上起中间载体）生物素辅基在酶的位点上起中间载体的作用将羧基转移到丙酮酸上生成草酰乙酸 的作用将羧基转移到丙酮酸上生成草酰乙酸 。。

（（ 33 ）） KK++ 对该酶有激活作用对该酶有激活作用 44 、丙酮酸脱、丙酮酸脱 HH 酶酶 （（ 11 ）受）受 ATPATP 和亚砷酸的抑制。和亚砷酸的抑制。 （（ 22 ）） ADPADP 、、 CaCa+ + 使该酶激活。使该酶激活。

柠檬酸合成简要途径柠檬酸合成简要途径 丙 酮 酸丙 酮 酸 + + COCO2 2 ↙ ↘ ↙ ↘ – CO– CO22 ↗↗ ↓ ↓ 丙酮酸羧化酶 ↓ 丙酮酸脱丙酮酸羧化酶 ↓ 丙酮酸脱 HH 酶 酶 草酰乙酸 乙酰草酰乙酸 乙酰 CoACoA ↘ ↙ ↘ ↙ 柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶 柠檬酸柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸 (( 三羧酸循环三羧酸循环 ))

55 、柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸的反应，是因为黑曲霉、柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸的反应，是因为黑曲霉的线粒体上存在顺乌头酸水合酶的线粒体上存在顺乌头酸水合酶 ,, 它能催化建立以下平衡它能催化建立以下平衡:: 柠檬酸柠檬酸 :: 顺乌头酸顺乌头酸 :: 异柠檬酸异柠檬酸 =90:3:7=90:3:7 ，该酶需要，该酶需要 FeFe2+2+ 参参与，应控制与，应控制 FeFe2+2+ 浓度。而浓度。而 NAD-NAD- 异柠檬酸脱氢酶活性低异柠檬酸脱氢酶活性低 ,,虽然细胞质中虽然细胞质中 NADP-NADP- 异柠檬酸脱氢酶不受柠檬酸抑制异柠檬酸脱氢酶不受柠檬酸抑制 ,,但在线粒体上的但在线粒体上的 NADP-NADP- 异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸抑制异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸抑制 ;;所以当柠檬酸达到一定浓度时，能够抑制自身的进一步分所以当柠檬酸达到一定浓度时，能够抑制自身的进一步分解解 ,, 导致积累柠檬酸导致积累柠檬酸 ; ; 当当 pHpH 到到 2.02.0 时时 ,, 已经能使上述三种已经能使上述三种酶失活而进一步积累柠檬酸酶失活而进一步积累柠檬酸 . .

以黑曲霉生产柠檬酸时，如果短时间停止供以黑曲霉生产柠檬酸时，如果短时间停止供气，会影响柠檬酸的产量，但对菌体生长没气，会影响柠檬酸的产量，但对菌体生长没影响。这主要是黑曲霉含有两条呼吸链，即影响。这主要是黑曲霉含有两条呼吸链，即侧系呼吸链（不生成侧系呼吸链（不生成 ATPATP ）和标准呼吸链）和标准呼吸链（生成（生成 ATPATP ）。当供气正常时，两条呼吸）。当供气正常时，两条呼吸链同时工作，代谢正常进行。当供气不正常链同时工作，代谢正常进行。当供气不正常时，侧系呼吸链产生不可逆失活，此时时，侧系呼吸链产生不可逆失活，此时 NANADHDH22 只能通过标准呼吸链氧化，产生过量的只能通过标准呼吸链氧化，产生过量的ATPATP ，从而抑制磷酸果糖激酶，从而抑制磷酸果糖激酶 (PFK)(PFK) 的活的活性，糖酵解减慢。性，糖酵解减慢。

黑曲霉柠檬酸发酵机制小结黑曲霉柠檬酸发酵机制小结 锰缺乏锰缺乏 (<30mmol) →(<30mmol) → 抑制蛋白质合成抑制蛋白质合成

→→ NHNH4 4 ++ 浓度上升浓度上升 (25mmol (25mmol 左右左右 )) 解解

除柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制除柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制 .. 不产不产 ATPATP 的侧系呼吸链→解除对磷酸的侧系呼吸链→解除对磷酸

果糖激酶的抑制→果糖激酶的抑制→ EMPEMP 途径顺畅。途径顺畅。 应降低应降低 FeFe2+2+ 浓度来抑制顺乌头酸水合浓度来抑制顺乌头酸水合

酶的话性酶的话性 .. 降低降低 pHpH 值有利于积累柠檬酸值有利于积累柠檬酸 ..

利用假丝酵母生产柠檬酸利用假丝酵母生产柠檬酸 大约在大约在 19631963年左右发现一些棒状杆菌能够利用正烷烃为碳源生年左右发现一些棒状杆菌能够利用正烷烃为碳源生产谷氨酸，同时日本也研究开发了假丝酵母利用正烷烃为碳源生产谷氨酸，同时日本也研究开发了假丝酵母利用正烷烃为碳源生产柠檬酸的项目。产柠檬酸的项目。

主要特点：主要特点： 发酵初期只长菌不长菌，只有在培养基中的氮源消耗完以后才开发酵初期只长菌不长菌，只有在培养基中的氮源消耗完以后才开始积累柠檬酸。始积累柠檬酸。

发酵发酵 pHpH不低于不低于 5.05.0。。 高高 FeFe2+2+ 浓度会增加乌头酸水合酶的活性，减少柠檬酸的积累。浓度会增加乌头酸水合酶的活性，减少柠檬酸的积累。 产物中异柠檬酸比例的较高，达到产物中异柠檬酸比例的较高，达到 50%50%，可添加抑制剂（氮氟，可添加抑制剂（氮氟乙酸、乙酸、 2,4-2,4-二硝基苯酚等）抑制乌头酸水合酶活性。二硝基苯酚等）抑制乌头酸水合酶活性。