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실험 4. 식물세포 배양 및 성장률 측정

1. 실험 목적

식물플랑크톤의 세포성장에 대한 이해와 실제 세포계수를 통한 성장률 측정 방법을 학습한다.

2. 실험 원리

1) 세포 성장 (cell growth)

세포의 크기나 구성물질의 증가만을 의미하는 것이 아니라 하나의 모세포(mother cell)가 세포

생식(cell reproduction)을 통해 2 개의 딸세포(daughter cell)를 생성하며 나타나는, 즉 세포분열을

동반한 세포의 수적 증가를 의미한다. 각 생물들은 다음과 같은 방법으로 생장한다: 세균(이분법),

효모(출아법), 곰팡이류(균사체 성장, 유사분열), 진핵세포(무성/유성생식).

2) 세포 성장 곡선 (growth curve)

생명체 개체군의 수(또는 농도)의 변화를 시간의 함수로 표현한 그래프이다. 모든 생물체의

개체군은 생물체 특유의 생장곡선을 보유하며, 세포의 성장은 수학적으로 예측 가능하다.

그림 4-1 세포 성장 곡선 (http://cms.daegu.ac.kr)

① lag phase (유도기, induction phase)

- 개체수의 증가가 거의 없다 (생성=소멸)

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- 세포를 새로운 배양액에 접종, 배양할 때 그 배양액에 적응하는 시기

- 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성 하는 시기

- 세포의 크기가 커지고 호흡활성도가 높은 시기

- 세포내의 RNA 량이 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성한 시기

(DNA 량은 변화하지 않음)

② logarithmic phase (대수기, exponential log phase)

- 세포가 대수적으로 증식하는 시기 (생성>소멸)

- 세대시간, 세포의 크기가 일정한 시기

- 세포질의 합성속도와 세포수의 증가는 비례. 세포 생장의 수학적 분석이 가능한 구간

- 증식속도는 배지의 영양, pH, 온도, 산소 분압 등의 환경인자에 의해서 결정

- 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기

- 물리적, 화학적 처리에 대해서 감수성이 높은 시기

③ stationary phase (정상기, maximum phase)

- 살아있는 세포의 수는 일정하게 유지되지만 전세포수는 최대가 되는 시기 (생성=소멸)

- 영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 pH 의 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이

되어 살아있는 세포수가 증가하지 않는다.

④ death phase (사멸기, phase of decline)

- 살아있는 세포의 수가 감소하는 시기 (생성

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4. 실험 방법

1) 1 주 동안 sampling 한 각각 다른 염분 농도의 sample 을 SR chamber 에 sample 1 mL 를 채워

넣는다(chamber 의 윗부분에 가장자리에서 밀듯이 coverslip 을 덮는다. 이때 cover slip 아래쪽에

기포가 생기지 않도록 유의한다.)

2) 현미경의 재물대 위에 SR chamber 를 두고 바닥으로 시료가 침전되도록 놓아둔다.

3) cell 수를 counting 한다.

① SR 챔버의 크기는 20X50X1mm 이며, 총 1000 칸으로 나누어져 있다.

② 임의의 1 칸에 해당하는 1mm3 의 체적에 있는 조류를 개수한다.

③ 최소 20 칸 이상을 계수한다. 주관적인 칸 선정은 피한다

④ 개체 수 산정

Cells/ mL = C × 1000 mm3

A(mm2) × D(mm) × F × V

C: 개수된 총 개체수

A: 한 칸 당 넓이(mm2)

D: 한 칸 당 높이(mm)

F: 개수한 칸 수

V: 농축 배율

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5. 실험 결과 및 토의 1) 세포 계수 결과를 통해 염분 농도 별 성장 곡선 그래프를 작성한다. 2) 일반적인 세포 성장곡선과 작성된 그래프를 비교하여 분석한다.

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3) 서로 다른 염도가 C. ehrenbergii 성장에 미치는 영향을 생각해 본다.