Post on 02-Sep-2019
Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155
151
TÁCH DÕNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)
CỦA VIRUS GÂY BỆNH XANH LÙN (CLRDV) TRÊN CÂY BÔNG
Ngô Mạnh Dũng1*
, Chu Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn
2
1Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 2Viện Công nghệ sinh học, VSAT
TÓM TẮT Cây bông là loại cây trồng lấy sợi có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới. Trong khoảng 20 loại
virus gây bệnh trên cây bông, bệnh xanh lùn là bệnh có thể gây thiệt hại nặng nề nhất trên thế giới.
Nguyên nhân gây bệnh xanh lùn đã đƣợc xác định là do virus gây bệnh xanh lùn (Cotton leaf roll
dwarf virus - CLRDV) thuộc họ Luteoviridae, chi Polerovirus gây ra. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi đã tiến hành tách dòng và giải trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây bệnh
xanh lùn trên cây bông ở Việt Nam, kích thƣớc gen đƣợc phân lập khoảng 606 bp. Trình tự gen CP
phân lập từ CLRDV ở Việt Nam có độ tƣơng đồng 98,2- 99,2% so với các trình tự gen đƣợc công
bố trên ngân hàng gen quốc tế.
Từ khóa: Bệnh xanh lùn, cây bông, CP-CLRDV, E. coli DH5 , RT-PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ*
Trên thế giới, cây bông đƣợc trồng ở nhiều
nƣớc có điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận
nhiệt đới và là một trong những loại cây trồng
lấy sợi quan trọng nhất. Trong khoảng 20 loại
virus gây bệnh trên cây bông, bệnh xanh lùn
là bệnh có thể gây thiệt hại nặng nề nhất nhất
trên thế giới [1]. Bệnh xanh lùn đã đƣợc phát
hiện tại nhiều nƣớc trồng bông thuộc Châu
Phi, Châu Á và Nam Mỹ,…
Đối với cây bông ở Việt Nam, bệnh xanh lùn
là bệnh gây thiệt hại nhiều nhất. Bệnh đƣợc
phát hiện lần đầu tiên tại Nha Hố (Ninh
Thuận) vào năm 1984-1985 nhƣng chƣa gây
hại đáng kể. Sau đó tác hại của bệnh tăng dần.
Năm 1991, Ninh Thuận xảy ra đợt dịch đầu
tiên, tại Nha Hố trên 80 ha trồng bông bị bệnh
với tỉ lệ 50-100%, gây thiệt hại hơn 50% sản
lƣợng bông.
Nguyên nhân gây bệnh xanh lùn là do virus
gây ra. Năm 2005, Correa và cộng sự thông
qua phân lập, xác định và so sánh trình tự của
gen vỏ và một phần của gen RdRp đã khẳng
định đƣợc virus gây bệnh xanh lùn là thuộc
họ Luteoviridae, có khả năng xếp vào chi
Polerovirus và đã đặt tên virus này là Cotton
leafroll dwarf virus (CLRDV) [4]. Đến năm
* Tel: 0979 722412, Email: dungmnsptn@gmail.com
2010, Distéfano sau khi nghiên cứu hoàn
chỉnh trình tự bộ gen của virus bệnh xanh lùn
trên cây bông, CLRDV, khẳng định đây là
một thành viên mới của chi Polerovirus [5].
Đến nay, đối với cây bông, biện pháp hiệu
quả nhất là sử dụng công nghệ gen trong
phòng chống, tạo ra các giống cây trồng có
khả năng kháng bệnh. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi tiến hành tách dòng và giải trình tự
gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây
bệnh xanh lùn trên cây bông nhằm tạo tiền đề
cho những nghiên cứu tạo cây bông chuyển
gen kháng bệnh virus xanh lùn sau này.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
Nguồn bệnh virus: Lá bông nghi nhiễm bệnh
xanh lùn do Viện Nghiên cứu và Phát triển
cây bông Nha Hố cung cấp.
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều là
hóa chất tinh khiết dùng trong phòng thí
nghiệm về sinh học phân tử (hóa chất của các
hãng Sigma, Invitrogen, Fermentas…).
Trình tự các mồi để phân lập gen:
CP-CLRDV-F:
5‟-AATTCATGAATACGGTCGTGGGTA-3‟
CP-CLRDV-R:
5‟-CTCGAGTTTTGGATTGTGGAATTGG-3‟
Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155
152
Phƣơng pháp
Tách chiết RNA tổng số thực hiện theo
phƣơng pháp của Napoli và cộng sự (1990).
cDNA đƣợc tổng hợp theo kít “RevertAidTM
H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit”
(Fermentas).
Phản ứng cDNA thực hiện trong thể tích 20
l gồm có các thành phần sau: 10 ng - 5 g
RNA tổng số; 250ng mồi ngẫu nhiên. Bổ
sung nƣớc khử ion có xử lý DEPC tới thể tích
12 l. Ủ 70°C/5 phút, sau đó đặt vào đá. Tiếp
tục bổ sung các thành phần vào ống phản ứng
trên: 4 l đệm RT 5X tổng hợp cDNA; 1 l
riboLock Ribonuclease inhibitor (20u/ l); 2
l dNTP (10 mM). Hỗn hợp sau đó đảo và ly
tâm nhẹ; ủ 25°C/5 phút. Tiếp tục bổ sung 1 l
enzyme RevertAid (200/ l) và thực hiện một
chu trình nhiệt nhƣ sau: 25°C/10‟, 42°C/60‟,
72°C/10‟, 40°C/10‟.
Các đoạn gen quan tâm
, chu kỳ nhiệt: 94°C /3‟, 25 chu kỳ
gồm 94°C/40s, từ 50-56°C /40s tùy thuộc vào
nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi,
72°C/1‟30s, 72°C/10‟ và kết thúc ở 4°C. Sản
phẩm đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8 % .
động ABI PRIM 3100 Avant Genetic
Analyzer bằng cách sử dụng bộ hoá chất
bigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhân bản gen của CLRDV bằng RT-PCR
RNA tổng số từ mẫu bông nghi nhiễm bệnh
sau khi tách chiết đƣợc sử dụng làm khuôn để
tổng hợp cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc
(Reverse transcriptase) với cặp mồi ngẫu
nhiên dài 6 nucleotide (random primer) (theo
bộ Kit của Fermentas). cDNA sau đó đƣợc
làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại các
đoạn DNA mang gen mã hoá cho protein vỏ
(CP) của CLRDV với cặp mồi đƣợc thiết kế
đặc hiệu.
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên hình 1
cho thấy sản phẩm RT-PCR rất đặc hiệu, chỉ
cho một phân đoạn DNA duy nhất với kích
thƣớc tƣơng ứng tính toán lý thuyết. Để có
thể kết luận chính xác các phân đoạn này có
phải là của virus CLRDV hay không, các
phân đoạn này tiếp tục đƣợc dòng hóa bằng
cách gắn vào vector pBT và biến nạp vào tế
bào khả biến E.coli DH5 với mục đích lựa
chọn những dòng khuẩn lạc dƣơng tính, tách
chiết plasmid để xác định trình tự.
Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR
nhân gen CP của CLRDV
M: Marker 1kb; 1: CLRDV; 2: ĐC âm
Dòng hóa gen vào vector pBT
Sản phẩm RT-PCR sau khi thôi gel và gắn
vào vector pBT đƣợc biến nạp vào tế bào khả
biến E. coli DH5 . Dựa vào phƣơng pháp
chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng và colony-
PCR, những dòng khuẩn lạc dƣơng tính đã
đƣợc lựa chọn để tinh sạch phục vụ cho việc
đọc trình tự.
pUC18F/pUC18R là cặp mồi nằm trên vector
pBT, nếu đoạn gen đƣợc chèn vào đúng vị trí
của plasmid thì theo lý thuyết sản phẩm
colony-PCR chọn dòng pBT/CP-CLRDV là
779 bp (615+164) và so với đối chứng âm
pBT là 164 bp.
Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di ở hình 2
cho thấy, các phân đoạn thu đƣợc cũng có
kích thƣớc tƣơng ứng với tính toán lý thuyết
đã chứng tỏ việc dòng hóa gen vào vector
pBT đã thành công.
Chúng tôi tiếp tục lựa chọn một dòng dƣơng
tính nuôi lỏng để tách chiết plasmid phục vụ
đọc trình tự.
bp M 1 2
750 500
Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155
153
Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR
chọn dòng pBT/CP-CLRDV
M. marker 1kb. 1-4: các khuẩn lạc; 5: ĐC âm
Xác định trình tự gen của CLRDV
Gen đƣợc đọc trình tự trên máy đọc tự động
ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer
bằng cách sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
Sau khi đọc trình tự, trình tự này đƣợc so
sánh trong BLAST của NCBI. Kết quả cho
thấy, đoạn gen phân lập đƣợc là đoạn gen CP
của virus CLRDV.
Kết quả đọc trình tự gen CP của dòng virus
CLRDV-Nha Hố và so sánh với các trình tự
gen của virus CLRDV đã công bố trên ngân
hàng gen thế giới đƣợc thể hiện ở hình 3.
Trình tự gen CP phân lập từ CLRDV ở Việt
Nam có độ tƣơng đồng với các trình tự gen
công bố trên 98%. Trình tự gen CP này giống
98,2% so với trình tự CP-CLRDV ở
Aghentina và 99,2% trình tự gen CP-CLRDV
ở Braxin. 10 20 30
------------------+-------------------+-------------------+-
1 A T G A A T A C G G T C G T G G G T A G A A G A A C G A T C CP-CLRDV-Agh
1 A T G A A T A C G G T C G T G G G T A G A A G A A C G A T T CP-CLRDV Bra
1 A T G A A T A C G G T C G T G G G T A G A A G A A C G A T T CP-CLRDV VN
40 50 60
------------------+-------------------+-------------------+-
31 A A T G G A A G A A G A C G A C C A C G T A G G C G C A A C CP-CLRDV-Agh
31 A A T G G A A G A A G A C G A C C A C G T A G G C G C A A C CP-CLRDV Bra
31 A A T G G A A G A A G A C G A C C A C G T A G G C G C A A C CP-CLRDV VN
70 80 90
------------------+-------------------+-------------------+-
61 A G G C G T C G G C A A A A T C A G C C A G T G G T T G T G CP-CLRDV-Agh
61 A G G C G T C G G C A A A A T C A G C C A G T G G T T G T G CP-CLRDV Bra
61 A G G C G T C G G C A A A A T C A G C C A G T G G T T G T G CP-CLRDV VN
100 110 120
------------------+-------------------+-------------------+-
91 G T C C A A G C C C C T C G G A A C A C A C A A C G C A G A CP-CLRDV-Agh
91 G T C C A A G C C C C T C G G A A C A C A C A A C G C A G A CP-CLRDV Bra
91 G T C C A A G C C C C T C G G A A C A C A C A A C G C A G A CP-CLRDV VN
130 140 150
------------------+-------------------+-------------------+-
121 A G A C G A C G A A G A C G A G G A G G T C G T A A T A G G CP-CLRDV-Agh
121 A G A C G A C G A A G A C G A G G A G G T C G T A A T A G G CP-CLRDV Bra
121 A G A C G A C G A A G A C G A G G A G G T C G T A A T A G G CP-CLRDV VN
160 170 180
------------------+-------------------+-------------------+-
151 A C A G G A G G A C G C A T T C C T G G A G G A C C A G G A CP-CLRDV-Agh
151 A C A G G A G G A C G C A T T C C T G G A G G A C C A G G A CP-CLRDV Bra
151 A C A G G A G G A C G C A T T C C T G G A G G A C C A G G A CP-CLRDV VN
190 200 210
------------------+-------------------+-------------------+-
181 G C T T C A A G C G A G A C A T T T G T T T T C T C A A A A CP-CLRDV-Agh
181 G C T T C A A G C G A G A C A T T T G T T T T C T C A A A A CP-CLRDV Bra
181 G C T T C A A G C G A G A C A T T T G T T T T C T C A C A A CP-CLRDV VN
220 230 240
------------------+-------------------+-------------------+-
211 G A C A G T C T C T C G G G A A G T T C C T C A G G A T C A CP-CLRDV-Agh
211 G A C A G T C T C T C G G G A A G T T C C T C A G G A T C A CP-CLRDV Bra
211 G A C A G T C T C T C G G G A A G T T C C T C A G G A T C A CP-CLRDV VN
250 260 270
------------------+-------------------+-------------------+-
bp M 1 2 3 4 5
1000 750
Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155
154
241 A T C A C G T T C G G G C C G T C T T T A T C A G A T T G C CP-CLRDV-Agh
241 A T C A C G T T C G G G C C G T C T T T A T C A G A T T G C CP-CLRDV Bra
241 A T C A C G T T C G G G C C G T C T T T A T C A G A T T G C CP-CLRDV VN
280 290 300
------------------+-------------------+-------------------+-
271 C C G G C A T T C A G C A A T G G A A T A C T C A A G G C C CP-CLRDV-Agh
271 C C G G C A T T C A G C A A T G G A A T G C T C A A G G C C CP-CLRDV Bra
271 C C G G C A T T C A G C A A T G G A A T G C T C A A G G C C CP-CLRDV VN
310 320 330
------------------+-------------------+-------------------+-
301 T A C C A T G A A T A T A A G A T C T C A A T G G T C T T A CP-CLRDV-Agh
301 T A C C A T G A A T A T A A G A T C T C A A T G G T C T T A CP-CLRDV Bra
301 T A C C A T G A A T A T T A G A T C T C A A T G G T C T T A CP-CLRDV VN
340 350 360
------------------+-------------------+-------------------+-
331 T T G G A G T T C A T C T C C G A G G C C T C T T C A A C A CP-CLRDV-Agh
331 T T G G A G T T C A T C T C C G A G G C C T C T T C A A C A CP-CLRDV Bra
331 T T G G A G T T C A T C T C C G A G G C C T C T T C A A C A CP-CLRDV VN
370 380 390
------------------+-------------------+-------------------+-
361 T C C T C C G G T T C C A T C T C T T A C G A A G T G G A T CP-CLRDV-Agh
361 T C C T C C G G T T C C A T C T C T T A C G A A G T G G A T CP-CLRDV Bra
361 T C C T C C G G T T C C A T C T C T T A C G A A G T G G A T CP-CLRDV VN
400 410 420
------------------+-------------------+-------------------+-
391 C C A C A C T G T A A A T T G T C A A C C C T A T C C T C C CP-CLRDV-Agh
391 C C A C A C T G T A A A T T G T C A A C C C T A T C C T C C CP-CLRDV Bra
391 C C A C A C T G T A A A T T G T C A A C C C T A T C C T C C CP-CLRDV VN
430 440 450
------------------+-------------------+-------------------+-
421 A C G A T T A A C A A A T T C G G A A T C A C C A A G A A T CP-CLRDV-Agh
421 A C G A T T A A C A A A T T C G G A A T C A C C A A G A A C CP-CLRDV Bra
421 A C G A T T A A C A A A T T C G G A A T C A C C A A G A A C CP-CLRDV VN
460 470 480
------------------+-------------------+-------------------+-
451 G G G A G G A A G C A A T T T G C G G C G T C T T T C A T C CP-CLRDV-Agh
451 G G G A G G A A G C A A T T T G C G G C G T C T T T C A T C CP-CLRDV Bra
451 G G C A G G A A G C A A T G T G C G G C G T C T T T C A T C CP-CLRDV VN
490 500 510
------------------+-------------------+-------------------+-
481 A A T G G A C A G G A A T G G C A T G A C A C C T C C G A G CP-CLRDV-Agh
481 A A T G G A C A G G A A T G G C A T G A C A C C T C C G A G CP-CLRDV Bra
481 A A T G G A C A G G A A T G G G A T G A C A C C T C C G A G CP-CLRDV VN
520 530 540
------------------+-------------------+-------------------+-
511 G A C C A A T T C A G A A T C T T A T A C A A A G G C A A T CP-CLRDV-Agh
511 G A C C A G T T C A G A A T C T T A T A T A A A G G C A A T CP-CLRDV Bra
511 G A C C A G T T C A G A A T C T T A T A T A A A G G C A A T CP-CLRDV VN
550 560 570
------------------+-------------------+-------------------+-
541 G G T T C C T C G T C G A T A G C T G G C T C T T T T A A G CP-CLRDV-Agh
541 G G T T C C T C G T C G A T A G C T G G C T C T T T T A G G CP-CLRDV Bra
541 G G T T C C T C G T C G A T A G C T G G C T C T T T T A G G CP-CLRDV VN
580 590 600
------------------+-------------------+-------------------+-
571 G T C A C A A T T C G G T G C C A A T T C C A C A A T C C A CP-CLRDV-Agh
571 G T C A C A A T T C G G T G C C A A T T C C A C A A T C C A CP-CLRDV Bra
571 G T C A C A A T T C G G T G C C A A T T C C A C A A T C C A CP-CLRDV VN
------------
601 A A A T A G CP-CLRDV-Agh
601 A A A T A G CP-CLRDV Bra
601 A A A T A G CP-CLRDV VN
Hình 3. Kết quả đọc trình tự và so sánh gen CP-CLRDV phân lập ở Việt Nam (CP-CLRDV VN) với các
trình tự đã được công bố ở Braxin (CP-CLRDV Bra) và Aghentina (CP-CLRDV Agh).
Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155
155
KẾT LUẬN
Gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây
bệnh xanh lùn trên cây bông ở Việt Nam đã
đƣợc phân lập với kích thƣớc 779 bp. Trình tự
gen CP phân lập từ CLRDV ở Việt Nam có
độ tƣơng đồng 98,2-99,2% so với các trình tự
gen đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Brown J K, (1992), Viral Diseases, In: Hillocks
R J (ed.) Cotton Diseases, CBA International,
Wallingford, 275-329.
2. Cauquil J and Follin J C, (1983), Cotton disease
attributed to viruses or mycoplasmas in Africa
south of the Sahara and in the rest of the world,
Coton et Fibres Tropicales 38, 293-317.
3. Chaudhry MA, (2002), Impact of Genetically
Engineered Cotton in the World, 2nd Meeting of the
Asian Cotton Research and Development Network
Tashkent, Uzbekistan, November 14-16, 2002.
4. Correa R L, Silva T F, Simoes-Araujo J L,
Barroso P A V, Vidal M S, Vaslin M F S, (2005),
Molecular characterization of a virus from the
family Luteoviridae associated with cotton blue
disease, Arch Virol, 150(7),1357-67.
5. Distéfano A J, Kresic I B, Hopp H E (2010),
The complete genome sequence of a virus
associated with cotton blue disease, cotton leafroll
dwarf virus, confirms that it is a new member of
the genus Polerovirus. Archives of Virology
(155), 1849-1854.
6. Junior Osme'rio Pupim, Ivan Schuster, Ronald
Barth Pinto, Ely Pires, Jean-Louis Belot, Piere
Silvie, Luiz Gonzaga Chitarra, Lu‟cia Vieria
Hoffmann and Paulo Barroso, (2008), Inheritance
of resistance to cotton blue disease, Pesq Agropec
Bras 43 (5), 661-665.
7. Miller WA, Brown MC, Wang S (1997), New
punctuation for the genetic code: luteovirus gene
expression, Seminars in Virology 8, 3-13.
8. Zhang BH, Fanglin, Yao CB, Wang KB (2000),
“Recent progress in cotton biotechnology and
gentic engineering in China”, Current Science,
79(1), 37 - 44.
SUMMARY
CLONING AND SEQUENCING OF THE COAT PROTEIN GENE (CP)
OF COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS (CLRDV)
Ngo Manh Dung
1*, Chu Hoang Ha
2, Le Van Son
2
1College of Education - TNU 2Insitue of Biotechnology, VAST
Cotton (Gossypium hirsutum L.) is an important fiber crop in the world. There are about 20
different viruses cause disease on cotton have been found in the world. Cotton blue disease caused
by Cotton leaf roll dwarf virus (CLRDV, Genus: Polerovirus, Family: Luteoviridae) is a viral
disease of the the most severe damage. In this study, we conducted cloning and sequencing of coat
protein (CP) gene of blue dwarf virus from cotton in Vietnam, gene size about 606 bp. CP gene
sequences isolated from CLRDV in Vietnam have similarities of 98.2 to 99.2% compared with the
published gene sequences on GenBank.
Keywords: leafroll dwarf virus, cotton, CP-CLRDV, E. coli DH5 , RT-PCR
Ngày nhận bài:22/4/2014; Ngày phản biện:29/4/2014; Ngày duyệt đăng: 5/5/2014
Phản biện khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm – Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN
* Tel: 0979 722412, Email: dungmnsptn@gmail.com
Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155
156