Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155

151

TÁCH DÕNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ (CP)

CỦA VIRUS GÂY BỆNH XANH LÙN (CLRDV) TRÊN CÂY BÔNG

Ngô Mạnh Dũng1*

, Chu Hoàng Hà2, Lê Văn Sơn

2

1Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 2Viện Công nghệ sinh học, VSAT

TÓM TẮT Cây bông là loại cây trồng lấy sợi có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới. Trong khoảng 20 loại

virus gây bệnh trên cây bông, bệnh xanh lùn là bệnh có thể gây thiệt hại nặng nề nhất trên thế giới.

Nguyên nhân gây bệnh xanh lùn đã đƣợc xác định là do virus gây bệnh xanh lùn (Cotton leaf roll

dwarf virus - CLRDV) thuộc họ Luteoviridae, chi Polerovirus gây ra. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi đã tiến hành tách dòng và giải trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây bệnh

xanh lùn trên cây bông ở Việt Nam, kích thƣớc gen đƣợc phân lập khoảng 606 bp. Trình tự gen CP

phân lập từ CLRDV ở Việt Nam có độ tƣơng đồng 98,2- 99,2% so với các trình tự gen đƣợc công

bố trên ngân hàng gen quốc tế.

Từ khóa: Bệnh xanh lùn, cây bông, CP-CLRDV, E. coli DH5 , RT-PCR

ĐẶT VẤN ĐỀ*

Trên thế giới, cây bông đƣợc trồng ở nhiều

nƣớc có điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận

nhiệt đới và là một trong những loại cây trồng

lấy sợi quan trọng nhất. Trong khoảng 20 loại

virus gây bệnh trên cây bông, bệnh xanh lùn

là bệnh có thể gây thiệt hại nặng nề nhất nhất

trên thế giới [1]. Bệnh xanh lùn đã đƣợc phát

hiện tại nhiều nƣớc trồng bông thuộc Châu

Phi, Châu Á và Nam Mỹ,…

Đối với cây bông ở Việt Nam, bệnh xanh lùn

là bệnh gây thiệt hại nhiều nhất. Bệnh đƣợc

phát hiện lần đầu tiên tại Nha Hố (Ninh

Thuận) vào năm 1984-1985 nhƣng chƣa gây

hại đáng kể. Sau đó tác hại của bệnh tăng dần.

Năm 1991, Ninh Thuận xảy ra đợt dịch đầu

tiên, tại Nha Hố trên 80 ha trồng bông bị bệnh

với tỉ lệ 50-100%, gây thiệt hại hơn 50% sản

lƣợng bông.

Nguyên nhân gây bệnh xanh lùn là do virus

gây ra. Năm 2005, Correa và cộng sự thông

qua phân lập, xác định và so sánh trình tự của

gen vỏ và một phần của gen RdRp đã khẳng

định đƣợc virus gây bệnh xanh lùn là thuộc

họ Luteoviridae, có khả năng xếp vào chi

Polerovirus và đã đặt tên virus này là Cotton

leafroll dwarf virus (CLRDV) [4]. Đến năm

* Tel: 0979 722412, Email: dungmnsptn@gmail.com

2010, Distéfano sau khi nghiên cứu hoàn

chỉnh trình tự bộ gen của virus bệnh xanh lùn

trên cây bông, CLRDV, khẳng định đây là

một thành viên mới của chi Polerovirus [5].

Đến nay, đối với cây bông, biện pháp hiệu

quả nhất là sử dụng công nghệ gen trong

phòng chống, tạo ra các giống cây trồng có

khả năng kháng bệnh. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi tiến hành tách dòng và giải trình tự

gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây

bệnh xanh lùn trên cây bông nhằm tạo tiền đề

cho những nghiên cứu tạo cây bông chuyển

gen kháng bệnh virus xanh lùn sau này.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Vật liệu

Nguồn bệnh virus: Lá bông nghi nhiễm bệnh

xanh lùn do Viện Nghiên cứu và Phát triển

cây bông Nha Hố cung cấp.

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều là

hóa chất tinh khiết dùng trong phòng thí

nghiệm về sinh học phân tử (hóa chất của các

hãng Sigma, Invitrogen, Fermentas…).

Trình tự các mồi để phân lập gen:

CP-CLRDV-F:

5‟-AATTCATGAATACGGTCGTGGGTA-3‟

CP-CLRDV-R:

5‟-CTCGAGTTTTGGATTGTGGAATTGG-3‟

Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155

152

Phƣơng pháp

Tách chiết RNA tổng số thực hiện theo

phƣơng pháp của Napoli và cộng sự (1990).

cDNA đƣợc tổng hợp theo kít “RevertAidTM

H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit”

(Fermentas).

Phản ứng cDNA thực hiện trong thể tích 20

l gồm có các thành phần sau: 10 ng - 5 g

RNA tổng số; 250ng mồi ngẫu nhiên. Bổ

sung nƣớc khử ion có xử lý DEPC tới thể tích

12 l. Ủ 70°C/5 phút, sau đó đặt vào đá. Tiếp

tục bổ sung các thành phần vào ống phản ứng

trên: 4 l đệm RT 5X tổng hợp cDNA; 1 l

riboLock Ribonuclease inhibitor (20u/ l); 2

l dNTP (10 mM). Hỗn hợp sau đó đảo và ly

tâm nhẹ; ủ 25°C/5 phút. Tiếp tục bổ sung 1 l

enzyme RevertAid (200/ l) và thực hiện một

chu trình nhiệt nhƣ sau: 25°C/10‟, 42°C/60‟,

72°C/10‟, 40°C/10‟.

Các đoạn gen quan tâm

, chu kỳ nhiệt: 94°C /3‟, 25 chu kỳ

gồm 94°C/40s, từ 50-56°C /40s tùy thuộc vào

nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi,

72°C/1‟30s, 72°C/10‟ và kết thúc ở 4°C. Sản

phẩm đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8 % .

động ABI PRIM 3100 Avant Genetic

Analyzer bằng cách sử dụng bộ hoá chất

bigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nhân bản gen của CLRDV bằng RT-PCR

RNA tổng số từ mẫu bông nghi nhiễm bệnh

sau khi tách chiết đƣợc sử dụng làm khuôn để

tổng hợp cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc

(Reverse transcriptase) với cặp mồi ngẫu

nhiên dài 6 nucleotide (random primer) (theo

bộ Kit của Fermentas). cDNA sau đó đƣợc

làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại các

đoạn DNA mang gen mã hoá cho protein vỏ

(CP) của CLRDV với cặp mồi đƣợc thiết kế

đặc hiệu.

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên hình 1

cho thấy sản phẩm RT-PCR rất đặc hiệu, chỉ

cho một phân đoạn DNA duy nhất với kích

thƣớc tƣơng ứng tính toán lý thuyết. Để có

thể kết luận chính xác các phân đoạn này có

phải là của virus CLRDV hay không, các

phân đoạn này tiếp tục đƣợc dòng hóa bằng

cách gắn vào vector pBT và biến nạp vào tế

bào khả biến E.coli DH5 với mục đích lựa

chọn những dòng khuẩn lạc dƣơng tính, tách

chiết plasmid để xác định trình tự.

Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR

nhân gen CP của CLRDV

M: Marker 1kb; 1: CLRDV; 2: ĐC âm

Dòng hóa gen vào vector pBT

Sản phẩm RT-PCR sau khi thôi gel và gắn

vào vector pBT đƣợc biến nạp vào tế bào khả

biến E. coli DH5 . Dựa vào phƣơng pháp

chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng và colony-

PCR, những dòng khuẩn lạc dƣơng tính đã

đƣợc lựa chọn để tinh sạch phục vụ cho việc

đọc trình tự.

pUC18F/pUC18R là cặp mồi nằm trên vector

pBT, nếu đoạn gen đƣợc chèn vào đúng vị trí

của plasmid thì theo lý thuyết sản phẩm

colony-PCR chọn dòng pBT/CP-CLRDV là

779 bp (615+164) và so với đối chứng âm

pBT là 164 bp.

Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di ở hình 2

cho thấy, các phân đoạn thu đƣợc cũng có

kích thƣớc tƣơng ứng với tính toán lý thuyết

đã chứng tỏ việc dòng hóa gen vào vector

pBT đã thành công.

Chúng tôi tiếp tục lựa chọn một dòng dƣơng

tính nuôi lỏng để tách chiết plasmid phục vụ

đọc trình tự.

bp M 1 2

750 500

Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155

153

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR

chọn dòng pBT/CP-CLRDV

M. marker 1kb. 1-4: các khuẩn lạc; 5: ĐC âm

Xác định trình tự gen của CLRDV

Gen đƣợc đọc trình tự trên máy đọc tự động

ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer

bằng cách sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

Sau khi đọc trình tự, trình tự này đƣợc so

sánh trong BLAST của NCBI. Kết quả cho

thấy, đoạn gen phân lập đƣợc là đoạn gen CP

của virus CLRDV.

Kết quả đọc trình tự gen CP của dòng virus

CLRDV-Nha Hố và so sánh với các trình tự

gen của virus CLRDV đã công bố trên ngân

hàng gen thế giới đƣợc thể hiện ở hình 3.

Trình tự gen CP phân lập từ CLRDV ở Việt

Nam có độ tƣơng đồng với các trình tự gen

công bố trên 98%. Trình tự gen CP này giống

98,2% so với trình tự CP-CLRDV ở

Aghentina và 99,2% trình tự gen CP-CLRDV

ở Braxin. 10 20 30

------------------+-------------------+-------------------+-

1 A T G A A T A C G G T C G T G G G T A G A A G A A C G A T C CP-CLRDV-Agh

1 A T G A A T A C G G T C G T G G G T A G A A G A A C G A T T CP-CLRDV Bra

1 A T G A A T A C G G T C G T G G G T A G A A G A A C G A T T CP-CLRDV VN

40 50 60

------------------+-------------------+-------------------+-

31 A A T G G A A G A A G A C G A C C A C G T A G G C G C A A C CP-CLRDV-Agh

31 A A T G G A A G A A G A C G A C C A C G T A G G C G C A A C CP-CLRDV Bra

31 A A T G G A A G A A G A C G A C C A C G T A G G C G C A A C CP-CLRDV VN

70 80 90

------------------+-------------------+-------------------+-

61 A G G C G T C G G C A A A A T C A G C C A G T G G T T G T G CP-CLRDV-Agh

61 A G G C G T C G G C A A A A T C A G C C A G T G G T T G T G CP-CLRDV Bra

61 A G G C G T C G G C A A A A T C A G C C A G T G G T T G T G CP-CLRDV VN

100 110 120

------------------+-------------------+-------------------+-

91 G T C C A A G C C C C T C G G A A C A C A C A A C G C A G A CP-CLRDV-Agh

91 G T C C A A G C C C C T C G G A A C A C A C A A C G C A G A CP-CLRDV Bra

91 G T C C A A G C C C C T C G G A A C A C A C A A C G C A G A CP-CLRDV VN

130 140 150

------------------+-------------------+-------------------+-

121 A G A C G A C G A A G A C G A G G A G G T C G T A A T A G G CP-CLRDV-Agh

121 A G A C G A C G A A G A C G A G G A G G T C G T A A T A G G CP-CLRDV Bra

121 A G A C G A C G A A G A C G A G G A G G T C G T A A T A G G CP-CLRDV VN

160 170 180

------------------+-------------------+-------------------+-

151 A C A G G A G G A C G C A T T C C T G G A G G A C C A G G A CP-CLRDV-Agh

151 A C A G G A G G A C G C A T T C C T G G A G G A C C A G G A CP-CLRDV Bra

151 A C A G G A G G A C G C A T T C C T G G A G G A C C A G G A CP-CLRDV VN

190 200 210

------------------+-------------------+-------------------+-

181 G C T T C A A G C G A G A C A T T T G T T T T C T C A A A A CP-CLRDV-Agh

181 G C T T C A A G C G A G A C A T T T G T T T T C T C A A A A CP-CLRDV Bra

181 G C T T C A A G C G A G A C A T T T G T T T T C T C A C A A CP-CLRDV VN

220 230 240

------------------+-------------------+-------------------+-

211 G A C A G T C T C T C G G G A A G T T C C T C A G G A T C A CP-CLRDV-Agh

211 G A C A G T C T C T C G G G A A G T T C C T C A G G A T C A CP-CLRDV Bra

211 G A C A G T C T C T C G G G A A G T T C C T C A G G A T C A CP-CLRDV VN

250 260 270

------------------+-------------------+-------------------+-

bp M 1 2 3 4 5

1000 750

Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155

154

241 A T C A C G T T C G G G C C G T C T T T A T C A G A T T G C CP-CLRDV-Agh

241 A T C A C G T T C G G G C C G T C T T T A T C A G A T T G C CP-CLRDV Bra

241 A T C A C G T T C G G G C C G T C T T T A T C A G A T T G C CP-CLRDV VN

280 290 300

------------------+-------------------+-------------------+-

271 C C G G C A T T C A G C A A T G G A A T A C T C A A G G C C CP-CLRDV-Agh

271 C C G G C A T T C A G C A A T G G A A T G C T C A A G G C C CP-CLRDV Bra

271 C C G G C A T T C A G C A A T G G A A T G C T C A A G G C C CP-CLRDV VN

310 320 330

------------------+-------------------+-------------------+-

301 T A C C A T G A A T A T A A G A T C T C A A T G G T C T T A CP-CLRDV-Agh

301 T A C C A T G A A T A T A A G A T C T C A A T G G T C T T A CP-CLRDV Bra

301 T A C C A T G A A T A T T A G A T C T C A A T G G T C T T A CP-CLRDV VN

340 350 360

------------------+-------------------+-------------------+-

331 T T G G A G T T C A T C T C C G A G G C C T C T T C A A C A CP-CLRDV-Agh

331 T T G G A G T T C A T C T C C G A G G C C T C T T C A A C A CP-CLRDV Bra

331 T T G G A G T T C A T C T C C G A G G C C T C T T C A A C A CP-CLRDV VN

370 380 390

------------------+-------------------+-------------------+-

361 T C C T C C G G T T C C A T C T C T T A C G A A G T G G A T CP-CLRDV-Agh

361 T C C T C C G G T T C C A T C T C T T A C G A A G T G G A T CP-CLRDV Bra

361 T C C T C C G G T T C C A T C T C T T A C G A A G T G G A T CP-CLRDV VN

400 410 420

------------------+-------------------+-------------------+-

391 C C A C A C T G T A A A T T G T C A A C C C T A T C C T C C CP-CLRDV-Agh

391 C C A C A C T G T A A A T T G T C A A C C C T A T C C T C C CP-CLRDV Bra

391 C C A C A C T G T A A A T T G T C A A C C C T A T C C T C C CP-CLRDV VN

430 440 450

------------------+-------------------+-------------------+-

421 A C G A T T A A C A A A T T C G G A A T C A C C A A G A A T CP-CLRDV-Agh

421 A C G A T T A A C A A A T T C G G A A T C A C C A A G A A C CP-CLRDV Bra

421 A C G A T T A A C A A A T T C G G A A T C A C C A A G A A C CP-CLRDV VN

460 470 480

------------------+-------------------+-------------------+-

451 G G G A G G A A G C A A T T T G C G G C G T C T T T C A T C CP-CLRDV-Agh

451 G G G A G G A A G C A A T T T G C G G C G T C T T T C A T C CP-CLRDV Bra

451 G G C A G G A A G C A A T G T G C G G C G T C T T T C A T C CP-CLRDV VN

490 500 510

------------------+-------------------+-------------------+-

481 A A T G G A C A G G A A T G G C A T G A C A C C T C C G A G CP-CLRDV-Agh

481 A A T G G A C A G G A A T G G C A T G A C A C C T C C G A G CP-CLRDV Bra

481 A A T G G A C A G G A A T G G G A T G A C A C C T C C G A G CP-CLRDV VN

520 530 540

------------------+-------------------+-------------------+-

511 G A C C A A T T C A G A A T C T T A T A C A A A G G C A A T CP-CLRDV-Agh

511 G A C C A G T T C A G A A T C T T A T A T A A A G G C A A T CP-CLRDV Bra

511 G A C C A G T T C A G A A T C T T A T A T A A A G G C A A T CP-CLRDV VN

550 560 570

------------------+-------------------+-------------------+-

541 G G T T C C T C G T C G A T A G C T G G C T C T T T T A A G CP-CLRDV-Agh

541 G G T T C C T C G T C G A T A G C T G G C T C T T T T A G G CP-CLRDV Bra

541 G G T T C C T C G T C G A T A G C T G G C T C T T T T A G G CP-CLRDV VN

580 590 600

------------------+-------------------+-------------------+-

571 G T C A C A A T T C G G T G C C A A T T C C A C A A T C C A CP-CLRDV-Agh

571 G T C A C A A T T C G G T G C C A A T T C C A C A A T C C A CP-CLRDV Bra

571 G T C A C A A T T C G G T G C C A A T T C C A C A A T C C A CP-CLRDV VN

------------

601 A A A T A G CP-CLRDV-Agh

601 A A A T A G CP-CLRDV Bra

601 A A A T A G CP-CLRDV VN

Hình 3. Kết quả đọc trình tự và so sánh gen CP-CLRDV phân lập ở Việt Nam (CP-CLRDV VN) với các

trình tự đã được công bố ở Braxin (CP-CLRDV Bra) và Aghentina (CP-CLRDV Agh).

Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155

155

KẾT LUẬN

Gen mã hóa protein vỏ (CP) của virus gây

bệnh xanh lùn trên cây bông ở Việt Nam đã

đƣợc phân lập với kích thƣớc 779 bp. Trình tự

gen CP phân lập từ CLRDV ở Việt Nam có

độ tƣơng đồng 98,2-99,2% so với các trình tự

gen đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Brown J K, (1992), Viral Diseases, In: Hillocks

R J (ed.) Cotton Diseases, CBA International,

Wallingford, 275-329.

2. Cauquil J and Follin J C, (1983), Cotton disease

attributed to viruses or mycoplasmas in Africa

south of the Sahara and in the rest of the world,

Coton et Fibres Tropicales 38, 293-317.

3. Chaudhry MA, (2002), Impact of Genetically

Engineered Cotton in the World, 2nd Meeting of the

Asian Cotton Research and Development Network

Tashkent, Uzbekistan, November 14-16, 2002.

4. Correa R L, Silva T F, Simoes-Araujo J L,

Barroso P A V, Vidal M S, Vaslin M F S, (2005),

Molecular characterization of a virus from the

family Luteoviridae associated with cotton blue

disease, Arch Virol, 150(7),1357-67.

5. Distéfano A J, Kresic I B, Hopp H E (2010),

The complete genome sequence of a virus

associated with cotton blue disease, cotton leafroll

dwarf virus, confirms that it is a new member of

the genus Polerovirus. Archives of Virology

(155), 1849-1854.

6. Junior Osme'rio Pupim, Ivan Schuster, Ronald

Barth Pinto, Ely Pires, Jean-Louis Belot, Piere

Silvie, Luiz Gonzaga Chitarra, Lu‟cia Vieria

Hoffmann and Paulo Barroso, (2008), Inheritance

of resistance to cotton blue disease, Pesq Agropec

Bras 43 (5), 661-665.

7. Miller WA, Brown MC, Wang S (1997), New

punctuation for the genetic code: luteovirus gene

expression, Seminars in Virology 8, 3-13.

8. Zhang BH, Fanglin, Yao CB, Wang KB (2000),

“Recent progress in cotton biotechnology and

gentic engineering in China”, Current Science,

79(1), 37 - 44.

SUMMARY

CLONING AND SEQUENCING OF THE COAT PROTEIN GENE (CP)

OF COTTON LEAFROLL DWARF VIRUS (CLRDV)

Ngo Manh Dung

1*, Chu Hoang Ha

2, Le Van Son

2

1College of Education - TNU 2Insitue of Biotechnology, VAST

Cotton (Gossypium hirsutum L.) is an important fiber crop in the world. There are about 20

different viruses cause disease on cotton have been found in the world. Cotton blue disease caused

by Cotton leaf roll dwarf virus (CLRDV, Genus: Polerovirus, Family: Luteoviridae) is a viral

disease of the the most severe damage. In this study, we conducted cloning and sequencing of coat

protein (CP) gene of blue dwarf virus from cotton in Vietnam, gene size about 606 bp. CP gene

sequences isolated from CLRDV in Vietnam have similarities of 98.2 to 99.2% compared with the

published gene sequences on GenBank.

Keywords: leafroll dwarf virus, cotton, CP-CLRDV, E. coli DH5 , RT-PCR

Ngày nhận bài:22/4/2014; Ngày phản biện:29/4/2014; Ngày duyệt đăng: 5/5/2014

Phản biện khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm – Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN

* Tel: 0979 722412, Email: dungmnsptn@gmail.com

Ngô Mạnh Dũng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 119(05): 151 - 155

156