Post on 13-Jul-2020
SIPULIEN POLYFENOLIEN ANTIMIKROBISUUS
Anna Kårlund
Pro gradu -tutkielma
Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka
Biotiede
Luonnontieteiden ja metsätieteiden
tiedekunta
Itä-Suomen yliopisto
Marraskuu 2012
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta
Biotiede
Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka
KÅRLUND ANNA O.: Sipulien polyfenolien antimikrobisuus
Pro gradu -tutkielma, 63 s.
Tutkielman ohjaajat: Dos. Reijo Karjalainen ja prof. Atte von Wright
Marraskuu 2012
Avainsanat: polyfenoli, sipuli, antimikrobisuus, elintarvikepatogeeni
Fenolisilla yhdisteillä on merkittävä rooli sekä kasvien evoluutiossa että selviytymisessä
ympäristön asettamista akuuteista ja kroonisista haasteista. Fenoliset yhdisteet toimivat
kasvissa esim. pigmentteinä, herbivoreja karkottavina yhdisteinä, antioksidantteina sekä mm.
signalointimolekyyleinä ja antimikrobisina komponentteina kasvi-mikrobi-
vuorovaikutussuhteissa. Fenolisilla yhdisteillä on biologisia aktiivisuuksia myös ihmisessä.
Allium-suvun kasvit eli sipulit ovat yksi vanhimmista ja taloudellisesti merkittävimmistä
viljelykasveista. Sipuleja on käytetty vuosituhansien ajan ravintona ja lääkkeinä, ja jotkut
niistä ovat tunnettuja koristekasveja. Sipuleissa esiintyvillä polyfenoleilla on todettu paitsi
antikarsinogeenisia ja sydän- ja verisuonitaudeilta suojaavia myös antimikrobisia
ominaisuuksia mm. elintarvikepatogeeneja vastaan. Sipulin runsaimpia fenolisia yhdisteitä
ovat flavonoidi kversetiini ja sen glykosyloidut johdannaiset kversetiini-4’-glukosidi ja
kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi.
Yksittäisillä polyfenolisilla yhdisteillä tai niiden johdannaisilla, esim. glykosideilla, on
havaittu eri tutkimuksissa hyvin vaihtelevia antimikrobisia vaikutuksia, jotka riippuvat sekä
yhdisteen että altistetun mikrobin ominaisuuksista. Gram-positiiviset bakteerit ovat monissa
tutkimuksissa todettu gram-negatiivisia bakteereita herkemmiksi kasvien fenolisille
yhdisteille ja kasveista valmistetuille polyfenolipitoisille raakauutteille. Hiivat ovat yleensä
osoittaneet hyvää resistenssiä. Myös kasvatusolosuhteilla, joissa tutkittavat mikrobit
altistetaan raakauutteille ja puhdasaineille on huomattava merkitys
antimikrobisuusaktiivisuuteen.
Pro gradu -tutkimuksessa kelta-, puna-, salotti- ja banaanisalottisipulista uutettujen
polyfenolien todettiin ehkäisevän gram-positiivisen Listeria monocytogenes
-bakteerin, gram-negatiivisen Salmonella infantis -bakteerin sekä Candida albicans -hiivan
kasvua. Kversetiini-4’-glukosidilla ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidilla ei havaittu olevan
bakteerien kasvua inhiboivaa vaikutusta. Hiivalla kversetiiniglukosidit vaikuttivat lähinnä
kasvun alkuvaiheeseen. Tutkimuksen tulokset osoittavat, että sipuliuutteen polyfenolisten
yhdisteiden synergistiset mikrobien kasvua inhiboivat vaikutukset ovat parempia kuin
puhtaiden flavonoidiglykosidien. Polyfenolien uuttaminen sipulin teollisen käsittelyn
seurauksena muodostuvasta kasvijätemateriaalista ja uutteiden hyödyntäminen
elintarviketeollisuuden säilöntäainesovelluksissa voisi olla mahdollista.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Natural and Forest Sciences
Biosciences
Nutrition and Food Biotechnology
KÅRLUND ANNA O.: The antimicrobial activity of onion polyphenols
Master’s thesis, 63 pages
Supervisors: Dos. Reijo Karjalainen and Prof. Atte von Wright
November 2012
Keywords: polyphenol, onion, antimicrobial activity, foodborne pathogen
Phenolic compounds have many important roles in the terrestrial plant evolution and in
plants’ survival responses to acute and chronic environmental stress factors. In plants,
phenolic compounds act for example as pigments, antiherbivoral agents, antioxidants, and as
signaling molecules and antimicrobial components in plant-microbe-interactions. Phenolic
compounds also have biological activities in humans.
Allium sp., better known as onions, are one of the oldest and economically most important
crops. Onions have been used for centuries as food and medicinal plants, and some of them
are known as ornamental plants. Onion polyphenols are known not only to protect against
cancer and cardiovascular diseases but also to have antimicrobial properties against foodborne
pathogens. Flavonoid quercetin and its derivatives quercetin-4’-glucoside and quercetin-3,4’-
di-O-glucoside are the most abundant onion polyphenols.
Single polyphenolic compounds and their derivatives, for example glycosidic forms, have
been found to possess very variable antimicrobial effects which depend both of the compound
and the microorganism exposed. In many studies, Gram-positive bacteria have been found to
be more sensitive than Gram-negative bacteria to plant phenolic compounds and plant-derived
polyphenol containing raw extracts. Yeasts have usually shown good resistance. Also the
culture conditions, in which the microbes are exposed to raw extracts and pure compounds,
have a great impact on the antimicrobial activity.
In this master’s study, polyphenols extracted from yellow and red onions and round and long
shallots were found to reduce the growth of Gram-positive bacterium Listeria monocytogenes,
Gram-negative bacterium Salmonella infantis and yeast Candida albicans. Quercetin-4’-
glucoside and quercetin-3,4’-di-O-glucoside did not show inhibitory effect on the growth of
the bacteria. With the yeast, the quercetin glucosides affected mainly the start of the growth.
The results indicate that the synergistic antimicrobial effects of the polyphenols of the onion
extracts are stronger than the inhibitory effects of the pure onion flavonoid glycosides.
Extraction of polyphenols from waste material arising from industrial handling of onions, and
utilization of the extracts in food industry in preservative applications could be possible.
SISÄLLYSLUETTELO
1. KIRJALLISUUSKATSAUS .................................................................................................. 6
1.1 Kasvien sekundaarimetabolia ........................................................................................... 6
1.1.1 Kasvien sekundaarinen aineenvaihdunta ja ekologia ................................................. 6
1.1.2 Terpenoidit ................................................................................................................. 6
1.1.3 Alkaloidit .................................................................................................................... 7
1.1.4 Fenyylipropanoidit ..................................................................................................... 7
1.2 Kasvien fenoliset yhdisteet ............................................................................................... 8
1.2.1 Fenolisten yhdisteiden tehtävät ja esiintyminen kasveissa ........................................ 8
1.2.2 Flavonoidit ............................................................................................................... 10
1.2.3 Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi ........................................................... 11
1.2.4 Fenolisten yhdisteiden biologinen aktiivisuus ihmisessä ......................................... 14
1.3 Sipulit ja niiden terveysvaikutukset ................................................................................ 15
1.4 Sipulien bioaktiiviset yhdisteet ....................................................................................... 17
1.4.1 Polyfenolit ................................................................................................................ 17
1.4.2 Rikkiyhdisteet........................................................................................................... 18
1.4.3 Saponiinit ................................................................................................................. 19
1.4.4 Frukto-oligosakkaridit .............................................................................................. 19
1.5 Elintarvikepatogeenit ja niiden hallinta .......................................................................... 19
1.5.1 Listeria monocytogenes ............................................................................................ 19
1.5.2 Salmonellat ............................................................................................................... 21
1.5.3 Candida albicans...................................................................................................... 22
1.5.4 Perinteiset ja uudet menetelmät elintarvikepilaajien kontrolloimiseksi ................... 23
1.6 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuus .......................................................................... 24
1.7 Fenolisten yhdisteiden molekyylirakenteen vaikutus antimikrobisuuteen ..................... 25
1.8 Sipulien flavonoidien bioaktiivisuus elintarvikepatogeeneja vastaan ............................ 29
2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ........................................................................................ 31
3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT ................................................................................. 32
3.1 Sipulimateriaali ............................................................................................................... 32
3.2 Uutteiden valmistus antimikrobisuuskokeita varten ....................................................... 32
3.3 Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen ..................................................................... 32
3.5 Tutkittavat mikrobit ja kasvatusolosuhteet ..................................................................... 33
3.6.2 Yhdistepitoisuudet .................................................................................................... 34
3.6.3 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteella........................................................ 35
4. TULOKSET ......................................................................................................................... 37
4.1 Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet ..................................................................... 37
4.2 Sipuliuutteiden antibakteerisuus ..................................................................................... 37
4.3 Puhdasaineiden antibakteerisuus .................................................................................... 39
4.4 Sipuliuutteiden antifungaalisuus ..................................................................................... 39
4.5 Puhdasaineiden antifungaalisuus .................................................................................... 40
5. POHDINTA .......................................................................................................................... 43
5.1 Erilaiset mikrobit ovat osoittaneet vaihtelevaa resistenttiyttä sipuliuutteille ja fenolisille
yhdisteille .............................................................................................................................. 43
5.2 Sipulien polyfenoliprofiilit vaihtelevat ja vaikuttavat sipuliuutteiden antimikrobiseen
aktiivisuuteen ........................................................................................................................ 45
5.3 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuuden mekanismit .................................................. 47
5.4 Pro gradu -tutkimuksen menetelmät ja niiden haasteet .................................................. 48
5.5 Sipuliuutteiden polyfenolit ja muut antimikrobiset komponentit toimivat synergistisesti
.............................................................................................................................................. 50
5.6 Tutkimuksen sovellusmahdollisuudet ............................................................................. 51
LÄHTEET ................................................................................................................................ 53
6
1. KIRJALLISUUSKATSAUS
1.1 Kasvien sekundaarimetabolia
1.1.1 Kasvien sekundaarinen aineenvaihdunta ja ekologia
Kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet, sekundaarimetaboliitit, ovat monimuotoinen
orgaaninen yhdisteryhmä, joka osallistuu primaaristen aineenvaihduntatuotteiden, kuten
sokereiden, proteiinien ja rasvahappojen, ohella lukuisiin kasvin selviytymisen kannalta
merkittäviin toimintoihin koko kasvin elinkierron ajan (Verpoorte & Memelink 2002; Zangerl
& Berenbaum 2004; Weng ym. 2012). Kasveista on eristetty tuhansia
sekundaarimetaboliitteja, jotka vaikuttavat kasvin ja sen ympäristön välisiin
vuorovaikutussuhteisiin ja kasvin lisääntymiseen sekä vastaavat omalta osaltaan kasvin
puolustautumisesta ympäristön bioottisia ja abioottisia stressin aiheuttajia vastaan (Rhodes
1994; Verpoorte & Memelink 2002). Mittavan sekundaarimetaboliansa ansiosta kasvit
kykenevät sopeutumaan muuttuvaan ympäristöönsä siitä huolimatta, etteivät voi liikkua
paikasta toiseen suotuisampiin olosuhteisiin (Gantet & Memelink 2002; Weng ym. 2012).
Sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden synteesi kasveissa on hyvin tarkasti säädeltyä
ajallisesti, paikallisesti ja geenitasolla (Rhodes 1994). Sekundaarimetaboliitteja, jotka
osallistuvat kasvin suojautumiseen ulkoisia uhkia vastaan muodostuu stressisignaalin
seurauksena, kun taas esimerkiksi pölyttäjiä houkuttelevien pigmenttimolekyylien
ilmentyminen on kasvikudoskohtaista (Gantet & Memelink 2002). Toisin kuin primaaristen
aineenvaihduntatuotteiden synteesi, jota tapahtuu kaikissa kasveissa, monien
sekundaarimetaboliittien esiintyminen rajoittuu vain muutamaan kasvilajiin, ja yhdisteiden
synteesi tapahtuu biokemialtaan erittäin spesifisiä reittejä pitkin (Rhodes 1994; Weng ym.
2012). Kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet voidaan jakaa biosynteesireittien
mukaan kolmeen ryhmään, terpenoideihin, alkaloideihin ja fenyylipropanoideihin (Bassman
2004).
1.1.2 Terpenoidit
Viisihiilisistä isopreeniyksiköistä johdettavat terpenoidit ovat suurin seukndaarimetaboliittien
ryhmistä (Bassman 2004). Terpenoidit luokitellaan isopreeniyksiköiden lukumäärän mukaan
mono-, seskvi-, di-, tri- ja tetraterpeeneihin (Bassman 2004). Kasvun säätelyyn osallistuvat
abskissihappo ja gibberelliinit ovat esimerkkejä terpenoideista, samoin kuin apupigmentteinä
7
toimivat karotenoidit (Bassman 2004). Suurin osa terpenoideista kuitenkin kuuluu kasvin
puolustautumisjärjestelmään (Bassman 2004). Hyönteistuholaisten aiheuttaman
vahingoittumisen seurauksena esimerkiksi tomaatin lehtien mono- ja seskviterpeenien
tuotanto lisääntyy, minkä tarkoituksena on mahdollisesti houkutella herbivorien luonnollisia
vihollisia (Raghava ym. 2010). Sukkulamatojen aiheuttamat juurituhot lisäävät terpenoidien
tuotantoa tupakassa, ja esimerkiksi altistuminen sienipatogeenien soluseinien komponentille,
ergosterolille, indusoi tupakkasolujen seskviterpeenien synteesiä (Kaplan ym. 2008;
Tugizimana um. 2012). UV-B-säteily aiheuttaa resiini-terpeenin tuotannon lisääntymistä
kasvun kustannuksella esimerkiksi Grindelia chiloensis -asterikasvissa (Zavala & Ravetta
2002).
1.1.3 Alkaloidit
Tyypillinen alkaloidiyhdiste muodostuu rengasrakenteesta ja typpiatomista (Koleva ym.
2012). Alkaloidit ovat kuitenkin kemiallisesti monimutkaisia ja -muotoisia rakenteita, joiden
biosynteesireittien selvittäminen on haasteellista (Bassman 2004). Monet alkaloidit johdetaan
aminohapoista, kuten lysiinistä, tryptofaanista tai tyrosiinista, mutta alkaloideihin kuuluu
myös esimerkiksi nikotiinihaposta johdettavia yhdisteitä (Koleva ym. 2012). Kokapensaan
lehdissä esiintyvä kokaiini ja tupakkakasvien nikotiini ovat alkaloidijohdannaisia (Koleva ym.
2012). Alkaloidit osallistuvat kasvien puolustautumiseen herbivoreja vastaan sekä jatkuvan
että indusoituvan synteesin kautta (Kaplan ym. 2008). Esimerkiksi perunan, tomaatin ja
munakoison glykoalkaloidipitoisuus vaihtelee lajikkeen ja sadonkorjuun jälkeisten
olosuhteiden mukaan (Barceloux 2009).
1.1.4 Fenyylipropanoidit
Fenyylipropanoidit ovat monimuotoinen aromaattisten yhdisteiden ryhmä, jonka jäsenet
johdetaan fenyylialaniini-aminohaposta fenyylialaniiniammoniumlyaasi-entsyymin (PAL)
katalysoimana muodostuvasta kanelihaposta (Dixon & Paiva 1995; Bonawitz ym. 2012).
Fenyylipropanoideista johdetaan edelleen suurin osa kasvien fenolisista yhdisteistä, jotka
voidaan luokitella karkeasti fenolisiin happoihin, flavonoideihin, stilbeeneihin ja lignaaneihin
(Bassman 2004; Manach ym. 2004). Fenyylipropanoidien rakenteellinen monimuotoisuus on
seurausta muun muassa prekursoriyhdisteiden hydroksylaatio-, glykosylaatio-, asylaatio-,
prenylaatio-, sulfaatio- ja metylaatioreaktioista (Dixon & Paiva 1995).
8
Fenyylipropanoidien pääasiallisen synteesireitin entsyymit ja useat transkriptiofaktorit
tunnetaan nykyään hyvin (Bonawitz ym. 2012). Fenyylipropanoidien synteesin säätely liittyy
sekä kasvien kemialliseen että fyysiseen suojautumiseen ulkoisia uhkia vastaan (Shadle ym.
2003; Dauwe ym. 2007). Tietyt fenyylipropanoidit ovat kasvien rakenteiden osia tai
osallistuvat kasvien kasvuun ja lisääntymiseen ja ovat välttämättömiä esimerkiksi siitepölyn
muodostumiselle (Dixon & Paiva 1995; Shadle ym. 2003; Bassman 2004; Dauwe ym. 2007).
Monet fenyylipropanoidit, kuten jotkin flavanonit, isoflavonoidit ja stilbeenit, luokitellaan
fytoaleksiineihin eli pienimolekyylisiin yhdisteisiin, joiden synteesi indusoituu patogeenien
hyökkäyksen tai esimerkiksi raskasmetalli- tai UV-altistuksen seurauksena (Halverson &
Stacey 1986; Kodan ym. 2002; Otomo ym. 2004; Zabala ym. 2006; Shimizu ym. 2012).
Seuraavassa kappaleessa on esitelty tarkemmin kasvien fenolisia yhdisteitä, niiden synteesiä
ja esiintymistä kasveissa sekä biologisia aktiivisuuksia kasveissa ja ihmisissä.
1.2 Kasvien fenoliset yhdisteet
1.2.1 Fenolisten yhdisteiden tehtävät ja esiintyminen kasveissa
Polyfenolisilla yhdisteillä on merkittävä rooli sekä kasvien evoluutiossa että selviytymisessä
ympäristön asettamista akuuteista ja kroonisista haasteista (Quideau ym. 2011). Osittain
polyfenolisten yhdisteiden ansiosta kasvit ovat kyenneet sopeutumaan elämään ja
lisääntymiseen kuivalla maalla sekä muodostamaan vuorovaikutussuhteita muiden maan
päällä elävien organismien kanssa (Quideau ym. 2011). Yleensä polyfenolit kertyvät kukkien,
lehtien, varsien, juurien, siementen ja hedelmien epidermisoluihin (Sakihama ym. 2002).
Kasvisolujen sisällä vesiliukoiset fenoliyhdisteet sijaitsevat usein vakuoleissa ja apoplasteissa,
joskus kloroplasteissa ja etioplasteissa (Sakihama ym. 2002). Rasvaliuokoiset molekyylit
sijoittuvat muun muassa kasvien vahamaisiin kerroksiin ja öljyrauhasiin (Sakihama ym.
2002). Esimerkiksi flavonoidien ja hydroksikanelihapon synteesi on useimmissa kasveissa
jatkuvaa, mutta myös stressi voi laukaista polyfenolien muodostumisen ja kertymisen
(Sakihama ym. 2002). Fenoliyhdisteiden synteesi kuluttaa hiiltä, mikä voi hidastaa kasvin
kasvua (Tattini & Traversi 2008; Scogings ym. 2011). Fenolisia yhdisteitä myös mahdollisesti
kulkeutuu tarpeen mukaan kasvinosasta toiseen, ja kasvi saattaa konsentroida esimerkiksi
lignifikaatioon osallistuvia fenoliyhdisteitä niihin solukoihin, joissa tarvitaan mekaanista
tukea bioottisia ja abioottisia uhkia vastaan (Negro ym. 2012; Singh ym. 2012). Muun muassa
apilassa, artisokassa ja omenassa on todettu tilastollisesti merkittäviä eroja polyfenolien
pitoisuuksissa sekä eri lajikkeiden, kasvinosien että kasvin kehitysvaiheiden välillä (Saviranta
9
ym. 2008; Vieira 2009; Negro ym. 2012). Muun muassa omenan ja sipulin kuoriosissa on
huomattavasti enemmän ja erilaisia polyfenoleja kuin kuorenalaisissa kasvinosissa (Vieira
2009; Pastene ym. 2009; Benítez ym. 2010). Monet polyfenolit ovat tyypillisiä tietyille
kasveille (Del Rio ym. 2012). Esimerkiksi flavanoneja esiintyy lähes yksinomaan
sitrushedelmissä, isoflavoneja palkokasveissa ja flavoneja sellerissä ja joissakin yrteissä
(Manach ym. 2004; Del Rio ym. 2012).
Useat polyfenolit ovat pigmenttejä, värillisiä yhdisteitä, joiden avulla kasvit houkuttelevat
pölyttäjiä ja siemeniä levittäviä eläimiä (Havsteen 2002). Polyfenoliset yhdisteet osallistuvat
kasvien puolustautumiseen taudinaiheuttajia vastaan muodostamalla esimerkiksi reaktiivisia
hapettumistuotteita, kinoneita, jotka voivat sitoutua patogeeniperäisiin molekyyleihin ja
muokata niitä (Quideau ym. 2011). Polyfenoleilla on edellä mainitun kinoniaktiivisuuden
lisäksi lukuisia muita antibioottisia toimintamekanismeja (Cowan 1999; Cushnie & Lamb
2005). Polyfenolit osallistuvat kasvi-mikrobi-vuorovaikutussuhteisiin toimimalla esimerkiksi
signalointimolekyyleinä kasvin ja symbioottisten maaperäbakteerien ja mykorritsasienten
välillä (Chabot ym. 1992; Mandal ym. 2010). Kasvien polyfenolit torjuvat myös herbivoreja
(Quideau ym. 2011). Kasvit voivat puolustautua esimerkiksi lehtiä syöviä eläimiä vastaan
tuottamalla fenolisia yhdisteitä, kuten tanniineja, ja kasvinosien kokonaisfenolipitoisuuden on
joissakin tapauksissa havaittu kasvavan herbivorian lisääntyessä (Scogings ym. 2011).
Kasvien normaali valosta riippuvainen aineenvaihdunta ja abioottinen, esimerkiksi UV-
säteilyn, kylmyyden, raskasmetallialtistuksen tai ravinnepuutosten aiheuttama stressi johtavat
reaktiivisten happilajien muodostumiseen kasveissa, ja yksi polyfenolien tehtävistä on suojata
kasveja tältä oksidatiiviselta stressiltä toimimalla antioksidantteina (Sakihama ym. 2002).
Esimerkiksi kurkun sirkkalehtiin kertyy UV-B-säteitä absorboivia stressipolyfenoleita
jatkuvan UV-B-sätelyaltistuksen seurauksena (Yamasaki ym. 2007). UV-säteilyä absorboivat
fenoliyhdisteet suojelevat kasvisoluja ionisoivan UV-B-säteilyn aiheuttamilta DNA-tuhoilta
(Dixon & Paiva 1995). Myös liian suolaisessa ympäristössä kasvava kasvi voi lisätä ja
muokata fenoliyhdisteidensä synteesiä siten, että antioksidatiiviselta teholtaan hyviä
flavonoideja muodostuu runsaasti (Tattini & Traversi 2008). Geenien lisäksi siis myös
kasvuolosuhteet vaikuttavat kasvin fenolipitoisuuteen ja -koostumukseen (Romani ym. 2003;
Saviranta ym. 2008).
10
1.2.2 Flavonoidit
Fenolisista yhdisteistä flavonoideja muodostuu kasveissa eniten (Quideau ym. 2011).
Flavonoidien rakenteessa on kaksi aromaattista rengasta (A- ja B-renkaat), joita yhdistää
kolmen hiiliatomin muodostama oksygenoitunut heterosyklinen pyraanirengas (C-rengas)
(Manach ym. 2004; Cushnie & Lamb 2005). Flavonoidien perusrakenne on esitetty kuvassa 1.
Flavonoideja on kuvattu yli 6500 erilaista ja ne voidaan jakaa karkeasti kuuteen ryhmään
flavonoleihin, flavoneihin, isoflavoneihin, flavanoneihin, antosyanidiineihin ja flavanoleihin
(Nemeth & Piskula 2007). Flavonoidit voidaan luokitella edelleen tarkemmin sen mukaan,
ovatko ne sekä biosynteesin väli- että lopputuotteita, kuten flavanonit ja flavan-3-olit, vai
ainoastaan synteesireitin lopputuotteita, kuten antosyanidiinit ja flavonolit (Cushnie & Lamb
2005). Kaikki korkeammat kasvit kykenevät flavonoidisynteesiin, sillä flavonoideja esiintyy
kaikissa fotosynteesiin osallistuvissa soluissa (Cushnie & Lamb 2005; Pollastri & Tattini
2011). Flavonoidikonsentraatiolla on yleisesti ottaen taipumus pienentyä siirryttäessä kasvin
ulommista kerroksista sisempiin (Nemeth & Piskula 2007; Benítez ym. 2010). Flavonoidien
tehtävät kasveissa vaihtelevat pölyttäjien houkuttelemisesta energian siirtoon, morfogeneesin,
fotosynteesin ja kasvihormonien toiminnan säätelyyn ja patogeeneiltä ja UV-säteilyltä
suojaamiseen (Cushnie & Lamb 2005).
Kuva 1. Flavonoidin perusrakenne (Del Rio ym. 2012 mukaillen).
Flavonolit ovat runsaimpia kasvien flavonoideista (Manach ym. 2004). Kversetiini (kuva 2) ja
kemferoli (kuva 3) puolestaan ovat yleisimmät flavonolit (Manach ym. 2004). Myös
esimerkiksi isoramnetiini (kuva 4), joka on kversetiinin metyylieetteri, on yksi biologisesti
aktiivisimmista ja ihmisen ravitsemuksen kannalta merkittävimmistä flavonoleista (Park &
Lee 1996). Flavonoleja on erityisen runsaasti esimerkiksi sipuleissa, purjoissa, parsakaalissa
ja mustikoissa (Manach ym. 2004). Flavonolit ovat kasveissa yleensä glykosidisessa
muodossa, ja sokeritähteenä on tavallisesti glukoosi tai ramnoosi (Manach ym. 2004).
Glykosyylitransferaasi-entsyymit katalysoivat flavonolien glykosylaatiota kasveissa (Li ym.
2001).
11
Kuva 2. Kversetiini Kuva 3. Kemferoli Kuva 4. Isoramnetiini
(ChemSpider, 2012a). (ChemSpider, 2012b). (ChemSpider, 2012c).
1.2.3 Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi
Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi alkaa pitkin sikimaattireittiä, jossa sikimaatista
muodostuu ensin korismaattia, ja korismaatista edelleen korismaattimutaasi-entsyymin
katalysoimana aromaattisia aminohappoja, muun muassa fenyylipropanoidien prekursoreina
toimivia fenyylialaniinia ja tyrosiinia (Herman & Weaver 1999; Bassman 2004; Fraser &
Chapple 2011). Sikimaatti johdetaan fosfoenolipuryvaatista ja erytroosi-4-fosfaatista, jotka
muodostuvat kasvien primaarisen hiiliaineenvaihdunnan, glykolyysin ja
pentoosifosfaattireitin välituotteina (Tzin & Galili 2010). Fenoliyhdisteiden johtaminen
fenyylialaniinista jatkuu pitkin fenyylipropanoidireittiä, jonka ensimmäisessä vaiheessa PAL
muokkaa fenyylialaniinista trans-kanelihappoa poistamalla molekyylistä aminoryhmän
(Fraser & Chapple 2011). Kuvassa 5 on esitetty sikimaatti- ja fenyylipropanoidireitit sekä
joidenkin niiden lopputuotteiden biosynteesitiet pääpiirteittäin. Trans-kanelihaposta
muodostuu edelleen para-kumariinihappoa kanelihappo-4-hydroksylaasi-entsyymin lisätessä
yhdisteeseen happimolekyylin (Zabala ym. 2006). Para-kumariinihappoa saadaan myös
suoraan tyrosiinista, ja kanelihaposta voidaan valmistaa stilbeenejä (kuva 6), kasvien fenolisia
puolustautumisyhdisteitä, sekä salisyylihappoa (kuva 7), signaalimolekyyliä, jota tuotetaan
esimerkiksi mikrobien hyökkäyksen seurauksena (Dixon & Paiva 1995; Shadle ym. 2003;
Bassman 2004).
12
FOTOSYNTEESI
fosfoenolipuryvaatti erytroosi-4-fosfaatti
sikimaatti
korismaatti
fenyylialaniini tyrosiini
PAL
salisyylihappo trans-kanelihappo LIGNIINIT sinappihappo
stilbeenit CH4
para-kumariinihappo kahvihappo ferulahappo
4CL
4-kumaryyli-KoA klorogeenihappo
CHS
ISOFLAVONIT naringeniini kalkoni suberiini
CHI
ISOFLAVANONIT naringeniini flavanoni FLAVONIT
F3H
dihydrokemferoli
F3’H ANTOSYANIDIINIT
dihydrokversetiini
FLAVONOLIT leukosyanidiini FLAVAN-3-OLIT
esim. kversetiini
PROANTOSYANIDIINIT
Kuva 5. Sikimaatti- ja fenyylipropanoidireittien pääpiirteet sekä joidenkin fenolisten yhdisteiden ja
yhdisteryhmien jatkosynteesireitit (Dixon & Paiva 1995; Bassman 2004; Zabala ym. 2006 mukaillen).
PAL = fenyylialaniiniammoniumlyaasi, CH4 = kanelihappo-4-hydroksylaasi, 4CL = 4-
kumaraatti:KoA-ligaasi, CHS = kalkonisyntaasi, CHI = kalkoni-isomeraasi, F3H = flavanoni-3-
hydroksylaasi, F3’H = flavonoidi-3’-hydroksylaasi
13
Para-kumariinihapon muodostumisen jälkeen reaktiotie haarautuu useisiin sivupolkuihin,
joita pitkin muodostuu lukuisia fenyylipropanoidiyhdisteitä (Dixon & Paiva 1995; Bassman
2004). Para-kumariinihaposta johdetaan esimerkiksi fenoliset polymeerit suberiinit ja
ligniinit, joiden rakenteet vaihtelevat kasvilajeittain (kuva 8) (Dixon & Paiva 1995; Zabala
ym. 2006; Fraser & Chapple 2011). Myös fenolinen kahvihappo ja edelleen klorogeeni-,
ferula- ja sinappihappo muodostuvat para-kumariinihaposta (Dixon & Paiva 1995; Zabala
ym. 2006).
Flavonoidien synteesi alkaa para-kumariinihapon muuttuessa 4-kumaraatti:KoA-ligaasin
katalysoimana 4-kumaryyli-koentsyymi A:ksi (Zabala ym. 2006; Fraser & Chapple 2011). 4-
kumaryyli-koentsyymi A muuttuu edelleen naringeniini kalkoniksi ja naringeniini
flavanoniksi kalkonisyntaasin ja kalkoni-isomeraasin toiminnan seurauksena (Zabala ym.
2006). Monet entsyymit osallistuvat naringeniinin muokkaamiseen muiksi flavonoideiksi,
kuten flavoneiksi, flavonoleiksi, antosyaaniineiksi ja flavan-3-olien kautta
proantosyanidiineiksi (Zabala ym. 2006). Flavanoni-3-hydroksylaasi-entsyymin avulla
naringeniini flavanonista muodostuu dihydrokemferoli, josta flavonoidi-3’-hydroksylaasi
tekee edelleen dihydrokversetiiniä (Slimestad ym. 2007). Dihydrokversetiini on esimerkiksi
sekä kversetiinin että leukosyanidiinin prekursori, ja kasvissa vallitsevat sisäiset olosuhteet,
kuten kehitysvaihe, vaikuttavat entsyymiaktiivisuuksien kautta siihen, mitä lopputuotetta
prekursorista muodostuu (Ju ym. 1997). 4-kumaryyli-koentsyymi A:sta tai naringeniinista
johdetaan myös isoflavonit (kuva 9) ja niistä edelleen isoflavanonit (Zabala ym. 2006).
Kuva 6. Stilbeeni Kuva 7. Salisyylihappo
(ChemSpider, 2012d). (ChemSpider, 2012e).
14
Kuva 8. Koniferyylialkoholi, yksi esim.
havupuiden ligniinin prekursoreista Kuva 9. Isoflavoni
(ChemSpider, 2012f). (ChemSpider, 2012g).
1.2.4 Fenolisten yhdisteiden biologinen aktiivisuus ihmisessä
Fenoliset yhdisteet eivät ole välttämättömiä ihmisen terveydelle, mutta nauttimalla runsaasti
(poly)fenoleja sisältäviä ruoka-aineita saattaa olla mahdollista ehkäistä kroonisten sairauksien
muodostumista: fenolisten yhdisteiden on todettu hillitsevän muun muassa hermoston
rappeutumista, syöpää, tyypin 2 diabetesta ja sydän- ja verisuonitauteja (Del Rio 2012;
Hollman ym. 2012; Yilmazer-Musa ym. 2012). Syötävistä kasveista on tunnistettu useita
satoja polyfenoleja (Manach ym. 2004). Hedelmät, tee, kahvi ja viini ovat tärkeimpiä
polyfenolien lähteitä ihmisruokavaliossa (Manach ym. 2004; Rastmanesch 2011). Muita
tärkeitä polyfenolien lähteitä ovat muun muassa vihannekset, joista merkittävänä esimerkkinä
sipulit, viljat ja siemenet (Rastmanesch 2011). Ihmisen keskimääräinen polyfenolien saanti on
noin 1 g päivässä (Rastmanesch 2011). Kansallinen ruokakulttuuri ja alueelle ominainen
maatalous ja luonnonkasvillisuus pitkälti määrittävät, mitkä ovat merkittävimpiä polyfenolien
lähteitä ja siten myös mitkä yhdisteet esiintyvät runsaimpina ruokavaliossa (Manach ym.
2004).
Fenolisten yhdisteiden terveysvaikutukset on perinteisesti yhdistetty molekyylien
antioksidatiiviseen aktiivisuuteen, mutta tuoreet tutkimukset ovat paljastaneet myös muita
toimintamekanismeja, jotka vähentävät elimistön tulehdusstressiä tai kohdistuvat esimerkiksi
solusyklin säätelyyn (Del Rio ym. 2012; Giménez-Bastída ym. 2012; Hollman ym. 2012).
Muun muassa sydän- ja verisuonitautien osalta elimistön kokonaisantioksidanttikapasiteetin ja
pienentyneen sairastumisriskin välistä yhteyttä ei ole todistettu pitävästi (Hollman ym. 2012).
Suoran antioksidanttivaikutuksen lisäksi polyfenolit voivat esimerkiksi kyetä aktivoimaan
geenejä ja signaalireittejä, jotka vastaavat solujen suojautumisesta oksidatiivista stressiä
vastaan (Hollman ym. 2012). Jotkut polyfenolijohdannaiset osallistuvat sairauksien ehkäisyyn
15
esimerkiksi inhiboimalla verihiutaleiden aktivaatiota ja aggregoitumista, vaikuttamalla
verisuonten supistumiseen ja laajenemiseen typpioksidin tuotannon kautta tai osallistumalla
kasvutekijä- tai sytokiinireseptorigeenien, tuumorirepressorigeenien tai onkogeenien
säätelyyn (Del Rio ym. 2012; Giménez-Bastída ym. 2012; Hollman ym. 2012; Togolini 2012;
Yilmazer-Musa ym. 2012). Polyfenolit kykenevät osallistumaan lukuisten entsyymien kuten
kinaasien, erilaisia signaalimolekyylejä, esimerkiksi typpioksidia ja prostaglandiinia
muodostavien syntaasien sekä sokereita pilkkovien amylaasien ja glukosidaasien toimintaan
(Del Rio ym. 2012; Hollman ym. 2012; Yilmazer-Musa ym. 2012). Esimerkiksi katekiini-3-
gallaatit voivat estää ravinnon tärkkelyksen entsymaattista hajoamista ruoansulatuskanavassa,
millä puolestaan on merkitystä verensokerin säätelyssä ja siten tyypin 2 diabeteksen
ennaltaehkäisyssä (Yilmazer-Musa ym. 2012). Fenoliset yhdisteet myös muokkaavat
suoliston mikrobiflooraa vaikuttaen tätä kautta muun muassa ruoansulatuskanavan terveyteen
ja ihmisen energia-aineenvaihduntaan (Rastmanesh 2011; Queipo-Ortuño ym. 2012).
Maksan ja suoliston entsyymit muokkaavat ravinnon mukana saatuja fenolisia yhdisteitä,
jolloin yhdisteiden biosaatavuus, bioaktiivisuudet ja esimerkiksi antioksidatiivinen
kapasiteetti muuttuvat (Manach ym. 2004; Del Rio ym. 2012; Hollman ym. 2012). Ihmisen
suoliston mikrobiflooran muokkaamat polyfenolit ovat usein paremmin elimistön
hyödynnettävissä ja aktiivisuudeltaan alkuperäisestä yhdisteestä poikkeavia (Cerdá ym. 2004;
Tomás-Barberán & Andrés-Lacueva 2012). Fenoliyhdisteiden aktiivisuudet vaihtelevat myös
ihmisyksilöittäin, mikä johtunee ainakin osittain eroista henkilökohtaisessa
suolistomikrobistossa (Cerdá ym. 2004; Chanet ym. 2012). Polyfenolit voivat toimia
antioksidatiivisina komponentteina myös mahalaukussa ennen ravintoaineiden absorptiota,
jolloin yhdisteet estävät esimerkiksi verisuoniterveydelle haitallisten rasvojen
oksidaatiotuotteiden muodostumista (Kanner ym. 2012).
1.3 Sipulit ja niiden terveysvaikutukset
Allium-suvun kasvit eli sipulit ovat yksi vanhimmista viljelykasveista (Lanzotti 2006).
Sipulikasveja on käytetty vuosituhansien ajan ravintona ja lääkkeinä, ja jotkut niistä ovat
tunnettuja koristekasveja (Voipio 2001; Keusgen ym. 2006; Lanzotti 2006). Allium cepa -
lajiin kuuluva kepa- eli ruokasipuli on maailmanlaajuisesti tomaatin jälkeen toiseksi
merkittävin puutarhakasvi (Griffiths ym. 2002). Valkosipuli (Allium sativum) ja purjo (Allium
porrum) ovat myös taloudellisesti tärkeitä viljelykasveja (Voipio 2001). Allium cepa -lajin
uskotaan olevan alun perin kotoisin Keski-Aasiasta (Griffiths ym. 2002). Allium-lajeja
16
tavataan kuitenkin kaikilla mantereilla sekä viljeltyinä että luonnonvaraisina (Voipio 2001;
Griffiths ym. 2002; Li ym. 2010). Tärkeimmät sipulintuottajamaat ovat Kiina, Intia, USA,
Venäjä, Turkki ja Iran (Slimestad ym. 2007). Hyvien säilyvyysominaisuuksiensa vuoksi
sipulien kansainvälinen kauppa on laajamittaista verrattuna moniin muihin vihanneksiin
(Griffiths ym. 2002). Sipuleja käytetään ravintona lähes kaikissa etnisissä ja kaikissa
kuluttajaryhmissä, joten se on suosittu raaka-aine myös prosessoiduissa elintarvikkeissa
(Griffiths ym. 2002). Sipulin teollisen prosessoinnin seurauksena syntyy erilaisten
sipuliperäisten materiaalien sivuvirtoja, joita voitaisiin käsitellä ja hyödyntää edelleen muun
muassa elintarviketeollisuuden sovelluksissa, vaikkapa hapettumisenesto- tai säilöntäaineena
(Nemeth & Piskula 2007; Benítez ym. 2010).
Allium-lajit ovat erittäin monimuotoisia niin väriltään, muodoltaan kuin maultaankin. Allium
cepa -lajin edustajiksi luokiteltavia sipuleita ovat muun muassa kelta- ja punasipuli sekä
salottisipuli (Griffiths ym. 2002; Nemeth & Piskula 2007), joita kaikkia käytetään yleisesti
ruoanvalmistuksessa. Keltaiset ja valkoiset Allium cepa -lajikkeet ovat käytetyimpiä
Euroopassa ja USA:ssa, mutta monissa maailman maissa punertavat lajikkeet ovat
suosituimpia, ja esimerkiksi tropiikin kosteissa olosuhteissa salottisipuli menestyy parhaiten
(Griffiths ym. 2002). Valkosipuli, Allium sativum, on lukuisista terveysvaikutuksistaan
tunnettu, aasialaista alkuperää oleva lääke- ja maustekasvi (Agarwal 1996; Voipio 2001;
Casella ym. 2012). Purjo, Allium porrum, on maultaan mieto Allium-suvun jäsen, jonka
viljely Euroopassa ja Suomessa on kohtalaisen aktiivista (Voipio 2001). Myös purjoa on
laajalti käytetty sekä elintarvikkeena että kansanlääketieteessä, mutta purjon bioaktiivisten
yhdisteiden tutkimus ja analysointi on tähän mennessä ollut vähäistä (Adão ym. 2011; Casella
ym. 2012). Sekä valkosipulista että purjosta on olemassa eri tyyppejä, jotka poikkeavat
toisistaan muun muassa kasvuominaisuuksiltaan (Voipio 2001).
Allium cepa -lajikkeiden tuotanto oli jo vuonna 2000 melkein 47 miljoonaa kiloa, ja määrä on
kasvussa (Slimestad ym. 2007). Sipulit ja niiden käyttötavat monimuotoistuvat kuluttajien
kiinnostuksen myötä ja kysynnän mukaisesti (Griffiths ym. 2002; Yang ym. 2004; Bonaccorsi
ym. 2008). Sipulin monet terveysvaikutukset ovat laajalti tunnettuja, mikä lisää halukkuutta
sipulin käyttöön ruoanvalmistuksessa (Griffiths ym. 2002). Sipulin sisältämien bioaktiivisten
yhdisteiden tiedetään olevan muun muassa sydän- ja verisuonitauteja ja syöpää ehkäiseviä,
antioksidatiivisia ja antimikrobisia sekä lievittävän esimerkiksi diabetekseen liittyvää
munuaisten vajaatoimintaa (Griffiths ym. 2002; Yang ym. 2004; Singh ym 2009; Casella ym.
2012; Lanzotti ym. 2012). Muun muassa sipulin ja valkosipulin vaikutuksista mahasyöpää ja
17
sen muodostumiseen osallistuvaa Helicobacter pylori -bakteeria vastaan on saatu vahvaa
näyttöä (Griffiths ym. 2002). Sipulin flavonoidit voivat esimerkiksi vaikuttaa syöpäsolujen
jakaantumiseen ja apoptoosiin liittyvien signaalireittien toimintaan (Galluzzo ym. 2009).
Terveysvaikutteisten aineenvaihduntatuotteiden lisäksi sipulit sisältävät runsaasti esimerkiksi
seleeniä, jonka riittävä saanti voi auttaa ylläpitämään mielenterveyttä ja hedelmällisyyttä sekä
ehkäisemään syöpiä ja sydän- ja verisuonitauteja (Griffiths ym. 2002).
1.4 Sipulien bioaktiiviset yhdisteet
1.4.1 Polyfenolit
Flavonoidit ovat sipulien tärkein fenoliyhdisteiden ryhmä (Benítez ym. 2010). Sipulit
sisältävät runsaasti flavonoideja verrattuna moniin muihin tutkittuihin kasviksiin ja ovat
maailmanlaajuisesti tärkeä flavonoidien lähde ihmisen ruokavaliossa (Miean & Mohamed
2001; Yang ym. 2004; Nemeth & Piskula 2007). Allium cepa -lajikkeiden pääasiallisia
fenolisia yhdisteitä ovat flavonoideihin kuuluva flavonoli kversetiini ja sen johdannaiset
(Bonaccorsi ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008; Soininen ym. 2012). Esimerkiksi sipulin
antikarsinogeeniset ja sydän- ja verisuonitaudeilta suojaavat vaikutukset perustunevat ainakin
osittain sipulin sisältämien polyfenolien, kuten juuri kversetiinin ja sen glykosyloitujen
johdannaisten, antioksidanttiominaisuuksiin ja muihin toimintamekanismeihin (Griffiths ym.
2002; Galluzzo ym. 2009; Lee ym. 2011).
Sipulien sisemmissä kerroksissa kversetiini on lähes yksinomaan glykosideina, mutta
kuoriosassa on runsaasti myös kversetiini-aglykonia (Benítez ym. 2010). Ohutsuolessa β-
glukosidaasi pilkkoo tehokkaasti kversetiini-monoglukosidin ja -diglukosidin kversetiini-
aglykoniksi, josta suurin osa absorboituu hyödynnettäväksi muualle elimistöön (Griffiths ym.
2002). Flavonoideista kversetiinin ja sen glykosidien lisäksi sipuleista on eristetty
isoramnetiinia ja kemferolia sekä niiden glykosidisia muotoja, pieniä määriä myrisetiiniä ja
dihydroflavonoli taksifoliinin johdannaisia (Slimestad ym. 2007). Sipulien
flavonoidiglykosideissa sokeriosa on tavallisesti glukoosi (Slimestad ym. 2007). Punasipulista
on eristetty myös flavonoideihin lukeutuvia antosyaaneja ja proantosyanidiineja (Bahorun ym.
2004; Slimestad ym. 2007). Punasipulista valmistetuissa kuoriuutteissa on havaittu
flavonoidien (kversetiini ja kemferoli) lisäksi myös fenolisia galli-, ferula- ja
protokatekuhappoja (Singh ym. 2009). Allium cepa -sipuleista punasipuli on verrattain hyvä
flavonoidien ja niiden glykosidien lähde (Yang ym. 2004; Slimestad ym. 2007; Bonaccorsi
18
ym. 2008). Kokonaisfenolipitoisuudeltaan salottisipuli on osoittautunut Allium cepa -
lajikkeista parhaimmaksi (Yang ym. 2004).
Purjossa suurin osa flavonoideista on kemferolia (Nemeth & Piskula 2007). Valkosipulissa on
kversetiinin ja myrisetiinin lisäksi runsaasti apigeniiniä, jota ei ole merkittäviä määriä Allium
cepa -lajikkeissa (Miean & Mohamed 2001; Lanzotti 2006). Valkosipulin ei ole havaittu
sisältävän isoramnetiinia tai kemferolia (Miean & Mohamed 2001). Kaiken kaikkiaan purjo ja
valkosipuli sisältävät huomattavasti vähemmän flavonoideja kuin Allium cepa -lajikkeet
(Nemeth & Piskula 2007). Kuoritussa valkosipulinkynnessä ei ole lähes lainkaan
flavonoideja, ja muidenkin sipuleiden flavonoideista suuri osa menetetään kuorittaessa
(Griffiths ym. 2002). Lisäksi esimerkiksi keitettäessä sipulin kversetiini-glukosidit liukenevat
keitinveteen, ja sipulimurskassa sipulin omat flavonoidiglukosidaasi-entsyymit saattavat alkaa
pilkkoa kversetiini-diglukosideja (Nemeth & Piskula 2007).
1.4.2 Rikkiyhdisteet
Solukkovaurion, esimerkiksi pilkkomisen, seurauksena S-alk(en)yyli-L-kysteiini-S-oksideista
muodostuu sipuleissa allinaasi-entsyymin katalysoimassa reaktiossa orgaanisia, rikkipitoisia
bioaktiivisia yhdisteitä, jotka ovat tutkituimpia sipulien terveysvaikutteisista komponenteista
(Griffiths ym. 2002; Lanzotti 2006; Kyung 2011). Sipulin ominainen maku ja tuoksu
aiheutuvat juuri tällaisista rikkiyhdisteistä, joita ovat esimerkiksi tiosulfinaatit, mono-, di- ja
trisulfidit sekä kepaeeni (engl. cepaene) (Griffiths ym. 2002). Sipulin rikkiyhdisteillä on
todettu lisäksi useita farmakologisia, muun muassa antioksidatiivisia, kasvainten
muodostumista ehkäiseviä, veren kolesterolipitoisuutta alentavia ja antimikrobisia vaikutuksia
(Lanzotti 2006). Valkosipuli on erittäin hyvä terveysvaikutteisen allisiinin ja sen
johdannaisten lähde (Agarwal 1996). Muissa sipuleissa kuin valkosipulissa S-alk(en)yyli-L-
kysteiini-S-oksideista muodostuu sulfeenihapon kautta tiopropanaali-S-oksidia ja siitä
edelleen muun muassa kepaeenia, jolla on esimerkiksi verihyytymien muodostumista
ehkäiseviä ominaisuuksia (Griffiths ym. 2002). Sipuleiden verihiutaleiden aggregoitumista
ehkäisevä aktiivisuus on yhdistetty orgaanisiin rikkiyhdisteisiin, ja antiastmaattisten
vaikutusten taustalla ovat mahdollisesti tiosulfinaatit ja kepaeenit (Griffiths ym. 2002).
19
1.4.3 Saponiinit
Saponiinit ovat glykosideja, joissa on yhdestä kolmeen sakkaridia kinnittyneenä
triterpenoidiin tai steroidirakenteeseen (Osbourn 1996; Khokhar & Apenten 2009; Lanzotti
ym. 2012). Sipulien saponiinien tiedetään osallistuvan tärkeisiin biologisiin prosesseihin
(Lanzotti 2006). Saponiinit ovat pintajännitystä alentavia kitkeriä yhdisteitä, joilla on todettu
lukuisia terveysvaikutuksia (Osbourn 1996; Lanzotti 2006; Khokhar & Apenten 2009).
Detergenttiominaisuuksiensa vuoksi saponiinit voivat tosin aiheuttaa esimerkiksi haitallista
verisolujen hemolyysiä (Khokhar & Apenten 2009; Adão ym. 2011). Saponiinien
antimikrobiset, erityisesti kasvien sienitauteja ehkäisevät ominaisuudet ovat hyvin tunnettuja
(Osbourn 1996; Lanzotti ym. 2012). Esimerkiksi purjosta eristetyllä saponiinilla uskotaan
olevan ruoansulatuskanavaa suojaavaa ja tulehduksia ehkäisevää aktiivisuutta (Adão ym.
2011).
1.4.4 Frukto-oligosakkaridit
Sipulit sisältävät runsaasti frukto-oligosakkarideja kestoosia, nystoosia ja
fruktofuranosyylinystoosia (Jaime 2001; Soininen ym. 2012). Frukto-oligosakkaridit ovat
lineaarisia fruktoosioligomeereja, joita tavataan sipulin ja valkoispulin lisäksi paljon myös
muun muassa parsassa, maa-artisokassa, vehnässä ja rukiissa (Bornet ym. 2002). Frukto-
oligosakkaridit ovat prebioottisia molekyylejä, jotka edistävät hyödyllisten bifidobakteerien
kasvua ja hidastavat haitallisen mikrobien lisääntymistä ihmisen suolistossa (Bornet ym.
2002). Lisäksi frukto-oligosakkarideilla on havaittu positiivisia vaikutuksia lipidi- ja
glukoosiaineenvaihduntaan (Bornet ym. 2002).
1.5 Elintarvikepatogeenit ja niiden hallinta
1.5.1 Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes on zoonoottinen gram-positiivinen sauvabakteeri, joka ei muodosta
itiöitä (NACMCF 1991). Bakteeri on fakultatiivisesti anaerobinen (Jadhav ym. 2012). L.
monocytogenes -bakteerin isäntiä ovat lukuisat nisäkkäät, linnut, kalat, äyriäiset ja hyönteiset
(Murray 1955; NACMCF 1991). L. monocytogenes leviää ympäristöön, esimerkiksi
maaperään ja vesistöön, isäntäeläinten ulosteiden välityksellä (Beuchat 1996). L.
monocytogenes on Listeria-suvun seitsemästä jäsenestä käytännössä ainut ihmispatogeeni,
20
joskin harvoja muiden Listeria-lajien aiheuttamia tautitapauksiakin on esiintynyt (Jadhav ym.
2012).
L. monocytogenes on ollut viime vuosikymmeninä useiden ruokamyrkytysepidemioiden
aiheuttaja (NACMCF 1991). Listerioiden aikaansaamaa ruokamyrkytystilaa kutsutaan
listerioosiksi (Murray 1955). Terveillä ihmisillä oireet eivät yleensä ole vakavia, mutta
riskiryhmään kuuluvilla, kuten vastasyntyneillä ja henkilöillä, joilla on alentunut
immuunipuolustuskyky (vanhukset, syöpä- ja HIV-potilaat ym.), tauti voi olla vaarallinen
(NACMCF 1991; Lyytikäinen ym. 2000a; Pontello ym. 2012). Listerioosin ensioireita ovat
muun muassa vatsavaivat, kuten ripuli, ja kuume (Beuchat 1996; Lyytikäinen ym. 2000a).
Tauti voi myös olla täysin oireeton (Pontello ym. 2012). Vakavimmillaan listerioosista voi
kuitenkin seurata aivokalvontulehdus, verenmyrkytys ja jopa kuolema (Murray 1955;
Lyytikäinen ym. 2000a). Vaikka listerioosi on suhteellisen harvinainen sairaus, se aiheuttaa
lähes kolmasosan ruokamyrkytyskuolemista, ja kuolleisuusprosentti on 20˗30 (Lyytikäinen
ym. 2000a; Tompkin 2002).
Valmisateriat, raa'at kasvikset, pastöroimattomat maitovalmisteet ja esimerkiksi tyhjiöpakatut
kalatuotteet ovat listerioositartunnan kannalta riksielintarvikkeita (NACMCF 1991; Beuchat
1996; Lyytikäinen ym. 2000a; Tompkin 2002). Bakteeri pystyy elämään suurissa
suolapitoisuuksissa ja pH-alueella 5,0-9,6 sekä kasvamaan ja lisääntymään jopa vain hieman
yli 1 °C:ssa (NACMCF 1991). Listerian kasvun kannalta epäsuotuisia elintarvikkeita ovat
happamat, pienen vesiaktiivisuuden tuotteet sekä pakastevalmisteet, jotka kuumennetaan
ennen nauttimista (Tompkin 2002). Koska L. monocytogenes kykenee sopeutumaan
monenlaisiin kasvuolosuhteisiin ja muodostaa biofilmejä abioottisille kasvualustoille, se
saattaa kotiutua myös ruoanvalmistusympäristöjen mikrobistoon ja olla ongelmallinen
torjuttava (NACMCF 1991; Lyytikäinen ym. 2000a; Jadhav ym. 2012). Elintarvike voi
kontaminoitua käsittelyn ja valmistuksen yhteydessä ihmisen tai työvälineiden kautta, tai
raaka-aine voi olla saastunut jo ennen käsittelyä (Beuchat 1996). Pistokokeissa L.
monocytogenes -kontaminaatioita havaitaan monenlaisissa elintarvikkeissa, mutta
bakteeripitoisuudet ovat yleensä pieniä, noin 100 pesäkkeen muodostavaa yksikköä
grammassa (Lyytikäinen ym. 2000a). Listerioositartunnan aiheuttavissa elintarvikkeissa
mikrobipitoisuus on ollut yli 1000 pesäkkeen muodostavaa yksikköä grammassa (Tompkin
2002).
21
Vuonna 1999 Suomessa puhkesi listerioosepidemia, jonka yhteydessä diagnosoitiin 25
potilasta (Lyytikäinen ym. 2000b). Lähes kaikilla sairastuneilla immuunipuolustus oli selvästi
heikentynyt muun sairauden seurauksena, ja kuusi potilaista kuoli (Lyytikäinen ym. 2000b).
Epidemian aiheutti todennäköisesti pastöroitu voi, joka oli kontaminoitunut
pastörointiprosessin jälkeen laitteiston tai meijeriympäristön välityksellä (Lyytikäinen ym.
2000b). Listerioosiepidemioiden ennaltaehkäisyn kannalta elintarvikevalmistuksen hygienia
ja kattava ja jatkuva elintarvikkeiden ja niiden prosessointiympäristöjen seuranta L.
monocytogenes -kontaminaatioiden varalta on tärkeää (Lyytikäinen ym. 2000b, Pontello ym.
2012).
1.5.2 Salmonellat
Salmonella-suvun bakeerit ovat gram-negatiivisia sauvabakteereja, jotka ovat fakultatiivisesti
anaerobeja eivätkä muodosta itiöitä (Franz & van Bruggen 2008). Salmonellat ovat yksi
tavallisimmista ja parhaiten tunnetuista ihmisten ripulisairauksien aiheuttajista (D'Aoust 1991;
Franz & van Bruggen 2008 ). Salmonellat leviävät usein maatalouseläinten, esimerkiksi
nautakarjan, sikojen ja kanojen välityksellä, ja sekä ihmiset että eläimet voivat kantaa
bakteeria myös oireettomina (D'Aoust 1994; Franz & van Bruggen 2008). Salmonelloosin
aiheuttavia elintarvikkeita ovat perinteisesti olleet eläinperäiset tuotteet, kuten liha ja
kananmunat, mutta myös kasvisperäiset salmonelloositapaukset ovat lisääntyneet (Franz &
van Bruggen 2008; Rihmanen-Finne ym. 2011). Salmonellalla saastuneiden vesien ja maan
käyttö maanviljelyssä voi aiheuttaa esimerkiksi hedelmien suoraa tai ristikontaminaatiota
jatkojalostuksen yhteydessä (D’Aoust 1994). Salmonella voi siirtyä ruokaan myös esimerkiksi
kuumentamisen jälkeen lisättävien mausteiden yhteydessä (D’Aoust 1994).
Salmonellainfektioon tarvittava solumäärä vaihtelee, mutta tietyissä tapauksissa jo hyvin
pienikin altistus voi aiheuttaa sairauden (Cruickshank & Humprey 1987).
Tavallisesti salmonellakannat aiheuttavat ei-typhoidista salmonelloosia, jonka oireita ovat
korkeintaan viisi vuorokautta kestävä vetinen ripuli ja lievä kuume (D'Aoust 1991).
Salmonelloosin sairastanut henkilö voi kuitenkin kantaa ja levittää bakteeria vielä kaksikin
kuukautta oireiden lievittymisen jälkeen (D'Aoust 1991). Harvinaisemman typhoidisen
salmonelloosiin oireet voivat kestää jopa kuukauden, ja sairaus voi muuttua systeemiseksi eli
levitä ruoansulatuskanavan ulkopuolisiin kudoksiin (D'Aoust 1991). Riittämättömästi
hoidetun salmonellainfektion seurauksena voi muodostua myös krooninen kantajuus, joka voi
kestää vuosikymmeniä (D’Aoust 1991). Salmonellainfektio voi pahimmassa tapauksessa
22
johtaa kuolemaan (D’Aoust 1994). Salmonellan ruoansulatuskanavaan isäntäsolujen
solulimaan erittämä enterotoksiini on bakteerin merkittävin ripulia aiheuttava virulenssitekijä
(D'Aoust 1991).
Salmonelloosin puhkeamisen syynä ovat usein lihojen epähygieeninen käsittely ja riittämätön
kypsennys kotitalouksien tai ateriapalveluiden keittiöissä (D’Aoust 1994).
Elintarviketeollisuuden ja ravintolapalveluiden tarjoajien työtekijöiden välityksellä tapahtuva
ristikontaminaatio voi muodostua ongelmaksi pitkien, jopa kroonisten kantajuusjaksojen
vuoksi, joiden seurauksena laajojen salmonelloosiepidemioiden riski kasvaa (Cruickshank &
Humprey 1987; D’Aoust 1991). Epidemioiden yhteydessä salmonelloositapauksia todetaan
usein todellisia tapauksia vähemmän, sillä vatsatautiin sairastuneet eivät yleensä hakeudu
lääkäriin, mikäli oireet eivät ole vakavia (Rihmanen-Finne ym. 2011). Suomessa todettiin
vuonna 2009 S. Bovismorbificans -kannan aiheuttama salmonelloosiepidemia, jonka
yhteydessä varmistettiin 42 tautitapausta, joskin todellisen määrän uskotaan olevan suurempi
(Rihmanen-Finne ym. 2011). Suomen epidemian tartuntalähde olivat sinimailasen itujen
italialaiset siemenet (Rihmanen-Finne ym. 2011). Kansainvälistyvä elintarvikekauppa luo
haasteita myös salmonellan kontrolloinnille, sillä erityisesti kehittyvistä maista tuotavien
tuotteiden mikrobiologinen laatu on usein kärsinyt vajavaisesta puhtaanapidosta, ja valvonta
voi olla puutteellista (D’Aoust 1994). Elintarviketeollisuudessa on huolehdittava riskialttiiden
raaka-aineiden pysymisestä erillään muista raaka-aineista ristikontaminaatioiden välttämiseksi
(D’Aoust 1994). Myös antibioottien käyttö eläintuotannossa edesauttaa antibioottiresistenttien
salmonellakantojen syntyä (D’Aoust 1994). Lainsäädäntö, viranomaisten suorittama
säännöllinen testaus ja valvonta, ripulin sairastaneiden elintarvikealan työntekijöiden riittävän
pitkät karenssi- ja seuranta-ajat, sekä tehokkaat ja turvalliset dekontaminointimenetelmät ovat
tärkeitä salmonelloosiepidemioiden torjunnassa (D’Aoust 1991; D’Aoust 1994; Rihmanen-
Finne ym. 2011).
1.5.3 Candida albicans
Candida albicans on ihmisen normaaliflooraan kuuluva hiiva, joka elää kommensaalina
terveiden yksilöiden ruoansulatuskanavassa sekä suun ja emättimen limakalvoilla (Kim &
Sudbery 2011). C. albicans on kuitenkin opportunistinen taudinaiheuttaja ja tavallisin ihmisen
sienipatogeeni, joka infektoi yleensä limakalvoja ja ihoa (Kim & Sudbery 2011). C. albicans -
hiivan aiheuttamaa limakalvoinfektiota kutsutaan kandidaasiksi ja verenmyrkytystä
kandidemiaksi (Kim & Sudbery 2011). Verenkierrosta C. albicans -hiivan aiheuttama
23
tulehdus voi siirtyä sisäelimiin (Kim & Sudbery 2011). Terveillä henkilöillä esimerkiksi
emättimen kandidaasi on tavallinen, vaaraton ja hoidettavissa oleva sairaus, ja
immuunipuolustuksen neutrofiilit estävät yleensä kandidemian muodostumisen (Kim &
Sudebery 2011). Yksilöillä, jotka kärsivät alentuneesta immuunipuolustuksen tasosta
esimerkiksi AIDSin tai syövän seurauksena, suun limakalvojen kandidaasi kertoo usein taudin
etenemisestä, ja heillä sisäelinten infektio on erittäin vakava ja vaikeasti hoidettava tila (Segal
ym. 1979; Kim & Sudbery 2011).
Leivin- ja panimohiivoja käytetään hyödyksi elintarviketeollisuudessa tiettyjen tuotteiden
valmistuksessa (Fleet 2007). Lisäksi esimerkiksi Aasiassa on pitkät perinteet erilaisten
fermentoitujen tuotteiden valmistuksesta hiivojen avulla (Hesseltine & Wang 19667).
Joidenkin hiivojen, myös C. albicans -hiivan, läsnäolo elintarvikkeessa on kuitenkin
haitallista (Fleet 2007; Evira 2009; Sanas ym. 2010). Hiivat aiheuttavat aistittavan laadun
muutoksia ja pilaavat hiilihydraattipitoisia tuotteita esimerkiksi alkoholikäymisreaktioilla
(García-Gimeno & Zurera-Cosano 1997; Fleet 2007; Evira 2009). Lisäksi hiivojen
aineenvaihdunta saattaa mahdollistaa muiden haitallisten mikro-organismien kasvun (Irlinger
& Mounier 2009). C. albicans kykenee muodostamaan biofilmejä kiinteille pinnoille (Kim &
Sudbery 2011; Maisch ym. 2012). C. albicans -hiivaa esiintyy joskus ulosteperäisenä
luonnonvesissä, joissa se ilmentää veden laatua ja saattaa muodostaa myös terveysriskin
(Buck & Bubucis 1978). C. albicans -hiivan on havaittu myös siirtyvän vedestä mereneläviin
(Buck ym. 1977). Candida -suvun hiivoja on havaittu ilmestyneen +4 °C:ssa varastoituihin
kasvissalaatteihin 156 h:n säilytyksen aikana (García-Gimeno & Zurera-Cosano 1997).
Candida-suvun hiivoilla voi olla maidon rasvoja hydrolysoivaa lipolyysiaktiivisuutta, joka
aiheuttaa esimerkiksi makumuutoksia voissa (Sagdic ym. 2010).
1.5.4 Perinteiset ja uudet menetelmät elintarvikepilaajien kontrolloimiseksi
Nykypäivän elintarviketeollisuudessa käytetään muun muassa etikkahappoa ja sen suoloja
sekä kalium- ja natriumnitriittiä estämään useiden ruokamyrkytyksiä aiheuttavien bakteerien
kasvua tuotteissa (Evira 2009). Esimerkiksi puolukassa luontaisesti esiintyvä bentsoehappo,
sen suolat ja muut johdannaiset ovat tehokkaita hiivojen ja homeiden kasvun ehkäisyssä
(Evira 2009; Devi ym. 2008). Jo ennen kemiallisten säilöntämenetelmien käyttöönottoa
esimerkiksi suolapitoisuuden lisäämisellä, vesipitoisuuden vähentämisellä (kuivaaminen),
savustamisella, happamuuden lisäämisellä (fermentointi) ja pakastamisella on pyritty
hidastamaan elintarvikepilaajien kasvua ruoassa (Gorris & Smid 1998; Evira 2009).
24
Säilöntäaineiden käyttö on usein elintarviketurvallisuuden näkökulmasta hyvin perusteltua,
sillä erityisesti pitkään säilytettävissä elintarvikkeissa mikrobien aiheuttama
pilaantumisprosessi on oikeanlaisesta varastoinnista huolimatta jatkuvasti käynnissä (Evira
2009). Esimerkiksi listerian esiintyminen elintarvikkeissa on lisääntynyt, kun säilöntäaineiden
ja suolan käyttöä elintarvikkeissa on vähennetty (Lyytikäinen ym. 2000a).
Kiinnostus luonnonmukaisesti tuotettuja, mahdollisimman vähän prosessoituja, terveellisiä
elintarvikkeita kohtaan kasvaa jatkuvasti (Gorris & Smid 1998; Grunert & Bredahl 1998;
Griffiths ym. 2002). Siksi synteettiset lisäaineet, mukaan lukien elintarvikepilaajien torjuntaan
käytetyt säilöntäaineet, ovat joutuneet kuluttajien ennakkoluulojen kohteeksi (Grunert &
Bredahl 1998; Arima ym. 2002; Park ym. 2008; Santas ym. 2010). Myös esimerkiksi
elintarvikkeiden säteilyttämiseen patogeenien torjuntamenetelmänä suhtaudutaan varauksella
(D’Aoust 1994). Toisaalta kysyntää on myös nopeille ja käytännöllisille valmisaterioille,
joiden säilyvyysajat ovat pitkiä (Grunert & Bredahl 1998; Devi ym. 2008). Näistä syistä
luonnosta peräisin olevien säilöntäaineiden tutkimus ja kehitys lienee ajankohtaista (Gorris &
Smid 1998; Arima ym. 2002; Park ym. 2008; Santas ym. 2010).
1.6 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuus
Yksinkertaisilla fenoleilla, fenolihapoilla ja polyfenoleilla on kauan tiedetty olevan mikrobien
kasvua sääteleviä ominaisuuksia (Cowan 1999; Cushnie & Lamb 2005; Mandal ym. 2010).
Erilaiset fenoliset yhdisteet toimivat muun muassa signalointimolkeyyleinä palkokasvien ja
niiden kanssa symbioosissa elävien Rhizobium-bakteerien välillä (Mandal ym. 2010).
Fenolisten yhdisteiden uskotaan osallistuvan myös kasvi-sieni-vuorovaikutussuhteisiin:
joidenkin flavonoidien ja fenolihappojen on tietyissä olosuhteissa havaittu edistävän
mykorritsasienten kasvua, joillakin yhdisteillä taas on sienirihmojen kasvua inhiboivaa
aktiivisuutta (Chabot ym. 1992; Mandal ym. 2010). Punaviinin polyfenolien on todettu
vaikuttavan ihmisen suolistomikrobistoon edistämällä probioottisten bakteerien kasvua ja
inhiboimalla haitallisia lajeja (Queipo-Ortuño ym. 2012). Ihmiskunta on hyödyntänyt kasvien
bioaktiivisten yhdisteiden antimikrobisia ominaisuuksia jo vuosituhansia erilaisten
sairauksien hoidossa, ja esimerkiksi propoliksen eli kittivahan, leipäpuu-uutteiden ja
eukalyptuksen bakteereita ja sieniä torjuvat vaikutukset on yhdistetty nimenomaan fenolisiin
yhdisteisiin (Cowan 1999; Ahmad & Beg 2011; Cushnie & Lamb 2005; Jagtap & Bapat
2010).
25
Flavonoidit ovat polyfenolinen yhdisteryhmä, johon kuuluvilla yhdisteillä on rakenteellisista
samankaltaisuuksistaan huolimatta lukuisia erilaisia aktiivisuuksia ja farmakologisia
ominaisuuksia (Cushnie & Lamb 2005). Flavonoidit tunnetaan myös antimikrobisista
ominaisuuksistaan. Flavonoideihin kuuluvista flavonoleista ainakin datiscetiinin, kemferolin,
kversetiinin, myrisetiinin ja moriinin on toistuvasti havaittu ehkäisevän muun muassa
Staphylococcus- ja Bacillus-sukuihin kuuluvien patogeenien kasvua (Mori ym. 1987; Nishino
ym. 1987; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001; Santas ym. 2010). Puhdas ei-hydroksyloitu
flavoni sekä 6,7-dihydroksiflavoni ovat osoittaneet antibakteerista aktiivisuutta (Mori ym.
1987; Nishino ym. 1987; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). Flavanoneista ainakin
naringeniinin on todettu olevan joissakin tapauksissa antibakteerinen (Tsuchiya ym. 1996;
Rauha ym. 2000). Esimerkiksi vihreässä teessä esiintyvä flavan-3-oli epigallokatekiini on
osoittanut monissa yhteyksissä antimikrobisia ominaisuuksia (Mori ym. 1987; Nishino ym.
1987; Taguri ym. 2004). Lisäksi useilla flavonoidimonomeereista muodostuvilla
kondensoiduilla tanniineilla eli proantosyanidiineilla ilmenee bakteereita ja sieniä torjuvaa
aktiivisuutta (Scalbert 1991; Cowan 1999).
Sienet, kuten Candida albicans, ovat osoittautuneet useissa tutkimuksissa bakteereja
resistentimmiksi flavonoideille (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010). Monien flavonoidien
antimikrobisuudesta on saatu ristiriitaisia tuloksia, joihin vaikuttanevat ainakin kokeissa
käytetty mikrobikanta ja koeolosuhteet (Mori ym. 1987; Nishino ym. 1987; Chabot ym. 1992;
Xu & Lee 2001; Taguri ym. 2004; Santas ym. 2010).
1.7 Fenolisten yhdisteiden molekyylirakenteen vaikutus antimikrobisuuteen
Fenolisen yhdisteen bioaktiivisuuteen vaikuttavat paitsi molekyylin oma hiilirunko, myös
muut kemialliset ominaisuudet, kuten hapettumisaste, fenolirenkaiden hydroksyloituminen,
molekyyliin liittyneet sokeritähteet (glykosylaatio), asylaatio ja stereoisomeria (Scalbert &
Williamson 2000). Jo pienet erot yhdisteiden rakenteessa vaikuttavat merkittävästi niiden
bioaktiivisuuksiin (Cowan 1999). Luonnossa suurin osa kasvien fenolisista yhdisteitä esiintyy
glykosideina, mutta molekyylit voivat muodostaa myös muita bioaktiivisia konjugaatteja ja
aineenvaihduntatuotteita joutuessaan kosketuksiin ihmisen solujen tai mikrobien kanssa
(Scalbert & Williamson 2000; Spencer ym. 2004). Yksittäisten polyfenolien ja niiden
johdannaisten, esimerkiksi juuri glykosidien, antimikrobiset ominaisuudet vaihtelevat, ja
vaihteluun vaikuttaa myös tutkittavana oleva mikrobilaji ja -kanta (Waage & Hedin 1985;
Ohemeng ym. 1992; Rauha ym. 2000; Ahmad & Beg 2001; Taguri ym. 2004). Gram-
26
positiiviset bakteerit ovat useissa tutkimuksissa osoittautuneet gram-negatiivisia bakteereita
herkemmiksi polyfenolisille puhdasaineille, mutta sekä gram-positiivisten että gram-
negatiivisten bakteerien keskuudessa on suuria kantakohtaisia eroja resistenttiydessä
esimerkiksi flavonoideille (Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001; Taguri ym. 2004; Santas ym.
2010). Bakteereilla solukalvoa ympäröi fysikaalisesti vahva, runsaasti monimutkaisia
polymeerisiä peptidoglykaaniyhdisteitä sisältävä soluseinä, jonka rakenne on gram-
positiivisilla bakteereilla gram-negatiivisten soluseinää yksinkertaisempi (Strominger &
Tipper 1965; Martin 1966). Bakteerien soluseinän peptidoglykaanit ja niiden synteesi ovat
monien antibakteeristen lääkkeiden vaikutuskohde (Bugg ym. 2011). Myös sienillä on
soluseinä, jossa on muun muassa kitiiniä ja polysakkaridi-proteiinikomplekseja, joiden määrä
vaikuttaa esimerkiksi hiivan soluseinän läpäisevyyteen (Chattaway ym. 1967). Ainakin
joidenkin flavonoidipolymeerien antifungaalisen aktiivisuuden ajatellaan kohdistuvan sienen
soluseinään (Patel ym. 2011). Perinteisten antifungaalisten lääkkeiden vaikutukset ovat
perustuneet muun muassa sienten, esimerkiksi hiivojen, solukalvoille spesifisen ergosterolin
synteesiin osallistuvan demetylaasi-entsyymin inhiboitumiseen (Fukuoka ym. 2003; Yu ym.
2011).
Flavonoidien vaikutusmekanismit mikrobisolussa voivat kohdistua solukalvon ja -seinän
lisäksi muun muassa entsyymeihin, soluseinän ja soluliman proteiineihin tai
nukleiinihappoihin (Mori ym. 1987; Nishino ym. 1987; Cowan 1999; Xu & Lee 2001;
Spencer ym. 2004; Apostolidis ym. 2008; Patel ym. 2011). Esimerkiksi myrisetiini inhiboi
Burholderia cepacia -bakteerin proteiinisynteesiä DNA:sta riippumattomalla mekanismilla
(Xu & Lee 2001). Olemalla vuorovaikutuksessa mikrobisolujen makromolekyylien kanssa,
flavonoidit ja niiden johdannaiset mahdollisesti osallistuvat solunsisäiseen signalointiin,
proteiinien ja soluseinän synteesiin ja hajotukseen sekä aiheuttavat esimerkiksi
raudanpuutosta ja reagoivat solun komponenttien tioliryhmien kanssa (Scalbert 1991; Cowan
1999; Spencer ym. 2004; Kylli ym. 2011). Fenolisten yhdisteiden kertyminen solukalvoille
voi aiheuttaa muun muassa kalvojen juoksevuuden ja stabiilisuuden muutoksia ja edelleen
häiritä elektronien siirtoa ja solujen energia-aineenvaihduntaa (Apostolidis ym. 2008). On
mahdollista, että esimerkiksi flavonoidin antimikrobinen aktiivisuus kohdistuu useampaan
kuin yhteen solun komponenttiin, mutta toisaalta yhdisteen tietyt rakenteelliset ominaisuudet
saattavat olla välttämättömiä molekyylin pääsylle mikrobisolun läheisyyteen tai sen sisään
(Cushnie & Lamb 2005). Molekyylin solutason vaikutukset riippuvat lopulta siitä, kuinka
laajaan kosketukseen yhdiste pääsee solun kanssa joko kalvolla tai solulimassa (Spencer ym.
2003).
27
Flavonoidin fenoliryhmän hydroksylaation on usein ajateltu liittyvän flavonoidien kykyyn
ehkäistä mikrobien kasvua: merkitystä on todennäköisesti sekä hydroksyyliryhmien määrällä
että sijainnilla (Tsuchiya ym. 1996). Useissa tutkimuksissa on tultu johtopäätökseen, että mitä
hydroksyloituneempi ja siten myös hydrofiilisempi yhdiste on, sitä tehokkaammin se toimii
antimikrobisena komponenttina (Nishino ym. 1987; Cowan ym. 1999; Xu & Lee 2001).
Toisaalta hydroksyloitujen, luonteeltaan hydrofiilisten flavonolien on tietyissä olosuhteissa
todettu jopa edistävän sienirihmojen kasvua, ja hydroksyyliryhmien lisääminen flavoni-
molekyyliin vähentää yhdisteen antifungaalisuutta (Chabot ym. 1992; Rauha ym. 2000).
Polyfenolin hydrofobisuus puolestaan voi edesauttaa proteiini-polyfenoli-kompleksien
muodostumista ja fenolien kiinnittymistä ja akkumuloitumista mikrobin solukalvolle (Richard
ym. 2006; Apostolidis ym. 2008). Fenolisten yhdisteiden taipumus sitoutua proteiineihin
voimakkailla vetysidoksilla voi edelleen aiheuttaa tärkeiden entsyymien
konformaatiomuutoksia ja inhiboitumista ja vaurioittaa esimerkiksi bakteerien soluseinän
proteiinipitoisia alueita (Mulaudzi ym. 2012). Hydrofobiset voimat osallistuvat myös
polyfenolien sitoutumiseen suoraan solukalvolle (Yu ym. 2011).
Ainakin kversetiini ja jotkin flavonit sitoutuvat DNA-gyraasiin, prokaryoottien DNA:n
topologiaa muokkaavaan entsyymikompleksiin, inhiboiden entsyymin aktiivisuutta ja siten
estäen sen toiminnan (Ohemeng ym. 1993; Plaper ym. 2003). Kversetiinijohdannaisten
rutiinin ja isokversitriinin on havaittu häiritsevän topoisomeraasi IV:n, toisen bakteerien
DNA:n kierteisyyttä säätelevän entsyymin toimintaa mahdollisesti ohjaamalla entsyymin
vääriin DNA:n katkaisukohtiin (Bernard ym. 1997). Esimerkiksi fenolisten kahvi- ja
gallihappojen antimikrobisen aktiivisuuden kohteeksi on esitetty myös
proliinidehydrogenaasi-entsyymiä, jonka toiminta on edellytys bakteerien kasvulle (Kwon
ym. 2007; Apostolidis ym. 2008). Lisäksi bakteerien lipaasi-entsyymejä on pidetty
mahdollisena flavonoidien vaikutuskohteena (Nishino ym. 1987). Omenasta eristettyjen
flavan-3-olien, kversetiiniglykosidien ja poly- ja oligomeeristen prosyanidiinien sekä sipulista
eristetyn kversetiini-4’-glukosidin on osoitettu inhiboivan Helicobacter pylori -bakteerin
virulenssille tärkeää ureaasi-entsyymiä ja sitä vastaavaa Lactobacillus fermentum -bakteerin
ureaasia in vitro (Pastene ym. 2009; Shabana ym. 2010). Joidenkin katekiinien ajatellaan
alentavan C. albicans -hiivan proteasomien entsyymiaktiivisuutta aiheuttamalla sykliini-
riippuvaisen kinaasi-inhibiittorin kertymistä hiivasoluihin ja sitä kautta häiritsevän solujen
morfogeneesiä, normaalia solusykliä ja lopulta biofilmin muodostusta (Evensen & Braun
2009).
28
Flavonoidiglykosidit eivät sellaisenaan ole osoittaneet merkittävää antimikrobista tehoa
(Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). Polyfenoliin kiinnittyneet
glukoositähteet voivat estää hydrofobisten, antimikrobisuusaktiivisuudelle olennaisten
proteiini-polyfenoli-vuorovaikutusten syntymisen (Richard ym. 2006). Glukosidiosan
leikkautuminen irti polyfenoliglukosidista lisää aglykonin lipofiilisyyttä ja samalla taipumusta
hakeutua solukalvoille (Del Rio ym. 2012). Glykosylaation osuus heikkoon antimikrobiseen
tehoon saattaa kuitenkin olla merkityksetön in vivo -olosuhteissa, sillä esimerkiksi suoliston
mikrobiflooran lajit deglykosyloivat ravinnon flavonoidiglykosideja ja käyttävät syntyviä
glykaaneja ravintonaan (Rastmanesh 2011). Bakteerien kyvyssä hyödyntää glykaaneja on
sukukohtaisia eroja, mikä saattaa selittää suolistomikrobiston lajisuhteita sen lisäksi, että
bakteerilajien herkkyys polyfenolien antimikrobisia ominaisuuksia kohtaan vaihtelee
(Rastmanesh 2011). Antimikrobisissa, kasveista eristetyissä raakauutteissa, joissa flavonoidit
ovat usein glykosidisessa muodossa, ovat aina useiden yhdisteryhmien seoksia, jolloin
molekyylien väliset vuorovaikutukset voivat aiheuttaa antimikrobisen aktiivisuuden, vaikka
vaikutusta ei havaita yksittäisillä glykosideilla tai muilla yhdisteillä (Griffiths ym. 2002;
Cowan 1999; Cushnie & Lamb 2005). Yhdistämällä fenolisia yhdisteitä keskenään tai muiden
antimikrobisten kemikaalien, kuten antibioottien tai elintarvikesäilöntäaineiden kanssa,
mikrobien kasvun ehkäiseminen on usein tehokkaampaa (Tsuchiya ym. 1996; Cowan 1999;
Arima ym. 2002; Taguri ym. 2004; Ramos ym. 2006).
Esimerkiksi kversetiinin ja muiden flavonoidien hapettuessa transitiometallien läsnäollessa
voi muodostua myrkyllisiä kinonimuotoja, joilla on mahdollisesti sytotoksisia ja
antimikrobisia ominaisuuksia (Cowan 1999; Spencer ym. 2004; Ramos ym. 2006; Sung ym.
2008; Perron ym. 2011). Lisäksi kversetiinin antimikrobinen aktiivisuus saattaa ainakin osin
olla seurausta yhdisteen C-renkaan kaksoissidoksesta (Xu & Lee 2001). Flavonit ja flavonolit,
joiden A/C-rengas on ollut muodoltaan tasomainen, ovat osoittaneet verrattain hyvää
antimikrobista tehoa verrattuna flavonoideihin, joiden A/C-rengas on asettautunut ei-
tasomaisesti (Nishino ym. 1987). Flavonoidien B-renkaan on ajateltu olevan merkittävässä
osassa ainakin DNA- ja RNA-synteesin inhibition kautta toteutuvassa antimikrobisessa
aktiivisuudessa (Mori ym. 1987). Metoksiryhmä kalkonin rakenteessa vaikuttaisi vähentävän
yhdisteen antimikrobista tehoa (Alcaráz ym. 2000). Lisäksi fenolisten yhdisteiden
molekyylikoolla on vaikutusta siihen, missä ja miten yhdisteiden antimikrobinen aktiivisuus
ilmenee (Mulaudzi ym. 2012). Pienemmät molekyylit pääsevät helpommin mikrobisolujen
läheisyyteen ja läpäisevät solujen fyysiset esteet (Mulaudzi ym. 2012). Toisaalta
29
molekyylipainoltaan suurempien polyfenolien on todettu tehokkaammin ehkäisevän
ureaasiaktiivisuutta in vitro (Pastene ym. 2009).
1.8 Sipulien flavonoidien bioaktiivisuus elintarvikepatogeeneja vastaan
Flavonoidi kversetiini ja erityisesti sen glykosidiset muodot kversetiini-4’-glukosidi tai
kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi ovat sipulin runsaimpia polyfenolisia yhdisteitä (Bonaccorsi
ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008). Kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-
glukosidin lisäksi sipuli sisältää pääasiassa viittä muuta flavonolia kversetiini-3,7,4’-
triglukosidia, kversetiini-7,4’-diklukosidia, isoramnetiini-3,4’-glukosidia, kversetiini-3’-
glukosidia ja isoramnetiini-4’-glukosidia (Bonaccorsi ym. 2008; Soininen ym. 2012). Edellä
mainittujen yhdisteiden ohella sipuleissa on havaittu pieniä määriä muita kversetiini- ja
isoramnetiinijohdannaisia, kemferolia ja myrisetiiniä johdannaisineen, dihydroflavonoli
taksifoliinin johdannaisia sekä antosyaaneja, joita esiintyy erityisesti punasipulissa (Slimestad
ym. 2007). Polyhydroksyloidut flavonoidit kversetiini, kemferoli ja myrisetiini, ovat
osoittaneet antimikrobista aktiivisuutta esimerkiksi ruokamyrkytyksiä aiheuttavaa
Staphylococcus aureus -bakteeria vastaan (Xu & Lee 2001). Aglykonit ovat yhdisteiden
glykosidimuotoja tehokkaampia mikrobien kasvun ehkäisijöitä (Rauha ym. 2000). Sipulin
ruskea kuori, jossa kversetiinin aglykonia esiintyy muita sipulin osia enemmän, suojaa
luonnossa sipulia taudinaiheuttajien hyökkäyksiltä (Takahama & Hirota 2000; Benítez ym.
2010). Kuoriosassa on myös kversetiinin antifungaalisiksi ja antibakteerisiksi todettuja
hapettumistuotteita, jotka ehkäisevät paitsi sipuleita infektoivia sienipatogeeneja myös
esimerkiksi H. pylori -bakteerin kasvua (Takahama & Hirota 2000; Ramos ym. 2006).
Sipulista voidaan eristää polyfenoleja uuttamalla sipulin solukoita orgaanisilla liuottimilla,
kuten metanolilla, etanolilla, propanolilla, asetonilla ja etyyliasetaattilla, joita voidaan käyttää
myös seoksina toistensa tai voimakkaasti poolisen veden kanssa (Garcia-Salas ym. 2010).
Fenoliyhdisteen liukoisuus joko poolisiin tai poolittomiin liuottimiin riippuu paitsi yhdisteen
omista ominaisuuksista myös vuorovaikutussuhteista esimerkiksi kasvisolukon
makromolekyylien kanssa (Garcia-Salas ym. 2010). Sipuliuutteiden antimikrobinen teho
vaihtelee sen mukaan, mitä liuotinta uutossa on käytetty (Kyung 2011). Sipulista orgaanisilla
liuottimilla valmistettujen flavonoidirikkaiden raakauutteiden on todettu monissa
tutkimuksissa olevan antimikrobisia elintarvikepatogeeneja, kuten Listeria monocytogenes,
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ja Escerichia coli -bakteereja vastaan (Rauha ym.
2000; Benkeblia ym. 2005; Park & Chin 2010; Santas ym. 2010). Kuitenkin esimerkiksi
30
kversetiinin ja kemferolin puhtaat aglykonimuodot ovat osoittaneet raakauutteita parempaa
antimikrobista aktiivisuutta, mikä saattaa olla seurausta siitä, että uutteissa sipulin flavonoidit
ovat glykosideina, joilta puuttuu C-3-hydroksyyliryhmä (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010).
Kversetiiniglykosidit ovat luonteeltaan hydrofiilisiä, mikä vaikuttaa niiden biologiseen
aktiivisuuteen solussa (Bischoff 2008; Santas ym. 2010). Mikro-organismit saattavat lisäksi
kyetä metaboloimaan flavonoidiglykosideja, jolloin myös yhdisteiden biologiset aktiivisuudet
muuttuvat (Spencer ym. 2004; Chung ym. 2011; Millet ym. 2012).
Myös vedellä sipulista liukenee paljon fenolisia yhdisteitä, mutta vesiuutteiden
flavonoidipitoisuus on pieni ja antimikrobinen teho heikko verrattuna orgaanisilla liuottimilla
uutettuihin fraktioihin, joissa flavonoidipitoisuus on suurempi (Santas ym. 2010; Rahman ym.
2011). Vedellä ja orgaanisilla liuottimilla sipulista liukenee paljon myös sipulien ominaisia
antimikrobisia rikkiyhdisteitä, jotka kuitenkin ovat haihtuvia ja erityisesti Allium cepa -lajin
sipuleissa erittäin epästabiileja (Griffiths ym. 2002; Lanzotti 2006; Kyung 2011; Millet ym.
2012). Fermentoimalla sipulin vesiuutetta sipulin ja heran luontaisen mikrobiflooran avulla,
uutteen antimikrobinen teho patogeenisia bakteerikantoja vastaan paranee, tosin uutteessa ei
ilmene enää samaa sipulille ominaista flavonoidiprofiilia kuin fermentoimattomassa
vesiuutteessa (Millet ym. 2012). Sipulin raakauutteiden antimikrobinen teho perustuu
luultavasti paitsi fenolisiin yhdisteisiin myös muihin uutteessa läsnä oleviin komponentteihin
ja on riippuvainen mikrobien määrästä ja kasvuolosuhteista, joissa
antimikrobisuusaktiivisuutta ilmennetään (Cowan 1999; Cushnie & Lamb 2005).
31
2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kelta-, puna-, salotti ja banaanisalottisipulista
(Allium cepa), valkosipulista (Allium sativum) ja purjosta (Allium porrum) uutettujen
fenolisten yhdisteiden sekä sipuleissa runsaimpina esiintyvien yksittäisten
flavonoidiglykosidien vaikutuksia gram-positiivisen Listeria monocytogenes -bakteerin,
gram-negatiivisen Salmonella infantis -bakteerin ja eukaryoottisen Candida albicans -hiivan
kasvuun turbidometriaan perustuvalla, reaaliaikaisella mittausmenetelmällä. Tavoitteena oli
myös arvioida sipulimateriaalin jatkojalostuksesta muodostuvien sivuvirtojen potentiaalia
elintarvikkeiden säilyvyyttä edistävien fenoliyhdisteiden lähteenä.
32
3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT
3.1 Sipulimateriaali
Suomalaiset kelta-, puna- ja banaanisalottisipulit, tanskalaiset salottisipulit, espanjalaiset
valkosipulit sekä ranskalainen purjo valittiin sattumanvaraisesti kuopiolaisesta
supermarketista fenoliyhdisteiden uuttamista varten. Sipulit säilytettiin +4 °C:ssa pimeässä
uuttamiseen asti.
Sipulit käytettiin uuttoon tuoreina. Sipulit kuorittiin ja niistä poistettiin kuivat ja sitkeät osat.
Purjosta käytettiin sekä valkoinen että vihreä osa. Sipulit silputtiin tavallisella
kotitalouskäyttöön tarkoitetulla leikkurilla.
3.2 Uutteiden valmistus antimikrobisuuskokeita varten
Uutot suoritettiin 50 ml Falcon-putkissa, joihin oli punnittu 15 g sipulisilppua ja lisätty 30 ml
99,5 % etyyliasetaattia (Sigma-Aldrich, USA). Yhtä sipulilajia kohden käsiteltiin 15˗25 x 15
g sipulisilppua, jossa oli yhdistetty 1-7 sipulista saatu materiaali. Sipulimateriaalia käsiteltiin
60 min tasoravistelijassa (Unimax 2010, Heidolph Instuments, Saksa) ravistellen 400 rpm.
Uutteet suodatettiin kolveihin kuitukankaan (Mölnlycke Health Care, Ruotsi) läpi ja
etyyliasetaatti haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttajalla (Rotavapor - RE, Büchi, Sveitsi)
vesihauteessa vakuumissa. Kuiva-aineet liuotettiin kolveista uudelleen 99,5 %
etyyliasetaattiin. Uutteet siirrettiin lasisiin koeputkiin ja ilmakuivattiin huoneenlämmössä
vetokaapissa uudelleen kuiviksi. Ilmakuivatuksen jälkeen yhdisteet liuotettiin 1ml:aan 80 %
etanolia (Altia, Suomi) ja siirrettiin Eppendorf-putkiin. Kiinteä aine erotettiin uutteista
sentrifugoimalla 13000 g 5 min mikrosentrifugilla (Biofuge Pico, Heraeus Instruments,
Saksa). Sentrifugoidut uutteet suodatettiin 0,2 µm:n suodattimella (Phenomenex, Tanska) ja
niiden kokonaisfenolipitoisuus määritettiin. Valmiit uutteet säilöttiin -20 °C:ssa
antimikrobisuuskokeisiin asti.
3.3 Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen
Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuus määritettiin värireaktioon perustuvalla Folin-
Ciocalteu-menetelmällä. Sipuliuutteista valmistettiin 1:200, 1:1000 ja 1:2000 laimennokset
33
ultrapuhtaaseen veteen. Uuttomenetelmän optimointivaiheessa uutteista valmistettiin 1:10,
1:50 ja 1:100 laimennokset. Standardikantaliuos valmistettiin liuottamalla gallihappoa
(Sigma-Aldrich, USA) ultrapuhtaaseen veteen konsentraatiolla 1 mg/ml, ja kantaliuoksesta
valmistettiin laimennossarja, jossa gallihappopitoisuudet olivat 0,01 mg/ml, 0,03 mg/ml, 0,05
mg/ml, 0,07 mg/ml ja 0,10 mg/ml. 200 µl:aan laimennettuja näytteitä tai standardiliuoksia
lisättiin 1000 µl 1:10 laimennettua Folin-Ciocalteu-reagenssia (Merck, Saksa) ja 800 µl 7,5 %
natriumkarbonaattiliuosta. Kustakin uute- ja standardipitoisuudesta valmistettiin kolme
rinnakkaista mitattavaa näytettä. Negatiivikontrolli valmistettiin vastaavasti ultrapuhtaasta
vedestä. Näytteet sekoitettiin koeputkisekoittajalla ja suojattiin valolta. Reaktion annettiin
tapahtua 1 h:n ajan. Näytteet sekoitettiin koeputkisekoittajalla kertaalleen n. 25 min
inkuboinnin jälkeen ja siirrettiin muovikyvetteihin (Kartell, Australia) n. 50 min inkuboinnin
jälkeen. Näytteiden absorbanssit mitattiin spektrofotometrillä (Ultrospec 2000, Pharmacia
Biotech, USA) 765 nm:n aallonpituudella. Standardinäytteiden perusteella piirrettiin
standardisuora, jonka pohjalta määritettiin uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet
gallihappoekvivalentteina mg/ml.
Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet säädettiin joko laimentamalla tai konsentroimalla
pitoisuuteen 15 mg/ml.
3.4 Puhdasaineet
Antimikrobisuuskokeissa testattavat puhtaat fenoliyhdisteet olivat flavonolit kversetiini-3,4’-
di-O-glukosidi (CAS-numero 29125-80-2) ja kversetiini-4’-glukosidi eli spireosidi (CAS-
numero 243-614-6) (Extrasynthese, Ranska). Kyseiset kversetiinijohdannaiset ovat sipulien
runsaimpia polyfenoleja (Bonaccorsi ym. 2008). Puhdasaineista valmistettiin kantaliuokset
dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Merck Schuchardt, Saksa) pitoisuudessa 10 mg/ml.
3.5 Tutkittavat mikrobit ja kasvatusolosuhteet
Antimikrobisuuskokeissa käytetyt mikrobikannat olivat bakteerit Listeria monocytogenes
EELA Hki L211 ja Salmonella infantis EELA 72 sekä hiiva Candida albicans EELA 188.
Kannat on saatu Elintarviketurvallisuusvirastosta (EVIRA) ja ne ovat elintarvikkeista
eristettyjä. Työssä haluttiin tutkia tyypillisiä elintarvikkeiden pilaajamikrobeja ja
ruokamyrkytysten aiheuttajia. Listeria on grampositiivinen ihmisen patogeeni, joka aiheuttaa
34
pääasiassa elintarvikevälitteisesti tarttuvaa listerioosia, salmonella on gramnegatiivinen,
zoonoottinen elintarvikepatogeeni, ja C. albicans on opportunistisesti patogeeninen ihmisen
pöytävierasmikrobi.
Ennen antimikrobisuuskokeiden aloittamista mikrobikannat siirrostettiin kiinteille
kasvatusalustoille joko syväjäädytetyistä (-70 °C) helmistä tai maljoilta. Kantoja ylläpidettiin
tutkimuksen ajan siirrostamalla yksi pesäke uudelle kasvatusmaljalle kerran viikossa. Listeria-
ja salmonella-kantoja ylläpidettiin veriagarmaljoilla + 37 °C:ssa ja hiivaa oxytetracycline
glucose yeast extract (OGYE) -maljoilla (Lab M Ltd, Iso-Britannia) + 30 °C:ssa.
3.6 Sipuliuutteiden ja puhdasaineiden antimikrobisuuden määritys
3.6.1 Mittauslaitteisto
Antimikrobisuuskokeet suoritettiin inkubaattorista ja turbidometristä koostuvan automaattisen
mittauslaitteen (Bioscreen C, ThermoLabsystems, Suomi) avulla. Laite mittaa kustakin 100-
kuoppalevyn (Honeycomb, ThermoLabsystems, Suomi) kuopasta absorbanssin, jonka
muutokset ovat suoraan verrannollisia kuopissa olevan kasvatusliemen samentumiseen ja
siten myös bakteerien kasvuun. Laitteella voidaan mitata yhdellä ajokerralla 200 näytettä.
3.6.2 Yhdistepitoisuudet
Antimikrobisuuskokeissa tutkittavat mikrobit altistettiin useille pitoisuuksille sipuleista
uutettuja fenolisia yhdisteitä ja puhdasaineita, joista valmistettiin laimennokset
kantaliuoksista. Kelta-, puna, salotti- ja banaanisalottisipuliuuttella kantaliuosten
kokonaisfenolipitoisuus oli 15 mg/ml 80 % etanolia, valkosipuliuutteella 12 mg/ml ja
purjouutteella 7,5 mg/ml. Puhdasaineet liuotettiin pitoisuuteen 10 mg/ml DMSO:ta. Käytetyt
yhdistepitoisuudet kullekin mikrobille on esitetty taulukossa 1.
35
Taulukko 1. Antimikrobisuuskokeissa käytetyt polyfenolipitoisuudet kullekin tutkittavalle
mikrobikannalle.
YHDISTE KÄYTETYT YHDISTEPITOISUUDET mg/ml
L. monocytogenes S. infantis C. albicans
Uute, kokonaisfenolipitoisuus 5, 10, 15, *) 5, 10, 15, *) 0.6, 0.75, 1, 1.3, 1.8,
2.4
Kversetiini-4’-glukosidi 1, 2, 4, 6, 8, 10 1, 2, 4, 6, 8, 10 1, 2, 3, 4, 5
Kversetiini-4’-glukosidi +
kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi
1, 2, 3, 4, 5 1, 2, 3, 4, 5 1, 2, 3, 4, 5
*) Valkosipuliuutteiden antibakteerisuuskokeissa käytetyt kokonaisfenolipitoisuudet olivat 4, 8 ja 12 mg/ml ja
purjouutteen n. 7,5 mg/ml.
3.6.3 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteella
Sipuliuutteiden antimikrobisuuden testaamista varten yksi pesäke kumpaakin bakteerikantaa
siirrettiin kasvamaan 5 ml:aan tryptonisoija-kasvatuslientä (TSB)(Oxoid Ltd, Iso-Britannia) ja
hiivaa yksi pesäke 5 ml:aan OGYE-kasvatuslientä (Lab M Ltd, Iso-Britannia). Bakteereita
inkuboitiin yön yli + 37 °C:ssa ja hiivaa + 30 °C:ssa. Seuraavana päivänä nestekasvatusten
absorbanssit aallonpituudessa 625 nm säädettiin n. 0,1:een, jolloin mikrobitiheys liemessä oli
bakteereilla n. 1 x 108 pmy/ml ja hiivalla n. 1 x 10
5 pmy/ml.
Mikrobit altistettiin 100-kuoppalevyllä sipuliuutteille siten, että 5-10 rinnakkaiseen kuoppaan
pipetoitiin 220 µl kasvatuslientä, 75 µl mikrobisuspensiota ja 7,5 µl uutetta tai
puhdasaineliuosta. Taulukossa 2 näkyvät kokonaisfenoli- ja puhdasainepitoisuudet kuopissa.
Lisäksi kuoppalevylle pipetoitiin seuraavat kontrollit:
- Puhdas kasvatusliemi (TSB/OGYE, 300 µl)
- Kasvatusliemi (TSB/OGYE, 295 µl) ja uute/puhdasaineliuos (7,5 µl)
- Kasvatusliemi (TSB/OGYE, 225 µl) ja mikrobisuspensio (75 µl)
- Kasvatusliemi (TSB/OGYE, 220 µl), mikrobisuspensio (75 µl) ja liuotin (80 % EtOH /
DMSO, 7,5 µl)
Taulukko 2. Sipulien fenolien tai puhdasaineiden lopulliset pitoisuudet antimikrobisuuskokeiden
aikana (μg/ml).
YHDISTE PITOISUUS KUOPASSA μg/ml
L. monocytogenes ja S. infantis C. albicans
Sipulin polyfenolit: kelta-,
puna-, salotti- ja
banaansalottisipuli
123, 246, 369 15, 18, 25, 32, 44, 59
Sipulin polyfenolit: valkosipuli 98, 197, 295 -
Sipulin polyfenolit: purjo 184 -
Kversetiini-4’-glukosidi 25, 49, 98, 148, 197, 246 25, 49, 74, 98, 123
Kversetiini-4’-glukosidi +
kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi
25, 49, 74, 98, 123 25, 49, 74, 98, 123
36
Kasvun inhibition määrittämiseksi bakteereja inkuboitiin kuoppalevyllä Bioscreen C -
laitteessa + 37 °C:ssa ja hiivaa + 30 °C:ssa 24 h. Laite mittasi absorbanssin 15 min välein
420-580 nm:n laajalla suodattimella. Laite ravisteli bakteerikasvatuksia 10 s ennen mittauksia,
hiivaa kasvoi jatkuvassa ravistelussa.
Bakteerikokeissa uutteiden ja puhdasaineiden inhibitiotehokkuuden selvittämiseksi
määritettiin kuopissa tapahtunut absorbanssin muutos vähentämällä lähtötilanteen
absorbanssiarvo absorbanssiarvosta 24 h:n kokeen lopussa. Tällöin arvosta vähenivät
kasvatusliemen, alkuperäisten solujen ja uutteen vaikutus. Absorbanssin muutos on suoraan
verrannollinen mikrobien kasvuun. Rinnakkaisten kuoppien absorbanssin muutoksista
laskettiin keskiarvo. Kasvuprosentin laskemiseksi fenolisille yhdisteille altistettujen
bakteerikasvatusten keskimääräinen absorbanssin muutos jaettiin liuotinkontrollikasvatusten
keskimääräisellä absrobanssin muutoksella, jonka katsottiin edustavan 100-prosenttista
kasvua. Inhibitioprosentit laskettiin edelleen vähentämällä kasvuprosentti 100 prosentista.
Bakteerien kasvu määritettiin kokonaan estyneeksi, kun inhibitioprosentti oli yli 90
(Väkeväinen 2010).
Hiivan kasvua tarkasteltiin kasvukäyrien avulla. Absorbanssissa tapahtuneet muutokset
laskettiin edellä kuvatun mukaisesti jokaiselle mittauspisteelle. Rinnakkaisten kuoppien
keskimääräisen absorbanssin muutoksen perusteella piirrettiin 24 h:n kasvukäyrät, joista
nähtiin hiivasolujen kasvussa uute- ja puhdasainealtistuksen jälkeen tapahtuneet muutokset
liuotinkontrollikasvatuksiin verrattuna. Myös hiivalla kasvun katsottiin estyneen, kun solujen
määrä kokeen lopussa oli korkeintaan 10 % liuotinkontrollisolujen määrästä.
37
4. TULOKSET
4.1 Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet
Uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet vaihtelivat välillä 7,5˗30 mg/ml ja grammasta tuoretta
sipulimateriaalia saatiin etyyliasetaatilla uutettua 0,01-0,09 mg fenolisia yhdisteitä. Uuttoihin
käytetyt sipulimäärät, uutteiden fenolipitoisuudet ja sipulien fenolipitoisuudet milligrammoina
grammaa tuorepainoa kohti on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3. Antimikrobisuuskokeisiin valmistettuihin sipuliuutteisiin käytetyt sipulimäärät, uutteiden
Folin-Ciocalteu-menetelmällä määritetyt kokonaisfenolipitoisuudet ja sipulien fenolipitoisuudet
tuorepainoon suhteutettuna.
Sipuli Uuttoon käytetty
sipulimäärä (g)
Uutteen fenolipitoisuus
(mg/ml)
Sipulin fenolipitoisuus
(mg/g tuorepainoa)
Keltasipuli 360 30 0,08
Punasipuli 360 33 0,09
Salottisipuli 360 22 0,06
Banaanisalottisipuli 330 24 0,07
Valkosipuli 360 12 0,02
Purjo 360 5 0,01
4.2 Sipuliuutteiden antibakteerisuus
Bioscreen-kokeissa bakteerien kasvussa havaittiin selvä annosvaste kelta-, puna-, salotti- ja
banaanisalottisipulista uutetuille fenolisille yhdisteille: uutteen kokonaisfenolipitoisuuden
kasvaessa myös uutteen kyky hidastaa bakteerien kasvua parani. Kuvassa 10 on esitetty
bakteerikohtaiset inhibitioprosentit kullekin uutteelle ja kokonaisfenolipitoisuudelle.
Punasipuliuute ehkäisi tehokkaimmin sekä L. monocytogenes että S. infantis -bakteerin
kasvua. Punasipuliuute, jonka kokonaisfenolipitoisuus oli 15 mg/ml, esti L. monocytogenes -
bakteerin kasvun lähes täysin. S. infantis -bakteerilla absorbanssi oli kokeen lopussa
alhaisempi kuin kokeen alussa, kun bakteerit altistettiin punasipuliuutteille, joiden
kokonaisfenolipitoisuus oli 15 tai 10 mg/ml; inhibitioprosentteina ilmaistuna S. infantis -
bakteerin kasvu siis ehkäistyi yli 100-prosenttisesti. Punasipuliuutteen
kokonaisfenolipitoisuudet 10 ja 5 mg/ml hidastivat L. monocytogenes -bakteerin kasvua
selvästi, ja pitoisuus 5 mg/ml inhiboi S. infantis -bakteerin kasvusta yli 60 %. Keltasipuli- ja
banaanisalottisipuliuutteet ehkäisivät kaikilla kokonaisfenolipitoisuuksilla S. infantis -
bakteerin kasvua L. monocytogenes -bakteerin kasvua tehokkaammin, ja S. infantis oli selvästi
L. monocytogenes -bakteeria herkempi banaanisalottisipuliuutteelle. Sen sijaan L.
monocytogenes -bakteerin kasvu reagoi voimakkaammin salottisipuliuutteisiin, joskin pienin
38
kokonaisfenolipitoisuus, 5 mg/ml, hillitsi hieman tehokkaammin S. infantis -bakteerin kuin L.
monocytogenes -bakteerin kasvua.
A
B
Kuva 10. Sipuliuutteiden antibakteerisuus inhibitioprosentteina (keskiarvo ± keskihajonta) 24 h:n
altistuksen jälkeen suhteutettuna liuotinkontrolliin (80% EtOH) A) L. monocytogenes ja B) S. infantis
-bakteereille. PS= punasipuli, KS = keltasipuli, BS = banaanisalottisipuli, SS = salottisipuli.
39
Myös valkosipuli ja purjouutteet näyttivät hidastavan tehokkaasti bakteerien kasvua
(mittaustuloksia ei näytetä). Valkosipulin ja purjon alhaiset fenolipitoisuudet ja uutteiden
sakkautuminen kasvatusliemessä kuitenkin heikensivät antimikrobisuuskokeiden tulosten
vertailukelpoisuutta ja vaikeuttivat inhibitiovaikutusten luotettavaa tulkintaa.
4.3 Puhdasaineiden antibakteerisuus
Bakteerien kasvussa ei havaittu mainittavaa johdonmukaista muutosta kversetiini-4’-
glukosidille tai kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin yhdistelmälle
altistumisen jälkeen testatuilla pitoisuuksilla (mittaustuloksia ei näytetä). L. monocytogenes -
bakteerilla kasvu estyi kversetiini-4’-glukosidilla maksimissaan 12-prosenttisesti ja S. infantis
-bakteerilla 8-prosenttisesti, mutta keskihajonnat kokeissa olivat suuria. Yhdisteiden
yhdistelmällä ei käytännössä ollut vaikutusta bakteerien kasvuun.
4.4 Sipuliuutteiden antifungaalisuus
Sipuliuutteilla oli selvä vaikutus C. albicans -hiivan kasvuun. C. albicans -hiivan kasvun
alkuvaihe hidastui huomattavasti aina, kun solut altistettiin sipuliuutteille. Kelta- ja
punasipuliuutteet, joiden kokonaisfenolipitoisuus oli vähintään 2,4 mg/ml estivät täysin
hiivasolujen kasvun, ja kelta-, salotti- ja banaanisalottisipuliuutteissa kasvun esto tapahtui jo
kokonaisfenolipitoisuudella 1,8 mg/ml. Sipuliuutteille altistettujen hiivasolujen kasvussa ei
kuitenkaan havaittu selkeää annosvastetta kokonaisfenolipitoisuuksille, jotka olivat alle 1,8
mg/ml. Sipuliuutteilla, joiden kokonaisfenolipitoisuus oli korkeintaan 1,3 mg/ml, havaittiin
erittäin vaihtelevia hiivasolujen kasvua ehkäiseviä vaikutuksia. Taulukossa 4 on esitetty
inhibitioprosentit sipuliuutelaimennoksille, joiden kokonaisfenolipitoisuus on 0,6 ja 1,8
mg/ml.
Taulukko 4. Sipuliuutteiden C. albicans -hiivasolujen kasvua ehkäisevä vaikutus 24 h:n altistuksen
jälkeen, kun uutteen kokonaisfenolipitoisuus on 0,6 tai 1,8 mg/ml. Tulokset on suhteutettu
liuotinkontrolliin (80 % EtOH) ja esitetty inhibitioprosentteina (keskiarvo ± keskihajonta).
KASVUA EHKÄISEVÄ VAIKUTUS (%)
SIPULI Fenolipitoisuus 0,6 mg/ml Fenolipitoisuus 1,8 mg/ml
Keltasipuli 23 ± 23 98 ± 1
Punasipuli 76 ± 24 85 ± 9
Salottisipuli 67 ± 27 101 ± 1
Banaanisalottisipuli 20 ± 9 101 ± 1
40
Banaanisalottisipuliuutteelle altistettujen hiivasolujen kasvu kuitenkin noudatteli keskimäärin
uutelaimennosten kokonaisfenolipitoisuuksia: banaanisalottisipuliuute, jonka
kokonaisfenolipitoisuus oli suurin (2,4 mg/ml) ehkäisi kasvua tehokkaimmin ja uute, jonka
kokonaisfenolipitoisuus oli pienin (0,6 mg/ml) vastaavasti heikoimmin. Kuvassa 11 on
esitetty banaanisalottisipuliuutteiden vaikutus C. albicans -hiivan kasvuun. Kasvukäyrät on
piirretty absorbanssissa tapahtuneen muutoksen perusteella siten, että lähtötasoksi on asetettu
0. Absorbanssin muutos on laskettu vähentämällä jokaisen mittauspisteen absorbanssiarvosta
kokeen alussa mitattu lähtöabsorbanssi, jolloin arvosta vähenivät kasvatusliemen,
alkuperäisten solujen ja uutteen vaikutus.
Kuva 11. Muutokset C. albicans -hiivan kasvussa 24 h:n aikana, kun solut on
altistettu banaanisalottisipulista uutetuille fenolisille yhdisteille. Uutteiden
kokonaisfenolipitoisuudet vaihtelivat välillä 0,6-1,8 mg/ml.
Hiivasolujen kasvusta estyi 24 h:n kokeen aikana liuotinkontrolliin verrattuna
punasipuliuutteella vähintään 40 %, salottisipuliuutteella 37 %, banaanisalottisipuliuutteella 9
% ja keltasipuliuutteella 2 %. Sipuliuutteista punasipuliuute siis ehkäisi varmimmin
hiivasolujen kasvua myös pienimmällä testatulla uutteen kokonaisfenolipitoisuudella (0,6
mg/ml).
4.5 Puhdasaineiden antifungaalisuus
Kversetiini-4’-glukosidi hidasti C. albicansin kasvun alkuvaihetta kaikilla testatuilla
pitoisuuksilla. 24 h:n aikana solujen määrä kasvatusliemessä kuitenkin saavutti ja jopa ylitti
41
kontrollisolujen määrän. Kuvassa 12 on esitetty kversetiini-4’-glukosidin keskimääräinen
vaikutus C. albicans -kasvatusten absorbanssiin.
Kuva 12. Kversetiini-4’-glukosidille altistettujen C. albicans -hiivasolujen
kasvukäyrät 24 h:n ajalta absorbanssin muutoksen avulla esitettynä. Kversetiini-4’-
glukosidi-liuosten kokonaisfenolipitoisuus vaihteli välillä 1-5 mg/ml.
Kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin yhteisvaikutus C. albicans -
hiivan kasvuun oli selvempi kuin pelkän kversetiini-4’-glukosidin, ja kaikki testatut
pitoisuudet ehkäisivät solujen kasvua kontrolliin verrattuna. Tulokset olivat kuitenkin
vaihtelevia. Keskimäärinkin suurin testattu kversetiinipitoisuus hidasti solujen kasvua kokeen
loppuun mennessä parhaiten, mutta muilla pitoisuuksilla hiivasolujen kasvun hidastumisessa
ei havaittu annosvastetta, kun tarkasteltiin koko 24 h:n mittausaikaa (kuva 13). Yllättäen
kasvun alkuvaihe hidastui sitä enemmän, mitä pienemmälle kversetiinipitoisuudelle hiivasolut
oli altistettu, mutta solumäärät eri kversetiinipitoisuuksissa tasoittuivat kokeen loppuun
mennessä. Suurimalle käytetylle yhdistepitoisuudelle altistettujen solujen määrä jäi kuitenkin
selvästi alhaisimmaksi.
42
Kuva 13. Kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin
yhteisvaikutus C. albicans -hiivasolujen kasvuun 24 h:n aikana. Tulokset on esitetty
absorbanssin muutoksena, joka on suoraan verrannollinen hiivasolujen kasvuun.
Yhdisteiden kokonaispitoisuus kantaliuoksissa vaihteli välillä 1-5 mg/ml.
43
5. POHDINTA
Pro gradu -tutkielman tarkoituksena oli selvittää eri sipulimateriaaleista uutettujen fenolisten
yhdisteiden elintarvikepatogeenien kasvua ehkäiseviä vaikutuksia ja siten yhdisteiden
potentiaalia toimia esimerkiksi elintarvikkeiden säilyvyyttä edistävinä komponentteina.
Sipulien polyfenolien antimikrobisuudesta on olemassa paljon tutkimustietoa, mutta tulosten
vertailu ja selkeiden johtopäätösten tekeminen niiden perusteella on melko haasteellista
vaihtelevien tutkimusmenetelmien vuoksi. Perinteisimmät antimikrobisuuskokeet pohjautuvat
mielenkiinnon kohteena olevien aineiden diffuusioon joko kiekosta tai kaivosta kiinteään
kasvatusalustaan, jolla tutkittavat mikrobit kasvavat: kiekon tai kaivon ympärille muodostuu
niin sanottu inhibitiokehä, jonka koko kertoo yhdisteen mahdollisesta antimikrobisuudesta.
Tässä tutkimuksessa gram-positiivisen Listeria monocytogenes -bakteerin, gram-negatiivisen
Salmonella infantis -bakteerin ja eukaryoottisen Candida albicans -hiivan kasvun
inhiboitumisen määrittämiseksi käytettiin nestekasvatusten sameuden automaattiseen,
säännölliseen mittaamiseen perustuvaa menetelmää, jonka avulla saatiin tietoa mikrobisolujen
kasvun muutoksista koko altistusajalta reaaliaikaisesti. Vastaavaa menetelmää ei ole juurikaan
käytetty aiemmin sipuliuutteiden antimikrobisuuden selvittämisessä.
5.1 Erilaiset mikrobit ovat osoittaneet vaihtelevaa resistenttiyttä
sipuliuutteille ja fenolisille yhdisteille
Gram-postiiviset bakteerit, erityisesti listeriat, ovat aiemmissa tutkimuksissa osoittaneet
huonoa vastustuskykyä sipulista valmistetuille polyfenolipitoisille raakauutteille (Rauha ym.
2000; Santas ym. 2010). Santas ryhmineen (2010) testasi hopea- ja keltasipulista uutettujen
polyfenolien antimikrobisia vaikutuksia useilla mikrobeilla ja totesi, että gram-negatiivisiin
bakteereihin uutteilla ei ollut kasvua ehkäisevää vaikutusta, mutta että uutteet inhiboivat lähes
kaikkia testattuja gram-positiivisia bakteereja. Heidän tutkimuksessaan gram-positiivinen L.
monocytogenes osoittautui kaikkein herkimmäksi kuoppalevykokeessa, jossa bakteerit
altistettiin agarin joukkoon lisätyille sipuliuutteille. Pro gradu -tutkimuksessa gram-
negatiivinen S. infantis osoittautui yllättäen hieman gram-positiivista L. monocytogenes -
bakteeria herkemmäksi useimmille eri sipulilajikkeista valmistetuille polyfenolipitoisille
raakauutteille. Ainoastaan salottisipuliuute ehkäisi tehokkaammin L. monocytogenes -
bakteerin kuin S. infantis -bakteerin kasvua.
44
Flavonoideihin kuuluva flavonoli kversetiini on sipulin runsain polyfenolinen yhdiste, joka
esiintyy sipulissa yleensä glykosidisessa muodossa, joko kversetiini-4’-glukosidina tai
kversetiini-3,4’-di-O-glukosidina (Bonaccorsi ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008). Tästä
johtuen pro gradu -tutkimuksessa testattiin sekä pelkän kversetiini-4’-glukosidin että
kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin yhdistelmän vaikutusta
elintarvikepatogeenien kasvuun. Kversetiini-4’-glukosidi tai kahden kversetiiniglykosidin
yhdistelmä ei käytännössä ehkäissyt kummankaan bakteerin kasvua tai havaittu kasvun
heikkeneminen oli vähäistä. Yksittäisillä polyfenolisilla yhdisteillä tai niiden johdannaisilla,
esimerkiksi juuri glykosideilla, on havaittu eri tutkimuksissa hyvin vaihtelevia antimikrobisia
ominaisuuksia, jotka riippuvat sekä yhdisteen että altistetun bakteerin ominaisuuksista. Gram-
positiiviset bakteerit ovat useissa tutkimuksissa osoittautuneet gram-negatiivisia bakteereita
herkemmiksi uutteiden lisäksi polyfenolisille puhdasaineille (Rauha ym. 2000; Taguri ym.
2004; Santas ym. 2010), mutta myös gram-positiivisten bakteerien resistenttiydessä
esimerkiksi flavonoideille on eroja (Xu & Lee 2001). Flavonoidiglykosidit ovat yleisesti
ottaen osoittaneet vain heikkoa antimikrobisuutta (Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000;
Xu & Lee 2001). Kversetiini-aglykonin ja sen isomeerin moriinin sen sijaan tiedetään olevan
antibakteerisia tiettyjä lajeja kohtaan (Rauha ym. 2000; Corrales ym. 2010; Santas ym. 2010).
Eukaryoottiset mikrobit, esimerkiksi hiiva C. albicans, ovat useissa tutkimuksissa osoittaneet
hyvää resistenssiä sipulista ja muista kasveista valmistetuille polyfenoliuutteille
kiekkodiffuusiokokeissa (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010). C. albicans -hiivan osalta tässä
tutkimuksessa saadut tulokset poikkeavat hieman aiemmista, sillä hiivasolujen kasvu
inhiboitui erittäin tehokkaasti, kun ne altistettiin sipuliuutteille. Lisäksi C. albicans -hiivan
kasvun estävät uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet olivat pieniä verrattuna bakteerien kasvun
inhiboitumiseen vaadittaviin pitoisuuksiin. Puhdasaineiden osalta C. albicans -hiivalla
tehtyjen altistuskokeiden tulokset puolestaan tukivat aiemmin tehtyjä havaintoja. Kversetiini-
4’-glukosidi ja kversetiiniglykosidien yhdistelmä eivät estäneet C. albicans -hiivan kasvua,
joskin solujen kasvun alkuvaihe hidastui huomattavasti kontrollisoluihin verrattuna.
Aiemmissakaan tutkimuksissa kversetiinillä tai sen glykosideilla ei ole saatu hidastettua C.
albicans -hiivan kasvua (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010).
45
5.2 Sipulien polyfenoliprofiilit vaihtelevat ja vaikuttavat sipuliuutteiden
antimikrobiseen aktiivisuuteen
Sipulista on tunnistettu kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin ohella
pääasiassa viittä muuta flavonolia: kversetiini-3,7,4’-triglukosidia, kversetiini-7,4’-
diklukosidia, isoramnetiini-3,4’-glukosidia, kversetiini-3’-glukosidia ja isoramnetiini-4’-
glukosidia (Bonaccorsi ym. 2008; Soininen ym. 2012). Lisäksi sipulissa on havaittu pieniä
määriä muita kversetiini- ja isoramnetiinijohdannaisia, kemferolia ja myrisetiiniä sekä niiden
johdannaisia, dihydroflavonoli taksifoliinin johdannaisia sekä lähinnä punasipulissa esiintyviä
antosyaaneja (Slimestad ym. 2007). Polyhydroksyloidut flavonoidit, kuten kversetiini,
kemferoli ja myrisetiini, ovat osoittaneet antimikrobista aktiivisuutta (Xu & Lee 2001).
Sipulilajikkeissa, jotka on jalostettu pitkäaikaiseen säilytykseen, näyttäisi olevan erityisen
paljon kversetiini-3,7,4’-triglukosidia ja isoramnetiini-3,4’-diglukosidia (Bonaccorsi ym.
2008). Tämä saattaisi viitata siihen, että kversetiini-3,7,3’-triglukosidi ja isoramnetiini-3,4’-
diglukosidi liittyisivät sipulin säilyvyyteen ja siten myös mahdollisesti osallistuisivat mikro-
organismien kasvun estymiseen.
Allium cepa -lajikkeiden kemialliset koostumukset tunnetusti poikkeavat merkittävästi
toisistaan esimerkiksi juuri kokonaisfenolipitoisuuden ja kversetiinin eri muotojen osalta
(Yang ym. 2004; Bonaccorsi ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008). Geenien osuuden
sipulin polyfenoliprofiilin määräytymisessä uskotaan olevan merkittävä, mutta myös
ympäristöllä, esimerkiksi kasvupaikalla ja sillä vallitsevalla ilmastolla, sipulin
kypsyysasteella, sadonkorjuuajankohdalla ja jopa siementen alkuperällä uskotaan olevan
vaikutusta (Yang ym. 2004; Rodríguez Galdón ym. 2008). Ennen pro gradu -työtä tehdyissä
koeuutoissa havaittiin, että sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet olivat hyvinkin
poikkeavia verrattuna antimikrobisuuskokeissa käytettyihin lopullisiin uutteisiin; erot
saattavat selittyä koeuuttojen sipulimateriaalin ostoajankohdalla, alkuperämailla ja
varastointiajoilla.
Pro gradu -työssä punasipuli osoittautui tehokkaimmaksi bakteerien kasvun ehkäisijäksi,
keltasipuli toiseksi tehokkaimmaksi. Punasipuli sisältää paljon flavonoideja ja niiden
glykosideja verrattuna moniin muihin Allium cepa -sipuleihin (Yang ym. 2004; Slimestad ym.
2007; Bonaccorsi ym. 2008). Joissakin tutkimuksissa punasipulin on todettu sisältävän
moninkertaisesti muun muassa myrisetiiniä verrattuna keltasipuliin (Franke ym. 2004;
46
Slimestad ym. 2007). Myrisetiinillä on saatu ehkäistyä sekä gram-positiivisten että gram-
negatiivisten bakteerien kasvua (Xu & Lee 2001). Lisäksi punasipulissa on muista
sipulilajikkeista poiketen muun muassa proantosyanidiineja, joiden tiedetään olevan
antibakteerisia ja antifungaalisia (Scalbert 1991; Bahorun ym. 2004; Slimestad ym. 2007;
Kylli ym. 2011; Patel ym. 2011). Keltasipulilajikkeiden kokonaisfenolipitoisuudet ovat usein
suurempia kuin esimerkiksi hopeasipulilajikkeiden, mutta pienempiä kuin salottisipulin ja
punasipulin (Yang ym. 2004; Santas ym. 2010). Flavonoideja tietyissä keltasipulilajikkeissa
on havaittu olevan kokonaisuudessaan salottisipulia enemmän (Yang ym. 2004).
Keltasipulilajikkeiden sijoittuminen lajikkeiden välisissä kokonaisfenoli- ja
flavonoidipitoisuusvertailussa on kuitenkin hyvin vaihtelevaa, sillä keltasipulilajikkeiden
polyfenoliprofiileissa on eroja (Yang ym. 2004).
Myös antifungaalisuuskokeissa punasipuliuute ehkäisi varmimmin hiivasolujen kasvua, mutta
toisin kuin bakteerikokeissa, salottisipuli vaikutti hiivakokeissa antimikrobiselta teholtaan
keltasipulia varmemmalta myös pienimmällä testatulla kokonaisfenolipitoisuudella.
Salottisipulista puristetun raakamehun on jo aikaisemmin todettu olevan antifungaalista (Zarei
Mahmoudabadi & Gharib Nasery 2009). C. albicans on eukaryootti, jonka soluseinän rakenne
poikkeaa bakteerisolujen soluseinän rakenteesta. Näistä syistä lienee luonnollista, että samat
fytokemikaalit vaikuttavat bakteereihin ja hiivoihin eri tavoin. Yleisesti ottaen vaikuttaisi
siltä, että kasviuutteiden polyfenolien kvalitatiiviset ominaisuudet ja esimerkiksi
molekyylikoot ovat antimikrobisuustehon kannalta merkittävämpiä kuin
kokonaisfenolipitoisuus (Apostolidis ym. 2008; Patel ym. 2011). Pro gradu -työssä hiivan
kasvun inhiboitumiseen tarvittavat polyfenolipitoisuudet olivat huomattavasti pienempiä kuin
bakteereiden kasvun estävät vähimmäiskonsentraatiot. Tämä voisi viitata siihen, että
tutkimuksessa käytettyjen etyyliasetaattiuutteiden polyfenoliprofiilit suosivat vallitsevissa
koeolosuhteissa erityisen hyvin juuri hiivojen kasvun kontrollointia. Viinirypäleistä uutetuilla
polyfenoleilla tehtyjen antifungaalisuuskokeiden yhteydessä on pohdittu esimerkiksi tiettyjen
torjunta-ainejäämien mahdollista tehostavaa osuutta kasviuutteiden sienten kasvua
ehkäisevään aktiivisuuteen, jota ei antibakteerisuuskokeissa havaittu (Corrales ym. 2010).
Hiivasoluilla voisikin olla kiinnostavaa testata esimerkiksi luomusipulista ja tehotuotetusta
sipulista valmistettujen kuoriuutteiden välisiä inhibitorisia bioaktiivisuuseroja.
Salottisipulin on lajikevertailuissa todettu sisältävän runsaimmin fenolisia yhdisteitä (Yang
ym. 2004) ja sipulin pääasiallisia flavonoideja (Bonaccorsi ym. 2008). Banaanisalottisipuli
kuuluu nykyluokittelun mukaan salottisipulin tapaan Allium cepa -lajin ryvässipulien
47
(Aggregatum) ryhmään (Voipio 2001; Nemeth & Piskula 2007; Thompson & Morgan,
http://www.thompson-morgan.com/vegetables/vegetable-seeds/onion-and-leek-seeds/shallot-
banana/376TM), mutta banaanisalottisipulista ja sen sekundaarimetaboliiteista on saatavana
vain vähän spesifistä tutkimustietoa. Pro gradu -työssä banaanisalottisipulista ja
salottisipulista kokonaisfenolipitoisuusmittauksissa ja antimikrobisuuskokeissa saadut
tulokset osoittavat, että banaanisalottisipuli sekä sisältää enemmän fenoliyhdisteitä että on
tehokkaampi gram-negatiivisen S. infantis -bakteerin kasvun ehkäisyssä kuin ”perinteinen”
salottisipuli. Banaanisalottisipuli ja salottisipuli ehkäisivät kuitenkin aavistuksen puna- ja
keltasipulia heikommin bakteerien kasvua. Koska salottisipuli sisältää aiempien tutkimusten
mukaan muihin sipulilajikkeisiin verrattuna runsaasti kversetiini-4’-glukosidia ja kversetiini-
3,4’-di-O-glukosidia, sipulin pääasiallisia flavonoideja, voidaan ehkä päätellä, että ainakaan
nämä kaksi kversetiinin glykosidimuotoa eivät ole tärkeimpiä sipuliuutteiden fenolisten
yhdisteiden antibakteerisuutta selittäviä komponentteja. Myrisetiinin, antosyaanien ja
proantosyanidiinien mahdollinen osallisuus erityisesti punasipuliuutteen hyvään
antimikrobiseen tehoon herättää mielenkiintoa.
5.3 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuuden mekanismit
Fenolisten yhdisteiden ja flavonoidien antimikrobisuuden taustalla vaikuttavista
mekanismeista on esitetty lukuisia teorioita. On selvää, että mikrobi- ja muiden solujen
herkkyys fenolisille yhdisteille riippuu sekä yhdisteen että solun ominaisuuksista, ja jo pienet
erot yhdisteiden rakenteessa saattavat vaikuttaa niiden aktiivisuuteen (Cowan 1999; Spencer
ym. 2004; Taguri ym. 2004). Monien tutkimusten yhteydessä on todettu, että flavonoidin
fenoliryhmän hydroksylaatioaste ja hydroksyyliryhmien sijainti näyttäisivät melko
johdonmukaisesti liittyvän flavonoidien kykyyn ehkäistä mikrobien kasvua: mitä
hydroksyloituneempi yhdiste on, sitä tehokkaammin se toimii antimikrobisena komponenttina
(Nishino ym. 1987; Cowan ym. 1999; Xu & Lee 2001). Polyfenolin hydrofobisuus puolestaan
voi helpottaa proteiini-polyfenoli-kompleksien muodostumista ja fenolien antimikrobista
aktiivisuutta mikrobin solukalvolla (Richard ym. 2006; Apostolidis ym. 2008; Yu ym. 2011).
Kversetiinillä C-renkaan kaksoissidos saattaa lisäksi olla tärkeä yhdisteen antibakteeriselle
aktiivisuudelle (Xu & Lee 2001). Isoramnetiinin esimerkiksi NADPH-oksidaasi-entsyymin
toimintaa inhiboiva aktiivisuus on yhdistetty yhdisteen metyyliryhmään (Steffen ym. 2008),
joten metylaatio saattaa vaikuttaa myös molekyylin muihin bioaktiivisuuksiin, kuten
antimikrobisuuteen. Flavonoidien bioaktiiviset muodot voivat myös olla absorption
yhteydessä muodostuneita metaboliitteja tai konjugaatteja, jotka poikkeavat kasveissa
48
esiintyvistä luonnollisista muodoista, myös toiminnaltaan (Spencer ym. 2004). Esimerkiksi
kversetiinin ja muiden flavonoidien hapettumistuotteet ovat osoittaneet antimikrobisia
ominaisuuksia, mikä voi olla seurausta muun muassa toksisten kinonimuotojen
muodostumisesta (Cowan 1999; Spencer ym. 2004; Ramos ym. 2006). Flavonoidien ja
flavan-3-olijohdannaisten mahdollisia vaikutuskohteita mikrobisoluissa ovat entsyymit,
solukalvo, soluseinän ja soluliman proteiinit ja DNA (Nishino ym. 1987; Cowan 1999; Xu &
Lee 2001; Spencer ym. 2004; Apostolidis ym. 2008; Patel ym. 2011). Flavonoidit ja niiden
johdannaiset voivat mahdollisesti vaikuttaa solunsisäisiin signaalireitteihin, proteiinien ja
soluseinän synteesiin ja hajotukseen sekä aiheuttaa raudanpuutosta ja reagoida solun
komponenttien tioliryhmien kanssa (Scalbert 1991; Cowan 1999; Spencer ym. 2004; Kylli
ym. 2011).
5.4 Pro gradu -tutkimuksen menetelmät ja niiden haasteet
Tulkittaessa pro gradu -työn tuloksia ja vertailtaessa niitä aiempiin tutkimustuloksiin, on
otettava huomioon, että kasvatusolosuhteilla, joissa tutkittavat mikrobit altistetaan
raakauutteille ja puhdasaineille, voi olla huomattava merkitys saatuihin
antimikrobisuustuloksiin (Taguri ym. 2004; Apostolidis ym. 2008; Santas ym. 2010; Kyung
2011). Flavonoidimetaboliittien solutason vaikutukset ovat lopulta riippuvaisia solukontaktin
laajuudesta, ja kasvumediumin komponentit, esimerkiksi transitiometallit, voivat osallistua
muun muassa kversetiinin kaltaisten dihydroksyloitujen flavonoidien metaboloitumiseen ja
siten muokata niiden aktiivisuutta ja pienentää vaikuttavaa konsentraatiota (Spencer ym.
2004). Tässä tutkimuksessa mikrobit altistettiin sipulista uutetuille polyfenoleille ja
puhdasaineille nestekasvatuksessa jatkuvassa tai säännöllisessä ravistelussa, jolloin solujen
kontaktin tutkittavien yhdisteiden kanssa voisi olettaa olevan hyvä. Tutkimuksessa valmistetut
raakauutteet osoittivatkin hyvää antimikrobista tehoa sekä gram-positiivisia ja gram-
negatiivisia bakteereita että hiivasoluja vastaan. Bioscreen C -laite ja vastaavat
turbidometriaan perustuvat laitteet mittavat kasvatusliemestä sekä elävät että kuolleet solut
(Raynolds & Farinha 2005). Esimerkiksi punasipuliuutealtistuksessa havaittu yli sadan
prosentin inhibitio voi selittyä S. infantis -solujen uutteen sisältämien polyfenolien
aiheuttamalla aggregoitumisella (Cushnie & Lamb 2005), jonka seurauksena kasvatusliemen
sameus on vähentynyt. Myös solujen hajotessa kasvatusliemen absorbanssi voi muuttua (Prior
ym. 1975). Sipulin flavonoidit ovat pigmenttejä (Slimestad ym. 2007), ja värillisten
sipuliuutteiden aiheuttaman tausta-absorbanssin vuoksi koe- ja kontrollikuopista saadut
mittaustulokset eivät olleet suoraan verrannollisia keskenään, mikä vaikeutti tulosten
49
tulkintaa. Pro gradu -työssä käytetyllä uuttomenetelmällä saatiin valmistettua kerralla vain 1-2
ml uutetta, jonka polyfenolipitoisuus oli riittävän suuri antimikrobisuuskokeisiin. Tästä syystä
uuttoja oli tarpeen suorittaa useita. Eri uuttokerroilla valmistettujen uutteiden fysikaaliset
ominaisuudet vaihtelivat jonkin verran, ja siksi myös eri mittauskerroilta saatujen
antimikrobisuuskokeiden tuloksia oli haasteellista verrata. Valkosipuli- ja purjouutteet
vaahtosivat tai sakkasivat kasvatusliemessä, joko heti reagoidessaan liemen kanssa tai
myöhemmin mittauksen aikana, joten luotettavien mittaustulosten saaminen oli mahdotonta.
Valkosipuli- ja purjouutteiden reaktiot kasvatusliemessä saattavat johtua esimerkiksi
sipulimateriaalin sisältämistä saponiineista tai uutteissa epäpuhtautena olevista proteiineista.
Sipulimateriaalista irtoaa uuton yhteydessä vettä ja sen mukana mahdollisesti myös
vesiliukoisia molekyylejä, esimerkiksi proteiineja. Denaturoituneet proteiinit voivat
muodostaa ravistelun seurauksena vaahtoa (Cooper & Kennedy 2010). Saponiinit ovat
tunnetusti vesiliuoksissa vaahtoavia yhdisteitä (Khokhar & Apenten 2009).
Uuttomenetelmän valinta on polyfenolitutkimuksessa tärkeää, jos yhdisteiden määrä ja
aktiivisuus halutaan selvittää mahdollisimman tarkkaan (Santas ym. 2008). Uutettaessa kasvin
polyfenoleja on otettava huomioon yhdisteiden laaja kirjo kasvissa: kunkin fenoliyhdisteen
liukoisuus riippuu sen kemiallisesta muodosta ja vuorovaikutussuhteista esimerkiksi
makromolekyylien kanssa (Garcia-Salas ym. 2010). Myös kasvisolukko, josta yhdisteet
halutaan eristää, vaikuttaa siihen, millaisia liuottimia tai niiden yhdistelmiä kannattaa käyttää
(Pekić ym. 1998). Polyfenolien uutossa käytettyjä poolittomia orgaanisia liuottimia ovat
muun muassa metanoli, etanoli, propanoli, asetoni ja etyyliasetaatti, joita voidaan käyttää
myös seoksina toistensa tai voimakkaasti poolisen veden kanssa (Garcia-Salas ym. 2010).
Yleisellä tasolla orgaanisten liuottimien käytön huono puoli on menetelmän vaatima pitkä
käsittelyaika, jonka seurauksena uutetut polyfenolit voivat alkaa hajota (Garcia-Salas ym.
2010). Pro gradu -työssä käytettiin 60 minuutin uuttoaikaa, ja uutteet altistuivat vielä uuton
jälkeenkin valolle ja korkeille lämpötiloille, jotka voivat vaikuttaa uutteen koostumukseen.
Uuttomenetelmien monimuotoisuus tekee kirjallisuudessa raportoitujen kasviuutteista
mitattujen kokonaisfenolipitoisuuksien ja yksittäisten polyfenolien määrien vertailun
haastavaksi: käytetyn liuottimen ja käsittelyaikojen lisäksi myös esimerkiksi kasvimateriaali
ja sen käsittelytapa ennen uuttoa vaihtelevat, mikä vaikuttaa muun muassa yksikköön, jolla
kokonaisfenolipitoisuus ilmaistaan.
Mielenkiinnon kohteesta riippuen käytettävän liuottimen poolisuuden on siis oltava sellainen,
että se liuottaa joko mahdollisimman monen muotoisia polyfenoleja tai spesifisesti vain
50
tiettyjä fenolisia yhdisteitä. Etyyliasetaatti on monessa yhteydessä osoittautunut hyväksi
liuottimeksi uutettaessa polyfenoleja, erityisesti flavonoideja (Rauha ym. 2000; Singh ym.
2009; Santas ym. 2010). Etyyliasetaatti sopii siis hyvin myös sipulin polyfenolien
uuttamiseen, sillä flavonoidit ovat sipulin runsaimpia polyfenoleja (Slimestad ym. 2007). Pro
gradu -työtä edeltävässä uuttomenetelmien optimointivaiheessa vertailtiin eri liuottimien (100
% MeOH, 70% MeOH, 99,5% EtOAc) vaikutusta uutteiden kokonaisfenolipitoisuuteen ja
todettiin, että 99,5-prosenttisella etyyliasetaatilla saatiin keltasipuliuutteisiin suurimmat
kokonaisfenolipitoisuudet. Myös sipuliuutteiden antimikrobisuuden tiedetään aiempien
tutkimusten perusteella vaihtelevan riippuen uutossa käytetystä liuottimesta (Kyung 2011).
Heikosti polaarinen etyyliasetaatti uuttaa kasvimateriaalista tehokkaasti flavonoidien
hydrofobisia aglykonisia muotoja, jotka tunnetusti ovat antimikrobisuudeltaan glykosideja
parempia (Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). Tutkittaessa
nimenomaan polyfenolien antimikrobisia ominaisuuksia etyyliasetaattiuuton ongelma on, että
etyyliasetaatilla sipulista irtoaa myös muun muassa tiosulfinaattien transformaatiotuotteita,
joiden tiedetään olevan antimikrobisia (Kyung 2011).
5.5 Sipuliuutteiden polyfenolit ja muut antimikrobiset komponentit
toimivat synergistisesti
Antimikrobisuusnäkökulmasta tarkasteltuna etyyliasetaatti kuitenkin vaikuttaa hyvältä
liuotinvalinnalta, sillä etyyliasetaattiuutteiden teho mikrobien torjunnassa osoittautui erittäin
hyväksi. 99,5-prosenttisen etyyliasetaatin kaltaisella epäspesifisellä liuottimella
kasvimateriaalista valmistetut raakauutteet ovat aina useiden yhdisteryhmien seoksia, joissa
molekyylit saattavat toimia synergistisesti, vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Monissa
tutkimuksissa on havaittu, että yhdistämällä fenolisia yhdisteitä keskenään tai muiden
antimikrobisten kemikaalien kanssa, saadaan mikrobien kasvun inhiboitumista usein
tehostettua (Cowan 1999; Arima ym. 2002; Taguri ym. 2004; Ramos ym. 2006). Myös
elintarvikesäilöntäainesovelluksissa eri yhdisteiden seokset toimivat todennäköisesti
tehokkaammin kuin esimerkiksi yksittäiset polyfenolit (Apostolidis ym. 2008; Devi ym.
2008). Esimerkiksi L. monocytogenes -bakteerin kasvun inhiboitumista on saatu tehostettua
yhdistämällä oreganosta ja karpalosta uutettuja fenolisia yhdisteitä natriumlaktaattiin
(Apostolidis ym. 2008). Pro gradu -työn yhteydessä saadut tulokset vahvistavat aiempien
tutkimusten tuloksia puhtaiden kversetiiniglykosidien heikosta antimikrobisesta tehosta
(Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). C. albicans -solujen kasvukäyrät
51
osoittavat, että hiivasolujen kasvun alkuvaihe hidastuu kversetiiniglykosidialtistuksessa,
mutta kasvu normalisoituu vuorokauden kuluttua lähes kontrollisolujen kasvun tasolle. Tätä
ilmiötä saattaa selittää esimerkiksi se, että mikro-organismit voivat kyetä metaboloimaan
flavonoidijohdannaisia (Spencer ym. 2004). Bakteerisolujen kasvuun puhdasaineilla ei ollut
mainittavaa vaikutusta. Kokonaisuudessaan tämä viittaa siihen, että mitä useammalle
antimikrobiselle komponentille solut altistetaan samanaikaisesti, sitä huonommin solujen
puolustusmekanismit kykenevät torjumaan yhdisteiden toksisia vaikutuksia. Lisäksi tässä
tutkimuksessa havaittu kversetiiniglykosidien huono antimikrobinen teho voi olla seurausta
yhdisteiden välisten synergististen reaktioiden puutteesta tai molekyylien tehon esimerkiksi
hapettumisesta johtuvasta heikkenemisestä vallitsevissa olosuhteissa (Spencer ym. 2004).
5.6 Tutkimuksen sovellusmahdollisuudet
Elintarviketeollisuus tuottaa ohellaan monenlaista kasviperäistä jätettä, jonka sisältämien
bioaktiivisten yhdisteiden hyödyntäminen edelleen muissa teollisuuden sovelluksissa tarjoaa
monia mahdollisuuksia. Sipulin teollisesta käsittelystä yli jäävä kuori- ja muu jätemateriaali
sisältää runsaasti esimerkiksi ravintokuitua, hivenaineita, terveysvaikutteisia rikkiyhdisteitä ja
myös polyfenoleja (Benítez ym. 2011). Sipulin uloin, kuiva kuori ja välittömästi sen alla
olevat mehevät kerrokset ovat erittäin hyviä fenolisten yhdisteiden lähteitä (Benítez ym.
2011). Pro gradu -työssä sipulin polyfenoliuutteilla saatuja hyviä antimikrobisuustuloksia
voitaisiin siis edelleen parantaa käyttämällä uuttoon sipulin sisimpien osien sijasta ulompia
kerroksia.
Sipulista valmistettujen raakauutteiden elintarvikesovelluksia ajatellen on otettava huomioon
uutteiden haju ja maku, jotka johtuvat luultavasti sipulin ominaisen aromin aikaan saavista S-
alk(en)yyli-L-kysteiini-S-oksidien hajoamistuotteista (Griffiths ym. 2002; Benítez ym. 2011).
Elintarvikkeissa, esimerkiksi joissakin lihavalmisteissa, joiden maustamiseen sipuli sopii,
sipuliuutteiden käyttäminen mikrobiperäisen pilaantumisen ehkäiseminen voisi olla
mahdollista. Sipulista ja valkosipulista valmistettujen jauheiden on todettu ehkäisevän
enterobakteerien kasvua sianlihassa (Park ym. 2008). Toisaalta ainakin tiosulfinaattien osalta
on havaittu, että molekyylien reaktiivisuus elintarvikkeen komponenttien kanssa rajoittaa
näiden yhdisteiden käyttöä elintarvikesäilöntäaineena (Kyung 2011). Tämä saattaa muodostaa
ongelman myös polyfenolien kohdalla, sillä esimerkiksi juuri liharuokien sisältämä proliini-
aminohappo ja sen prekursorit voivat mitätöidä polyfenolien antimikrobisen tehon
(Apostolidis ym. 2008). Lisäksi polyfenolin liukoisuusominaisuudet vaikuttanevat sen
52
käyttökelpoisuuteen elintarvikkeissa. Sipuliuutteiden säilöntäainesovellusten
jatkotutkimuksissa onkin siis olennaista testata uutteiden tehoa ja käyttäytymistä sekä
mikrobien kasvun inhiboitumiseen riittäviä polyfenolikonsentraatioita nestemäisten
mikrobikasvatusten lisäksi myös erilaisissa elintarvikkeissa ja tyypillisissä elintarvikkeiden
säilytyslämpötiloissa.
Pro gradu -tutkimuksen tulokset osoittavat, että sipulin terveysvaikutteisiksi tiedetyillä
polyfenolisilla yhdisteillä on myös elintarvikepatogeenien kasvua ehkäisevää aktiivisuutta.
Tämän työn tulokset vahvistavat aiempia tutkimustuloksia, joiden perusteella sipuliuutteen
polyfenolisten yhdisteiden synergistiset, mikrobien kasvua inhiboivat vaikutukset ovat
huomattavasti puhtaita sipulin polyfenoleita parempia. Tulokset kannustavat kehittämään
sipulin teollisen käsittelyn seurauksena muodostuvien kasvimateriaalin sivuvirtojen
hyödyntämistä paitsi lääke- ja kosmetiikkateollisuuden myös elintarviketeollisuuden
sovelluksissa.
53
LÄHTEET
Adão CR, da Silva BP & Parente JP, 2011. A new steroidal saponin with antiinflammatory and
antiulcerogenic properties from the bulbs of Allium ampeloprasum var. porrum. Fitoterapia 82:
1175-1180
Agarwal KC, 1996. Therapeutic actions of garlic constituents. Med Res Rev 16: 111-124
Ahmad I & Beg AZ, 2001. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants
against multi-drug resistant human pathogens. J Ethnopharmacol 74: 113
Alcaráz LE, Blanco SE, Puig ON, Tomás F & Ferretti FH 2000. Antibacterial activity of flavonoids
against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. J Theor Biol 205: 231-240
Apostolidis E, Kwon Y-I & Shetty K, 2008. Inhibition of Listeria monocytogenes by oregano,
cranberry and sodium lactate combination in broth and cooked ground beef systems and likely
mode of action through proline metabolism. Int J Food Microbiol 128: 317-324
Arima H, Ashida H & Danno G, 2002. Rutin-enhanced antibacterial activities of flavonoids against
Bacillus cereus and Salmonella enteridis. Biosci Biotech Biochem 66: 1009-1014
Bahorun T, Luximon-Ramma A, Crozier A & Aruoma OI, 2004. Total phenol, flavonoid,
proanthocyanidin and vitamin C levels and antioxidant activities of Mauritanian vegetables. J
Sci Food Agric 84: 1553-1561
Barceloux DG, 2009. Potatoes, tomatoes, and solanine toxicity (Solanum tuberosum L., Solanum
lycopersicum L.). Medical toxicology of natural substances: foods, fungi, medicinal herbs, toxic
plants, and venomous animals, 1157 s. John Wiley & Sons Inc., Hoboken, USA
Bassman JH, 2004. Ecosystem consequences of enhanced solar ultraviolet radiation: secondary plant
metabolites as mediators of multiple trophic interactions in terrestrial plant communities.
Photochem Photobiol 79: 382-398
Benítez V, Mollá E, Martín-Cabrejas MA, Aguilera Y, López-Andréu FJ, Cools K, Terry LA &
Esteban RM, 2011. Characterization of industrial onion wastes (Allium cepa L.): Dietary fibre
and bioactive compounds. Plant Foods Hum Nutr 66: 48-57
Benkeblia N, Dahmouni S, Onodera S & Shiomi N, 2005. Antimicrobial activity of phenolic
compound extracts of various onions (Allium cepa L.) cultivars and garlic (Allium sativum L.). J
Food Technol 3: 30-34
Bernard FX, Sablé S, Cameron B, Provost J, Desnottes JF, Crouzet J & Blanche F, 1997. Glycosylated
flavones as selective inhibitors of topoisomerase IV. Antimicrob Agents Chemother 41: 992-
998
Beuchat LR, 1996. Listeria monocytogenes: incidence on vegetables. Food Control 7: 223-228
Bischoff SC, 2008. Quercetin: potentials in the prevention and therapy of disease. Curr Opin Clin Nutr
Metab Care 11: 733–740
Bonaccorsi P, Caristi C, Gargiulli C & Leuzzi U, 2008. Flavonol glucosides in Allium species: A
comparative study by means of HPLC-DAD-ESI-MS-MS. Food Chem 107: 1668-1673
54
Bonawitz ND, Soltau WL, Blatchley MR, Powers BL, Hurlock AK, Seals LA, Weng J-K, Stout J &
Chapple C 2012. REF4 and RFR1, subunits of the transcriptional coregulatory complex
mediator, are required for phenylpropanoid homeostasis in Arabidopsis. J Biol Chem 287:
5434–5445
Bornet FRJ, Brounsl F, Tashiro Y & Duvillier V, 2002. Nutritional aspects of short-chain
fructooligosaccharides: natural occurrence, chemistry, physiology and health implications. Dig
Liver Dis 34: S111-S120
Buck JD , Bubucis PM & Combs TJ, 1977. Occurrence of human-associated yeasts in bivalve shellfish
from Long Island Sound. Appl Environ Microbiol 33: 370-377
Buck JD & Bubucis PM, 1978. Membrane filter procedure for enumeration of Candida albicans in
natural waters. Appl Environ Microbiol 35: 237-242
Bugg TDH, Braddick D, Dowson CG & Roper DI 2011. Bacterial cell wall assembly: still an
attractive antibacterial target. Trends Biotechnol 29: 167-173
Casella S, Leonardi M, Melai B, Fratini F & Pistelli L, 2012. The role of diallyl sulfides and dipropyl
sulfides in the in vitro antimicrobial activity of the essential oil of garlic, Allium sativum L., and
leek, Allium porrum L. . Phytother Res DOI: 10.1002/ptr.4725
Cerdá B, Espín JC, Parra S, Martínez P & Tomás-Barberán FA, 2004. The potent in vitro antioxidant
ellagitannins from pomegranate juice are metabolized into bioavailable but poor antioxidant
hydroxyl-6H-dibenzopyran-6-one derivatives by the colonic microflora of healthy humans. Eur
J Nutr 43: 205-220
Chabot S, Bel-Rhild R, Chênevert R & Piché Y, 1992. Hyphal growth promotion in vitro of the VA
mycorrhizal fungus, Giaspora margarita Becker & Hall, by the activity of structurally specific
flavonoid compounds under CO2-enriched conditions. New Phytol 122: 461-467
Chanet A, Milenkovic D, Manach C, Mazur A & Morand C, 2012.Citrus flavanones: what is their role
in cardiovascular protection? J Agric Food Chem DOI: 10.1021/jf300669s
Chattaway FW, Holmes MR & Barlow AJE, 1967.Cell Wall Composition of the mycelial and
blastospore forms of Candida albicans. J Gen Microbiol 51: 367-376
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012a: Simple search: Quercetin:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444051.html?rid=d91fc4f1-fac3-4f7e-adc8-
61fc76d8e5bb
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012b: Simple search: Kaempferol:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444395.html?rid=a5b44378-a20b-42f2-8a71-
d75ca2a22b12
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012c: Simple search: Isorhamnetin:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444973.html?rid=0b4fc8c6-811c-40a5-933e-
db4946706124
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012d: Simple search: Stilbene:
http://www.chemspider.com/Search.aspx?rid=36b67ba0-4520-4dad-ab6a-1565f8d501b4
55
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012e: Simple search: Salicylic acid:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.331.html?rid=0d9f0a13-d6db-4e04-9f80-
b1d7bedf9564
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012f: Simple search: Coniferol:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.1266063.html?rid=70a2b6df-fcc0-43f2-8c2f-
d800f7da3a08
ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012g: Simple search: Isoflavone:
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.65255.html?rid=b625df36-5b0f-48fc-a293-
ccdf0f8bb60e
Chung D-M, Chung Y-C, Maeng PJ & Chun H-K, 2011.Regioselective deglycosylation of onion
quercetin glucosides by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Lett 33: 783-786
Cooper A & Kennedy MW, 2010. Biofoams and natural protein surfactants. Biophys Chem 151: 96-
104
Corrales M, Fernandez A, Vizoso Pinto MG, Butz P, Franz CMAP, Schuele E & Tauscher B, 2010.
Characterization of phenolic content, in vitro biological activity, and pesticide loads of extracts
from white grape skins from organic and conventional cultivars. Food Chem Toxicol 48: 3471-
3476
Cowan MM, 1999. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 12: 564-582
Cruickshank JG & Humprey TJ, 1987. The carrier food-handler and non-typhoid salmonellosis.
Epidem Infect 98: 223-230
Cushnie TPT & Lamb AJ, 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents 26:
343-356
D’Aoust J-Y, 1991. Pathogenicity of foodborne Salmonella. Int J of Food Microbiol 12: 17-40
D’Aoust J-Y, 1994. Salmonella and the international food trade. Int J of Food Microbiol 24: 11-31
Dauwe R, Morreel K, Goeminne G, Gielen B, Rohde A, Van Beeumen J, Ralph J, Boude A-M, Kopka
J, Rochange SF, Halpin C, Messens E & Boerjan W, 2007.Molecular phenotyping of lignin-
modified tobacco reveals associated changes in cell-wall metabolism, primary metabolism,
stress metabolism and photorespiration. Plant J 52: 263-285
Del Rio D, Rodriguez A, Spencer JPE, Togolini M, Borges G & Crozier A, 2012. Dietary
(poly)phenolics in human health: structures, bioavailability and evidence of protective effects
against chronic diseases. Antioxid Redow Signal DOI: 10.1089/ars.2012.4581
Devi KP, Suganthy N, Kesika P & Pandian SK, 2008. Bioprotective properties of seaweeds: In vitro
evaluation of antioxidant activity and antimicrobial activity against food borne bacteria in
relation to polyphenolic content. BMC Complement Altern Med 8: 38
Dixon RA & Paiva NL, 1995. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell 7: 1085-1097
Evensen NA & Braun PC, 2009. The effects of tea polyphenols on Candida albicans: inhibition of
biofilm formation and proteasome inactivation. Can J Microbiol 55: 1033-1039
Evira, 2009. Lisäaineopas. Eviran julkaisuja 4/2009, 78 s. Multiprint Oy, Helsinki
56
Fleet GH, 2007. Yeasts in foods and beverages: impact on product quality and safety. Curr Opin
Biotech 18: 170-175
Franke AA, Custer LJ, Arakaki C & Murphy SP, 2004. Vitamin C and flavonoid levels of fruits and
vegetables consumed in Hawaii. J Food Compost Anal 17: 1-35
Franz E & van Bruggen AHC, 2008. Ecology of E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in the
primary vegetable production chain. Crit Rev Microbiol 34: 143-161
Fraser CM & Chapple C, 2011. The phenylpropanoid pathway in Arabidopsis. Arabidopsis Book DOI:
10.1199/tab.0152
Fukuoka T, Johnston DA, Winsolw CA, de Groot MJ, Burt C, Hitchcock CA & Filler SG, 2003.
Genetic basis for differential activities of fluconazole and voriconazole against Candida krusei.
Antimicrob Agents Chemother 47: 1213–1219
GalluzzoP, Martini C, Bulzomi P, Leone S, Bolli A, Pallottini V & Marino M, 2009. Quercetin-
induced apoptotic cascade in cancer cells: Antioxidant versus estrogen receptor α-dependent
mechanisms. Mol Nutr Food Res 53: 699-708
Gantet P & Memelink J, 2002. Transcription factors: tools to engineer the production of
pharmacologically active plant metabolites. Trends Pharmacol Sci 23: 563-568
García-Gimeno RM & Zurera-Cosano G, 1997. Determination of ready-to-eat vegetable salad shelf-
life. Int J Food Microbiol 36: 31-38
Garcia-Salas P, Morales-Soto, Segura-Carretero A & Fernández-Gutiérrez A, 2010. Phenolic-
compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules 15: 8813-8826
Giménez-Bastída JA, Larrosa M, González-Sarrías A , Tomás-Barberán F, Espín JC & García-Conesa
M-T, 2012. Intestinal ellagitannin metabolites ameliorate cytokine-induced inflammation and
associated molecular markers in human colon fibroblasts. J Agric Food Chem DOI:
10.1021/jf300290f
Gorris LGM & Smid EJ, 1998. Natural preservation systems for food application. VTT Symposium
177: Biotechnology in the food chain. New tools and applications for future foods, toim. Kaisa
Poutanen, 260 s. Oy Edita Ab, Espoo
Griffiths G, Trueman L, Crowther T, Thomas B & Smith B, 2002. Onion - a global benefit to health.
Phytother Res 16: 603-615
Grunert KG & Bredahl L, 1998. Future foods: consumers’ hopes and fears. VTT Symposium 177:
Biotechnology in the food chain. New tools and applications for future foods, toim. Kaisa
Poutanen, 260 s. Oy Edita Ab, Espoo
Halverson LJ & Stacey G, 1986. Signal exchange in plant-microbe interactions. Microbiol Rev 50:
193-225
Hasseltine CW & Wang HL, 1967. Traditional fermented foods. Biotechnol Bioeng 9: 275-288
Havsteen BH, 2002. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol Ther 96:
67-202
57
Herman & Weaver, 1999. The shikimate pathaway. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 473-
503
Hollman PC, Cassidy A, Comte B, Heinonen M, Richelle M, Richling E, Serafini M, Scalbert A, Sies
H & Vidry S 2012. The biological relevance of direct antioxidant effects of polyphenols for
cardiovascular health in humans is not established. J Nutr 141: 989S-1009S
Irlinger F & Mounier J, 2009. Microbial interactions in cheese: implications for cheese quality and
safety. Curr Opin Biotechnol 20: 142-148
Jadhav S, Bhave M & Palombo EA, 2012. Methods used for the detection and subtyping of Listeria
monocytogenes. J Microbiol Methods 88: 327-341
Jagtap UB & Bapat VA, 2010. Artocarpus: A review of its traditional uses, phytochemistry and
pharmacology. J Ethnopharmacol 129: 142-166
Jaime L, Martín-Cabrejas MA, Mollá E , López-Andréu FJ & Esteban RM, 2001. Effect of storage on
fructan and fructooligosaccharide of onion (Allium cepa L.). J Agric Food Chem 49: 982-988
Ju Z, Yuan Y, Liu C, Wang Y & Tian X, 1997. Dihydroflavonol reductase activity and anthocyanin
accumulation in ‘Delicious’, ‘Golden Delicious’ and ‘Indo’ apples. Sci Hortic 70: 31-43
Kanner J, Gorelik S, Roman S & Kohen R, 2012. Protection by polyphenols of postprandial human
plasma and low-density lipoprotein modification: the stomach as a bioreactor. J Agric Food
Chem DOI: 10.1021/jf300193g
Kaplan I, Halitschke R, Kessler A, Sardanelli S & Fenno RF, 2008. Constitutive and induced defenses
to herbivory in above- and belowground plant tissues. Ecology 89: 392–406
Khokhar S & Owusu Apenten RK, 2009. Antinutritional effects in food legumes and effects of
processing. The role of food, agriculture, forestry and fisheries in human nutrition, toim. Victor
Squires, 390 s. Eolss Publishers Company Limited, Oxford, Englanti
Kim J & Sudbery P, 2011. Candida albicans, a major human fungal pathogen. J Microbiol 49: 171-
177
Kodan A, Kudora H & Sakai F, 2002. A stilbene synthase from Japanese red pine (Pinus densiflora):
Implications for phytoalexin accumulation and down-regulation of flavonoid biosynthesis.
PNAS 99: 3335–3339
Koleva II, van Beek T, Soffers AEMF, Dusemund B & Rietjens IMCM, 2012. Alkaloids in the human
food chain – Natural occurrence and possible adverse effects. Mol Nutr Food Res 56: 30-52
Kwon Y-I, Apostolidis E, Labbe RG & Shetty K, 2007. Inhibition of Staphylococcus aureus by
phenolic phytochemicals of selected clonal herbs species of Lamiaceae family and likely mode
of action through proline oxidation. Food Biotechnol 21: 71-89
Kylli P, Nohynek L, Puupponen-Pimiä R, Westerlund-Wikström B, Leppänen T, Welling J, Moilanen
E & Heinonen M, 2011. Lingonberry (Vaccinium vitis-idaea) and European cranberry
(Vaccinium microcarpon) proanthocyanidins: Isolation, identification, and bioactivities. J Agric
Food Chem 59: 3373-3384
Kyung KH, 2011. Antimicrobial properties of allium species. Curr Opin Biotechnol 23: 1-6
58
Lanzotti V, 2006. The analysis of onion and garlic. J Cromatogr A 1112: 3-22
Lanzotti V, Barile E, Antignani V, Bonanomi G & Scala F, 2012. Antifungal saponins from bulbs of
white onion, Allium cepa L. var. Voghiera. Phytochemistry 78: 126-134
Lee J & Mitchell AE, 2011. Quercetin and isorhamnetin glycosides in onion (Allium cepa L.): Varietal
comparison, physical distribution, coproduct evaluation, and long-term storage stability. J Agric
Food Chem 59: 857-863
Li Q-Q, Zhou S-D, He X-J, Yu Y, Zhang Y-C & Wei X-Q, 2010. Phylogeny and biogeography of
Allium (Amaryllidaceae: Allieae) based on nuclear ribosomal internal transcribed spacer and
chloroplast rps16 sequences, focusing on the inclusion of species endemic to China. Ann Bot
106: 709-733
Li Y, Baldauf S, Lim E-K & Bowles DJ, 2001. Phylogenetic analysis of the UDP-glycosyltransferase
multigene family of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 276: 4338-4343
Lyytikäinen O, Siitonen A, Johansson T, Lukinmaa S, Mikkola J & Ruutu P, 2000a, Listerioosi
Suomessa. Duodecim 116: 2111-2118
Lyytikäinen O, Autio T, Maijala R, Ruutu P, Honkanen-Buzalski T, Miettinen M, Hatakka M,
Mikkola J, Anttila V-J, Johansson T, Rantala L, Aalto T, Korkeala H & Siitonen A, 2000b. An
outbreak of Listeria monocytogenes serotype 3a infections from butter in Finland. J Infect Dis
181: 1838-1841
Maisch T, Shimizu T, Isbary G, Heinlin J, Karrer S, Klämpfl TG, Li YF, Morfill G & Zimmermann
JL, 2012. Contact-free inactivation of Candida albicans biofilms by cold atmospheric air
plasma. Appl Environ Microbiol 78: 4242-4247
Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C & Jiménez L, 2004. Polyohneols: food sources and
bioavailability. Am J Clin Nutr 79: 727-747
Mandal SM, Chakraborty D & Dey S, 2010. Phenolic acids act as signaling molecules in plant-
microbe symbioses. Plant Signal Behav 5: 359-368
Martin HH, 1966. Biochemistry of bacterial cell walls. Annu Rev Biochem 35:457-484
Miean KH & Mohamed S, 2001. Flavonoid (myricetin, quercetin, kaempferol, luteolin, and apigenin)
content of edible tropical plants. J Agric Food Chem 49: 3106-3112
Millet A, Lamy E, Jonas D, Stintzing F, Mersch-Sundermann V & Merfort I, 2012. Fermentation
enhances the biological activity of Allium cepa bulb extracts. J Agric Food Chem 60: 2148-2156
Mori A, Nishino C, Enoki N & Tawata S, 1987. Antibacterial activity and mode of action of plant
flavonoids against Proteus vulgaris and Staphylococcus aureus. Phytochemistry 26: 2231-2234
Mulaudzi RB, Nidhala AR, Kulkarni MG & Van Staden J, 2012. Pharmacological properties and
protein binding capacity of phenolic extracts of some Venda medicinal plants used against
cough and fever. J Ethnopharmacol 143: 185-193
Murray EGD, 1955. A characterization of listeriosis in man and other animals. CMAJ 72: 99-103
NACMCF, National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods, 1991. The ecology
of Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiol 14: 185-246
59
Negro ym., 2012. Polyphenol compounds in artichoke plant tissues and varieties.J Food Sci 77: C244-
C252
Nemeth K & Piskula MK, 2007. Food content, processing, absorption and metabolism of onion
flavonoids. Crit Rev Food Sci Nutr 47: 397-409
Nishino C, Enoki N, Tawata S, Mori A & Kobayashi K, 1987. Antibacterial activity of flavonoids
against Staphylococcus epidermidis, a skin bacterium. Agric Biol Chem 51: 139-143
Ohemeng KA, Schwender CF, Fu KP & Barrett JF, 1992. DNA gyrase inhibitory and antibacterial
activity of some flavones (1). Bioorg Med Chem Lett 3: 225-230
Osbourn A, 1996. Saponins and plant defence - a soap story. Trends Plant Sci 1: 4-9
Otomo K, Kenmoku H, Oikawa H, König WA, Toshima H, Mitsuhashi W, Yamane H, Sassa T &
Toyomasu T, 2004. Biological functions of ent- and syn-copalyl diphosphate synthases in rice:
key enzymes for the branch point of gibberellin and phytoalexin biosynthesis. Plant J 39:886-
893
Park Sy & Chin KB, 2010. Effects of onion on physicochemical properties, lipid oxidation and
microbial growth of fresh pork patties. Int J Food Sci Technol 45, 1153-1160
Park SY, Yoo SS, Shim JH & Chin KB, 2008. Physicochemical properties, and antioxidant and
antimicrobial effects of garlic and onion powder in fresh pork belly and loin during refrigerated
storage. J Food Sci 73: C577-C584
Park YK & Lee, 1996. Identification of isorhamnetin 4'-glucoside in onions. J Agric Food Chem 44:
34-36
Pastene E, Troncoso M, Figueroa G, Alarco J & Speisky H, 2009. Association between
polymerization degree of apple peel polyphenols and inhibition of Helicobacter pylori urease. J
Agric Food Chem 57: 416-424
Patel KD, Scarano FJ, Kondo M, Hurta RAR & Neto CC, 2011. Proanthocyanidin-rich extracts from
cranberry fruit (Vaccinium macrocarpon Ait.) selectively inhibit the growth of human
pathogenic fungi Candida spp. and Cryptococcus neoformans. J Agric Food Chem 59: 12864-
12873
Pekić B, Kovač V, Alonso E & Revilla E, 1998. Study of the extraction of proanthocyanidins from
grape seeds. Food Chem 61: 201-206
Perron NR, García CR, Pinzón JR, Chaur MN & Brumaqhim JL, 2011. Antioxidant and prooxidant
effects of polyphenol compounds on copper-mediated DNA damage. J Inorg Biochem 105: 745-
53
Plaper A, Golob M, Hafner I, Oblak M, Šolmajer T & Jerala R, 2003. Characterization of quercetin
binding site on DNA gyrase. Biochem Biophys Res Commun 306: 530-536
Pollastri S & Tattini M, 2011. Flavonols: old compounds for old roles. Ann Bot 108: 1225-1233
Pontello M, Guatia A, Sala G, Cipolla M, Gattuso A, Sonnessa M & Gianfranceschi MV, 2012.
Listeria monocytogenes serotypes in human infections (Italy, 2000-2010). Ann Ist Super Sanita
48: 146-150
60
Prior BA, Fennema O & Pate J, 1975. Effect of dichlorodifluoromethane on the appearance, viability,
and integrity of Escherichia coli. Appl Microbiol 29: 685-691
Queipo-Ortuño MI, Boto-Ordóñez M, Murri M, Gomez-Zumaquero JM, Clemente-Postigo M, Estruch
R, Cardona Diaz F, Andrés-Lacueva C & Tinahones FJ, 2012. Influence of red wine
polyphenols and ethanol on the gut microbiota ecology and biochemical biomarkers. Am J Clin
Nutr 95:1323-1334
Quideau S, Deffieux D, Douat-Casassus C & Pouysgu L, 2011. Plant polyphenols: Chemical
properties, biological activities, and synthesis. Angew Chem Int Ed 50: 586-621
Raghava T, Ravikumar P, Hegde R & Kush A, 2010. Spatial and temporal volatile organic compound
response of select tomato cultivars to herbivory and mechanical injury. Plant Sci 179: 520-526
Rahman S, Khasru PA, Islam R & Khan MH, 2011. Antibacterial activity of natural spices on multiple
drug resistant Escherichia coli isolated from drinking water, Bangladesh. Ann Clin Microbiol
Antimicrob 10: 10-13
Ramos FA, Takaishi Y, Shirotori M, Kawaguchi Y, Tsuchya K, Shibata H, Higuti T, Tadokoro T &
Takeuchi M, 2006. Antibacterial and antioxidant activities of quercetin oxidation products from
yellow onion (Allium cepa) skin. J Agric Food Chem 54: 3551-3557
Rastmanesh R, 2011. High polyphenol, low probiotic diet for weight loss because of intestinal
microbiota interaction. Chem Biol Interact 189: 1-8
Rauha J-P, Remes S, Heinonen M, Hopia A, Kähkönen M, Kujala T, Pihlaja K, Vuorela H & Vuorela
P, 2000. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other
phenolic compounds. Int J Food Microbiol 56: 3-12
Rhodes MJC, 1994. Physiological roles for secondary metabolites in plants: some progress, many
outstanding problems. Plant Mol Biol 24: 1-20
Richard T, Lefeuvre D, Descendit A, Quideau S & Monti JP, 2006. Recognition characters in peptide-
polyphenol complex formation. Biochim Biophys Acta 1760: 951-958
Rihmanen-Finne R, Niskanen T, Lienemann T, Johansson T, Sjöman M, Korhonen T, Guedes S,
Kuronen H, Virtanen MJ, Mäkinen J, Jokinen J, Siitonen A & Kuusi M, 2011. A nationwide
outbreak of Salmonella Bovismorbificans associated with sprouted alfalfa seeds in Finland,
2009. Zoonoses Public Health 58: 589-596
Rodríguez Galdón B, Rodríguez Rodríguez EM & Díaz Romero C, 2008. Flavonoids in onion
cultivars (Allium cepa L.). J Food Sci 73: C599-C605
Romani A, Vignolini P, Galardi C, Aroldi C, Vazzana C & Heimler D, 2003. Polyphenolic content in
different plant parts of soy cultivars grown under natural conditions. J Agric Food Chem
51:5301-5306
Sagdic O, Ozturk I, Bayram O, Kesmen Z & Yilmaz MT, 2010. Characterization of butter spoiling
yeasts and their inhibition by some spices. J Food Sci 75: M597-M603
61
Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC & Yamasaki H, 2002. Plant phenolic antioxidant and prooxidant
activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. Toxicology 177:
67-80
Santas J, Almajano MP & Carbó R, 2010. Antimicrobial and antioxidant activity of crude onion
(Allium cepa, L.) extracts. Int J Food Sci Technol 45: 403-409
Santas J, Carbó R, Gordon MH & Almajano MP, 2008. Comparison of the antioxidant activity of two
Spanish onion varieties. Food Chem 107: 1210-1216
Saviranta NMM, Anttonen MJ, von Wright A & Karjalainen RO, 2008. Red clover (Trifolium
pratense L.) isoflavones: determination of concentrations by plant stage, flower colour, plant
part and cultivar. Sci Food Agric 88: 125-132
Scalbert A, 1991. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry 30: 3875-3883
Scalbert A & Williamson G, 2000. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J Nutr 130:
2073S-2085S
Shimizu T, Lin F, Hasegawa M, Nojiri H, Yamane H & Okada K, 2012. The potential bioproduction
of the pharmaceutical agent sakuranetin, a flavonoid phytoalexin in rice. Bioengineered 3,
DOI: 10.1074/jbc.M112.351270
Scogings PF, Hjältén J & Skarpe C 2011. Secondary metabolites and nutrients of woody plants in
relation to browsing intensity in African savannas. Oecologia 167: 1063-1073
Segal E, Berg RA & Bennett JE, 1979. Detection of Candida antigen in sera of patients with
candidiasis by an enzyme-linked immunosorbent assay-inhibition technique. J Clin Microbiol
10: 116-118
Shabana S, Kawai A, kai K, Akiyama K & Hayashi H, 2010. Inhibitory activity against urease of
quercetin glycosides isolated from Allium cepa and Psidium guajava. Biosci Biotechnol
Biochem 74: 878-880
Shadle GL, Wesley SV, Korth KL, Chen F, Lamb C & Dixon RA, 2003. Phenylpropanoid compounds
and disease resistance in transgenic tobacco with altered expression of l-phenylalanine
ammonia-lyase. Phytochemistry 64: 153-161
Singh BN, Singh BR, Singh RL, Prakash D, Singh DP, Sarma BK, Upadhyay G & Singh HB, 2009.
Polyphenolics from various extracts/fractions of red onion (Allium cepa) peel with potent
antioxidant and antimutagenic activities. Food Chem Toxicol 47: 1161-1167
Singh A, Sarma BK, Upadhyay RS & Singh HB, 2012. Compatible rhizosphere microbes mediated
alleviation of biotic stress in chickpea through enhanced antioxidant and phenylpropanoid
activities. Microbiol Res DOI: 10.1016/j.micres.2012.07.001
Slimestad R, Fossen T & Molund Vågen I, 2007. Onions: A source of unique dietary flavonoids. J
Agric Food Chem 55: 10067–10080
Soininen TH, Jukarainen N, Julkunen-Tiitto R, Karjalainen R & Vepsäläinen JJ, 2012. The combined
use of constrained total-line-shape 1H NMR and LC-MS/MS for quantitative analysis of
bioactive components in yellow onion. J Food Compost Anal 25: 208-214
62
Spencer JPE, Abd El Mohsen MM & Rice-Evans C, 2004. Cellular uptake and metabolism of
flavonoids and their metabolites: implications for their bioactivity. Arch Biochem Biophys 423:
148-161
Steffen Y, Gruber C, Schewe T & Sies H, 2008. Mono-O-methylated flavonols and other flavonoids
as inhibitors of endothelial NADPH oxidase. Arch Biochem Biophys 469: 209-219
Strominger JL & Tipper DJ, 1965. Bacterial cell wall synthesis and structure in relation to the
mechanism of action of penicillins and other antibacterial agents. Am J Med 39: 708-721
Taguri T, Tanaka T & Kouno I, 2004. Antimicrobial activity of 10 different polyphenols against
bacteria causing food-borne disease. Biol Pharm Bull 27: 1965-1969
Takahama U & Hirota S, 2000. Deglucosidation of quercetin glucosides to the aglycone and formation
of antifungal agents by peroxidase-dependent oxidation of quercetin on browning of onion
scales. Plant Cell Physiol 41: 1021-1029
Tattini & Traversi, 2008. Responses to changes in Ca2+
supply in two Mediterranean evergreens,
Phillyrea latifolia and Pistacia lentiscus, during salinity stress and subsequent relief
Thompson & Morgan, 17.7.2012: Vegetables: Vegetable Seeds: Onion & Leek Seeds: Shallot
‘Banana’: http://www.thompson-morgan.com/vegetables/vegetable-seeds/onion-and-leek-
seeds/shallot-banana/376TM
Togolini M, Giorgio C, Mohamed IH, Barocelli E, Calani L, Reynaud E, Dangels O, Borges G,
Crozier A, Brighenti F & Del Rio D, 2012. Perturbation of the EphA2−EphrinA1 system in
human prostate cancer cells by colonic (poly)phenol catabolites. J Agric Food Chem DOI:
10.1021/jf205305m
Tomás-Barberán FA & Andrés-Lacueva C, 2012. Polyphenols and health: current state and progress. J
Agric Food Chem DOI: 10.1021/jf300671j
Tompkin RB, 2002. Control of Listeria monocytogenes in the food-processing environment. J Food
Prot 65: 709-725
Tsuchiya H, Sato M, Miyazaki T, Fujiwara S, Tanigaki S, Ohyama M, Tanaka T & Iinuma M,
1996. Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones
against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol 50: 27-34
Tugizimana F, Steenkamp PA, Piater LA & Dubery IA, 2012. Ergosterol-induced sesquiterpenoid
synthesis in tobacco cells. Molecules 17:1698-715
Tzin V & Galili G, 2010. New insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis
pathways in plants. Mol Plant 3: 956-72
Verpoorte R & Memelink J, 2002. Engineering secondary metabolite production in plants. Curr Opin
Biotechnol 13:181-187
Vieira FG, Borges Gda S, Copetti C, Gonzaga LV, Nunes Eda C & Fett R, 2009. Activity and contents
of polyphenolic antioxidants in the whole fruit, flesh and peel of three apple cultivars. Arch
Latinoamer Nutr 59: 101-106
63
Voipio I, 2001. Viahnnekset: lajit, viljely, sato. Puutarhaliiton julkaisuja nro 316, 351 s. Nordmanin
Kirjapaino Oy, Forssa
Väkeväinen K, 2010. Pinosylviinin ja sen sukulaisaineiden antimikrobisuus ja sytotoksisuus. Pro
gradu -tutkielma, 65 s. Biotieteiden laitos, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta, Itä-
Suomen yliopisto
Waage SK & Hedin PA, 1985. Quercetin 3-O-galactocyl-(1→6)-glucoside, a compound from
narrowleaf vetch with antibacterial activity. Phytochemistry 24: 243-245
Weng J-K, Philippe RN & Noel JP, 2012. The rise of chemodiversity in plants. Science 336: 1667-
1670
Xu H-X & Lee SF, 2001. Activity of plant flavonoids against antibiotic-resistant bacteria. Phytother
Res 15: 39-43
Yamasaki S, Shimada E Kuwano T, Kawano T & Noquchi N, 2007. Continuous UV-B irradiation
induces endoreduplication and peroxidase activity in epidermal cells surrounding trichomes on
cucumber cotyledons. J Radiat Res 51: 187-196
Yang J, Meyers KJ, van der Heide J & Liu RH, 2004. Varietal differences in phenolic content and
antioxidant and antiproliferative activities of onions. J Agric Food Chem 52: 6787-6793
Yilmazer-Musa M, Griffith AM, Michels AJ, Schneider E & Frei B, 2012. Grape seed and tea extracts
and catechin 3-gallates are potent inhibitors of α-amylase and α-glucosidase activity. J Agric
Food Chem DOI: 10.1021/jf301147n
Yu X, Chu S, Hagermann AE & Lorigan GA, 2011. Probing the interaction of polyphenols with lipid
bilayers by solid-state NMR spectroscopy. J Agric Food Chem 59: 6783-6789
Zabala G, Zou J, Tuteja J, Gonzalez DO, Clough SJ & Vodkin LO, 2006. Transcriptome changes in
the phenylpropanoid pathway of Glycine max in response to Pseudomonas syringae infection.
BMC Plant Biol 6: 26-43
Zangerl AR & Berenbaum MR, 2004. Genetic variation in primary metabolites of Pastinaca
sativa; Can herbivores act as selective agents? J Chem Ecol 30: 1985-2002
Zarei Mahmoudabadi A & Gharib Nasery MK, 2009. Anti fungal activity of shallot, Allium
ascalonicum Linn. (Liliaceae), in vitro. J Med Plants Res 3: 450-453
Zavala JA & Ravetta DA, 2002. The effect of solar UV-B radiation on terpenes and biomass
production in Grindelia chiloensis (Asteraceae), a woody perennial of Patagonia, Argentina.
Plant Ecol 161: 185-191