6.8 Metodologia do LAPETOX (Laboratório de Pesquisas
Toxicológicas): [49]
A metodologia utilizada no Laboratório de Pesquisas Toxicológicas é baseada
na metodologia de Meyer et al.
Obtenção de matanáuplios de Artemia salina L. / Incubação:
Colocar cerca de 20 mg de cisto de Artemia salina L. em um estudo
dos lados da incubadora;
Cobrir esse mesmo lado da incubadora com papel de alumínio;
Deixar o sistema sob luz artificial por 48 horas para que haja a
eclosão das larvas (metanáuplios).
Dissolução da substancia em estudo:
Pesar 50 mg da substancia em um vidro de penicilina;
Adicionar 2 gotas de Cremophor. Com a extremidade plana de uma
espátula metálica homogeneizar a mistura;
Adicionar à mistura 1mL de Tween 80 à 5 % utilizando uma pipeta
graduada de maneira que o solvente escorra pelas paredes do tubo.
Homogeneizar a mistura e verificar se há material acumulado na
espátula;
Transferir a solução para um balão volumétrico de 5mL utilizando um
funil pequeno. Completar os 5 mL com água salina. Em soluções
translúcidas, a curvatura do menisco deve coincidir com traço da
aferição. Já em substancias coloridas, é a borda do menisco que
deve coincidir com o traço de aferição. A fim de se evitar perdas de
solução, a água salina utilizada para completar o volume de 5 mL
deve ser antes utilizada para “lavar” o funil e o vidro de penicilina
que continha a substancia. Ao retirar o funil verificar se há gotas de
solução aderidas a ele;
Tampar o balão, agitar e transferir novamente a solução para o vidro
de penicilina. Verificar se há gotas de solução aderidas ao balão.
Preparação do controle:
Em um vidro de penicilina, adicionar 2 gotas de Cremophor e 1 mL
de Tween 80 a 5 %. Com a extremidade plana de uma espátula
metálica homogeneizar a mistura;
Transferir a solução para um balão volumétrico de 5 mL utilizando
um funil pequeno;
Completar o volume de 5 mL com água salina, a qual, antes de ser
adicionada à solução, deve ser utilizada para “lavar” o funil e o vidro
de penicilina utilizado;
Tampar o balão, agitar e transferir a solução para o vidro de
penicilina. Verificar se há gotas de solução aderidas ao balão.
Teste de toxicidade / Exposição:
O teste de toxicidade é feito em triplicata para cada concentração. As
concentrações utilizadas no teste são: 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250
μg/mL, 100 μg/mL e 50 μg/mL obtidas a partir de diluições da solução inicial
em água do mar. Caso não seja possível determinar a CL50 nestas
concentrações é feito um diluição para: 100 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30
μg/mL, 20 μg/mL e 10 μg/mL.
Utilizando pipetas automáticas, adicionar os volumes de 500 μL, 375 μL,
250 μL, 125 μL, 50 μL e 25 μL da solução inicial aos tubos de ensaio ou 50μ,
25 μL, 20 μL, 15 μL e 10 μL para as menores concentrações, sendo 3 tubos
para cada concentração. Certificar-se de que não há bolhas na pipeta e de que
a solução está sendo colocada na parte de baixo do tubo;
Com uma bureta adicionar 5 mL de água salina filtrada e com pH entre 8
e 9. Com uma pipeta de Pasteur adicionar de 10 a 13 matanáuplios de Artemia
salina Leach em cada tubo de ensaio. Certificar-se de que nenhuma larva está
aderida à parede da pipeta ou do tubo de ensaio. Após adição das larvas aos
tubos de ensaio, deixar o sistema sob luz artificial por 24 horas.
Preenchimento da Ficha Cumulativa / Leitura:
Media dos vivos, em ordem decrescente de concentrações;
Media dos mortos, em ordem crescente de concentrações;
Vivos acumulados, em ordem decrescente de concentração;
Mortos acumulados, em ordem crescente de concentração;
A porcentagem de vivos é dada pela regra de três, onde total acumulado
corresponde a 100 % e os vivos acumulados correspondem a X.
As concentrações e as porcentagens de vivos foram então analisadas
pelo método estatístico Probitos para determinação da CL50.
Top Related