Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Evaluatie van meerdere Real-Time PCR voor de moleculaire
detectie van bacteriële gastro-enteritis aan de hand van
TaqMan Array Cards
Evelyne Duthoo
Promotor: Prof. Dr. Sc. Van Landschoot Anita
Tutor: Dr. Reynders Marijke en Dr. Sc. Descheemaeker Patrick
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie
AUTEURSRECHTELIJKE BESCHERMING
“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
scriptie.”
“The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis”.
3 juni 2016
Auteur Evelyne Duthoo
Promotor Prof. Dr. Sc. Van Landschoot Anita
Tutor Dr. Sc. Descheemaeker Patrick
Tutor Dr. Reynders Marijke
WOORD VOORAF
Bij het schrijven van dit eindwerk wil ik graag nog enkele mensen bedanken die een cruciale
rol hebben gespeeld in het tot stand brengen van deze masterproef. In het bijzonder mijn
promotoren Dr. Sc. Patrick Descheemaeker en Dr. Marijke Reynders, bij wie ik eindeloos
terecht kon voor zowel begeleiding als inzicht.
Daarnaast wil ik ook de mensen van het labo moleculaire diagnostiek bedanken, Sofie Maton,
Thomas Van Landschoot, Ellen Van Neder en Charlotte Vercamer, die steeds klaar stonden
voor een extra woordje uitleg tijdens het onderzoek.
Graag wil ik ook mijn interne promotor Dr. Sc. Anita Van Landschoot bedanken voor de
begeleiding doorheen het academiejaar.
Tot slot bedankt aan mijn familie voor de morele steun tijdens de voorbije studiejaren.
ABSTRACT
Gastro-enteritis is een vaak voorkomend probleem en kan bij kinderen, ouderen en personen
met een verzwakt immuunsysteem zelfs tot een fataal einde leiden. Vaak neemt de
conventionele bacteriologische diagnostiek te veel tijd in beslag en is deze niet gevoelig
genoeg. Daardoor is het belangrijk om tot een screeningsmethode te komen waarbij zowel de
parasitaire, virale en bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis met slechts 1 enkele test
kunnen gedetecteerd worden met behulp van een TaqMan Array Card (TAC) op basis van
Real-Time PCR.
In deze masterproef stonden de bacteriële intestinale pathogenen centraal en werd er
onderzoek gedaan naar species specifieke targetgenen voor het opsporen van toxinogene
Clostridium difficile, Salmonella spp., Campylobacter coli en Campylobacter jejuni, Shigella
spp., Yersinia spp. en diaregene Escherichia coli. Voor deze genen werden primer- en
probesequenties gegenereerd, gevalideerd en geoptimaliseerd die in een Real-time PCR
reactie de betreffende pathogene species opsporen. Deze optimalisatie werd eerst enkel op
de primers uitgevoerd met de SYBR Select Mastermix samen met een smeltcurveanalyse.
Daarna werd overgegaan op evaluatie met een specifieke TaqMan Real-Time PCR met de
geselecteerde primers in combinatie met een probe van Minor Groove Binders (MGB) en de
TaqMan Fast Virus 1-step Mastermix. Beide evaluaties werden uitgevoerd op zowel
reinculturen als fecale stalen.
Na optimalisatie werden de initiele 63 primerparen en 23 probes gereduceerd tot 20 functionele
primer-probe-combinaties. Deze zullen gelyofiliseerd worden op de TAC, waarop verdere
validatie kan worden uitgevoerd. Het op punt stellen van de TAC voor bacteriële intestinale
pathogenen is dus tot op heden nog niet afgerond.
ENGLISH ABSTRACT
Gastro-enteritis is a frequently occurring problem which can be fatal when it develops within
children, the elderly or immunocompromised adults. Often the conventional bacteriological
diagnosis is too time consuming and has a low sensitivity. Therefore, it is important to develop
a new screening method that tests for parasitic, viral and bacterial initiators of the disease, all
in one test. This can be done, using a TaqMan Array Card (TAC) based on Real-Time PCR.
This master thesis only includes the bacterial pathogens. The first stage of the research
included the selection of species-specific target genes of toxinogenic Clostridium difficile,
Salmonella spp., Campylobacter coli and Campylobacter jejuni, Shigella spp., Yersinia spp.
and diarrheagenic Escherichia coli. Primers and probes were generated for each of these
genes, which were subsequently validated and optimized in a Real-Time PCR reaction. The
first optimisation was performed on the primers using the SYBR Select Mastermix and an
additional meltcurve analysis. Afterwards, the TaqMan Fast Virus 1-Step Mastermix was used
for further specific evaluation of the primers in combination with a probe of Minor Groove
Binders (MGB). All primers and probes were analysed on both axenic as faecal samples.
At the end of the optimisation the initially selected 63 primerpares and 23 probes were reduced
to 20 functional primer-probe combinations. These will be spotted on the TAC by lyophilisation.
Further validation of the primers and probes will be performed with the TAC. Consequently,
the development of the TAC for the examined bacterial pathogens has not yet been completed.
INHOUDSOPGAVE
Afkortingen ............................................................................................................................................................. 9
Figuren .................................................................................................................................................................. 10
Tabellen ................................................................................................................................................................. 11
Inleiding ................................................................................................................................................................. 13
1. Literatuurstudie................................................................................................................................................. 14
1.1 Bacteriële gastro-enteritis: transmissie ...................................................................................................... 14
1.2 Bacteriële gastro-enteritis: mechanismen .................................................................................................. 15
1.3 Bacteriële gastro-enteritis: oorzaken .......................................................................................................... 18
1.4 Geselecteerde pathogenen ......................................................................................................................... 19
1.4.1 Clostridium difficile ............................................................................................................................... 19
1.4.2 Salmonella ............................................................................................................................................ 20
1.4.3 Campylobacter ..................................................................................................................................... 22
1.4.4 Shigella ................................................................................................................................................. 23
1.4.5 Yersinia ................................................................................................................................................. 24
1.4.6 Escherichia coli ..................................................................................................................................... 25
1.5 PCR doelwitgenen ....................................................................................................................................... 32
1.5.1 C. difficile doelwitgenen ....................................................................................................................... 32
1.5.2 Salmonella doelwitgenen ..................................................................................................................... 33
1.5.3 Campylobacter doelwitgenen .............................................................................................................. 34
1.5.4 Shigella doelwitgenen .......................................................................................................................... 34
1.5.5 Yersinia doelwitgenen .......................................................................................................................... 34
1.5.6 E. coli doelwitgenen ............................................................................................................................. 35
1.6 Bespreking van de methoden voor het onderzoek ..................................................................................... 36
1.6.1 DNA-extractie ....................................................................................................................................... 36
1.6.2 Real-Time PCR ...................................................................................................................................... 37
1.6.3 Gelelektroforese .................................................................................................................................. 42
1.6.4 DNA sequentiebepaling ........................................................................................................................ 43
2. Materiaal en methoden .................................................................................................................................... 45
2.1 Selectie van primers en probes ................................................................................................................... 45
2.1.1 Clostridium difficile ............................................................................................................................... 45
2.1.2 Salmonella ............................................................................................................................................ 45
2.1.3 Campylobacter ..................................................................................................................................... 46
2.1.4 Shigella ................................................................................................................................................. 46
2.1.5 Yersinia ................................................................................................................................................. 46
2.1.6 Escherichia coli ..................................................................................................................................... 47
2.2 Reinculturen ................................................................................................................................................ 48
2.3 Vircell DNA controles .................................................................................................................................. 49
2.4 Fecesstalen .................................................................................................................................................. 49
2.5 Mastermixen ............................................................................................................................................... 50
2.5.1 SYBR® Select Master Mix...................................................................................................................... 50
2.5.2 TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix ............................................................................................... 51
2.6 DNA-extractie .............................................................................................................................................. 51
2.6.1 Benodigdheden .................................................................................................................................... 51
2.6.2 Werkwijze ............................................................................................................................................. 51
2.7 Real-Time PCR met SYBR Select Mastermix + smeltcurveanalyse .............................................................. 52
2.8 Efficiëntiebepaling ....................................................................................................................................... 53
2.9 Real-Time PCR met FAST Mastermix ........................................................................................................... 55
2.10 Gelelektroforese ....................................................................................................................................... 56
2.11 DNA sequentiebepaling ............................................................................................................................. 57
2.11.1 Benodigdheden .................................................................................................................................. 57
2.11.2 Werkwijze ........................................................................................................................................... 57
3. Resultaten en bespreking .................................................................................................................................. 59
3.1 Algemeen: Strategie .................................................................................................................................... 59
3.2 Selectie primers en probes .......................................................................................................................... 61
3.2.1 Clostridium difficile ............................................................................................................................... 61
3.2.2 Salmonella ............................................................................................................................................ 67
3.2.3 Campylobacter ..................................................................................................................................... 69
3.2.4 Shigella. ................................................................................................................................................ 74
3.2.5 Yersinia ................................................................................................................................................. 75
3.2.6 Escherichia coli ..................................................................................................................................... 78
3.4 Elektroforese ............................................................................................................................................... 82
3.5 DNA sequenering ........................................................................................................................................ 84
3.6 Kwaliteitscontrole ....................................................................................................................................... 85
4. Samenvattend Besluit ....................................................................................................................................... 86
5. Bronnenlijst ....................................................................................................................................................... 89
6. Bijlagen .............................................................................................................................................................. 95
AFKORTINGEN
A Adenine
A/E Attaching and Effacing
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
C Cytosine
CDI Clostridium difficile infectie
Ct Treshold cycle
DAEC Diffuus-adhererende E. coli
DEC Diarree veroorzakende E. coli
ddNTP Dideoxyribonucleotide trifosfaat
dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat
dsDNA Dubbelstrengig DNA
EAEC Enteroaggregatieve E. coli
EIA Enzyme immunoassays
EIEC Enteroinvasieve E. coli
EPEC Enteropathogene E. coli
ETEC Enterotoxigene E. coli
fw Forward
G Guanine
GDH Glutamaat dehydrogenase
GITC Guanidium isothiocyanaat
GTC Guanidium thiocyanaat
HC Hemorragisch colitis
HV Sterk virulent
HUS Hemolytisch-uremisch syndroom
LT Hitte labiele enterotoxines
LV Zwak virulent
MGB Minor Groove Binders
NTS Niet-typhoïdale Salmonella
PaLoc Pathogeniciteit locus
PCR Polymerase Chain Reaction
qPCR Real-Time PCR
PDV Phocine distemper virus
PMC Pseudomembraneuze colitis
rv Reverse
SCV Salmonella bevattende vacuolen
SDS Sodium dodecyl sulfaat
ssDNA Enkelstrengig DNA
ST Hitte stabiele enterotoxines
STEC Shiga-toxine producerend E. coli
SHV Seal herpes virus
T Thymine
TAC TaqMan Array Card
TAE Trix-Acetaat-EDTA
TBE Tris-boraat-EDTA
Tm Smelttemperatuur
VBNC Viable But Non-Culturable
VTEC Verotoxine producerend E. coli
ΔG Vrije Gibbs energie
FIGUREN
Figuur 1: Schatting van de sterftecijfers van kinderen jonger dan 5 jaar veroorzaakt door diarree (Croxen et al,
2013).
Figuur 2: Algemeen overzicht van potentiële transmissiebronnen, specifiek voor pathogene E. coli (Croxen et al,
2013).
Figuur 3: De verschillende pathogenesestadia van EAEC (Hebbelstrup Jensen et al, 2014).
Figuur 4: Pathogenese mechanisme van Salmonella enterica serovar Typhimurium (Fabrega et al, 2013).
Figuur 5: De totale frequentie van het voorkomen van gedetecteerde pathogenen (Spina et al, 2015).
Figuur 6: Clostridium difficile (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).
Figuur 7: Salmonella (Centers for Disease Control and Prevention, 2014).
Figuur 8: Campylobacter (Centers for Disease Control and Prevention, 2013)
Figuur 9: Shigella (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).
Figuur 10: Yersinia enterocolitica (Elika, 2013).
Figuur 11: Escherichia coli (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).
Figuur 12: Voorstelling van het vasthechten van E. coli in het spijsverteringsstelsel (Croxen et al, 2013).
Figuur 13: Genetische map van PaLoc in C. difficile. (Carter et al, 2012).
Figuur 14: Theoretische voorstelling van een real-time PCR curve (Tawe,2014).
Figuur 15: Structuur SYBR Green I (Maervoet, 2014).
Figuur 16: SYBR Green I mechanisme (Tawe, 2014).
Figuur 17: Smeltcurve-analyse voor een homozygoot wild type, homozygote mutant en een heterozygoot
(Hoffman et al, 2007).
Figuur 18: TaqMan probe mechanisme (Tawe, 2014).
Figuur 19: Bekomen resultaat bij DNA sequenering volgens Sanger met fluorescent gelabelde ddNTPs (Fei, 2014).
Figuur 20: Fragment van een DNA sequentie file (GenSeq, 2015).
Figuur 21: PCR cycli voor real-time PCR met SYBR select mastermix + smeltcurveanalyse
Figuur 22: Grafische voorstelling efficiëntiebepaling.
Figuur 23: PCR cycli voor real-time PCR met FAST mastermix
Figuur 24: Voorbeeld van een mooie smeltcurve bij verschillende inputconcentratie van het targetgen.
Figuur 25: Voorbeeld van smeltcurve met aspecifieke amplificatie bij verschillende inputconcentraties van het
targetgen.
Figuur 26: Resultaat elektroforese van Campylobacter en Yersinia.
Figuur 27: Resultaat elektroforese ter voorbereiding van sequenering.
Figuur 28: Schematische voorstelling van de gewenste te bekomen indeling van de TaqMan array kaart.
TABELLEN
Tabel 1: Bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis die verder zullen besproken worden in dit eindwerk.
Tabel 2: Overzicht van intestinale E. coli pathogenen (Croxen et al, 2013).
Tabel 3: Te testen primers Clostridium difficile
Tabel 4 : Te testen primers Salmonella spp.
Tabel 5: Te testen primers Campylobacter.
Tabel 6: Te testen primers Shigella.
Tabel 7: Te testen primers Yersinia spp.
Tabel 8: Te testen primers Escherichia coli.
Tabel 9: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Tabel 10: Overzicht reinculturen Salmonella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Tabel 11: Overzicht reinculturen Campylobacter en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Tabel 12: Overzicht reinculturen Shigella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Tabel 13: Overzicht reinculturen Yersinia en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Tabel 14: Weergave vircell DNA controles en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.
Tabel 15: Gebruikte fecesstalen.
Tabel 16: Bestanddelen SYBR® Select Master Mix (Life Technologies, 2015).
Tabel 17: Bestanddelen TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Thermofischer, 2012).
Tabel 18: Samenstelling PCR-mix voor 300 nm
Tabel 19: Samenstelling PCR-mix voor 1000 nm
Tabel 20: Fictieve waarden bepaling efficiëntie.
Tabel 21: Samenstelling PCR-mix met probe
Tabel 22: Temperatuursprofiel van het programma SEQ.
Tabel 23: Overzicht primers en probes C. difficile.
Tabel 24: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.
Tabel 25: Ct-waarden C. difficile met bijbehorende efficiëntie.
Tabel 26: Bekomen efficiënties C. difficile uitgevoerd op reincultuur 901.
Tabel 27: Bekomen efficiënties C. difficile uitgevoerd op plasmides.
Tabel 28: Samenstelling reincultuur mengsels voor test op specificiteit.
Tabel 29: Gebruikte fecesstalen en de genen waarvoor ze verondersteld positief zijn.
Tabel 30: Overzicht primers en probes Salmonella spp.
Tabel 31: Resultaten functionaliteit Salmonella spp met primerconcentratie 1000 nM.
Tabel 32: Ct-waarden voor Salmonella met bijbehorende efficiëntie.
Tabel 33: Overzicht primers en probes Campylobacter spp.
Tabel 34: Resultaten functionaliteit Campylobacter spp met primerconcentratie 1000 nM.
Tabel 35: Resultaten voor functionaliteit in aanwezigheid van vreemd DNA voor Campylobacter.
Tabel 36: Bekomen efficiëntiewaarden voor Campylobacter, uitgevoerd op plasmides.
Tabel 37: Overzicht primers en probes Shigella spp.
Tabel 38: Overzicht primers en probes Yersinia spp.
Tabel 39: Overzicht primers en probes Yersinia spp.
Tabel 40: Bekomen efficiëntiewaarden voor E.coli.
Tabel 41: Overgebleven primerparen met hun probe
13
INLEIDING
Gastro-enteritis komt vaak voor en kan leiden tot verstoring van het metabolisme bij kinderen,
ouderen of bij mensen met een verzwakt immuunsysteem. Dit leidt nog steeds tot grote
medische problemen. Hierdoor is het nodig om een gevoelige detectiemethode op te stellen
die kan worden uitgevoerd op een snelle en nauwkeurige manier waardoor er vlug kan worden
overgegaan tot een juiste behandeling. Vaak is de conventionele diagnostiek te
arbeidsintensief, te langdurig en weinig gevoelig, waardoor het beter is gebruik te maken van
een moleculaire detectiemethode die een hogere gevoeligheid kent.
Het doel hierbij is dan ook om een gevoelige screeningsmethode te ontwikkelen waarbij alle
parasitaire, virale en bacteriële oorzaken van gastro-enteritis kunnen worden gedetecteerd
met behulp van een TaqMan Array Card (TAC). In dit onderzoek wordt er alleen gewerkt op
de bacteriële veroorzakers. Per pathogeen zal er gekozen worden om minstens twee genen
te detecteren. Voor deze targetgenen worden er op basis van de literatuur in totaal 63
primerparen ontwikkeld die tijdens dit onderzoek zullen worden geëvalueerd en
geoptimaliseerd naar functionaliteit, efficiëntie en specificiteit toe. Als eerste worden de
primers geoptimaliseerd met de SYBR Select Mastermix, waarbij er al een eerste selectie van
deze primerparen plaatsvindt. Daarna worden voor de geselecteerde primers TaqManprobes
van Minor Groove Binders (MGB) besteld en ook deze worden geoptimaliseerd, dit keer met
de TaqMan Fast Virus 1-step Mastermix. Hierbij kan een laatste selectie plaatsvinden, waarna
de geselecteerde primers en probes zullen worden gelyofyliseerd op de TAC. Daarna moet er
ook nog een validatie van deze TAC plaatsvinden.
Dit onderzoek begint met een literatuurstudie waarbij er informatie over de bacteriële
pathogenen verzameld wordt. Hierbij worden de algemene kenmerken van het pathogeen
besproken, net als het ziektebeeld die deze veroorzaken, de behandeling die kan worden
uitgevoerd en tot slot de doelwitgenen waarnaar gedetecteerd zal worden. Ook worden in deze
literatuurstudie de gebruikte technieken kort besproken. Dan worden de materialen die zullen
gebruikt worden beschreven in ‘Materiaal en methoden’, net als de methoden die gebruikt
worden tijdens het onderzoek. Hierna worden de resultaten van de optimalisatie van primers
en probes besproken met tot slot een algemeen besluit over deze nieuw ontwikkelde
screeningsmethode.
14
1. LITERATUURSTUDIE
Gastro-enteritis omvat de ontsteking van de mucosa van de maag, de dunne darm en/of de
dikke darm. Wanneer gastro-enteritis veroorzaakt wordt door virussen, bacteriën of parasieten
is ze besmettelijk, wat meestal het geval is. Daarnaast kan het ook veroorzaakt worden door
de inname van verdovende middelen en chemische giftige stoffen, die onder meer van metaal
afkomstig kunnen zijn of van plantaardige oorsprong. Gastro-enteritis kan leiden tot groot
ongemak, maar het elektrolyten- en vochtverlies dat hierdoor veroorzaakt wordt leidt bij
gezonde volwassen meestal niet tot verstoring van het metabolisme. Dit kan echter wel
ontstaan bij kinderen, ouderen of bij mensen met een verzwakt immuunsysteem. Wereldwijd
sterven zo’n 3 tot 6 miljoen kinderen jaarlijks aan infectieuze gastro-enteritis (Med-info, 2011).
In figuur 1 wordt kindersterfte door diarree voorgesteld op globaal vlak.
Figuur 1: Schatting van de sterftecijfers van kinderen jonger dan 5 jaar veroorzaakt door diarree, weergegeven
per land. Dit zijn de cijfers voor het jaar 2010. Deze kaart geeft weer dat de grootste mortaliteit in deze
leeftijdscategorie voorkomt in ontwikkelingslanden, voornamelijk in Centraal-Afrika en Zuid-Azië. (Croxen et al,
2013).
In deze masterproef worden enkel de bacteriële oorzaken van infectieuze gastro-enteritis
behandeld.
1.1 BACTERIËLE GASTRO-ENTERITIS: TRANSMISSIE
De bacteriële transmissie van gastro-enteritis wordt schematisch voorgesteld in figuur 2. Deze
is specifiek voor pathogene E. coli maar hetzelfde mechanisme is toepasbaar voor alle verder
besproken organismen. Pathogene stammen kunnen gevonden worden in dierenstallen, waar
het aan andere dieren kan worden doorgegeven. Feces afkomstig van deze dieren kunnen
voedsel, irrigatiewater en drinkwater besmetten, waardoor het bij de mens kan terechtkomen
15
door consumptie van dit besmet voedsel of water na onvoldoende behandeling. Daarnaast
kan er ook secundaire transmissie zijn tussen mensen onderling (Croxen et al, 2013).
Figuur 2: Algemeen overzicht van potentiële transmissiebronnen, specifiek voor pathogene E. coli. STEC staat voor
shiga toxine producerend E. coli , ETEC voor enterotoxigene E. coli, EAEC voor enteroaggregatieve E. coli, EIEC
voor enteroinvasieve E. coli, EPEC voor enteropathogene E. coli en aEPEC voor atypische EPEC (Croxen et al, 2013).
1.2 BACTERIËLE GASTRO-ENTERITIS: MECHANISMEN
Doordat entero-pathogenen in staat zijn om zich vast te hechten aan het intestinaal epithelium,
dit te koloniseren, in sommige gevallen de gastcel binnen te dringen, intracellulair te overleven
en zich te verspreiden van cel tot cel kunnen zij menselijke ingewanden succesvol infecteren.
Om dit mogelijk te maken hebben deze bacteriën een groot aantal moleculen ontwikkeld die
zullen interageren met de gastheer om zo de normale cellulaire functies te ondermijnen. De
meeste van deze moleculen worden gesecreteerd door type III secretiesystemen (Souza dos
Reis & Horn, 2010).
16
Pathogenen die diarree veroorzaken kunnen dit doen door het intestinale epithelium te
koloniseren op een aantal verschillende manieren. Deze pathogenen hebben de mogelijkheid
ontwikkeld om (1) niet-specifieke afweermechanismes van de gastheer te weerstaan zoals
maagzuur, peristaltiek, mucosale cel exfoliatie, intestinale mucines en bacteriocines en (2)
zich vast te hechten aan de intestinale epitheelcellen. Deze epithelia kunnen ze dan uiteindelijk
koloniseren. De kolonisatie kan cellulaire invasie inhouden maar dit is niet altijd zo. Wanneer
er cellulaire invasie optreedt verkrijgt men ofwel intracellulaire vermenigvuldiging en
verspreiding van de bacterie naar andere weefsels ofwel bacteriële persistentie. Verschillende
bacteriële pathogenen hebben verschillende werkwijzen om de gastheer te infecteren; toch
veroorzaken ze dezelfde cellulaire reacties. Virulentiefactoren werken ofwel vanuit
extracellulair milieu door cel-liganden te herkennen en hierop vast te hechten ofwel worden ze
ingebracht in het intracellulair milieu. Daar kunnen ze invloed hebben op de signalerende
pathways waardoor ze heel wat teweeg kunnen brengen op de cel zoals het verminderen van
de plasticiteit van het cytoskelet, de endocytose onderbreken en soms zelfs resistentie tegen
fagocytose opwekken. De gastheercel verdedigt zichzelf tegen de infectie door een
ontstekingsreactie op te wekken en de intestinale vochtbalans te veranderen om de
ongewenste bacteriën te kunnen wegspoelen met een diarreereactie als gevolg. Het al dan
niet voorkomen van een infectie hangt dus af van de interactie tussen de gastheer en de
bacterie voor elk organisme op zijn eigen manier. Voorbeelden hiervan zijn enteropathogene
E. coli (EPEC) die zich sterk gaan vasthechten aan epitheelcellen en zo extracellulair blijven
terwijl Salmonella, Shigella en Yersinia het darmepitheel binnendringen. De macrofagen
aanwezig in de cel gaan fagocytose induceren bij Salmonella en Shigella waardoor er een
ontstekingsreactie ontstaat die de epitheelbarrière verstoort. Yersinia kan deze fagocytose
echter vermijden en zal de ontstekingsreactie inhiberen. Bij al deze voorbeelden is het mogelijk
voor de bacterie om zich te vermenigvuldigen, de gastheer te verlaten en zo te worden
doorgegeven aan een nieuwe gastheer (Souza dos Reis & Horn, 2010). In figuur 3 wordt het
mechanisme van enteroaggregatieve E. coli (EAEC) verder toegelicht en geïllustreerd. In
figuur 4 wordt hetzelfde gedaan voor het mechanisme van Salmonella.
17
Figuur 3: De verschillende pathogenesestadia van EAEC. (1) stelt de agglutinatie van de EAEC bacterie voor. (2)
Het EAEC hecht zich vast aan het intestinale epitheel en koloniseert de darm. (3) De biofilm wordt geproduceert.
(4) Bacteriële toxines worden aangemaakt die ervoor zorgen dat het epitheel beschadigd wordt zodat de secretie
van deze toxines versterkt kan doorgaan. (5) Een additionele biofilm wordt aangemaakt (Hebbelstrup Jensen et
al, 2014).
Figuur 4: Pathogenese mechanisme van Salmonella enterica serovar Typhimurium. (1) Salmonella cellen hechten
zich vast aan het intestinale epitheel door middel van adhesines, gecodeerd in SPI-3 en SPI-4. (2) en (3) De bacterie
dringt de cel binnen. Dit wordt gemedieerd door de virulentiefactoren gecodeerd in SPI-1 en SPI-5. (4) Naast het
binnendringen van de cel kan het ook voorkomen dat de bacteriële cellen onmiddellijk worden opgenomen door
dendritische cellen aanwezig in het submucosa. (5) Wanneer de Salmonella zich in het cytoplasma bevindt, gaat
ze naar de Salmonella bevattende vacuolen (SCV) waar ze gaat repliceren. De factoren die gecodeerd worden in
SPI-2 en het pSLT plasmide zijn essentieel voor de overleving van Salmonella in deze SCVs. (6) Door middel van
transcytose gaan de SCVs naar het basolateraal membraan waar ze de interne cellen vrijlaten in het submucosa.
(7) De bacteriën worden opgevangen in fagocyten en opnieuw gelocaliseerd in een SCV, waar het SPI-3, SPI-2 en
het pSLT plasmide een belangrijke rol spelen. Uiteindelijk kunnen deze geïnfecteerde fagocyten zich verplaatsen
via het weefselvocht en het bloed (Fabrega et al, 2013).
18
1.3 BACTERIËLE GASTRO-ENTERITIS: OORZAKEN
Infectieuze gastro-enteritis kan worden veroorzaakt door zowel virussen, bacteriën als
parasieten. De meest voorkomende bacteriële oorzaken van gastro-enteritis kunnen afgeleid
worden uit onderstaande grafiek (Figuur 5) (Spina et al, 2015).
Figuur 5: Totale
frequentie van
voorkomen van
gedetecteerde
pathogenen en de
frequentie van het
voorkomen van
gedetecteerde
pathogenen in
fecesstalen waarin
meerdere pathogenen
werden
teruggevonden. In de
onderzochte stalen
werden er in totaal 555
pathogenen teruggevonden (Spina et al, 2015).
In deze masterproef worden enkel de meest voorkomende bacteriële oorzaken van gastro-
enteritis behandeld. Deze zijn samengevat in tabel 1.
Tabel 1: Bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis die verder zullen besproken worden in dit eindwerk.
Bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis
Clostridium difficile Toxinogene C. diff Salmonella Species Shigella Species Escherichia coli ETEC enterotoxigene E.coli EPEC enteropathogene E.coli STEC shiga toxine-producerend E.coli EIEC enteroinvasieve E. coli EAEC enteroaggregatieve E.coli Campylobacter C. jejuni C. coli Yersinia Pathogene Y. enterocolitica
19
1.4 GESELECTEERDE PATHOGENEN
1.4.1 CLOSTRIDIUM DIFFICILE
1.4.1.1 ALGEMENE KENMERKEN
Clostridium difficile is de belangrijkste oorzaak van nosocomiaal infectieuze diarree (Persson
et al, 2015). Het is een strikt anaerobe, Gram-positieve sporenvormer (Jamal et al, 2014) die
alom vertegenwoordigd is in het milieu en in het
spijsverteringskanaal van mens en dier (Knight et al, 2015).
Toxine producerend C. difficile wordt teruggevonden in 10 tot
25% van met antibiotica-behandelde diarreegevallen (Persson
et al, 2015). Door het gebruik van antibiotica zoals
clindamycine, cefalosporine en ampicilline wordt de normale
intestinale microbiële flora verstoord, wat de overwoekering van
C. difficile tot gevolg kan hebben (Bélanger et al, 2003). C.
difficile wordt ook vaak teruggevonden in vlees dat bestemd is
voor consumptie (Persson et al, 2008).
Figuur 6: Clostridium difficile (Centers for Disease Control and Prevention,
2015).
Het voorkomen en de ernst van C. difficile infectie (CDI) is een grote last voor de globale
gezondheidszorg aangezien dit zorgt voor extra kosten bij behandeling en infectie-controle, dit
de kans op het terugkeren van de ziekte vergroot en de verblijftijd van de patiënt in het
ziekenhuis verlengt, voornamelijk bij ouderen (Knight et al, 2015).
Het testen op C. difficile kan gebeuren aan de hand van een cytotoxische assay op de
weefselcultuur, via enzym immunoassays (EIA) of via glutamaat dehydrogenase (GDH). De
cytotoxische assay wordt het meest gebruikt door zijn efficiëntie maar hij duurt lang, 24 tot 48
uur. Er zijn ook steeds verse culturen voor nodig, het is arbeidsintensief en het heeft nood aan
specifieke labofaciliteiten en technische expertise. Daarnaast worden EIA en GDH ook vaak
gebruikt maar deze zijn minder gevoelig en minder specifiek (Bélanger et al, 2003; de Jong et
al, 2012; Jamal et al, 2014). Daarom wordt er overgestapt naar real-time PCR. Echter heeft
deze het nadeel dat ook asymptomatische C. difficile infecties worden aangetoond, waardoor
het belangrijk zal zijn om ook toxinegenen te onderzoeken. Een nieuwere methode om C.
difficile te analyseren is om met real-time PCR het tcdB gen te beschouwen, rechtstreeks in
het fecesstaal. Deze methode heeft een hoge gevoeligheid en specificiteit ten opzichte van
EIA. Het heeft echter als nadeel dat er geen onderscheid kan gemaakt kan worden tussen CDI
en asymptomatische kolonisatie met C. difficile aangezien PCR geen biologisch actief toxine
kan detecteren (Jamal et al, 2014).
1.4.1.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP
Antibiotica-geassocieerde pseudomembraneuze colitis (PMC) CDI is een ziekte in de dikke
darm, geïnduceerd door C. difficile toxines, waarbij minstens 3 keer per dag waterige, maar
niet bloederige, stoelgang wordt geconstateerd. Andere symptomen zijn pijn in de onderbuik,
20
krampen en koorts. Manifestaties gelokaliseerd buiten de darmen komen amper voor. Het
ziektebeeld kan gaan van mild tot zeer ernstig en kan soms zelfs fataal zijn. Daarnaast komt
asymptomatische C. difficile infectie vaak voor, vooral in ziekenhuizen, wat waarschijnlijk een
rol speelt in de ziekteoverdracht (Knight et al, 2015).
1.4.1.3 BEHANDELING
De behandeling van een C. difficile infectie hangt af van de ernst van de infectie. Ook is het
belangrijk om weten of de ziekte voor de 1ste maal voorkomt of ze recidief is. Bij het voor het
eerst voorkomen van een milde C. difficile infectie wordt de patiënt behandeld met
metronidazol gedurende 10 tot 14 dagen. Wanneer een ernstige infectie voor het eerst
voorkomt wordt aan de patiënt vancomycine oraal toegediend gedurende 10 tot 14 dagen.
Bij een complexe infectie kan vancomycine zowel oraal als rectaal worden toegediend in
hogere dosis. Dit kan al dan niet worden gecombineerd met een intraveneuze dosis
metronidazol. Bij een zeer ernstig ziektebeeld kan een colectomie noodzakelijk zijn (Cohen
et al, 2010). Recent wordt echter meer gebruik gemaakt van stoelgangtransplantatie (Rohlke
& Stollman, 2012).
Bij een 1ste terugkeer van de infectie kan dezelfde behandeling gebruikt worden als bij het 1ste
voorkomen. Bij verdere terugkeer mag metronidazol niet meer worden toegediend omdat
deze cumulatieve neurotoxiciteit zou kunnen teweegbrengen (Cohen et al, 2010).
1.4.2 SALMONELLA
1.4.2.1 ALGEMENE KENMERKEN
Salmonella is een Gram-negatieve, niet-
sporenvormer die behoort tot de familie
Enterobacteriaceae en nauw verwant is aan het
genus Escherichia. Deze micro-organismen hebben
een diameter van 0,7 tot 1,5 µm en een lengte van 2
tot 5 µm. Het zijn facultatieve anaeroben die
voornamelijk peritriche flagellen hebben (Fàbrega &
Vila, 2013).
Figuur 7: Salmonella (Centers for Disease Control and
Prevention, 2014).
Het is een belangrijk pathogeen dat voedselvergiftiging veroorzaakt en darmziekten kan
teweegbrengen in een grote variëteit aan gastheren (Tatavarthy & Cannons, 2010).
Pathogenen die voorkomen in voedsel komen vaak voort uit het gebruiken van met feces
vervuild water, gebruikt voor zowel irrigatie als in het productieproces. Het grootste risico
hierbij ligt bij voedingsmiddelen die niet of onvoldoende gekookt worden vooraleer ze worden
geconsumeerd (Vital et al, 2014). Van alle pathogenen die voedselvergiftiging veroorzaken
zorgt Salmonella voor 11% van de infecties, 35% van hospitalisaties en 28% van doden in de
21
VS (Zhang et al, 2011). Het genus Salmonella kan worden opgedeeld in twee species:
Salmonella enterica en Salmonella bongori (Tatavarthy & Cannons, 2010). Salmonella
enterica serotypes Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B en Paratyphi C worden samen gegroepeerd
als typhus veroorzakende Salmonella. Dit zijn organismen die enkel bij de mens voorkomen.
Ze kunnen buiktyfus en paratyfus veroorzaken. Andere S. enterica serotypes worden de niet-
typhoïdale Salmonella (NTS) genoemd. NTS stammen kunnen een grote variatie aan
gewervelden infecteren of koloniseren. Ook kunnen ze zich aanpassen aan of beperken tot
bepaalde niet-menselijke diersoorten (Crump et al, 2015). Deze NTS kunnen verder worden
opgedeeld in 6 subspecies (I, II, IIIa, IIIb, IV en VI). De meeste ziektes worden veroorzaakt
door S. enterica I, maar sporadisch komen er ook infecties voor die veroorzaakt werden door
S. enterica IIIa, IIIb, IV, VI en S. bongori (Tatavarthy & Cannons, 2010). Een voorbeeld van
een serotype binnen S. enteritica is Salmonella enteritidis, wat kan teruggevonden worden in
gevogelte en eieren. (Szmolka et al, 2015).
Conventionele identificatiemethoden van Salmonella in voedsel houden een aantal stappen
in: niet-selectieve aanrijking, selectieve aanrijking, selectief uitplaten en uiteindelijk
biochemische en serologische confirmatietechnieken. Dit is arbeidsintensief en er zijn
minstens 5 dagen nodig om al deze stappen te kunnen doorlopen. Daardoor wordt er
overgestapt naar methodes die een snelle screening en detectie mogelijk maken. Er wordt
gekozen voor qPCR omdat ze sneller en gevoeliger is dan een gewone PCR en er wordt real-
time data verkregen zonder dat de amplicons op gel moeten worden gezet (Zhang et al, 2011).
1.4.2.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP
De 2 belangrijkste syndromen die veroorzaakt worden door Salmonella infectie zijn typhoïde
koorts en colitis. Typhoïde koorts wordt veroorzaakt door de pathogenen S. enterica serotype
Typhi en S. enterica serotype Paratyphi A en B. Deze zijn enkel pathogeen voor de mens. De
symptomen hierbij zijn koorts, hoofdpijn, buikpijn, voorbijgaande diarree of constipatie. De
infectie kan ook fatale schade berokkenen aan de luchtwegen, lever, milt en kan mogelijks
neurologische schade veroorzaken. De sterftecijfers voor deze ziekte liggen tussen de 10 en
20% wanneer de patiënt niet wordt behandeld. Met antibioticabehandeling daalt dit cijfer tot
<1%. NTS stammen die colitis veroorzaken kunnen naast mensen ook heel wat andere dieren
infecteren. NTS wordt voornamelijk veroorzaakt door S. enteritidis en S. typhimurium. Hierbij
liggen de sterftecijfers rond 24% in ontwikkelingslanden. De symptomen omvatten koorts,
krampen, buikpijn, diarree, stoelgang die bloederig kan zijn, vaak samen met misselijkheid en
braken. De ernst van deze symptomen kan sterk variëren. Ziekte komt meestal voor wanneer
meer dan 50 000 bacteriën worden geconsumeerd en de incubatieperiode bedraagt 6 tot 72
uur. Zo’n 5% van patiënten met NTS-infectie ontwikkelen ook bacteriemie, waarbij bacteriën
zich in de bloedbaan bevinden. Bij NTS infecties die zich beperken tot de darmen duren de
symptomen 5 tot 7 dagen, waarna ze spontaan uit zichzelf stoppen (Fàbrega & Vila, 2013).
1.4.2.3 BEHANDELING
Bij niet-thypoïdale salmonellose is behandeling met antibiotica niet nodig bij gezonde
personen. Deze is enkel noodzakelijk bij mensen met een verlaagd immuunsysteem, kinderen
22
en ouderen (Tatavarthy & Cannon, 2010). De behandeling gebeurt 3 tot 7 dagen, waarbij vaak
fluoroquinolones, trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMZ), ampicilline of breedspectrum
cefalosporines (bv. Ceftriaxon of cefixim) worden toegediend. Antibioticaresistentie komt
echter steeds vaker voor bij S. typhimurium isolaten waardoor TMP-SMZ en ampicilline minder
vaak worden toegepast (Fàbrega & Vila, 2013).
1.4.3 CAMPYLOBACTER
1.4.3.1 ALGEMENE KENMERKEN
Campylobacter species zijn Gram-negatieve, niet-sporenvormers die 0,2 tot 0,8 op 0,5 tot 5
µm groot zijn. Het zijn chemo-organotrofen die hun energie halen uit aminozuren of
tricarboxylzuurcyclus intermediairen. Ze behoren tot de familie Campylobacteraceae (de Boer
et al, 2010; Kaakoush et al, 2015).
Figuur 8: Campylobacter (Centers for Disease Control and Prevention,
2013).
Campylobacter species zijn een belangrijke oorzaak van
bacteriële enteritis bij mensen, waarbij vooral de species C.
jejuni en C. coli een rol spelen. Daarnaast worden ook C.
lari, C. upsaliensis en C. hyointestinalis gezien als
enteropathogenen. Ook C. concisus en C. ureolyticus
worden steeds vaker geconstateerd als de oorzaak voor
gastro-enteritis (de Boer et al, 2010). C. jejuni wordt
teruggevonden bij 90% van de gevallen waarbij een
Campylobacter species de oorzaak is van diarree
(Humphries & Linscott, 2015).
In klinische labo’s worden Campylobacter species meestal gedetecteerd door ze op te groeien
op selectieve media en daarna verder te identificeren met fenotypische methoden of met
MALDI-TOF. Deze cultuurmethoden zijn vooral gericht op het vinden van C. jejuni en C. coli.
De selectieve media die hierbij gebruikt worden (bv. Preston agar, Skirrow agar en Butzler
agar) kunnen de groei van andere Campylobacter species gaan inhiberen. Ook zijn er een
aantal niet-thermofiele Campylobacter species die niet kunnen overleven bij de
incubatietemperatuur van 42°C die tijdens deze identificatie gehanteerd wordt. Hierdoor wordt
het ware voorkomen van Campylobacter vaak onderschat. Ook is deze identificatiemethode
redelijk traag, waardoor slechts resultaten bekomen worden na 2 tot 4 dagen (Maher et al,
2003).
1.4.3.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP
In onderzoeken werd er vastgesteld dat zelfs bij een lage dosis van 800 CFU aan C. jejuni
diarree kan optreden. Door infectie met C. jejuni of C. coli krijgen patiënten last van waterige
of bloederige diarree, koorts, gewichtsverlies en krampen die gemiddeld 6 dagen duren. Op
23
symptomen alleen kan men geen onderscheid maken tussen de infectie van beide species.
De incubatieperiode na inname is 24 tot 72 uur en hoe lager de dosis Campylobacter, hoe
langer deze incubatieperiode duurt. De piek van de ziekte kan 24 tot 48 uur duren, waarbij de
buikpijn gelijkaardig kan zijn aan deze bij appendicitis. Infectie met C. jejuni of C. coli komt
voor bij patiënten van alle leeftijden, maar vooral bij kleuters en jongvolwassenen. Ook werd
er geconstateerd dat bij iets oudere patiënten (vanaf leeftijd 34) en mensen die veel reizen de
kans op infectie met C. coli hoger lag dan met C. jejuni. Daarnaast kunnen andere species van
Campylobacter ook infectie veroorzaken, waarbij de symptomen iets milder zijn dan bij C. jejuni
en C. coli. C. jejuni kan ook leiden tot auto-immuunziektes zoals Guillain-Barré syndroom en
Miller Fisher syndroom. Campylobacter species kunnen ook leiden tot prikkelbare darm
syndroom, Barrett’s slokdarm en darmkanker. Daarnaast zouden ze een rol spelen bij
bacteriemie, longinfecties, abcessen in de hersenen, meningitis en artritis (Kaakoush et al,
2015).
1.4.3.3 BEHANDELING
De meeste infecties met Campylobacter gaan na verloop van tijd vanzelf over, waardoor er
geen behandeling nodig is. Er moet alleen gezorgd worden dat de patiënt voldoende
gehydrateerd blijft. Antibiotica moet wel worden toegediend bij patiënten met auto-
immuunziektes, met extra-intestinale infecties of bij patiënten waarbij de symptomen zeer
ernstig zijn. Daarvoor wordt vaak ciprofloxacin toegevoegd, wat een fluoroquinolone is.
Daarnaast worden ook meer en meer macroliden zoals azitromycine toegediend omdat steeds
meer Campylobacter species resistent worden tegen ciprofloxacin door het veelvuldig gebruik
hiervan in de pluimvee industrie. Bij zeer zware Campylobacter infecties wordt vaak gewerkt
met aminoglycosiden zoals gentamicine of kanamycine (Kaakoush et al, 2015).
1.4.4 SHIGELLA
1.4.4.1 ALGEMENE KENMERKEN
Shigellae zijn Gram-negatieve niet-sporenvormers, ze zijn
facultatief anaeroob en behoren tot de familie
Enterobacteriaceae (Sansonetti, 2001). Er zijn 4 verschillende
species bekend. Shigella flexneri, Shigella boydii en Shigella
sonnei zijn veroorzakers van gastro-enteritis. Shigella
dysenteriae veroorzaakt dysenterie (Jimenez et al, 2010). Het
voorkomen van Shigella infecties wordt waarschijnlijk
onderschat door het verkeerd uitvoeren van pre-analytische
stappen en door het feit dat Shigella vaak voorkomt Figuur 9:
Shigella (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).
als “viable but non-culturable” (VBNC) (Prakash et al, 2015). De
labo detectie verloopt in dezelfde stappen als degene die hierboven zijn beschreven voor
Salmonella.
24
1.4.4.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP
Shigella veroorzaakt shigellose, een acute gastro-enteritis. Shigellose is zeer besmettelijk en
kan worden doorgegeven bij fecaal contact. Hierdoor komt het vaak voor in dichtbevolkte
gebieden waar een gebrek aan hygiëne heerst. Ook kan het worden doorgegeven via besmet
voedsel of water (Hsu et al, 2007). De symptomen van shigellose zijn kortstondige waterige
diarree die vaak ook bloederig is, en koorts en krampen in de darmen (Sansonetti, 2001).
1.4.4.3 BEHANDELING
De behandeling van shigellose focust voornamelijk op rehydratie, al dan niet gecombineerd
met een antibioticakuur. De rehydratie gebeurt oraal. De antibioticakuur zorgt ervoor dat de
koorts en krampen verminderen, dat de symptomen van kortere duur zijn en dat het risico op
complicaties die de dood tot gevolg kunnen hebben verminderen. De antibioticakuur wordt 5
dagen toegediend. Het probleem bij Shigella species is dat ze snel resistentie ontwikkelen
waardoor ze onder andere resistent geworden zijn tegen tetracycline, chlooramfenicol,
ampicilline en co-trimoxazol. Vandaag de dag wordt voornamelijk fluoroquinolones toegediend
bij volwassenen en azitromycine bij kinderen (Niyogi, 2007).
1.4.5 YERSINIA
1.4.5.1 ALGEMENE KENMERKEN
Yersinia enterocolitica bestaat uit een heterogene groep van meer dan 50 stammen die een
grote verscheidenheid aan pathogeniteit kan veroorzaken bij zowel mens als dier (Lamps et
al, 2006). Ze kunnen verscheidene syndromen veroorzaken zoals diarree, enteritis en
enterocolitis (Wang et al, 2014). Y.
enterocolitica zijn Gram-negatieve staven
die een diversiteit aan morfologie vertonen.
Zo komen ze voor als kleine coccobacilli
met afgeronde einden maar ook als
uitgestrekte staven, soms met uitsluitsels
aanwezig. Bij 37°C is Y. enterocolitica niet
beweeglijk, maar bij 25°C is ze dit wel door
de aanwezige peritriche
Figuur 10: Yersinia enterocolitica (Elika, 2013).
flagellen. Ze kan worden opgegroeid op een vast medium zoals MacConkey agar, Sheep
Blood agar en Hektoen-Enteric agar waarbij ze 24 uur wordt geïncubeerd. Een hierbij vaak
voorkomend probleem is dat de plaat wordt overwoekerd door andere Enterobacteriaceae
aanwezig in het fecale staal. Dan zal er opnieuw moeten worden geïncubeerd, dit keer
gedurende 48 uur bij 37°C om lactose-negatieve kolonies te selecteren. Y. enterocolitica is in
staat om het sucrose aanwezig in Hektoen-Enteric agar te fermenteren; dit is geen specifieke
karakteristiek voor Yersinia kolonies en kan ook voorkomen bij andere darmflora (Bottone,
2015).
25
Y. enterocolitica zijn pathogenen die vaak worden teruggevonden in water, zuivelproducten en
vlees (Wang et al, 2014), voornamelijk varkensvlees (Uyeda, 1997). In ander vlees dat door
mensen geconsumeerd worden komen meestal niet-pathogene stammen van Y. enterocolitica
voor (Thoerner et al, 2003). Pathogene Y. enterocolitica kunnen onderverdeeld worden in 2
groepen: de sterk-virulente (HV) biogroep 1B en de zwak-virulente (LV) groep die bestaat uit
biogroepen 2 tot 5. Pathogene stammen die vaak voorkomen bij de mens zijn de serotypes
O:8 en O:13, behorende tot de HV groep, en stammen O:1, O:3 en O:9 die behoren tot de LV
groep (Lamps et al, 2013).
1.4.5.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP
Bij mensen kan Y. enterolitica zorgen voor zeer sterke buikpijn, koorts, diarree, hoofdpijn en
braken (Uyeda et al, 1997). Het kan leiden tot ernstige ziektes zoals de ziekte van Crohn en
mesenterische lymfadenitis, waarvan de symptomen sterk lijken op die van appendicitis. De
ernst van de ziekte is afhankelijk van verschillende parameters zoals gastheergevoeligheid,
het aantal ingenomen organismen en het serotype. De ziekte heeft een incubatieperiode van
24 tot 48 uur(Humphries & Linscott, 2015) en duurt ongeveer 10 dagen (Rosner et al, 2013).
In sommige gevallen kan ze echter 2 tot 12 maand aanhouden. Bij 20 tot 46% van de
gevallen komt bloederige stoelgang voor. Ziekte kan ook leiden tot opname in het ziekenhuis
door dehydratatie bij ernstige gevallen (Humphries & Linscott, 2015).
1.4.5.3 BEHANDELING
Net zoals bij vele andere gastro-intestinale infecties gaan de symptomen na verloop van tijd
vanzelf stoppen en is er geen antimicrobiële behandeling nodig. Toch kan in enkele gevallen
wel antibiotica worden toegediend wanneer de patiënt al verzwakt was of wanneer het gaat
over een zeer invasieve infectie die de dood tot gevolg kan hebben. Vroeger werd vooral
tetracycline, chlooramfenicol, gentamicine en cotrimoxazol toegediend, maar nu wordt meer
gebruik gemaakt van 3de generatie cefalosporines en fluoroquinolones (Fàbrega & Vila, 2012).
1.4.6 ESCHERICHIA COLI
1.4.6.1 ALGEMENE KENMERKEN
Escherichia coli werd voor het eerst geïsoleerd en gekarakteriseerd door Theodor Escherich
in 1954 (Croxen et al, 2015). In ontwikkelingslanden is diarree een van de grootste oorzaken
van sterfte, voornamelijk bij kinderen. Hierbij is diarree veroorzakende Escherichia coli (DEC)
een belangrijke oorzaak onder de bacteriële pathogenen (Auvray et al, 2008). E. coli zijn
facultatief anaeroben (Barletta et al, 2013) die veelvuldig in de darmflora van warmbloedige
dieren aanwezig zijn waar ze normaal gezien geen schadelijke invloed hebben (Croxen et al,
2013).
26
Figuur 11: Escherichia coli (Centers for Disease Control and Prevention, 2015).
Wanneer de patiënt echter een verzwakt immuunsysteem heeft, door wederkerende infecties
(zoals urineleider infectie, meningitis,…), of een verminderde gastro-intestinale barrière heeft
kan er een infectie met E. coli ontstaan doordat sommige stammen virulentiegenen bevatten.
Deze virulentiegenen zijn niet geassocieerd met wederkerende infecties maar zorgen ervoor
dat pathogenen kunnen aanhechten aan de cel, deze kunnen binnendringen en uiteindelijk
hun functie kunnen doen veranderen (Barletta et al, 2013). Pathogene E. coli kan een grote
variatie aan ziektes induceren bij mensen, zowel gastro-intestinale ziektes als ziektes die zich
bevinden in de urineleider, de bloedstroom en het centrale zenuwstelsel (Croxen et al, 2015).
Het zijn de intestinale pathogenen die tot diarree zullen leiden. DEC stammen kunnen
onderverdeeld worden in 6 categorieën : enteropathogene E. coli (EPEC), enterotoxigene E.
coli (ETEC), enteroinvasieve E. coli (EIEC), shiga toxine-producerend E. coli (STEC),
enteroaggregatieve E. coli (EAEC) en diffuus-adhererende E. coli (DAEC) (Abbasi et al, 2014).
STEC wordt soms ook verotoxine-producerend E. coli (VTEC) genoemd (Auvray et al, 2008).
Naar DAEC wordt in dit eindwerk geen onderzoek gedaan. In figuur 12 wordt de aanhechting
van de verschillende DEC geïllustreerd en toegelicht.
27
Figuur 12: Voorstelling van het vasthechten van E. coli in het spijsverteringsstelsel. Pathogene E. coli hebben gastheerepithelen nodig om zich aan vast te hechten. EPEC (voorgesteld als geel) en STEC (voorgesteld als roze) zijn extracellulaire pathogenen die zich vasthechten aan het intestinale epitheel en daar microvilli verwijderen om zo laesies te veroorzaken. EPEC vertoont lokale aanhechtingspatronen door de aanwezigheid van pili waardoor ze microkolonies kunnen vormen. Daarnaast kan ETEC (voorgesteld als oranje) kolonisatiefactoren (CFs) gebruiken om zich aan te hechten in de intestinale cellen. EAEC (voorgesteld als groen) vormt een biofilm over de intestinale mucosa. De bacteriën hechten zich zowel aan elkaar vast als aan het celoppervlak waar ze aggregerende aanhechtingspatronen vormen (Stacked Brick). Tot slot gaat EIEC (voorgesteld als rood) het intestinale epitheel binnendringen door middel van M-cellen waardoor zij zich gaan nestelen in het submucosa. Ze worden niet afgebroken door de macrofagen daar aanwezig aangezien ze macrofage celdood induceren en darmcellen basolateraal binnendringen en zich van daaruit lateraal verspreiden (Croxen et al, 2013).
In tabel 2 wordt een samenvattend overzicht gegeven van de verschillende DEC, met hun
gastheer, plaats van kolonisatie, besmettingsbron, ziekteverschijnselen, behandeling,
aanhechting en genetische identificatie.
28
Tabel 2: Overzicht van intestinale E. coli pathogenen (Croxen et al, 2013).
Pathotype tEPEC aEPEC STEC EIEC ETEC
Gastheer
kinderen < 5 jaar, volwassenen bij hoge dosis
volwassenen & kinderen
kinderen < 5 jaar, volwassenen, frequente
reizigers, Immuungecompromitteerde
personen
Kinderen < 5 jaar, reizigers
plaats van kolonisatie
Dunne darm
Distaal ileum, dikke
darm Dikke darm Dunne darm
Ziekte(s) Sterke waterige diarree
Waterige diarree, HC,
HUS
Shigellose, bacteriële disentery, mogelijks HUS
Waterige diarree
Gekende bron van
besmetting Mensen Mensen, dieren
Mensen, dieren,
voedsel, water
Mensen, dieren, voedsel, water
Voedsel, water, mensen, dieren
Behandeling Orale rehydratatie, antibiotica
bij aanhoudende gevallen
Hydratie, extra zorg
bij HUS
Orale rehydratatie, antibiotica
Rehydratatie, antibiotica
Aanhechting Aanhecting en "effacing" Aanhecting
en "effacing"
Niet van toepassing (invasief)
Door ingrijpen CF
Genetische identificatie
Eae+, bfp+, stx- Eae+, stx-
Eae+/-, stx+ ipaH+, ial+, stx+ CFs, LT, ST
Pathotype DAEC AIEC EAEC
Gastheer
Kinderen (ernstiger tussen 18
maanden en 5 jaar),
volwassenen
volwassenen en kinderen
volwassenen kinderen Immuungecompromitteerde
personen
plaats van kolonisatie
Spijs-verterings-
stelsel Dunne darm
Dunne en/of dikke darm
Ziekte(s)
Aan-houdende waterige
diarree bij kinderen, kan bijdragen tot de ziekte van
Crohn
ziekte van Crohn Reiziger's
diarree, HUS (stx+)
Aan-houdende diarree Aan-houdende diarree
Gekende bron van
besmetting Onbekend Onbekend Voedsel, soms volwassen dragerschap
Behandeling Rehydratatie Antibiotica,
chirurgie
Antibiotica, orale
rehydratatie
Antibiotica, orale rehydratatie, mogelijks
probiotica Fluoroquinolones
Aanhechting Diffuus,
adherent en/of invasief
Niet van toepassing (invasief)
Stacked brick en/of invasief
Genetische identificatie
Geen uniforme merkers
Niet gekarakteriseerd
aat+A, aatC+, andere
29
1.4.6.1.1 EPEC
EPEC zijn de belangrijkste pathogenen bij het infecteren van kinderen onder de 2 jaar. Het
zijn ”attaching and effacing” pathogenen (A/E) en vormen vooral een probleem in
lageloonlanden (Abbasi et al, 2014). EPEC worden doorgegeven van gastheer naar gastheer
bij fecaal-oraal contact via gecontamineerde oppervlakten en humane dragers. Ook kan
besmetting worden veroorzaakt door consumptie van gecontamineerd water en voedsel, maar
dit komt minder vaak voor (Croxen et al, 2013). De EPEC bacterie gaat zich vastmaken aan
de darmwand van de gastheer en zorgt daar voor veranderingen in het cytoskelet van
epitheelcellen, wat zorgt voor een accumulatie aan gepolymeriseerd F-actine (Abbasi et al,
2014).
1.4.6.1.2 EAEC
EAEC is de 2de meest voorkomende oorzaak voor diarree tijdens het reizen (Morin et al, 2013).
Ook zorgt het vaak voor ziektebeelden bij kinderen in ontwikkelingslanden en bij patiënten met
een humaan virus immunodeficiëntie (Shin et al, 2015). Bij EAEC gebeurt de infectie in 3
stages: eerst bindt het aan het slijmvlies, daarna wordt er een biofilm gevormd en uiteindelijk
wordt er een ontstekingsreactie geïnduceerd waarbij toxines worden vrijgesteld (Hebbelstrup
Jensen et al, 2014).
1.4.6.1.3 STEC
STEC komt vaak voor in geïndustrialiseerde landen door waterverontreiniging (Abbasi et al,
2014). Ook kan STEC teruggevonden worden in voedingsmiddelen (Auvray, 2008),
voornamelijk wanneer deze voedingsmiddelen niet genoeg gekookt worden (Feng et al, 2011).
STEC stammen die hemorragische colitis (HC) of hemolytisch-uremisch syndroom (HUS)
veroorzaken worden voornamelijk teruggevonden bij gezond vee. Humane infectie wordt dan
veroorzaakt door direct contact met vee, koeienvlees of ongepasteuriseerde melk (Nielsen &
Andersen, 2003).
1.4.6.1.4 ETEC
ETEC is in staat om hitte-labiele (LT) of hitte-stabiele (ST) enterotoxines aan te maken en het
draagt een groot aantal aan kolonisatiefactoren die adhesie aan intestinaal epitheel mogelijk
maakt (Croxen et al, 2013). De infectieuze dosis aan ETEC bij volwassenen is minstens 108
cellen (Feng et al, 2011).
1.4.6.1.5 EIEC
In tegenstelling tot andere E. coli zijn EIEC niet beweeglijk, gaan ze geen lysine
decarboxyleren en fermenteren ze geen lactose (Feng et al, 2011). EIEC stammen hebben
sterke biochemische, genetische en pathogene gelijkenissen met Shigella. Toch is infectie bij
EIEC milder dan bij Shigella en is er een hogere dosis aan EIEC nodig voor infectie (Croxen
et al, 2013). Er is een dosis van minstens 106 EIEC organismen nodig om ziekte te
veroorzaken in gezonde volwassenen. EIEC zijn pathogenen omdat ze in staat zijn om het
darmweefsel binnen te dringen en het af te breken. Het wordt niet teruggevonden bij dieren,
30
waardoor besmetting altijd gebeurt via geïnfecteerde personen (Feng et al, 2011). Meestal
wordt het doorgegeven via gecontamineerd water of voedingsmiddelen of via direct contact
met een besmet persoon (Croxen et al, 2013).
1.4.6.2 SYMPTOMEN EN ZIEKTEVERLOOP
1.4.6.2.1 EPEC
EPEC kan resulteren in diarree, vaak gepaard met koorts, braken en
uitdrogingsverschijnselen. Deze symptomen treden vanaf 2,9 uur na inname van het wild-type
bacterie op. Meestal is er sprake van acute diarree, maar bij hardnekkige gevallen kunnen de
symptomen 2 weken duren (Croxen et al, 2013).
1.4.6.2.2 EAEC
EAEC infectie kan leiden tot waterige diarree, samengaand met lichte koorts, misselijkheid,
braken, buikpijn en af en toe bloederig feces. Bij kinderen en HIV-patiënten leidt EAEC tot
hardnekkige diarree die bij kinderen zelfs de groei en ontwikkeling kan afremmen (Croxen et
al, 2013).
1.4.6.2.3 STEC
De shiga toxine-producerende E. coli is een heterogene groep van organismen en het
ziektebeeld dat veroorzaakt wordt door een gastro-intestinale infectie hiervan is vrij
uiteenlopend (Auvray 2008). Zo kan dit leiden tot zowel milde tot bloederige diarree (Bugarel
et al, 2011) als HC, HUS en kan het uiteindelijk nierfalen veroorzaken (Auvray, 2008). De
incubatietijd bedraagt ongeveer 3 dagen. De eerste symptomen zijn meestal diarree samen
met koorts, buikkrampen en braken (Croxen et al, 2013).
1.4.6.2.4 ETEC
ETEC veroorzaakt milde tot ernstige waterige diarree die meestal niet bloederig is. Het heeft
symptomen die gelijkaardig zijn aan cholera en kan snel leiden tot dehydratatie. Naast diarree
kan er ook hoofdpijn, koorts, buikkrampen, misselijkheid en braken teweeggebracht worden.
De incubatietijd kan zeer kort zijn (zo’n 5 uur), maar meestal houdt ze 1 à 2 dagen in. De ziekte
zelf houdt 3 tot 5 dagen stand maar kan in ernstigere gevallen langer dan een week duren. Bij
kinderen onder de 2 jaar kan infectie leiden tot groeibeperkingen (Croxen et al, 2013).
1.4.6.2.5 EIEC
EIEC zal, net zoals Shigella, leiden tot shigellose, wat in een vroeg stadium kan leiden tot
waterige diarree, vermoeidheid, koorts en anorexia. Hiernaast kunnen ook buikkrampen,
bloederige feces, tenesmus en dehydratatie geconstateerd worden. In derdewereldlanden kan
shigellose aanleiding geven tot complicaties en uiteindelijk sterfte. Het kan ook voorkomen dat
na infectie patiënten te maken krijgen met prikkelbare darm syndroom (Croxen et al, 2013).
31
1.4.6.3 BEHANDELING
1.4.6.3.1 EPEC
Bij de meeste gevallen zijn de symptomen beperkt en kunnen ze behandeld worden met een
orale rehydratie therapie. In hardnekkige gevallen kan antibiotica gebruikt worden, maar hierbij
moet rekening gehouden worden met de antibioticaresistentie van EPEC. Zo zijn er EPEC
gevonden die resistent zijn tegen penicillines, cefalosporines en aminoglycosiden (Croxen et
al, 2013).
1.4.6.3.2 EAEC
EAEC is, afhankelijk van waar ter wereld de infectie zich voordoet, resistent aan bepaalde
antibiotica waar bij behandeling rekening mee moet gehouden worden. EAEC infecties worden
vaak behandeld met ciprofloxacin en andere fluoroquinolones. In de Verenigde Staten wordt
vaak rifaximine of azitromycine toegediend (Croxen et al, 2013).
1.4.6.3.3 STEC
Bij de meeste gevallen van STEC infectie stoppen de symptomen vanzelf na een week.
Behandeling van STEC houdt onder andere in om intraveneus vloeistoffen toe te dienen. Er
worden geen pijnstillers of antibiotica toegediend. Ook zijn er vaccinaties in ontwikkeling tegen
STEC (Croxen et al, 2013). Antibiotica kan echter de symptomen versterken en zo HUS
teweegbrengen doordat ze de productie en/of het vrijlaten van het Shiga toxine (Stx) verhogen
(Bielaszewska et al, 2012).
1.4.6.3.4 ETEC
Diarree geïnduceerd door ETEC is zelflimiterend en kan in de meeste gevallen behandeld
worden met orale rehydratie. Bij ernstige dehydratatie kan intraveneuze rehydratie nodig zijn.
Medicijnen die secretie gaan tegenhouden kunnen veilig gebruikt worden bij volwassenen,
samen met antimicrobiële stoffen. Antibiotica zoals fluoroquinolones, azitromycine en
rifaximine kunnen de duur van de infectie gaan inperken (Croxen et al, 2013).
1.4.6.3.5 EIEC
EIEC leidt tot shigellose, wat in de meeste gevallen zelflimiterend is zolang er genoeg
rehydratie is. Daarnaast kan een antibioticakuur ervoor zorgen dat de symptomen sneller
voorbij gaan en dat het risico op complicaties verminderd wordt. Antibiotica die hiervoor
gebruikt kunnen worden zijn azitromycine, 3de generatie cefalosporine, ceftriaxon en het
fluoroquinolon ciprofloxacine. Daarnaast kunnen ook zinksupplementen worden toegediend
(Croxen et al, 2013).
32
1.5 PCR DOELWITGENEN
Voor de PCR reacties zijn specifieke doelwitgenen nodig die zullen toelaten om via de TaqMan
Array Cards de verscheidene bacteriële gastro-enteritis pathogenen te identificeren. Deze
worden hieronder besproken per onderzocht species of genus.
1.5.1 C. DIFFICILE DOELWITGENEN
De pathogeniciteit van het organisme is geassocieerd met de productie van de 2 belangrijkste
toxines: het enterotoxine TcdA, gecodeerd door tcdA en het cytotoxine TcdB, gecodeerd door
tcdB (Persson et al, 2008). Beide genen maken deel uit van het pathogeniciteit locus (PaLoc)
operon (Jensen et al, 2015). Deze bevat ook tcdC, wat een mogelijks negatieve regulator is
van tcdA en tcdB (Persson et al, 2008). Er is vastgesteld dat wanneer dit tcdC gen enkele
deleties bevat, er sterkere expressie van het cytotoxine verkregen wordt (Wroblewski et al,
2009). De meeste pathogene stammen produceren zowel toxine A als B. Toch zijn er ook
pathogene stammen teruggevonden die enkel toxine B produceren (Bélanger et al, 2003).
Figuur 13: Genetische map van PaLoc in C. difficile. Toxinegenen worden weergegeven in het groen en
regulatorgenen in het rood (Carter et al, 2012).
Daarnaast zijn sommige C. difficile stammen in staat om het C. difficile binair toxine aan te
maken. Dit wordt gecodeerd door het cdtA (de enzymatische component) en cdtB (de
bindingscomponent) operon (Persson et al, 2008). De binair toxinegenen zorgen voor extra
kans op ziekteverschijnsel, sterfte en recidiviteit van de C. difficile infectie (Jensen et al, 2015).
cdtA en cdtB produceren samen het actine-specifiek ADP-ribosyltransferase dat schade
veroorzaakt aan het actine skelet, wat kan resulteren in structurele veranderingen in cellijnen
(Wroblewski et al, 2009). C. difficile stammen die de sterkste ziekteverschijnselen opwekken
zijn stammen die ofwel positief zijn voor het binair toxine, een 18-bp deletie bevatten in tcdC
of die resistent zijn tegen fluoroquinolones. Andere varianten die vaak ziekenhuisinfecties
veroorzaken zijn de C. difficile stammen die negatief zijn voor TcdA maar positief zijn voor
TcdB. Deze varianten hebben een deletie in het 3’-uiteinde van tcdA. Dit codeert voor het
ligand-bindend domein, wat ervoor zorgt dat ze moeilijk detecteerbaar zijn bij cultuur cytotoxine
assays. Ook is er aangetoond dat in Europa meer dan de helft van de labo’s ELISA testen
gebruiken die zich enkel richten op TcdA. Deze testen zijn gebaseerd op het herkennen van
het ligand-bindend domein, wat het onmogelijk maakt om C. difficile met een deletie in tcdA te
detecteren (Persson et al, 2008).
33
Naast de toxinegenen wordt er ook onderzoek gedaan naar het 16S rRNA specifiek voor C.
difficile. Dit zal de aanwezigheid van C. difficile bevestigen. Slechts 15% van de bacteriële
genomen bevatten 1 enkele 16S rRNA kopij en ongeveer de helft van de bacteriële genomen
bevatten 5 of meer 16S kopijen (Větrovský & Baldrian, 2013). Hierdoor zal de PCR reactie
gevoeliger zijn. Rainy et al (1996) hebben geconstateerd dat Clostridium paradoxum zelfs 15
kopijen van het 16S rRNA bevat.
C. difficile Ribotype 027 (RT027) is een belangrijk pathogeen bij mensen dat wordt
geassocieerd met het uitbreken van CDI in zowel Noord-Amerika als Europa. RT027 heeft een
aantal eigenschappen wat het een hypervirulent fenotype maakt, zoals een verhoogde
productie van grote Clostridium toxines (LCTs), de aanwezigheid van het binair toxine, een
verhoogde sporulatie, afwijkende vormen van tcdC, productie van toxine B varianten die een
verhoogd spectrum van cytotoxiciteit vertonen en mutaties in het DNA gyrase waardoor een
weerstand tegen fluoroquinolone verkregen wordt. Recente RT027 stammen bevatten extra
transcriptionele regulatoren, een uniek faageiland en een twee-componenten
regulatorsysteem. Naast deze nieuwe genen bevat RT027 ook een aantal puntmutaties en
nucleotide inversies in zijn coderende regio, wat waarschijnlijk veranderingen veroorzaakt in
gen functionaliteit en fenotype. Ook werd er vastgesteld dat RT027 weerstand tegen
fluoroquinolone kan verkrijgen op twee manieren, wat resulteert in 2 verschillende
afstammingen (FQR1 en FQR2) die een verschillende besmettingspatroon vertonen (Knight
et al, 2015).
1.5.2 SALMONELLA DOELWITGENEN
Voor specifieke detectie van Salmonella wordt vaak gezocht naar volgende genen: invA
(Salmonella invasion protein gene), fimA (major fimbrial subunit encoding gene), spv (virulence
gene), stn (enterotoxin gene), fliC (flagellin gene) en hilA (invasion gene transcriptional
activator). Sommige serotypes van Salmonella bevatten niet alle voorgaande genen. Ook
worden er soms vals positieve resultaten verkregen voor sommige van deze genen bij detectie
op niet-Salmonella stammen (Chen et al, 2010). Verscheidene studies hebben aangetoond
dat het invA gen en zijn mRNA goede targets zijn voor het detecteren van Salmonella in stalen
met qPCR (Zhang et al, 2011).Het invA gen bevindt zich op het Salmonella pathogeniciteit
eiland 1 (SPI 1) en doordat het verkregen wordt via horizontale gentransfer is het vaak instabiel
of afwezig in sommige serotypes zoals bv. Salmonella serotype Seftenberg (Tatavarthy &
Cannons, 2010). Het nadeel aan qPCR is dat er genoeg invA mRNA moet aanwezig zijn in
het staal om de Salmonella te kunnen detecteren. In bepaalde milieus kan het voorkomen dat
Salmonella wel overleeft, maar dat ze uitgehongerd voorkomt en onder hoge stress, waardoor
ze misschien niet het invA mRNA kan produceren (Zhang et al, 2011). Daardoor is het
belangrijk om bij real-time PCR detectie van Salmonella naast invA ook te testen op andere
targets zoals bv. het ompF (outer membrane porin F) gen (Tatavarthy & Cannons, 2010).
Uit de studie van Tatavarthy & Cannons (2010) bleek dat het ompF gen aanwezig is bij alle
Salmonella species en 100% afwezig bij niet-Salmonella stammen waarop getest werd.
Porines aan de buitenkant van het membraan laten substraten door het membraan van Gram-
34
negatieve organismen. Het porine ompF is een niet-specifiek kation-verkiezend porine en het
gen wordt beter tot expressie gebracht wanneer het organisme zich bevindt in een milieu met
lage osmolariteit.
Het ssaN (putative type III secretion ATP synthase) gen codeert voor een eiwit van 47.8 kDA
dat waarschijnlijk dient als energiebron voor het type III secretie systeem (Hensel et al, 1997).
SsaN is essentieel voor secretie en Salmonella virulentie (Yoshida et al, 2014).
1.5.3 CAMPYLOBACTER DOELWITGENEN
Aangezien bijna alle Campylobacter species een rol spelen bij het veroorzaken van gastro-
enteritis, is een genusspecifieke 16S rRNA gen qPCR een belangrijke detectie-methode voor
het opsporen van deze species in stoelgangstalen (de Boer et al, 2010). Daarnaast kan
confirmatie worden uitgevoerd voor de twee belangrijkste Campylobacter species
verantwoordelijk voor gastro-enteritis: C. jejuni en C. coli. Voor C. jejuni gebeurt de confirmatie
aan de hand van het mapA gen. Dit gen codeert een 24 kDa membraan-geassocieerd eiwit
dat specifiek is voor dit species. Bij C. coli wordt er gezocht naar primers en probe voor het
ceuE gen, wat voor een periplasmatisch substraatbindend eiwit van 34.5 kDa codeert (Best et
al, 2003).
1.5.4 SHIGELLA DOELWITGENEN
Bij real-time PCR detectie wordt voor Shigella vaak gezocht naar primers voor het multicopy
ipaH gen (invasion plasmid antigen H). Deze target genen zijn betrokken bij het invasieproces
van de pathogenen in de cel. Ze bevinden zich zowel in het bacterieel chromosoom als in het
invasie plasmide (Jimenez et al, 2010) en zijn aanwezig bij alle 4 de Shigella species (Thiem
et al, 2004). Ook is ze aanwezig in entero-invasieve E. coli (Jimenez et al, 2010). Virulente
Shigella sp. hebben een type III secretiesysteem dat effectoren aanbrengt in het cytosol van
de gastheercel waar ze zullen inwerken op mechanismen die het actine cytoskelet controleren
om zo invasie en cel tot cel verspreiding tot stand te brengen. Eén van deze effectoren is het
45 kDA eiwit VirA, wat ervoor zorgt dat er een pad gevormd wordt waardoor de bacterie zich
kan verplaatsen in het dichte cytoplasma van de gastheercel. VirA werkt als een cysteïne
protease dat α-tubuline selectief zal afbreken. Shigella varianten die het functionele virA gen
missen kunnen zich niet doorheen het cytoplasma verplaatsen, waardoor het doordringbaar
vermogen van deze virA mutanten verminderd wordt. Hierdoor wordt aanvaard dat virA
essentieel is voor virulentie bij Shigella.(Davis et al, 2008).
1.5.5 YERSINIA DOELWITGENEN
Pathogene Y. enterocolitica organismen worden geclassificeerd onder biogroep 1B en
biogroepen 2 tot 5. Biogroep 1B is een serotype met hoge virulentie (HV). Biogroepen 2 tot 5
hebben lage virulentie (LV). Pathogene serotypes die vaak teruggevonden worden in de
mens zijn O:8 en O:13, die beide worden ingedeeld in de HV groep (Lamps et al, 2006). Bij
vroegere real-time PCR detectie naar Y. enterolitica werd alleen gezocht naar het
chromosomaal gelegen ail (attachment and invasion locus) gen. Dit gen komt niet voor bij
stammen van biogroep 1A, die vroeger werden gezien als niet-pathogeen. In recente studies
35
werd echter aangetoond dat sommige stammen van biotype 1A toch mogelijk pathogeen
zijn. Deze stammen bevatten het yst (Yersinia stable toxin) gen (Wang et al, 2014). Virulentie
bij Y. enterocolitica ontstaat door een complexe interactie tussen genen die gelokaliseerd zijn
op zowel het plasmide als chromosomaal. De genen gelokaliseerd op het virulentieplasmide
zijn echter niet geschikt als PCR targets aangezien ze zeer onstabiel zijn (Lambertz et al,
2008). De chromosomale virulentie genen zijn het ystA gen, ystB gen en ail gen. De
plasmide genen zijn het yadA gen en het virF gen. Het ail gen komt enkel voor in pathogene
stammen van Y. enterocolitica en zorgt ervoor dat de bacterie zich kan vasthechten op de
gastheercel. Het ystA gen codeert voor de productie van het hitte-stabiele enterotoxine in Y.
enterocolitica. ystB codeert een enterotoxine dat voornamelijk voorkomt in biotype 1A
varianten van Y. enterocolitica. yadA speelt een rol bij autoagglutinatie, serumresistentie en
adhesie. virF codeert voor transcriptionele activators van het yop regulon (Thoerner et al,
2003).
1.5.6 E. COLI DOELWITGENEN
1.5.6.1 EPEC
Vele EPEC en STEC bevatten het chromosomaal eae gen, wat codeert voor het 94 kDa eiwit
intimine. Wanneer dit eiwit bindt op de intimine receptor, zorgt hij voor een betere binding van
de bacterie aan de gastheercel. EPEC en VTEC onderscheiden zich van elkaar door de
afwezigheid van het Shiga toxine-coderende gen (stx) bij EPEC (Abbasi et al, 2014). Detectie
van EPEC is gebaseerd op het screenen naar de aanwezigheid van eae en bfpA (bundle
forming pili) (Croxen, 2013). Men spreekt over typische EPEC (tEPEC) wanneer ze BFP
bevatten, gelocaliseerd op het EAF (EPEC adherence factor) plasmide. Atypische EPEC
(aEPEC) daarentegen zijn de LEE(locus for enterocyte effacement)-positieve stx-negatieve
bfp-negatieve E. coli stammen (Hazen et al, 2014). Intimine wordt gevonden in alle stammen
die A/E histopathologie induceren. De vorming van A/E laesies gebeurt bij de omverwerping
van de actine dynamiek binnen de gastheercel en wordt in de hand gewerkt door de interactie
tussen intimine en de bacteriële translocatie van de intimine recepter Tir (Croxen, 2013).
1.5.6.2 EAEC
De transcriptionele regulator van EAEC is aggR (aggregative adherence regulator). Ze
reguleert de expressie van meerdere vermeende virulentiefactoren, zoals aggregatieve
bindingsfimbriae (AAF), dispersine, de dispersine translocator Aat en het Aai type VI
secretiesysteem (Morin et al, 2013). Deze factoren spelen een rol bij de adhesie en bij de
toxine productie (Croxen et al, 2013). Uit onderzoek is gebleken dat stammen waarbij aggR
tot expressie komt meer kans hebben om diarree te veroorzaken (Morin et al, 2013). aggR is
aanwezig bij meer dan 70% van EAEC isolaten uit patiënten (Croxen et al, 2013).
1.5.6.3 STEC
STEC wordt gekarakteriseerd door de productie van twee cytotoxines, Shiga toxine 1 en 2
(Stx1 en Stx2) en in sommige stammen de aanwezigheid van het LEE locus, wat ervoor zorgt
36
dat ze kan aanhechten aan de cel en wonden kan toebrengen aan de cel (Abbasi et al, 2014).
Hun mogelijkheid tot productie van deze 2 cytotoxines is de oorzaak van de ernstige ziektes
waartoe ze kunnen leiden bij mensen (Auvray, 2008). De binding van de bacterie aan de
gastheercel wordt beïnvloed door de binding van intimine op de intimine receptor. Dit intimine
wordt geproduceerd door het eae gen (Abbasi et al, 2014).
1.5.6.4 ETEC
ETECs zijn toxinogeen door hun productie van hitte instabiele (LT) of hitte stabiele (ST)
enterotoxines. De ST toxines die gelinkt worden aan menselijke ziektebeelden kunnen verder
onderverdeeld worden in STh en STp subtypes. Hun DNA sequenties hebben slechts kleine
verschillen. De ST en LT toxines worden tot expressie gebracht door genen op bacteriële
plasmiden. Voor onderzoek naar ETEC worden er 3 primers gezocht voor de 3 toxinegenen
van ETEC: estA voor STh, estB voor STp en eltB voor LT. Bij ST-positieve DNA stalen is STh
sterker vertegenwoordigd. Bij onderzoek naar kinderen uit Bangladesh met diarree waren
slechts 7% van alle ST-positieve stammen STp-positief (Lothigius et al, 2008).
1.5.6.5 EIEC
Detectie gebaseerd op PCR gaat vaak zoeken naar het invasie plasmide antigen H (ipaH) en
het invasie-geassocieerd locus ial gen, wat aanwezig is bij zowel EIEC als Shigella species
(Croxen et al, 2013).
1.6 BESPREKING VAN DE METHODEN VOOR HET ONDERZOEK
1.6.1 DNA-EXTRACTIE
De DNA extractie wordt uitgevoerd met het QIAsymphony SP-toestel van Qiagen. Deze
geautomatiseerde manier om DNA te extraheren maakt het mogelijk om accuraat te
pipetteren, de DNA extractie blijft vrij van contaminaties en het is een robuuste, ergonomische,
kosteneffectieve en snelle methode (Gehrig et al, 2009). De DNA-extractie gaat door in
verschillende stappen:
Cellen worden gelyseerd en eiwitten worden gedenatureerd met
guanidiumisothiocyanaat (GITC).
Eiwitten worden gedegradeerd met proteïnase K en sodium dodecyl sulfaat (SDS).
De vrijgekomen nucleïnezuren worden gebonden aan magnetische silica-
micropartikels bij hoge natriumchlorideconcentratie.
Onzuiverheden worden weggewassen.
Nucleïnezuren worden geëlueerd in een buffer met lage natriumchlorideconcentratie.
Om eiwitten te denatureren wordt een chaotroop agent gebruikt die de secundaire, tertiaire of
quaternaire structuur verstoort maar de primaire structuur intact laat. De vaakst gebruikte
reagentia zijn guanidinium thiocyanaat (GTC) en GITC. Beide zijn sterke chaotrope agentia
die in staat zijn om nucleïnezuren te beschermen tegen degradatie. Echter kunnen deze
agentia ook zorgen voor precipitaatvorming, dat mogelijks zal adhereren aan het recipiënt.
37
Om de vorming van precipitaten te voorkomen wordt een eiwit degraderend component
toegevoegd. Meestal wordt hiervoor gebruik gemaakt van een proteolytisch enzym dat de
splitsing in peptidebindingen katalyseert bij eiwitten, polypeptiden, oligopeptiden en peptiden.
Bij deze extractie wordt gekozen voor proteïnase K. Proteïnase K is ook resistent tegen
denaturatie door anionische detergenten zoals SDS (Voss T, 2014). SDS is een detergent dat
ervoor zal zorgen dat celmembranen worden opgelost en dat de overgebleven proteïnen een
negatieve lading krijgen (Maervoet & Van Hoorde, 2015).
De vrijgestelde nucleïnezuren kunnen geëxtraheerd worden door binding aan een vaste fase,
gevolgd door een wasstap waarbij onzuiverheden worden weggewassen en tot slot elutie van
de nucleïnezuren. Voor deze vaste fase wordt gebruik gemaakt van magnetische silica
partikels. Bij aanwezigheid van een hoge concentratie aan chaotrope zouten wordt een
hydrofoob milieu verkregen wat de binding tussen nucleïnezuren en silica-partikels mogelijk
maakt. Ook wordt de binding nog extra versterkt doordat de silica-partikels gesatureerd
worden met een positieve lading door de hoge concentratie aan chaotrope zouten. Door te
werken met magnetische silicapartikels kan de afscheiding van deze partikels, gebonden met
nucleïnezuren, van onzuiverheden uitgevoerd worden door het aanleggen van een
magnetische veld. Voor elutie wordt een buffer gebruikt met een lage zoutconcentratie zodat
de nucleïnezuren opnieuw worden gescheiden van de silicapartikels (SourceBioscience,
2016).
1.6.2 REAL-TIME PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een efficiënte DNA amplificatietechniek, ontwikkeld door
Kary Mullis in 1985. Opdat de PCR zou kunnen doorgaan, moeten er een aantal componenten
aanwezig zijn in de oplossing: een zo zuiver mogelijk DNA (of RNA) template, buffer bij pH 8
om depurinisatie en DNA nicking te vermijden, Mg2+-ionen als cofactor van de meeste DNA
polymerasen, thermostabiel DNA polymerase, deoxynucleotiden (dNTP; 200µM (µM of nM)
van dATP, dGTP, dCTP en dTTP) en een forward en reverse primer die complementair zijn
aan 1 van de 2 DNA-strengen. Het best gekende DNA polymerase is het Taq polymerase,
afkomstig van de thermofiele Thermus aquaticus. Deze heeft echter enkel 5’-3’ exonuclease
activiteit en geen 3’-5’ exonuclease activiteit waardoor er tijdens de PCR cycli meer fouten
kunnen ingebouwd worden in de sequentie.
De PCR gaat door in verschillende stappen:
Initiële denaturatie: het DNA wordt gedenatureerd gedurende 2-5 minuten bij 95-
98°C door verbreking van de waterstofbruggen aanwezig in de dubbele helix.
Daarna worden er 20 tot 40 cycli uitgevoerd, bestaande uit 3 stappen
Denaturatie waarbij dsDNA wordt gescheiden tot 2 ssDNA ketens.
Primer annealing waarbij de aanwezige primers zullen hechten aan de
gedenatureerde DNA ketens. De annealingtemperatuur is 5°C lager dan de
smelttemperatuur van de primers, deze ligt meestal tussen 50-70°C.
Elongatie of primer extension waarbij het thermostabiele DNA polymerase zal
hechten aan het 3’-uiteinde van de primer waardoor dsDNA verkregen wordt
(Maervoet, 2014).
38
Dit gaat maximaal 40 cycli door, daarna bereikt de PCR een plateau waarbij de activiteit van
het polymerase daalt door uitputting van dNTP’s, door inhibitie door, de overmaat aan
aanwezig amplicon en door een verminderde activiteit van het enzyme. (Van Houdt, 2012).
Deze methode maakt een exponentiële vermeerdering mogelijk van de doelwitsequentie. Het
is een snelle, gevoelige en specifieke analysemethode (Maervoet, 2014).
Bij real-time PCR is het mogelijk om bij een PCR reactie het PCR product continu te volgen
na elke cyclus. De concentratie aan product kan worden gevolgd door het gebruik van een
fluorescent signaal in de reactiemix. Dit wordt voorgesteld aan de hand van een grafiek waarbij
de fluorescentie wordt uitgezet in functie van het aantal PCR cycli. Deze grafiek wordt in figuur
14 voorgesteld. De sterkte van het bekomen fluorescent signaal is gelinkt aan de hoeveelheid
gevormd product tijdens de PCR reactie. Aan het begin van de reactie kan het signaal niet
worden onderscheiden van de ruis. Het is maar na een aantal cycli dat er genoeg product is
aangemaakt zodat het signaal deze drempelwaarde, de baseline threshold, kan overschrijden
en gedetecteerd worden. De cyclus waar dit gebeurt wordt de kwantificatie cyclus of Cq
genoemd. Vanaf de Cq waarde zal het signaal exponentieel toenemen aangezien de
concentratie aan product theoretisch gezien verdubbelt na elke cyclus (Tawe,2014). Na een
bepaalde tijd zal de grafiek overgaan in een plateaufase waarbij geen product meer wordt
gevormd aangezien het TaqDNA polymerase geïnhibeerd wordt door de hoge concentratie
aan amplicon (Maervoet, 2014).
Figuur 14: theoretische voorstelling van een real-time PCR curve (Tawe,2014).
Zoals hierboven al werd aangegeven, wordt bij real-time PCR de fluorescentie-intensiteit
gemeten tijdens het amplificatieproces. Dit fluorescent signaal kan bekomen worden door
gebruik van specifieke of niet-specifieke labels (Tawe, 2014).
39
1.6.2.1 VOORWAARDEN WAARAAN PRIMERS MOETEN VOLDOEN
De primers die gebruikt worden bij qPCR moeten voldoen aan enkele voorwaarden. Zo moeten
ze een lengte hebben van 18 tot 25 nt en moet er 40 tot 60% GC’s aanwezig zijn. Ook moeten
complementaire sequenties aan het 3’ uiteinde van een primerpaar vermeden worden, dit om
de vorming van heterodimeren te voorkomen. Daarnaast moeten ze aan het 3’-uiteinde een
GC-klem hebben die uit niet meer dan 3 G’s of C’s mag bestaan. (Maervoet, 2014).
1.6.2.2 NIET SPECIFIEKE LABEL: SYBR
Als niet-specifiek label kan gewerkt worden met dsDNA bindende fluorochromen zoals SYBR
Green, picogreen en quentiflor dye, waarbij SYBR Green I het vaakst gebruikt wordt
(Maervoet, 2014). Zijn structuur wordt voorgesteld in figuur 15.
Figuur 15: Structuur SYBR Green I (Maervoet, 2014).
SYBR Green I is een assymmetrische cyanine kleurstof die niet-specifiek bindt met de kleine
groef van dubbelstrengig DNA en daarbij een fluorescent signaal kan uitzenden (Tawe, 2014).
Het absorbeert blauw licht (met λmax = 497 nm) en emitteert groen licht (met λmax = 520 nm) en
zijn fluorescentie-intensiteit ligt hoger wanneer ze gebonden is aan DNA waardoor een
verhoogde intensiteit kan gemeten worden tijdens de amplificatie (Maervoet, 2014). Het
werkingsprincipe wordt voorgesteld in figuur 16. Aangezien het niet specifiek is kan het ook
primer-dimers en contaminaties detecteren waardoor het beter is om de reactie te combineren
met een smeltcurve-analyse. Een primer dimer ontstaat wanneer 2 primers aan elkaar hechten
door aanwezigheid van complementaire basen in hun sequentie (Tawe, 2014).
40
Figuur 16: SYBR Green I mechanisme. SYBR Green I bindt niet aan enkelstrengig DNA waardoor geen signaal
wordt uitgezonden. Wanneer het DNA terug dubbelstrenging wordt door polymerisatie kan het SYBR Green I
wel binden en wordt er een fluorescent signaal gedetecteerd (Tawe, 2014).
Bij een smeltcurve-analyse wordt bepaald aan het eind van de PCR waarbij de negatieve
verandering van de fluorescentie-intensiteit wordt uitgezet ten opzichte van de temperatuur.
Tijdens de smeltcurve-analyse wordt de temperatuur steeds verhoogd en wanneer ze de
smelttemperatuur (Tm) van het amplicon bereikt zal ze worden gedenatureerd, komt SYBR
Green vrij en zal de intensiteit van het fluorescentie-signaal dalen. Deze Tm kan bepaald
worden met de formule van Walace en is voornamelijk afhankelijk van het GC-gehalte. De
smeltcurve geeft de specificiteit van de PCR weer, aangezien er bij een zuiver amplicon slechts
1 piek te zien zal zijn, ter hoogte van zijn Tm. Wanneer er echter primerdimers gevormd zijn
of als er contaminatie aanwezig is, zullen meerdere pieken verkregen worden. (Maervoet,
2014). In figuur 17 wordt een voorbeeld van een smeltcurve-analyse weergegeven.
Figuur 17: Smeltcurve-analyse voor een homozygoot wild type, homozygote mutant en een heterozygoot
(Hoffman et al, 2007).
41
1.6.2.3 SPECIFIEKE LABEL : PROBE (MGB)
Bij een specifiekere qPCR zal men werken met probes die gelabeld zijn met een fluorochroom.
Hiervoor kan gewerkt worden met een TaqMan probe, dit zijn sequentie-specifieke
oligonucleotiden met aan hun 5’ uiteinde een fluorofoor (reporter) en aan hun 3’ uiteinde een
niet-fluorescerende quencher (Tawe, 2014). De emissiegolflengte van de reporter stemt
overeen met de excitatiegolflengte van de quencher (Maervoet, 2014). De quencher zal de
fluorescentie van het fluorofoor uitdoven wanneer het fluorofoor en de quencher zich dicht bij
elkaar bevinden. De TaqMan probe kan aanhechten aan zijn complementaire sequentie op
het target DNA net voor de primerannealing stap van de PCR waarbij nog steeds geen signaal
wordt gedetecteerd. Daarna zorgt de 5’-3’ exonuclease activiteit van het Taq DNA polymerase
tijdens de elongatiefase ervoor dat de probe wordt afgebroken, waarbij quencher en fluorofoor
van elkaar worden losgemaakt. Hierdoor is de afstand tussen quencher en fluorofoor groot
genoeg waardoor het fluorescent signaal kan gedetecteerd worden bij de golflengte die
overeenkomt met de emissie-golflengte van de reporter. Het werkingsprincipe van de TaqMan
probe wordt voorgesteld in figuur 18 (Tawe, 2014).
Figuur 18: TaqMan probe mechanisme (Tawe, 2014).
Het werken met een TaqMan probe heeft een aantal voordelen, zoals het creëren van een
grotere specificiteit door de selectiviteit van de probe, de lage detectielimiet en de mogelijkheid
om probes met verschillende fluorochromen in één reactie toe te voegen. (Maervoet, 2014).
Minor groove binders (MGB) zijn een groep DNA probes die kunnen binden aan dsDNA. Ze
zijn lange, platte moleculen die bestaan uit een aantal subunits, bij elkaar gehouden door
peptiden die de vorm kunnen aannemen van een halve maan. Door hun halve-maan structuur
kunnen ze in de kleine groef van het dsDNA passen. Daar worden ze gestabiliseerd door
hydrofobe interacties. Wanneer het MGB wordt toegevoegd aan het 5’-uiteinde van een DNA
probe, kan ze tijdens de synthese binden in de kleine groef en zorgt ze voor een stabilisatie
van het probe-target complex (Corpus, 2010), waardoor kortere probes gebruikt kunnen
worden. Aangezien het gevormd complex stabieler is, zal een hogere temperatuur nodig zijn
om de strengen te doen dissociëren. Ook zal bij het gebruik van MGB de specificiteit
bevorderen (Kutyavin et al, 2000). Door het gebruik van MGB zal een lagere
42
achtergrondfluorescentie verkregen worden. Deze gaat iets stijgen met een langere
probelengte maar is nog steeds lager dan bij probes zonder MGB (Crocker & Murray, 2003).
1.6.3 GELELEKTROFORESE
Gelelektroforese is een techniek die gebruikt wordt om macromoleculen (voornamelijk eiwitten
en nucleïnezuren) van elkaar te scheiden of op te zuiveren. Dit wordt gedaan op basis van
grootte of lading. De stalen worden geplaatst op een matrix die ondergedompeld wordt in een
buffer om de pH constant te houden. Deze buffer zorgt ook voor ionen die de conductiviteit
bevorderen. Meestal wordt gebruik gemaakt van Tris-acetaat-EDTA (TAE) of Tris-boraat-
EDTA (TBE) als buffer. Hierover wordt een elektrisch veld aangelegd waardoor de moleculen
worden aangetrokken tot ofwel de negatieve of positieve pool. Aangezien nucleïnezuren een
negatieve lading hebben door hun aanwezige fosfaatgroepen, zullen ze worden aangetrokken
tot de positieve pool. Eiwitten kunnen zowel positief als negatief geladen zijn. Daarnaast is er
ook een verschil in migratie op basis van confirmatie. DNA komt voor in 3 confirmaties:
supercoiled, lineair en circulair. Wanneer DNA dezelfde massa heeft maar voorkomt in
verschillende confirmaties zal ze sneller migreren wanneer ze supercoiled is en circulair DNA
zal het traagst migreren. Dit komt doordat supercoiled DNA kleiner is waardoor ze minder
weerstand ondervindt van de gel. Hierop is ook de scheiding op grootte op gebaseerd: hoe
kleiner de molecule, hoe sneller ze zal migreren.
De matrix die gebruikt wordt is in het algemeen een agarose- of polyacrylamidegel. Agarose
is een polysacharide die aangemaakt wordt uit zeewier. Er wordt voornamelijk gebruik
gemaakt van 0.5 tot 2% gels. Hierdoor kunnen DNA-fragmenten van 200 tot 50 000 baseparen
gescheiden worden. Een hogere concentratie aan agarose wordt gebruikt voor een scheiding
van kleinere DNA-fragmenten en vice versa. Agarosegels zijn niet toxisch en hebben een grote
scheidingsrange. Echter hebben ze wel een relatief lage resolutie.
Polyacrylamide is een cross-linkpolymeer van acrylamide. De lengte van deze polymeerketens
hangt af van de gebruikte concentratie aan acrylamide. Deze ligt meestal tussen 3.5 en 20%.
Polyacrylamidegels zijn moeilijker om mee te werken aangezien zuurstof de polymerisatie
inhibeert. Ook is acrylamide een neurotoxine. Polyacrylamide is op zich niet toxisch maar moet
nog steeds voorzichtig worden behandeld aangezien het mogelijk is dat er vrij acrylamide in
aanwezig is. Polyacrylamidegels hebben een kleinere scheidingsrange dan agarosegels maar
hebben een zeer hoge resolutie. Ze worden voornamelijk gebruikt bij het scheiden en
karakteriseren van proteïnemengsels.
De stalen worden op de matrix aangebracht met een ladingsbuffer die glycerol en een kleurstof
(bv. Broomfenolblauw) bevat. De glycerol is een dichte stof die het staal in de well doet zakken
en de kleurstof zorgt ervoor dat de migratie van het staal makkelijker kan gevolgd worden.
Daarnaast is er ethidium bromide aanwezig in de gel die het mogelijk maakt om de DNA
fragmenten te visualiseren. Het is een fluorescente kleurstof die intercaleert met DNA en RNA.
Ethidium bromide is een gekend mutageen dus het is noodzakelijk om steeds met
handschoenen te werken. Om het DNA zichtbaar te maken moet de gel geplaatst worden
onder UV-licht (Bowen, 2000).
43
1.6.4 DNA SEQUENTIEBEPALING
Sanger en Gilbert ontwikkelde sequenering met ofwel ketenafbraak ofwel chemische
fragmentatietechnieken, gekoppeld aan scheiding naar grootte gebaseerd op elektroforese.
De Sanger methode gebruikt dideoxynucleotide trifosfaten (ddNTPs) als DNA keten
terminators. Deze wordt vaker gebruikt dan de Maxam-Gilbert chemische
fragmentatietechnieken aangezien de Sanger methode efficiënter is, er minder toxische
chemicaliën gebruikt worden en dat ze minder radioactief is (Karger & Guttman, 2009).
ddNTP’s zijn dideoxyribonucleotides en bevatten geen hydroxyl-groep aan hun 3’-uiteinde.
Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd in een sequentie, kan de DNA-keten niet verder
verlengd worden en ligt de reactie stil. De concentratie aan dNTP’s ligt wel een stuk hoger dan
die van ddNTP’s (Seqcore, 2015).
De klassieke ketenafbraak methode is gelijkaardig aan een PCR, hierbij wordt een DNA primer
gebruikt die radioactief of fluorescent gelabeld is, een enkelstrengig (ss) template, een DNA
polymerase enzym en zowel deoxy- als dideoxynucleotiden. Het template wordt opgedeeld in
4 aliquots waarin zich dATP, dGTP, dCTP, dTTP en DNA polymerase bevindt. Aan elke reactie
wordt 1 van de 4 keten afbrekende dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP of ddTTP)
toegevoegd zodat deze aan het einde van een DNA fragment worden geplaatst tijdens de
elongatiereactie. Hierdoor worden DNA fragmenten verkregen van verschillende lengtes.
Deze worden gedenatureerd door een hittereactie en worden gescheiden aan de hand van
gelelektroforese met een polyacrylamidegel. De 4 reacties werden in 4 laantjes van een
elektroforesegel gebracht (lanen A, T, G en C) waarna de DNA bandjes werden gevisualiseerd
door middel van autoradiografie of UV-licht. De sequentie kon dan manueel bepaald worden
aan de hand van het patroon van de 4 parallelle runs. Deze methode kan geautomatiseerd
worden aan de hand van fluorescent gelabelde ddNTP’s of capillaire elektroforese (Karger &
Guttman, 2009).
Figuur 19: Bekomen resultaat bij DNA sequenering volgens Sanger met fluorescent gelabelde ddNTPs. De 4
ddNTPs zijn telkens gelabeld met een verschillend kleur. De keten elongatie gaat door totdat een ddNTP zich
vasthecht aan het fragment. Hierdoor wordt een mix aan fragmenten bekomen met een verschillende lengte en
deze worden gescheiden van elkaar door middel van gelelelektroforese op basis van grootte. De DNA sequentie
kan worden afgeleid van het bekomen kleurpatroon (Fei, 2014).
44
Bij geautomatiseerde DNA sequencers kan de klassieke elektroforesegel vervangen worden
door capillaire elektroforese. Hierbij wordt het DNA sequeneringsproduct tijdens de
elektroforese in het glasvezel capillair gebracht door middel van elektrokinetische injectie. Er
wordt een hoge spanning aangelegd gedurende korte tijd over de sequeneringsreactiebuffer
die de negatief geladen fragmenten in het capillair zal duwen. De sequenties worden
gescheiden op basis van hun totale lading en verlaten het capillair gerangschikt volgens
grootte. Een ultraviolet laser ingebouwd in de sequencer bestraalt het product nadat het de
elektroforese is doorgelopen om fluorescentiesignalen te kunnen opvangen. De computer kan
dan een plot van het staal genereren, waarbij de fragmenten gerangschikt worden van kortste
naar langste. Door interpretatie van het fluorescentiesignaal kan de nucleotide sequentie
bepaald worden (Fei, 2014) (GenSeq, 2015). Een fragment van zo’n plot wordt voorgesteld in
figuur 20.
Figuur 20: Fragment van een DNA sequentie file (GenSeq, 2015).
45
2. MATERIAAL EN METHODEN
2.1 SELECTIE VAN PRIMERS EN PROBES
De selectie van de gebruikte primers en probes in deze masterproef werd gedaan op basis
van een aantal gepubliceerde artikels, waarop hieronder verder zal worden ingegaan. De
sequenties van deze primers en probes en de eventuele wijzigingen van de sequenties die
deze hebben ondergaan zullen hier niet worden weergegeven in verband met confidentialiteit.
2.1.1 CLOSTRIDIUM DIFFICILE
De gebruikte primers voor Clostridium difficile worden gegeven in tabel 3.
Tabel 3: Te testen primers voor Clostridium difficile
Forwarda Reverseda Referentieb
16S p503 p506 Mutters et al, 2009
Clostridium difficile Toxine A enterotoxin
einde tcdA gen p510 p511 eigen ontwerp
begin tcdA gen p512 p513 Jensen et al, 2015
begin tcdA gen p514 p515 Wroblewski et al, 2009
Clostridium difficile Toxine B cytotoxin
p516 p517 Jensen et al, 2015
p518 p519 Wroblewski et al, 2009
p526 p527 van den Berg et al, 2006
Clostridium difficile Binair Toxine
C. difficile Binair Toxine A enzymatic component p520 p521 Wroblewski et al, 2009
C.difficile Binair Toxine A enzymatic component p522 p523 Jensen et al, 2015
C. difficile Binair Toxine B binding component p524 p525 Wroblewski et al, 2009
a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen
2.1.2 SALMONELLA
De uit te testen primers voor Salmonella spp zijn samengevat in tabel 4.
Tabel 4 : Te testen primers Salmonella spp.
Forwarda Reverseda Referentieb
ompF (outer membrane porin F gene) p568 p569 Josefsen et al, 2004; Soli et al, 2010
ttr (The genes ttrA, ttrB, and ttrC encode the tetrathionate reductase structural proteins)
p570 p571 Bruijnesteijn & van Coppenraet, 2015; de Boer et al, 2010; Lin et
al, 2011 ttr p572 p573 Omiccioli et al, 2009 invA (Salmonella invasion protein gene) p574 p575 Zhang et al, 2011 invA p576 p577 Liu et al, 2013 ssaN (putative type III secretion ATP synthase gene (ssaN).)
p578 p579 Chen et al, 2010
a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen
46
2.1.3 CAMPYLOBACTER
De uit te testen primers voor Campylobacter spp zijn samengevat in tabel 5.
Tabel 5: Te testen primers Campylobacter.
Forwarda Reverseda Referentieb
16S (5 species: jejuni, coli, lari, upsaliensis, hyointestinalis) p556 p558 Boer et al, 2013
16S (5 species: jejuni, coli, lari, upsaliensis, hyointestinalis) p556 p559 Boer et al, 2013
16S (5 species: jejuni, coli, lari, upsaliensis, hyointestinalis) p557 p558 Boer et al, 2013
16S (5 species: jejuni, coli, lari, upsaliensis, hyointestinalis) p557 p559 Boer et al, 2013
16S (All) p560 p561 Boer et al, 2013
Campylobacter jejuni
cadF (Campylobacter adhesin to fibronectin) p562 p563 Elfving et al, 2014
mapA (a species-specific 24-kDa membrane-associated protein)
p564 p565 Elfving et al, 2014
Campylobacter coli
ceuE(encoding a periplasmic substrate binding protein) p566 p567 Boer et al, 2013
a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen
2.1.4 SHIGELLA
De uit te testen primers voor Shigella spp zijn samengevat in tabel 6.
Tabel 6: Te testen primers Shigella.
Forwarda Reverseda Referentieb
ipaH p627 p628 Eigen ontwerp
virA p629 p630 Al-Talib et al, 2014
a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen
2.1.5 YERSINIA
De uit te testen primers voor Yersinia spp zijn samengevat in tabel 7.
Tabel 7: Te testen primers Yersinia spp.
Forwarda Reverseda Referentieb
Enterotoxin Yst precursor p646 p647 Elfving et al, 2014 Heat-stable toxin yst p648 p650 Bruijnesteijn &
van Coppenraet, 2015
Heat-stable toxin yst p649 p651 Eigen ontwerp yst p652 p653 Cremonesi et al,
2014 ail (Y. enterocolitica attachment invasion locus gene) p654 p655 Lambertz, 2008
a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen
47
2.1.6 ESCHERICHIA COLI
De uit te testen primers voor Escherichia coli zijn gegeven in tabel 8.
Tabel 8: Te testen primers Escherichia coli.
Forwarda Reverseda Referentieb
EPEC eae (outer surface protein intimin) p580 p581 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 eae p582 p583 Nielsen & Andersen, 2003 bfpA (bundle-forming pilus encoded by the EPEC adherence factor (EAF) plasmid)
p584 p585 Hardegen et al, 2010
bfpA p586 p587 Liu et al,2013 bfpA p588 p589 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 EAEC aggR p590 p591 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 STEC stx1 (Shiga-like toxin ) p593 p596 de Boer et al, 2010 stx1 p594 p596 de Boer et al, 2010 stx1 p595 p596 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 stx1 p597 p599 Liu et al, 2013 stx1-O157:H7 p598 p600 Sharma & Dean-Nystrom,
2003 stx2 p601 p603 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 stx2 p602 p603 de Boer et al, 2010 stx2 p604 p605 Jinneman, 2003 ETEC estA p606 p608 Elfving et al, 2014 estA (Heat-stable enterotoxin I) p606 p609 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 estA p606 p610 Lothigius et al,2008 estA p606,1 P610 Lothigius et al,2008 estA p606,2 p610 Lothigius et al,2008 estA p607 p608 Lothigius et al,2008 estA p607 p609 Lothigius et al,2008 estA p607 p610 Lothigius et al,2008 estB (STp) p611 p612 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 estB (STp) p611 p613 Lothigius et al,2008 eltB (LT) p614 p615 Elfving et al, 2014 eltB (LT) p616 p617 Liu et al, 2013 ETEC LT p618 p619 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015 Escherichia coli LT gen. Heat-stable toxin eltB p618 p620 Lothigius et al, 2008 lt p621 p622 Soli et al, 2014 LT gene LT-1 for p621 p623 Hardegen et al, 2010 EIEC ipaHc p624 p626 Liu et al, 2013 Shigella spp./EIEC Invasive plasmid ipaH 10 p625 p626 Bruijnesteijn & van
Coppenraet, 2015; Thiem et al,2004
a: enkel primercode wordt weergegeven (geen sequentie) wegens confidentialiteit. b: referentie waarop gebaseerd werd om de primers verder te ontwikkelen
48
De primers en probes worden aangekocht in concentraties van 100 pmol/µl en bewaard bij -
30°C.
2.2 REINCULTUREN
De verschillende bacteriële stammen gebruikt tijdens de validatie van de verschillende PCRs
zijn afkomstig van het UZ Brussel (C. difficile), werden aangekocht bij het ATCC of maken deel
uit van een eigen collectie van stammen geïsoleerd uit klinische stalen. Deze reinculturen zijn
verzameld in tabellen 9 tot 13.
Tabel 9: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Clostridium difficile 16S tcdA tcdB binA binB
898 + - + - -
901 + + + + +
902 + + + - -
5475 + + + - -
5476 + - + - -
5477 + + + + +
Tabel 10: Overzicht reinculturen Salmonella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Salmonella spp ompF ttr ssaN
ATCC 14028 (S. enterica) + + + 3A9 53 (S. enteritidis) + + + 3A9 87 (S. groep B) + + + 3A9 86 (S. groep C) + + + 3A9 02 (S.D.) + + + 3A9 82 (S. groep D) + + +
Tabel 11: Overzicht reinculturen Campylobacter en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Campylobacter spp 16S cadF (C. jejuni) ceuE (C. coli)
3A9 15 (C. jejuni) + + -
3A9 23 (C. jejuni) + + -
ATCC 33291 (C. jejuni) + + -
3A9 42 (C. coli) + - +
3A9 89 (C. coli) + - +
3A9 75 (C. coli) + - +
Tabel 12: Overzicht reinculturen Shigella en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Shigella spp ipaH virA
3A8 74 (S. boydii) + +
3A9 09 (S. flexneri) + + ATCC 12022 (S. flexneri) + + ATCC 25931 (S. sonnei) + +
49
Tabel 13: Overzicht reinculturen Yersinia en de genen waarvoor ze verondersteld positief/negatief zijn.
Yersinia enterocolytica yst ail
ATCC 23715 (Y. enterocolitica) + + 3A9 86 (Y. enterocolitica) + + 3A8 89 (Y. pseudotuberculosis) + + 1C6 87 (Y. enterocolitica) + + 1C6 88 (Y. enterocolitica) + + 1C6 93 (Y. enterocolitica) + + 1C6 97 (Y. enterocolitica) + + 1C6 99 (Y. enterocolitica) + + 1C8 02 (Y. enterocolitica) + + 1C6 92 (Y. pseudotuberculosis) + +
2.3 VIRCELL DNA CONTROLES
Voor Escherichia coli werd gebruik gemaakt van Vircell DNA controles. Deze worden
gegeven in tabel 14.
Tabel 14: Weergave vircell DNA controles en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.
Escherichia coli eae bfpA aggR stx1 stx2 estA eltB ipaH
MBC121 (EAEC) - - + - - - - -
MBC122 (EIEC) - - - - - - - +
MBC123 (EPEC) + - - - - - - -
MBC124 (ETEC) - - - - - + - -
MBC022 (STEC) - - - + + - + -
2.4 FECESSTALEN
Tabel 15 geeft alle klinische stalen weer die gebruikt werden tijdens de specificiteitsstudie. De
resultaten weergegeven in tabel 15 is gebasseerd op basis van klassieke bacteriologische
kweekprocedures en Gen Expert resultaten (voor C. difficile) binnen het labo bacteriologie van
het AZ Sint Jan Brugge.
50
Tabel 15: Gebruikte fecesstalen.
Feces Species gedetecteerd Feces Species gedetecteerd
163596001 Shigella flexneri 215900401 Campylobacter jejuni
164942201 Shigella sonnei 215985201 Campylobacter coli
177573801 Shigella sonnei 217853301 negatief
185922001 Shigella flexneri 219264001 Yersinia enterocolitica
199236701 Shigella boydii 221398528 Shigella boydii
208897001 Yersinia enterocolitica 223679901 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine
209571701 Campylobacter jejuni 224940501 Alle C. difficile genen
209873401 Salmonella typhimurium 225059901 Alle C. difficile genen
210635301 negatief a 225561501 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine
210945301 negatief 231048601 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine
212258801 negatief 231459301 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine
212380801 Alle C. difficile genen 233842501 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine
212404201 negatief 234337701 Alle C. difficile genen
212407201 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine
234557701 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine
212410501 negatief 234698701 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine
212449101 Alle C. difficile genen 235433201 C. difficile 16S, negatief voor toxine A en B en binair toxine
212478401 Alle C. difficile genen 235540101 Alle C. difficile genen
212483101 negatief 236400101 Alle C. difficile genen
212484301 negatief 236642001 Alle C. difficile genen
213467001 C. difficile 16S, toxine A en B 236690501 negatief
214521901 Alle C. difficile genen 236704101 negatief
215252501 Campylobacter jejuni 236704601 negatief
215548201 C. difficile positief 16S, toxine A en B, negatief voor binair toxine
236716901 negatief
a negatief: geen pathogene species werden gedetecteerd a. d. h. v. de klassieke kweekprocedures binnen het
labo bacteriologie
2.5 MASTERMIXEN
2.5.1 SYBR® SELECT MASTER MIX
De primers worden aangekocht in concentraties van 100 pmol/µl en bewaard bij -30°C. Als
mastermix wordt hier gebruik gemaakt van de SYBR Select Mastermix (Thermofischer,
cataloog nr 4472908), deze wordt aangekocht in een dubbele concentratie. De samenstelling
van deze mastermix is terug te vinden in tabel 16. De mastermix wordt bewaard bij 4°C.
51
Tabel 16: Bestanddelen SYBR® Select Master Mix (Life Technologies, 2015).
Bestanddelen
SYBR® GreenER™ dye
AmpliTaq® DNA Polymerase UP
dNTPs met een dUTP/dTTP mix
hitte-labiel UDG
ROX dye (passieve referentie)
geoptimaliseerde buffer componenten
Als DNA-staal kan er gebruik gemaakt worden van opgekweekte culturen of fecesstalen.
Beiden worden eerst geëxtraheerd volgens onderstaande werkwijze.
2.5.2 TAQMAN® FAST VIRUS 1-STEP MASTER MIX
Als mastermix wordt hier gebruik gemaakt van de FAST Mastermix (Thermofischer, cataloog
nr. 4444432). De samenstelling van deze mastermix is terug te vinden in tabel 17.
Tabel 17: Bestanddelen TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix (Thermofischer, 2012).
Bestanddelen
AmpliTaq® Fast DNA Polymerase
Thermostabiel MMLV enzym
dNTPs (dATP, dGTP, dCTP en dTTP)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor
ROX™ dye (passieve referentie)
Buffer componenten, geoptimaliseerd voor maximale gevoeligheid en tolerantie naar verschillende vaak voorkomende RT-PCR inhibitoren
Deze mastermix wordt geleverd in 4X concentratie.
2.6 DNA-EXTRACTIE
2.6.1 BENODIGDHEDEN
DNA-extracties worden uitgevoerd met de QiaSymphony van Qiagen. Hierbij kan gebruik
gemaakt worden van 2 extractieprotocollen: het pathogen complex 400 en het pathogen
complex 800. In deze thesis werd telkens gebruik gemaakt van het pathogen complex 800.
Hierbij wordt telkens 800 µl staal geëxtraheerd en geëlueerd in 110 µl.
2.6.2 WERKWIJZE
2.6.2.1 EXTRACTIE VAN FAECES MATERIAAL
Bij een lopend faeces-staal wordt ongeveer 100 µl staal overgebracht naar een Sarstedt-tube.
Wanneer het staal een vaste consistentie heeft, wordt met een oogentnaald een kleine
hoeveelheid overgebracht naar een Sarstedt-tube. Deze stalen worden dan aangelengd met
DNAzol Reagent (lifetechnologies) tot 1 ml. Hierbij wordt gezorgd dat de stalen steeds
52
gehomogeniseerd worden door te vortexen. Als het hierna nog niet mogelijk is om een
homogeen staal te verkrijgen, wordt er zoveel mogelijk van de vloeibare fase overgebracht in
een nieuwe Sarstedt-tube en opnieuw aangelengd tot 1 ml. Voor de Qiasymphony is het
belangrijk dat er minimaal 950 en maximaal 1300 µl aanwezig is in de Sarstedt-tube.
2.6.2.2 EXTRACTIE VAN REINCULTUREN
Voor reinculturen wordt er met een oogentnaald een kleine hoeveelheid overgebracht naar
een Sarstedt-tube. Deze stalen worden dan aangelengd met DNAzol Reagent
(lifetechnologies) tot 1 ml. Hierbij wordt gezorgd dat de stalen steeds gehomogeniseerd
worden door te vortexen. Voor de Qiasymphony is het belangrijk dat er minimaal 950 en
maximaal 1300 µl aanwezig is in de Sarstedt-tube.
2.6.2.3 EXTRACTIE OP QIASYMPHONY
De QIAsymphony wordt aangeschakeld. Dit wordt uitgevoerd door de reagent cartridges
“QIAsymphony Virus/Pathogen Midi kit en verbruiksgoederen te laden in de “Reagents and
Consumables” lade. De magnetische particles worden gevortexed en teruggeplaatst in de
cartridge. De deksels worden verwijderd en de proteïnase K wordt geplaatst op de cartridge.
Daarna wordt de ATL-buffer geplaats op het toestel en de cartridge in het toestel. Daarbij moet
gecontroleerd worden dat de “Waste” lade goed voorbereid is door een “inventory scan” uit te
voeren op de “Waste” lade.
Het vereiste elutie rek wordt geladen in de “Eluate” lade en de stalen in de “sample” lade. De
tube(s) die interne controle–carrier RNA–Buffer AVE mixture bevatten moeten in slot A van de
"Sample" lade geplaatst worden. Daarna wordt de nodige informatie voor iedere batch van
stalen ingegeven: staalinformatie, PDV, protocol en elutievolume. Om op te starten wordt op
de “Run” button gedrukt. Na extractie wordt het elutie rek met gezuiverd nucleïnezuur van de
“Eluate” lade verwijderd. Het eluaat wordt in de koelkast bewaard bij 4°C.
2.7 REAL-TIME PCR MET SYBR SELECT MASTERMIX + SMELTCURVEANALYSE
De aangekochte primers (100 pmol/µl) worden met molecular grade water 5 keer verdund tot
20 pmol/µl in Sarstedt-tubes. De PCR-mixen worden aangemaakt volgens tabel 18 en 19
naargelang de gewenste concentratie. Dit is de samenstelling voor 1 PCR-reactie.
Tabel 18: Samenstelling PCR-mix voor 300 nm
Samenstelling 1 reactie (µl) Finale Concentratie
Forward primer (20 pmol/µl) 0,3 300 nM
Reverse primer (20 pmol/µl) 0,3 300 nM
SYBR select mastermix (2x) 10 1x
DNA extract 5
Molecular grade water 4,4
totaal 20
53
Tabel 19: Samenstelling PCR-mix voor 1000 nm
Samenstelling 1 reactie (µl) Finale Concentratie
Forward primer (20 pmol/µl) 1 1000 nM
Reverse primer (20 pmol/µl) 1 1000 nM
SYBR secret mastermix (2x) 10 1x
DNA extract 5
Molecular grade water 3
totaal 20
Deze mix wordt aangemaakt voor het gewenste aantal reacties + 1. De mix wordt ook
gemengd door de tube een paar keer te inverteren. Daarna ondergaat de tube ook een short
spin centrifugatie zodat het totale volume naar de bodem zakt. Van deze mix wordt per PCR-
reactie 15 µl overgebracht naar MicroAmpTM optical 8-cap strips of naar een MicroAmpTM
Optical 96-Well reactieplaat. Hierna wordt aan iedere well het gewenste geëxtraheerde DNA-
staal toegevoegd. Er wordt telkens 5 µl toegevoegd aan elke well. De plaat of strips worden
afgesloten met optical covers of een optical seal, daarna worden ze eerst kort gevortexd en
ondergaan ze een short spin centrifugatie. De reactie wordt uitgevoerd met het ViiA7 RT-PCR
reactietoestel van Life Technologies. Hierna worden ze in de ViiA7 geplaatst voor de run. Deze
ondergaat een proces, terug te vinden in figuur 21.
Figuur 21: PCR cycli voor real-time PCR met SYBR select mastermix + smeltcurveanalyse
2.8 EFFICIËNTIEBEPALING
Per pathogeen wordt gewerkt met 1 of 2 reinculturen waarvan een reeks van 10-voudige
verdunningen wordt opgesteld. De reacties worden uitgevoerd in een Real-Time PCR reactie
met SYBR Select mastermix en een primerconcentratie van 1000 nM. De Ct-waarden die door
deze verdunningsreeks gegenereerd worden, hier met fictieve waarden voorgesteld in tabel
20, worden grafisch uitgezet. De richtingscoëfficient van deze grafiek wordt gebruikt om de
54
efficiëntie van de PCR te bepalen. De dynamische range stelt het aantal opeenvolgende Ct-
waarden voor die bekomen worden door amplificatie van opeenvolgende targetverdunningen.
Ze worden gebruikt om de resultaten te standaardiseren (Sigma-Aldrich, 2008;
Vandesompele, 2013).Hier wordt gebruik gemaakt van een dynamische range van 6 waarden.
Ideaal wordt er gebruik gemaakt van 7-8, maar 5 waarden zijn voldoende.
Tabel 20: Voorbeeld met fictieve waarden voor bepaling van de efficiëntie.
Verdunningen
primers staal 10x 100x 1000x 10000x 100000x 1000000x neg
FW-RV 1 20,01 23,55 28,31 32,07 34,95 NA NA
2 19,86 24,00 28,48 30,94 35,64 36,15 NA
Waarden uit bovenstaande tabel worden uitgezet in grafiek, voorgesteld hieronder in figuur 22.
Figuur 22: Grafische voorstelling efficiëntiebepaling.
De slope, ofwel de richtingscoefficiënt, die uit deze grafiek wordt gehaald, wordt gebruikt om
de efficiëntie te bepalen met volgende formule: 𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑖ë𝑛𝑡𝑖𝑒 = 101
𝑟𝑖𝑐𝑜 − 1 . Deze efficiëntie is
100% bij ideale omstandigheden. Factoren die een afwijking van 100% veroorzaken zijn de
lengte van de primers, het GC-gehalte van het amplicon, de secundaire structuren in primers,
probes en/of amplicon en de gebruikte concentraties (Vandesompele,2013).
Ook geeft de R2 of de correlatie coëfficiënt weer hoe goed de datapunten op de standaarcurve
liggen. Bij een R2-waarde lager dan 0.985 zijn de resultaten die bekomen zijn bij deze assay
niet betrouwbaar. De dynamische range is het verschil tussen de minimale en maximale
targetconcentratie die kan gedecteerd worden. De Y-intercept geeft aan welke theoretische
Ct-waarde bekomen zou worden wanneer één enkel target voor amplificatie zou zorgen. Er
y = -3,8408x + 16,261R² = 0,9939
y = -3,8512x + 16,235R² = 0,993
15
20
25
30
35
40
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
Ct
Concentratie (log)
Efficiëntiebepaling
1
2
55
wordt een efficiëntie gewenst van 90%-110%. (vandesompele 2013)(Sigma-Aldrich, 2008;
Vandesompele, 2013).
Fig 24: Voorbeeld van een verkregen amplificatiecurve van een goede verdunningsreeks.
2.9 REAL-TIME PCR MET FAST MASTERMIX
De aangekochte primers worden gebruikt in de 100 pmol/µl oorspronkelijke concentratie. De
probes worden ook aangekocht in een concentratie van 100 pmol/µl en worden 5 keer verdund
met molecular grade water tot 20 pmol/µl. Dit gebeurt in tubes die het licht niet doorlaten,
aangezien probes lichtgevoelig zijn. De PCR-mixen worden aangemaakt volgens tabel 21. Dit
is de samenstelling voor 1 PCR-reactie.
Tabel 21: Samenstelling PCR-mix met probe
Samenstelling 1 reactie (µl) Finale Concentratie
Forward primer (100 pmol/µl) 0,2 1000 nM Reverse primer (100 pmol/µl) 0,2 1000 nM Probe (20 pmol/µl) 0,25 250 nM FAST mastermix (4x geconcentreerd) 5 1x staal 10 water 4,35 totaal 20
Deze mix wordt aangemaakt voor het gewenste aantal reacties + 1. De mix wordt ook
gemengd door kort te vortexen. Daarna ondergaat de tube ook een short spin centrifugatie
zodat het totale volume naar de bodem zakt. Van deze mix wordt per PCR-reactie 15 µl
overgebracht naar MicroAmpTM optical 8-cap strips of naar een MicroAmpTM Optical 96-Well
reactieplaat. Hierna wordt aan iedere well het gewenste geëxtraheerde DNA-staal
toegevoegd. Van deze verdunning wordt 5 µl toegevoegd aan elke well. De plaat of strips
56
worden afgesloten met optical covers of een optical seal, daarna worden ze eerst kort
gevortexd en ondergaan ze een short spin centrifugatie. Hierna worden ze in de ViiA7
geplaatst voor de run. Deze ondergaat een proces, terug te vinden in figuur 23.
Figuur 23: PCR cycli voor real-time PCR met FAST mastermix
2.10 GELELEKTROFORESE
Eerst worden de wanden van de gelhouder goed afgeplakt met plakband. Daarna wordt het
kammetje in de houder geplaatst. Het gebruikt kammetje hangt af van het aantal stalen dat
men wenst te gebruiken. De 3% agarose-gel voor gelelektroforese wordt aangemaakt door 3g
agarose te mengen in 100 ml 0.5x TBE-buffer. Deze wordt lichtjes opgekookt door op te
warmen in een microgolfoven. Na opkoken wordt het mengsel lichtjes geschud zodat alle
agarose kan oplossen. Zolang er nog vaste agarose aanwezig is het mengsel wordt deze stap
herhaald. Nadat het mengsel lichtjes is afgekoeld wordt er 10 µl SYBR-safe toegevoegd en
gemengd. Dit mengsel wordt voorzichtig in de houder gegoten om luchtbellen te vermijden.
Deze gel heeft ongeveer een uur nodig om te stollen. Na het stollen worden de plakband en
het kammetje verwijderd en wordt de gel in de elektroforesetank geplaatst. Hieraan wordt 0.5x
TBE-buffer toegevoegd totdat de gel net ondergedompeld is. Nu kunnen de stalen op de gel
gebracht worden. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van geamplificeerde DNA-fragmenten,
bekomen na een PCR-reactie. Deze stalen bestaan uit 10 µl geamplificeerd staal waaraan 3
µl ladingsbuffer aan is toegevoegd. Het eerste en het laatste staal dat op de gel wordt gebracht
is een mengsel van 3 µl 100 bp DNA-ladder met 3 µl ladingsbuffer. De elektroforese loopt
gedurende 30 min tot een uur bij 100V. Als er na deze 30 minuten wordt geconstateerd dat de
stalen nog niet ver genoeg zijn gemigreerd, kan men de elektroforese nog wat langer laten
doorgaan. Hierna wordt de spanning afgezet en wordt de gel onder UV-licht geplaatst. Van de
57
belichte gel kan ook een foto worden genomen. De lengte van de DNA fragmenten kan geschat
worden met behulp van de basepaarladder.
2.11 DNA SEQUENTIEBEPALING
2.11.1 BENODIGDHEDEN
Geamplificeerd PCR product
PTC-200 Cycler
ABI3130 Genetic Analyzer of 3500xL Genetic Analyzer
MegaFuge 1.0R
Biofuge Pico
AmpliTaq Gold met 10 x PCR buffer-II en 25 mM MgCl2
dXTP-oplossing (5 mM per dXTP)
Specifieke forward en reverse primers
Molecular Grade water
BigDye terminator Ready Reaction mix v1.1
ExoSAP-IT
Sephadex G-50 superfine 100g
Gel loading buffer (5x)
100 bp ladder
2.11.2 WERKWIJZE
2.11.2.1 OPZUIVEREN PCR PRODUCT
In elke benodigde well van een 96-well plaat wordt 3.5 µl ExoSAP-IT gebracht waaraan telkens
7 µl PCR product aan wordt toegevoegd. Dit wordt onmiddellijk in de PTC-200 cycler gebracht
en het programma EXOSAP wordt gestart. Hierbij krijg je een degradatie van primers en
dNTP’s die 30 minuten doorgaat bij 37°C, gevolgd door een degradatie van enzymen die 20
minuten doorgaat bij 80°C. Het oorspronkelijke niet-gezuiverde PCR product wordt in de
tussentijd bewaard bij -20°C. Het opgezuiverde PCR product wordt bewaard bij 2-8°C als de
sequentie reactie op de dag zelf kan uitgevoerd worden. Zo niet wordt ze bewaard bij -20°C.
2.11.2.2 DNA SEQUENTIE REACTIE
De reagentiamix wordt voor elke primer apart gemaakt in 1.5 ml microcentrifuge tubes.De
mixen worden kort gevortexed en ondergaan een shortspin. Daarna worden ze uitverdeeld
over een 96-well plaat. Aan elke well wordt 1 µl primer en 1 µl opgezuiverd PCR product
toegevoegd. De 96-well plaat wordt in de PTC-200 cycler geplaatst en het programma SEQ
wordt opgestart.
58
Tabel 22: Temperatuursprofiel van het programma SEQ.
Sequentie programma # cycli
Hot start 6 min 98°C
Denaturatie 10 s 96°C 25 x
Annealing 10 s 50°C
Extensie 2 min 60°C
Bewaring ∞ 4°C
Na PCR kan de well bewaard worden bij 2-8°C.
2.11.2.3 ZUIVERING DNA-SEQUENTIEREACTIEPRODUCTEN DOOR SEPHADEX
KOLOMZUIVERING
Sephadex kolommen worden aangemaakt door de wells van een Multiscreen 45 µl Column
loader met sephadex G-50 te vullen. De Sephadex kolom wordt gewelld door 300 µl
gedeïoniseerd water toe te voegen. Dit moet minstens 3 uur staan zodat de kolommen kunnen
vormen. De Multiscreen HV plate wordt geplaatst op een 96-well microtiterplaat met een
Multiscreen Align Frame Blue er tussenin. Dit wordt 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 rpm.
Op de 96-well plaat wordt een septa gebracht en dit geheel wordt geplaatst op een zwarte
plaathouder en afgesloten met een witte plaathouder. Daarna wordt de capillaire elektroforese
uitgevoerd met de ABI3130 Genetic Analyzer.
59
3. RESULTATEN EN BESPREKING
3.1 ALGEMEEN: STRATEGIE
In eerste instantie werd er een literatuurstudie uitgevoerd van de meest geconserveerde target
regio’s per pathogeen. Op basis van deze literatuur werd per gen dat men wou detecteren een
aantal primers en probes geselecteerd. Op deze gepubliceerde primers en probes werd een
BLAST search analyse uitgevoerd om te controleren of ze uniek en specifiek zijn waarna ze
verder gevalideerd werden in silico. Daarbij werd voor zowel de primers als de probes
nagegaan of deze voldeden aan volgende voorwaarden: bij primers is het belangrijk dat ze
een geschikte lengte en smelttemperatuur hebben. Ze moeten een GC-concentratie bevatten
van 40-60% en het is belangrijk dat er geen te lange opvolging is van identieke basen,
voornamelijk van G’s en C’s aan het 3’-uiteinde. Het is ook beter om te vermijden dat er zich
een T aan het 3’-uiteinde bevindt. Bij probes is het opnieuw belangrijk dat de sequentie een
optimale lengte heeft. Daarnaast kan hierbij gewerkt worden met een GC-gehalte van 30-80%
en wordt er geopteerd om te werken met de streng die meer C’s dan G’s bevat. De
smelttemperatuur van de probe moet een 8 tot 10°C hoger liggen dan deze van de
corresponderende primers. Ook is het opnieuw belangrijk om lange opeenvolgingen van
dezelfde basen te vermijden, voornamelijk sequenties van 4 of meer G’s. Een G aan het 5’
uiteinde moet vermeden worden omdat dit het signaal van fluoroforen zou kunnen uitdoven
(Vandesompele, 2013).
Tot slot werd er gecontroleerd of de primers en probes onderling geen primerdimers zouden
veroorzaken. Op basis van deze in silico validatie werden de geselecteerde primers en probes
aanvaard, aangepast of volledig verworpen en werden dan vervolgens nieuwe primers en
probes ontwikkeld. Deze reeks primers is per pathogeen en corresponderend doelwitgen terug
te vinden in tabellen 3 tot en met 8.
Daarna ging de aanpassing van deze primers en probes binnen de geselecteerde targetregio’s
door. Ten eerste werd de functionaliteit van de geselecteerde primerparen getest. Hierbij is
het de bedoeling om te testen of de bestelde primers effectief werken bij concentraties van
300 nM en 1000 nM forward en reversed primer (voor de samenstelling van deze reacties zie
tabellen 18 en 19) in een Real-Time PCR-reactie met SYBR Green Mastermix. De overgang
van 300 nM naar 1000 nM is belangrijk om aan te tonen of er geen extra reacties zouden
ontstaan wanneer er gewerkt wordt met een hoge concentratie aan primers, zoals aspecifieke
amplicons en primerdimers. Deze reacties werden uitgevoerd op extracten van reinculturen
(zie tabellen 9 tot en met 13), 1000 x verdund in molecular grade water of op de aangekochte
E. coli Vircell DNA controle stalen verdund tot 1000 copies/µl.
Op basis van de resultaten van deze reacties kon een eerste evaluatie van de primers
gebeuren. Het primerpaar wordt dus als functioneel aanzien wanneer een specifieke
amplificatiecurve verkregen wordt voor een bepaalde doelwitsequentie met een Ct-waarde
lager dan 35. Wanneer de Ct-waarde hoger ligt dan 35 kan dit erop wijzen dat er ongewenste
detectie plaatsvindt, zeker wanneer er gewerkt wordt met reinculturen waarvan kan worden
uitgegaan dat er een hoge concentratie aan targetsequentie zal aanwezig zijn. Een extra
60
manier om de functionaliteit van een primerpaar te bevestigen is door ook een
smeltcurveanalyse uit te voeren. Hierbij is het noodzakelijk dat telkens één unieke smeltpiek
verkregen wordt (Figuur 24). Wanneer er meerdere pieken worden verkregen of als de
smeltpiek zich vertoont bij een onverwachte temperatuur is dit een indicatie dat de primers
aspecifieke amplificatie teweegbrengen (Figuur 25).
Figuur 24: Voorbeeld van een mooie smeltcurve bij verschillende inputconcentratie van het targetgen. Hierbij is
te zien dat alle bekomen smeltcurves, uitgevoerd op éénzelfde primerpaar, elkaar overlappen waardoor een
éénduidige smelttemperatuur kan worden afgeleid.
Figuur 25: Voorbeeld van smeltcurve met aspecifieke amplificatie bij verschillende inputconcentraties van het
targetgen. Hierbij is te zien dat het smeltcurveprofiel bestaat uit meerdere pieken wat kan wijzen op de
aanwezigheid van meerdere aspecifieke amplicons in de reactie.
61
Dankzij het testen op de functionaliteit, kon er een betere selectie worden uitgevoerd op het
aantal mogelijke primerparen per pathogeen. Hierdoor konden een aantal primerparen worden
geschrapt wegens het niet functioneel zijn of door de aanwezigheid van aspecifieke
amplificatie. In een tweede stap worden de overgebleven primerparen getest op hun efficiëntie.
De primerparen die zullen worden uitgekozen om te worden gespot op de TaqMan Array Card
(TAC) hebben een hoge efficiëntie nodig.
Daarna zullen de primers getest worden op hun specificiteit in aanwezigheid van een overmaat
aan vreemd DNA, geëxtraheerd uit fecesstalen zoals beschreven onder 2.6. De cycli die de
qPCR doorliep zijn dezelfde als bij de testen op de reinculturen. Ook de gebruikte mastermix
is dezelfde en de gebruikte primerconcentratie was ook steeds 1000 nM. Het doel van dit
experiment was om te controleren of het vreemd DNA dat aanwezig is in de fecesstalen een
invloed zou hebben op het al dan niet bekomen van aspecifieke amplificaties. Bij de gebruikte
fecesstalen was het geweten voor welk gen deze positief zouden testen. Daarnaast werden
ook een aantal negatieve stalen getest, opnieuw om te controleren of deze niet voor
aspecifieke amplificaties zouden zorgen. Bij deze negatieve stalen mag geen
amplificatiereactie optreden.
Tot slot werd de functionaliteit, specificiteit en efficiëntie van de Real-Time PCR in
aanwezigheid van een TaqMan MGB probe en TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix
aangetoond.
Om onderzoek te doen naar de functionaliteit van deze combinatie van primers en probes werd
opnieuw een qPCR uitgevoerd, deze keer volgens de methode beschreven onder punt 2.9.
Hier is het opnieuw de bedoeling dat er geen al te hoge Ct-waarde bekomen wordt wanneer
het te onderzoeken gen aanwezig is in het staal. Net als de primers moeten ook de probes
getest worden op specificiteit in aanwezigheid van een overmaat aan vreemd DNA
geëxtraheerd uit fecesstalen zoals beschreven onder 2.6. Het doel van deze testen was
dezelfde als bij de primers: controle of het vreemd DNA aanwezig in fecesstalen al dan niet
invloed heeft op het bekomen van aspecifieke amplificaties. Ook hier was het van de gebruikte
fecesstalen bekend voor welk gen deze positief zouden testen. De cycli die de qPCR doorliep
zijn dezelfde als bij de testen op functionaliteit en hier werd opnieuw beoogd om een Ct-waarde
onder 35 te verkrijgen bij positieve stalen en geen reactie bij negatieve stalen.
Op basis van de resultaten van al deze voorgaande punten worden de meeste performante
qPCRs geselecteerd om op de TaqMan Array Card te spotten.
3.2 SELECTIE PRIMERS EN PROBES
Primers en probes werden geselecteerd voor stammen van Clostridium difficile, van species
van Salmonella, Campylobacter, Shigella, Yersinia en van Escherichia coli.
3.2.1 CLOSTRIDIUM DIFFICILE
Er werden 10 primercombinaties uitgeprobeerd voor de detectie van C. difficile en de
specifieke toxinegenen (zie tabel 3) en dit op basis van reinculturen en het positief materiaal
opgelijst in tabellen 9 en 15. In tabel 23 wordt de selectie van primers en probes voorgesteld.
De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.
62
Tabel 23: Overzicht primers en probes C. difficile.
Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0
Functionaliteit/
efficiëntie
specificiteit
FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe
Clostridium difficile
16S p503a p506 p503 p506 p503 p506 509b p503 p506 678
C. difficile Toxine A
enterotoxin
tcdA (3’) p510 p511
tcdA (5’) p512 p513 p512 p513
tcdA (5’) p514 p515 p514 p515 p514 p515 656 p514 p515 656
C. difficile Toxine B
cytotoxin
tcdB p516 p517 p516 p517
tcdB p518 p519 p518 p519 p518 p519 657 p518 p519 657
tcdB p526 p527
C. difficile Binair Toxine
C. difficile Binair Toxine A p520 p521 p520 p521 p520 p521 658 p520 p521 658
C. difficile Binair Toxine A p522 p523 p522 p523
C. difficile Binair Toxine B p524 p525 p524 p525 p524 p525 659 p524 p525 659 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend. bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend.
3.2.1.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS
Primerpaar p503-p506 die het C. difficile 16S gen detecteert, vertoonde bij alle stalen
(opgesomd in tabel 9) een amplificatiecurve met een lage Ct-waarde (17-21) die te verwachten
is bij een extract uit een reincultuur. Ook was er weinig variatie in smelttemperatuur. Dit
primerpaar kan gebruikt worden als positieve controle voor de aanwezigheid van C. difficile in
het klinisch monster. Het aantonen van een toxinogene stam wordt bereikt door de detectie
van de toxinegenen. Zonder 16S confirmatie is dit theoretisch onmogelijk.
Voor het tcdA gen werden drie primerparen getest, p510-p511, p512-p513 en p514-p515 op
de reinculturen weergegeven in tabel 9. Primerpaar 510-511 resulteerde echter in geen
amplificatiereactie bij staal 5476, dit in tegenstelling tot primerparen p512-p513 en p514-p515
waarvoor wel een correct amplicon en een smeltcurve verkregen werd bij dit staal. Dit resultaat
was in tegenstelling tot de te verwachten resultaten. Deze aberrante resultaten werden 3x
herhaald ter confirmatie, waarbij steeds een positief resultaat verkregen werd met eenzelfde
Ct-waarde (22) en smelttemperatuur (75°C). Ook ligt de Ct-waarde en de smelttemperatuur
binnen de range van de waarden bekomen voor de andere reinculturen. Daarom werd
aangenomen dat er een fout is gebeurd (door bv. staalwissel) tijdens de identificatie van 5476
in het labo waarvan we dit staal gekregen hebben, aangezien 2 verschillende PCRs
specifiekere technieken zijn en deze wel tcdA positief was. Hiermee rekening houdende werd
p510-p511 niet geselecteerd omdat deze dan vals negatief zou zijn. Ook werd voor staal 5475
63
bij p512-p513 een vals negatief resultaat bekomen. Daarnaast werden voor alle 3 de
primerparen bij de overige reinculturen correcte resultaten bekomen.
Voor de detectie van tcdA werd dus enkel primerpaar p514-p515 weerhouden voor verdere
evaluatie.
Voor het onderzoek naar het tcdB gen waren terug 3 primerparen ter beschikking (p516-p517,
p578-p519 en p526-p527). De 3 primercombinaties bleken functioneel bij alle tcdB postieve
stalen (zie tabel 9) zowel bij de 300 nM als bij de 1000 nM reactie behalve voor staal 898 dat
overal een negatief resultaat vertoonde. Voor tcdB gaat de voorkeur uit naar p518-p519
aangezien voor p526-p527 bij reinculturen 901 en 5477 te hoge Ct-waarden (> 35) verkregen
werden en omdat er voor p516-p517 een negatief resultaat verkregen werd bij reincultuur
5476. Evenals bij tcdA werd opgemerkt dat een staalwissel de afwijkende resultaten voor staal
898 kon verklaren.
Bij de drie primerparen uitgezocht voor het binair toxine is er nog een verdere onderverdeling:
zo zijn primerparen p520-p521 en p522-p523 geschikt voor het Clostridium difficile Binair
Toxine A enzymatisch component en is primerpaar p524-p525 geschikt voor het Clostridium
difficile Binair Toxine B bindingscomponent. Aangezien er voor deze laatste slechts 1
primerpaar beschikbaar was, werd deze ook geselecteerd. Bij het C. difficile Binair Toxine A
enzymatisch component zal de voorkeur uitgaan naar p520-p521 aangezien er voor p522-
p523 aspecifieke amplificatie ontstaat bij reincultuur 898 bij een primerconcentratie van 300
nM.
Op basis van bovenstaande functionaliteitsstudie werden bij de 6 stammen volgende genen
gedetecteerd, verzameld in tabel 24. Deze zijn afwijkend van de opgegeven resultaten door
het referentiecentrum.
Tabel 24: Overzicht reinculturen Clostridium difficile en de genen waarvoor ze positief/negatief zijn.
Clostridium difficile 16S tcdA tcdB binA binB
898 + - - - -
901 + + + + +
902 + + + - -
5475 + + + - -
5476 + + + - -
5477 + + + + +
3.2.1.2 EFFICIËNTIE PRIMERS
De efficiëntie werd bepaald voor alle primerparen, behalve voor p503-p506 aangezien deze al
onderzocht was door een vorige thesisstudent. Dit werd uitgevoerd op 2 reinculturen: een
cultuur die positief is voor zowel toxine A, toxine B als het binair toxine (901) en een cultuur
die enkel positief was voor toxine A (5475). De resultaten hiervan zijn terug te vinden in tabel
25.
64
Tabel 25: Ct-waarden van diverse C. difficile voor 16 primers met bijbehorende efficiëntie.
Verdunning
primers staal 10x 100x 1000x 10000x 100000x 1000000x Negatief Helling Efficiëntie(%) 510-511
901 20,06 23,49 27,94 31,86 35,05 NAa NA -3,83 82,3 5475 18,99 23,63 28,05 31,02 35,26 36,49 NA -3,58 90,2
512-513
901 20,13 23,69 28,15 32,50 35,38 NA NA -3,93 79,6 5475 19,69 23,83 28,23 31,11 37,01 NA NA -4,19 73,2
514-515
901 20,11 23,81 28,20 32,38 34,07 38,11 NA -3,65 88,0 5475 19,58 23,70 27,88 30,97 35,07 NA NA -3,82 82,5
516-517
901 19,81 24,26 27,75 31,96 34,34 36,96 NA -3,68 87,0 5475 NA NA NA NA NA NA NA -b -
518-519
901 20,13 23,29 27,97 32,32 34,66 38,13 NA -3,81 83,1 5475 19,56 23,46 28,12 31,06 NA 36,75 NA -3,91 80,0
520-521
901 19,95 23,33 27,86 31,89 34,01 NA NA -3,67 87,3 5475 NA NA NA NA NA NA NA - -
522-523
901 20,22 23,83 27,72 32,07 35,60 38,45 NA -3,90 80,5 5475 NA NA NA NA NA NA 43,01
524-525
901 20,27 23,79 28,22 32,45 34,71 NA / -3,75 84,7 5475 NA NA NA NA NA NA NA - -
aNo Amplification, doelwitsequentie is niet aanwezig. bNiet Uitgevoerd
Overal werd een efficiëntie bekomen die hoger lag dan 80%. Door deze verdunningsreeksen
werd de selectie van p514-p515 voor het tcdA gen bevestigd aangezien zijn efficiëntie hoger
lag dan deze van de 2 overige primerparen, alhoewel er geen uitgesproken verschil in
efficiëntie waar te nemen was. Ook voor de andere primerparen bleek de efficiëntie de initiële
keuze niet tegen te spreken. Het streefdoel is natuurlijk het bekomen van een 100% efficiënte
PCR, wat hier niet het geval was. Een foutje in de verdunningsreeks kan nooit worden
uitgesloten, waardoor de efficiëntie normaal gezien niet zal berekend worden op een
éénmalige bepaling van de verdunningsreeksen. Nu werd hier echter wel voor geopteerd om
de kosten te besparen.
3.2.1.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
Alle oorspronkelijke primerparen voor C. difficile, behalve primerpaar p526-p527, werden
getest. Er was slechts 1 primerpaar, p512-p513, waarbij een vals negatief resultaat verkregen
werd. Dit resultaat, in combinatie met de efficiëntie en functionaliteit verkregen bij de
reinculturen, zorgt ervoor dat er definitief gekozen kan worden voor p514-p515 als
aangewezen primerpaar voor het toxine A gen.
Daarnaast werd bij zo goed als alle primers af en toe een aspecifieke amplificatie verkregen,
waarbij de Ct-waarde telkens hoger lag dan 35 en waarbij de smelttemperatuur afweek van
deze die verwacht werd. De enige 2 primerparen die nergens aspecifieke amplificatie
vertoonden waren primers p503-p506 en p516-p517. Van p503-p506 stond al vast dat deze
zou worden gekozen voor het detecteren van het 16S gen. p516-p517 was bij de testen op de
reinculturen al verworpen omdat p518-p519 daar een betere functionaliteit vertoonde.
65
3.2.1.4 FUNCTIONALITEIT PROBES
Voor C. difficile werd deze functionaliteit uitgevoerd op de 6 verschillende reinculturen (zie
tabel 9). Hierbij werd telkens de verwachtte amplificatie verkregen en is er nergens aspecifieke
amplificatie. De bekomen gemiddelde Ct-waarde voor de primer-probe combinatie werkzaam
op het 16S is ongeveer 15, terwijl de gemiddelde Ct-waarden voor de overige genen tussen
24 en 25 liggen.
Ook werd de efficiëntie bepaald op reincultuur 901. De bekomen efficiënties zijn verzameld in
tabel 26.
Tabel 26: Bekomen efficiënties C. difficile uitgevoerd op reincultuur 901.
Gen Primers//probe Efficiëntie (%)
tcdA 514-515//656 82,2
tcdB 518-519//657 82,2
BinA 520-521//658 90,5
BinB 524-525//659 77,9
Daarnaast werd een additionele efficiëntiebepaling van de primer-probe combinaties
uitgevoerd op een plasmide. Om alle overgebleven primers en probes te kunnen testen op
deze manier, werden 5 verschillende plasmides ontwikkeld die elk bestonden uit 4 à 5 van de
targetsequenties die in deze masterproef besproken worden. Hierbij is het wenselijk dat een
efficiëntie boven 90% bekomen wordt. Deze efficiëntiebepaling werd opnieuw slechts
éénmalig uitgevoerd, behalve wanneer deze waarden te laag waren zodat een herhaling nodig
was, zowel bij de bepaling op de reinculturen als op de plasmides. De efficiënties die hierbij
bekomen werden zijn verzameld in tabel 27.
Tabel 27: Bekomen efficiënties van C. difficile uitgevoerd op plasmides.
Gen Primers Efficiëntie (%)
16S 503-506//509 108,0
tcdA 514-515//656 106,5
tcdB 518-519//657 97,5
BinA 520-521//658 107,1
BinB 524-525//659 90,5
3.2.1.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
Hier werden 20 fecesstalen getest waarvan bij 16 correcte resultaten verkregen werden
(waarvan 12 Clostridium positief waren en 4 Clostridium negatief) behalve voor stalen
212404201 en 212410501 die volgens bacteriologisch onderzoek C. difficile negatief waren.
In Real-Time PCR werd echter een amplificatie met goede Ct-waarde (26 en 18 respectievelijk)
voor het 16S gen bekomen wat wijst op de aanwezigheid van niet toxinogene C. difficile. Hier
wordt ervan uitgegaan dat er een fout gebeurd was bij de detectie met antigenen en deze 2
stalen dus wel positief zijn voor Clostridium. Voor de overige 2 stalen, 212258801 en
212484301, die beide toxinegenen negatief waren, werd er daarnaast ook zeer zwakke
aspecifieke amplificatie verkregen bij de primers-probe voor het 16S gen. Staal 234337701
kon bij herhaling de resultaten van de antigeen bepaling niet confirmeren waardoor we
66
besluiten dat dit een correct negatieve stam is. Ook hierbij werd er vanuit gegaan dat dit
fecesstaal effectief negatief was voor alles behalve het 16S gen
Ten slotte werd de specificiteit van de probes getest op 4 mengsels, opgebouwd uit
verschillende reinculturen, en op nog een 11 extra fecesstalen (terug te vinden in tabel 29) die
ofwel positief zijn voor Clostridium, Campylobacter, Salmonella of Yersinia ofwel negatief zijn.
De precieze samenstelling van de reincultuurmengsels is terug te vinden in tabel 28.
Tabel 28: Samenstelling reincultuur mengsels voor test op specificiteit.
Mengsel Bestaande uit
1 MBC 022 (STEC) ATCC 33291 (C. jejuni) 898 (C. difficile) ATCC 23715 (Yersinia) 2 MBC 122 (EIEC) MBC 121 (EAEC) 3A9 75 (C. coli) 3A9 53 (Salmonella) 3 MBC 123 (EPEC) 901 (C. difficile) ATCC 14018 (Salmonella) 4 MBC 124 (ETEC) ATCC 12022 (Shigella) 904 (C. difficile)
Tabel 29: Gebruikte fecesstalen en de genen waarvoor ze verondersteld positief zijn.
Fecesstalen Positief voor
236400101 Alle Clostridium difficile genen
215548201 Clostridium difficile 16S, toxine A en B
219264001 Yersinia enterocolitica
208897001 Yersinia enterocolitica
209571701 Campylobacter jejuni
210635301 Geen bacteriële pathogenen geisoleerd
215985201 Campylobacter coli
209873401 Salmonella typhimurium
210945301 Geen bacteriële pathogenen geisoleerd
215252501 Campylobacter jejuni
217853301 Geen bacteriële pathogenen geisoleerd.
Bij de mengsels werden voor alle primer-probeparen de verwachtte resultaten verkregen. Bij
de testen op fecesstalen 23640010 en 215548201 werden echter vals negatieve resultaten
verkregen die werden verklaard door meerdere vries-dooi cycli die de detectielimiet kunnen
verhogen. Ook werd voor p503-p506-509 bij 6 van de C. difficile negatieve stalen aspecifieke
amplificatie verkregen, zelfs na herhaling. Daarom werd geopteerd om primers p503-p506 te
koppelen aan een nieuwe probe, 678, om deze specifieke amplificatie weg te werken. Bij deze
nieuwe probe bleef de aspecifieke amplificatie in stand, maar bij C. difficile positieve
fecesstalen gaf ze een lagere Ct-waarde waardoor geopteerd werd om toch met deze verder
te werken. Ook werd de functionaliteit getest van deze nieuwe probe op de 6 verschillende C.
difficile reinculturen en die gaven allemaal een goede Ct-waarde.
Door middel van alle voorgaande testen kunnen 5 primer-probecombinaties geselecteerd
worden voor C. difficile. Hiermee kan worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze
geselecteerde primers en probes zijn in het groen aangeduid in tabel 23.
67
3.2.2 SALMONELLA
Voor de detectie van Salmonella spp. en hun specifieke toxinegenen (zie tabel 4) werden 6
primercombinaties uitgeprobeerd. Dit werd uitgevoerd op basis van reinculturen en het positief
materiaal verzameld in tabellen 10 en 15. In tabel 30 wordt de selectie van primers en probes
voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.
Tabel 30: Overzicht primers en probes Salmonella spp.
aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend
3.2.2.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS
De functionaliteit van de 6 primerparen voor de detectie van Salmonella spp. werden
geëvalueerd aan de hand van 6 verschillende reinculturen (zie tabel 10). De bekomen
resultaten hiervan zijn terug te vinden in tabel 31.
Tabel 31: Resultaten functionaliteit Salmonella spp met primerconcentratie 1000 nM.
primers
ompF ttr ttr invA invA ssaN
p568 p570 p572 p574 p576 p578
Reinculturen p569 p571 p573 p575 p577 p579
Ct S. enterica ATCC 14028 20,43a 20,24 19,68 19,67 20,01 20,62
S. enteritidis 3A9 53 20,85 20,54 19,76 20,00 20,47 20,96
S. groep B 3A9 87 20,61 20,47 19,68 19,85 20,23 20,71
S. groep C 3A9 86 21,04 20,74 20,04 20,32 20,48 21,32
S. D 3A9 02 20,97 21,15 20,25 20,31 20,89 21,57
S. groep D 3A9 82 20,22 20,48 19,78 19,73 20,22 20,99
Tm S. enterica ATCC 14028 85,39 81,88 85,39 80,62 80,03 80,62
S. enteritidis 3A9 53 85,59 82,18 85,59 81,40 80,42 80,91
S. groep B 3A9 87 85,68 82,18 85,59 81,01 80,42 80,91
S. groep C 3A9 86 85,59 82,18 85,59 81,40 80,42 80,81
S. D 3A9 02 85,68 82,18 85,59 81,01 80,32 80,81
S. groep D 3A9 82 85,68 82,18 85,59 81,01 80,32 80,81
Gemiddelde Tm 85,60 82,13 85,56 81,06 80,32 80,81
Standaarddeviatie Tm 0,11 0,12 0,08 0,29 0,15 0,11
aGroene achtergrond geeft aan dat het primerpaar functioneel is voor dit staal.
Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0
Functionaliteit/
specificiteit efficiëntie
FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe
Salmonella spp
ompF p568a p569 p568 p569 p568 p569 667 p568 p569 667
ttr p570b p571 p570 p571
ttr p572 p573 p572 p573
invA p574 p575 p574 p575
invA p576 p577 p576 p577
ssaN p578 p579 p578 p579 p578 p579 668 p578 p579 668
68
Op basis van de bekomen resultaten kunnen nog geen primerparen geselecteerd worden
aangezien voor alle stalen positieve resultaten bekomen werden met goede Ct-waarden en
een weinig variërende smelttemperatuur.
3.2.2.2 EFFICIËNTIE PRIMERS
Tabel 32: Ct-waarden voor Salmonella met bijbehorende efficiëntie.
Verdunning
primers staal 10x 100x 1000x 10000x 100000x 1000000x Negatief Helling Efficiëntie (%)
570-571
3a9 53 25,63 28,57 32,42 35,92 NA 39,76 NAa -3,47 94,2 atcc
14028 24,82 28,26 31,64 35,10 36,00 37,07 39,65 -3,41 96,5
572-573
3a9 54 25,34 28,44 32,32 36,13 NA NA NA -3,62 88,8 atcc
14029 24,86 28,58 31,77 34,70 35,95 NA NA -3,27 102,2
aNo Amplification, doelwitsequentie is niet aanwezig.
De efficiëntie werd enkel bepaald voor de 2 primerparen die testen op het ttr gen aangezien
zowel voor het ompF gen als voor het ssaN gen slechts 1 primerpaar werd geselecteerd
waardoor een selectie op basis van efficiëntiewaarden onmogelijk is. Op basis van deze
verdunningsreeksen, terug te vinden in tabel 32, zal voor het ttr gen eerder gekozen worden
voor p572-p573 omdat bij het ander primerpaar 2x aspecifieke amplificatie verkregen werd.
3.2.2.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
Voor Salmonella werden slechts de primerparen p568-p569, p570-p571, p572-p573 en p578-
p579 getest, op dezelfde manier als bij C. difficile. De invA primers werden niet meer
meegetest omdat al besloten werd dat deze niet zullen geselecteerd worden, hier wordt later
in dit hoofdstuk op teruggekomen.
Het S. typhimurium staal 209873401 gaf goede amplificatiecurves voor alle 4 de primerparen
met een juiste smelttemperatuur. Daarnaast werd voor de negatieve stalen wel vaak
aspecifieke amplificatie verkregen met telkens een hoge Ct-waarde en afwijkende smeltcurve.
Toch werd bij 2 stalen de juiste smelttemperatuur verkregen: voor staal 219264001 bij p568-
p569 en voor 215900401 bij p572-p573. Voor beide werden wel zeer hoge Ct-waarden
bekomen (>35). Misschien was in dit fecesstaal toch Salmonella aanwezig maar in zo’n lage
concentratie dat deze bij voorgaande testen niet werd gedetecteerd.
De voorkeur zal hier uitgaan naar de primers voor het ompF gen (p568-p569) en het ssaN gen
(p578-p579) aangezien in de literatuur aangetoond werd dat deze altijd aanwezig waren bij
alle geteste Salmonella stammen en ook telkens afwezig waren bij andere niet-Salmonella
stammen (Chen et al, 2010; Tatavarthy et al, 2010). Het invA gen daarentegen kan verworven
worden via horizontale gen transfer en is genetisch onstabiel of zelfs afwezig in bepaalde
Salmonella serotypen (Tatavarthy et al, 2010).
69
3.2.2.4 FUNCTIONALITEIT VAN PROBES
Primerpaar 568-569 werkzaam op het ompF gen werd gecombineerd met probe 667 en
primerpaar 578-579 werkzaam op het ssaN gen werd gecombineerd met probe 668. Deze
werden op functionaliteit getest op reincultuur ATCC 14028, volgens dezelfde methode als bij
C. difficile. Bij beide werd een goede amplificatie verkregen met een Ct-waarde van ongeveer
20.
De efficiëntie werd hier enkel uitgevoerd op plasmides. Hierbij werd voor het ompF gen een
efficiëntie verkregen van 100.5% en voor het ssaN gen een efficiëntie van 95.7%.
3.2.2.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
De specificiteit van de probes werd getest op 4 mengsels, opgebouwd uit verschillende
reinculturen, en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen zijn verzameld in tabel
28 en 29.
Bij zowel de reincultuurmengsels als bij de fecesstalen werd voor beide primer-
probecombinaties overal de verwachtte resultaten verkregen en werd er nergens aspecifieke
amplificatie geconstateerd.
Dankzij deze voorgaande testen werden 2 primer-probecombinaties overgehouden voor
Salmonella spp. Met deze kan er worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze
geselecteerde primers en probes zijn in het groen aangeduid in tabel 30.
3.2.3 CAMPYLOBACTER
Voor de detectie van Campylobacter spp. en hun specifieke toxinegenen (zie tabel 5) werden
8 primercombinaties uitgeprobeerd. Dit werd uitgevoerd op basis van reinculturen en het
positief materiaal verzameld in tabellen 11 en 15. In tabel 33 wordt de selectie van primers en
probes voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.
Tabel 33: Overzicht primers en probes Campylobacter spp.
Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0
Functionaliteit/
specificiteit efficiëntie
FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe
Campylobacter spp
16S (5 species) p556b p558 p556 p558
16S (5 species) p556 p559 p556 p559
16S (5 species) p557 p558 p557 p558
16S (5 species) p557 p559 p557 p559
16S (All) p560a p561 p560 p561 p560 p561 664 p560 p561 664
Campylobacter jejuni
cadF p562 p563 p562 p563 p562 p563 665 p562 p563 665
mapA p564 p565 p564 p565
Campylobacter coli
ceuE p566 p567 p566 p567 p566 p567 666 p566 p567 679 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend
bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend
70
3.2.3.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS
Voor het onderzoek naar de primers voor Campylobacter spp. werd gebruik gemaakt van 6
verschillende reinculturen, waarvan 3 C. jejuni en de andere 3 C. coli waren. Het experiment
werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij de voorgaande bacteriën. Hier was het de bedoeling
om een primerpaar te selecteren voor het 16S gen, 1 specifiek voor C. jejuni en een andere
specifiek voor C. coli.
Tabel 34: Resultaten functionaliteit Campylobacter spp met primerconcentratie 1000 nM.
16S (5 species) 16S (all) cadF mapA ceuE
p556 p556 p557 p557 p560 p562 p564 p566
Reincultuur p558 p559 p558 p559 p561 p563 p565 p567
Ct C.
jejuni 3A9 15 17,17a 17,41 17,30 17,14 17,41 19,37 19,87 NA
C. jejuni 3A9 23 16,27 16,25 16,43 16,34 16,31 18,40 18,42 NA
C. jejuni
ATCC 33291 15,98 16,04 16,09 15,98 16,06 17,62 18,39 NA
C. coli 3A9 42 17,38 17,33 17,42 17,20 17,45 NA NA 19,04
C. coli 3A9 75 17,35 16,65 17,31 16,80 16,88 NA 38,64c 17,92
C. coli 3A9 89 NAb 17,17 17,09 16,92 17,32 NA NA 18,84
Tm C.
jejuni 3A9 15 79,74 80,42 79,64 80,32 81,60 75,72 76,60 NA
C. jejuni 3A9 23 79,64 80,32 79,64 80,32 81,60 75,72 76,50 NA
C. jejuni
ATCC 33291 79,64 80,42 79,64 80,42 81,60 75,72 76,60 NA
C. coli 3A9 42 79,54 80,32 79,64 80,23 81,50 NA NA 76,11
C. coli 3A9 75 79,64 80,42 79,74 80,32 81,60 NA 74,25 76,11
C. coli 3A9 89 NA 80,42 79,74 80,23 81,60 NA NA 76,21
Gemiddelde Tm 79,64 80,39 79,67 80,31 81,58 75,72 75,99 76,14
Standaarddeviatie Tm 0,07 0,05 0,05 0,07 0,04 0 1,16 0,06 aGroene achtergrond geeft aan dat het primerpaar functioneel is voor dit staal. bNo Amplification, de doelwitsequentie is niet aanwezig. cRode achtergrond geeft aan dat het primerpaar niet functioneel is voor dit staal. Dit kan voorkomen wanneer de doelwitsequentie wel aanwezig is maar dat er geen amplificatie verkregen wordt of wanneer de doelwitsequentie niet aanwezig is en er dus aspecifieke amplificatie verkregen wordt.
Zoals te zien is in tabel 34 geeft voor het 16S gen enkel p556-p558 een vals negatief resultaat
bij 1 cultuur: 3A9 89. Hier zal eerder geopteerd worden voor p560-p561 aangezien deze werkt
voor alle Campylobacter species terwijl de andere 4 slechts 5 species zullen detecteren. Ook
geeft dit primerpaar goede Ct-waarden (16-17) en wordt telkens dezelfde smelttemperatuur
bekomen.
Specifiek voor C. jejuni gaat de voorkeur uit naar p562-p563 aangezien voor dit primerpaar
nergens aspecifieke amplificatie bekomen wordt.
Alleen primerpaar p566-p567 was specifiek voor C. coli. Hierbij werd enkel bij C. coli culturen
een amplificatiecurve bekomen met een goede Ct-waarde en liggen de smelttemperaturen
steeds dicht bij elkaar.
71
3.2.3.2 EFFICIËNTIE PRIMER
De efficiëntie werd hier niet bepaald aangezien de 3 primers al geselecteerd werden na de
test op functionaliteit, waardoor de efficiëntie geen bijdrage meer levert aan de selectie.
3.2.3.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
Voor Campylobacter werd dezelfde techniek gebruikt als bij voorgaande bacteriën. Dit werd
echter alleen op de 3 geselecteerde primerparen uitgevoerd: p560-p561, p562-p563 en p566-
p567.
Bij deze test werden een aantal problemen geconstateerd. Zo werd er voor de primer voor het
16S gen (p560-p561) bij 6 van de 7 negatieve Campylobacter stalen een amplificatie
verkregen met Ct-waarde hoger dan 35. Bij 3 van deze gevallen lag de smelttemperatuur dicht
bij de smelttemperatuur die voor dit primerpaar verkregen werd bij de reinculturen. Van alle 7
Campylobacter-negatieve stalen waren er 4 bij waarop geen bacteriologische testen waren
uitgevoerd en het dus niet bekend was of ze al dan niet effectief Campylobacter negatief
waren. Ook gaven deze 4 allemaal een positief resultaat voor het 16S gen. Hierdoor ontstond
het vermoeden dat er een aspecifiek amplicon gegenereerd wordt tijdens amplificatie. Daarom
werden de bekomen amplicons van deze stalen gesequeneerd om te kijken of het hier toch
gaat om positieve Campylobacter stalen. Hier wordt later onder punt 3.4 en 3.5 op
teruggekomen.
Voor primerpaar p562-p563, specifiek voor C. jejuni, werden de minste problemen
geconstateerd. De fecesstalen positief voor C. jejuni gaven een goede amplificatiecurve met
juiste smelttemperatuur. Daarnaast gaven alle 4 de onbekende negatieve fecesstalen en het
Salmonella fecesstaal (209873401) aanleiding tot aspecifieke amplificatie, waarbij voor staal
236704101 zelfs een smelttemperatuur aangaf die overeen kwam met de verwachtte
smelttemperatuur voor dit primerpaar.
Ook het primerpaar specifiek voor C. coli gaf problemen. Voor dit primerpaar werd bij vele
fecesstalen een aspecifieke amplificatie bekomen, maar deze gaven wel steeds een zeer late
Ct-waarde en een afwijkende smelttemperatuur. Echter was er ook een fecesstaal getest
(215985201) waarvan men wist dat het positief was voor C. coli door middel van voorgaande
bacteriologische testen. Voor dit staal werd bij zowel p560-p561 (werkzaam op het 16S gen)
als bij p566-p567 (specifiek voor C. coli) een vals negatief resultaat verkregen. Dit werd verder
gecontroleerd om duidelijk te maken of het probleem lag bij de gebruikte primers of bij de
staalvoorbereiding. Daarom werd er opnieuw gebruik gemaakt van het oorspronkelijke
fecesstaal en werd deze aangerijkt met Campylobacter reinculturen alvorens de extractie te
ondergaan. Dezelfde procedure werd uitgevoerd op een Campylobacter-negatief staal ter
controle. Om dit te kunnen doen werden van beide fecesstalen telkens 3 monsters genomen,
waarvan 1 aangerijkt werd met een C. jejuni reincultuur, 1 met een C. coli reincultuur en 1 met
beide. Zo werden 6 nieuwe stalen verkregen. Deze 6 stalen werden geëxtraheerd en het
72
bekomen DNA onderging dezelfde PCR reactie als de fecesstalen hiervoor. Deze resultaten
zijn verzameld in tabel 35.
Tabel 35: Resultaten voor functionaliteit in aanwezigheid van vreemd DNA voor Campylobacter.
p560-p561 p562-p563 p566-p567
16S (all) cadF (C. jejuni) CeuE (C. coli)
Ct 208897001 + C. jejuni 18,92a 26,86 NA
208897001 + C. coli 19,3 38,98b 26,23
208897001 + C. jejuni en C.
coli 19,4 26 25,69
215985201 + C. jejuni NAc NA NA
215985201 + C. coli NA NA NA
215985201 + C. jejuni en C.
coli NA NA NA
Tm 208897001 + C. jejuni 80,95 72,55 75,97
208897001 + C. coli 81,15 75,38 NA
208897001 + C. jejuni en C.
coli 81,34 75,68 75,97
215985201 + C. jejuni NA NA NA
215985201 + C. coli NA NA NA
215985201 + C. jejuni en C.
coli NA NA NA
a Groene achtergrond geeft aan dat het primerpaar functioneel is voor dit staal. bOranje achtergrond geeft aan dat het primerpaar waarschijnlijk niet functioneel is voor dit staal. cNo Amplification, de doelwitsequentie is niet aanwezig.
Uit deze resultaten bleek dat het fecesstaal positief voor C. coli (215985201) zelfs na injectie
met reinculturen een vals negatief resultaat geeft voor alle 3 de genen. Hierbij kan het zijn dat
het Campylobacter DNA wordt afgebroken door andere componenten aanwezig in de feces of
door inhibitie.
Bij het geïnjecteerde negatieve staal (208897001) zijn de resultaten grotendeels zoals
verwacht. Er worden overal goede resultaten verkregen, behalve bij p562-p563 voor het staal
geïnjecteerd met C. coli. Hierbij wordt aspecifieke amplificatie verkregen.
3.2.3.4 FUNCTIONALITEIT VAN PROBES
De functionaliteit werd uitgevoerd op de 6 Campylobacter reinculturen, op dezelfde manier als
bij voorgaande bacteriën. Voor detectie op C. coli werd eerst gewerkt met probe 666. Deze
gaf echter heel vaak aspecifieke amplificatie. Na verder in silico onderzoek bleek dat de probe
zal annealen met de forward primer. Hierbij wordt een ΔG-waarde verkregen van
-9.99 kcal/mol, terwijl normaal gezien wordt gewerkt met ΔG-waarden hoger dan -6 kcal/mol
om heterodimeren te vermijden. Door deze lage waarde zullen primer en probe moeilijker van
elkaar loskomen bij de temperatuur die gehanteerd wordt tijdens de PCR, waardoor
aspecifieke amplificatie verkregen wordt. Daarom werd geopteerd om met een nieuwe probe
te werken, probe 679.
73
Tijdens de testen werd overal amplificatie met een goede Ct-waarde verkregen waar verwacht,
echter werd er ook zeer zwakke en daardoor verwaarloosbare aspecifieke amplificatie
verkregen (Ct > 38) bij cultuur 3A9 89 voor primer-probe combinatie p562-p563-665 en bij de
negatieve controle voor primer-probe combinatie p566-p567-679.
De efficiëntiebepaling met behulp van reinculturen werd niet gedaan voor C. coli. Deze
bepaling werd wel uitgevoerd op stam ATCC 33291. Voor de overige 2 genen wordt bij p560-
p561-664 93.9% verkregen en bij p562-p563-665 98.4%.
De efficiëntiebepaling met behulp van plasmides werd wel op alle 3 de combinaties uitgevoerd.
Deze waarden zijn verzameld in tabel 36.
Tabel 36: Bekomen efficiëntiewaarden voor Campylobacter, uitgevoerd op plasmides.
Gen Primers//probe Efficiëntie (%) Herhaling Gemiddelde
16S 560-561//664 90,1 118,8 104,5 CadF - C.
jejuni 562-563//665 95,4
ceuE - C. coli
566-567//679 101,6
3.2.3.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
De specificiteit van de probes werd getest op 4 mengsels, opgebouwd uit verschillende
reinculturen, en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen zijn verzameld in tabel
28 en 29.
Zoals al gedeeltelijk besproken werd bij functionaliteit, gaven de probes een aantal problemen
bij de Campylobacter spp. De primers werkzaam op het 16S gen werden gekoppeld met probe
664. Deze gaf bij zowel de reincultuurmengsels als bij de fecesstalen een aantal keer
aspecifieke amplificatie. Echter was het wel zo dat bij stalen positief voor Campylobacter er
ook een mooie amplificatiecurve ontstond. Om dit tegen te gaan werden de primers gebruikt
in combinatie met een nieuwe probe, 680. Deze gaf echter ook een aantal keer zwak vals
positieve resultaten waardoor er toch werd geopteerd om eerder verder te werken met probe
664.
Het primerpaar (p562-p563) specifiek werkzaam voor C. jejuni werd gebruikt in combinatie met
probe 665 en deze gaf overal de gewenste resultaten, behalve bij staal 215985201 waarvoor
er aspecifieke amplificatie verkregen werd.
Tot slot is er nog het primerpaar (p566-p567) werkzaam voor C. coli. In eerste instantie werd
de specificiteit nog getest met probe 666. Deze gaf echter, zoals al verwacht werd door de
resultaten bij de functionaliteit, heel vaak aspecifieke amplificatie. Wanneer de specificiteit dan
getest werd op probe 679 was al deze aspecifieke amplificatie weggewerkt. Ook bij deze
nieuwe probe werd er getest op de functionaliteit met behulp van de Campylobacter
74
reinculturen. Deze gaven opnieuw een mooie amplificatiecurve met goede Ct-waarde voor de
C. coli stalen en een negatief resultaat voor de C. jejuni stalen.
Dankzij deze voorgaande testen werden 3 primer-probecombinaties overgehouden voor
Campylobacter spp. Met deze kan er worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze
geselecteerde primers en probes zijn in het groen aangeduid in tabel 33.
3.2.4 SHIGELLA
Er werden 2 primercombinaties getest voor de detectie van Shigella spp. en hun specifieke
toxinegenen (zie tabel 6), uitgevoerd op basis van reinculturen en het positief materiaal
verzameld in tabellen 12 en 15. In tabel 37 wordt de selectie van primers en probes
voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.
Tabel 37: Overzicht primers en probes Shigella spp.
Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0
Functionaliteit/
specificiteit efficiëntie
FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe
Shigella spp
ipaH p627a p628 p627 p628
virA p629 p630 p629 p630 p629 p630 677 p629 p630 geen
aPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend
3.2.4.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS
Voor het onderzoek naar de primers voor Shigella spp. werd gebruik gemaakt van 4
verschillende reinculturen. Ook dit experiment werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij
voorgaande bacteriën.
De reactie voor het virA gen werd 4 keer uitgevoerd, waarbij slechts éénmalig een positief
resultaat bekomen werd voor alle 4 de reinculturen. Wel werd S. boydii telkens gedetecteerd
met dit primerpaar.
Uit deze resultaten blijkt dat enkel voor het ipaH gen een goede functionaliteit bekomen werd.
Toch werd deze niet geselecteerd aangezien er bij E. coli al een primerpaar geselecteerd werd
die actief was voor dit gen. De functionaliteit van de E. coli primers p624-p626 werd dan ook
getest op de Shigella reinculturen. Deze waren allemaal positief met goede Ct-waarden (19-
20) en een smelttemperatuur die dicht lag bij deze van de EIEC stam.
3.2.4.2 EFFICIËNTIE PRIMERS
De efficiëntie werd enkel uitgevoerd voor primerpaar p629-p630, werkzaam op het virA gen,
op staal ATCC 12022. Deze vertoont een goede efficiëntie van meer dan 95%. Het primerpaar
actief op ipaH werd niet meer getest, aangezien deze sowieso niet zal geselecteerd worden.
75
3.2.4.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
Voor Shigella werd dezelfde techniek gebruikt als bij voorgaande bacteriën. Dit werd
uitgevoerd op beide primerparen. Hierbij werd er geconstateerd dat bij 3 van de 4 negatieve
stalen en bij staal 215900401 aspecifieke amplificatie ontstaat, weliswaar met een lage Ct-
waarde (43) en een afwijkende smelttemperatuur. Alle geteste fecesstalen waren negatief voor
Shigella waardoor uit deze test niet kan worden afgeleid of er een goede amplificatie met een
juiste smelttemperatuur ontstaat bij Shigella positieve fecesstalen.
Om verder te werken met MGB probes werd enkel virA overgehouden, al lijkt deze niet de
beste keuze aangezien deze vals negatieve resultaten gaf bij 3 van de 4 stalen wanneer getest
werd op functionaliteit.
3.2.4.4 FUNCTIONALITEIT VAN PROBES
De functionaliteit werd uitgevoerd op de 4 Shigella reinculturen, op dezelfde manier als bij
voorgaande bacteriën, maar er werd enkel amplificatie verkregen bij cultuur 3A8 74. Ook hier
werd de efficiëntie enkel uitgevoerd op plasmides, waarbij een efficiëntie bekomen wordt van
93.3%.
3.2.4.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
De specificiteit van de probes werd getest op 4 mengsels, opgebouwd uit verschillende
reinculturen, en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen worden voorgesteld in
tabel 29 en 29.
In mengsel 4 werd gebruik gemaakt van een reincultuur van S. flexneri. Bij testen op
functionaliteit en specificiteit van enkel de primers werd al geconstateerd dat de primers
werkzaam op het virA gen hier geen amplificatie tot stand konden brengen. Ook bij het
toevoegen van probe 677 werd hetzelfde resultaat verkregen. Wel werd er bij de overige 3
mengsels en de gebruikte fecesstalen nergens aspecifieke amplificatie verkregen. Daarna
werd er een poging gedaan om de primers te testen met een nieuwe probe, 683, maar ook
deze gaf geen amplificatie voor S. flexneri. Deze nieuwe probe werd ook getest op de 4
reinculturen, waar hij enkel amplificatie vertoonde bij S. boydii.
Tot slot werden beide probes getest op 6 fecesstalen positief voor Shigella. Hierbij gaven ze
enkel bij 1 staal een positief resultaat. Daarom werd er besloten om geen primer-probes te
selecteren die specifiek zouden werken op het virA gen van Shigella. Voor de validatie van de
TAC- kaart zal geopteerd worden om Shigella samen te detecteren met EIEC aangezien beide
ipaH bevatten.
3.2.5 YERSINIA
Er werden 5 primercombinaties getest voor de detectie van Yersinia spp. en hun specifieke
toxinegenen (zie tabel 7), uitgevoerd op basis van reinculturen en het positief materiaal
verzameld in tabellen 13 en 15. In tabel 38 wordt de selectie van primers en probes
voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.
76
Tabel 38: Overzicht primers en probes Yersinia spp.
Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0
Functionaliteit/
specificiteit efficiëntie
FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe
Yersinia spp
yst p646b p647 p646 p647 p646 p647
yst p648 p650 p648 p650 p648 p650
yst p649 p651 p649 p651 p649 p651
yst p652a p653 p652 p653 p652 p653 662 p652 p653 662
ail p654 p655 p654 p655 p654 p655 663 p654 p655 663 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend
3.2.5.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS
Voor het onderzoek naar de primers voor Yersinia spp. werd gebruik gemaakt van 10
verschillende reinculturen. Ook dit experiment werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij
voorgaande bacteriën.
Hierbij werd er voor het yst gen gekozen voor p652-p653 aangezien deze het minste
aspecifieke amplificatie vertoonde. Voor het ail gen moet er wel gekozen worden voor p654-
p655. Uit deze waarden kan er al worden aangenomen dat beide primers vooral werkzaam
zijn op Y. enterocolitica. Zoals al werd aangegeven in de literatuurstudie, kunnen Yersinia
stammen onderverdeeld worden in verschillende subtypes. Naargelang ze binnen deze
subtypes vallen zijn ze ofwel niet-pathogeen, pathogeen met een lage virulentie en pathogeen
met een hoge virulentie. Er was aangegeven dat niet alle reinculturen, voorgesteld in tabel 13,
behoorden tot de hoog virulente biogroep 1B. Slechts ATCC 23715, 1C6 87 en 1C6 88
behoorden tot biogroep 1B en bij deze stammen werd dan ook een goede amplificatie
verkregen met lage Ct-waarden (13-21) en weinig variërende smelttemperaturen. Reinculturen
3A9 68, 1C6 93, 1C6 97, 1C6 99 en 1C8 02 behoorden echter allemaal tot biogroep 1A en
deze zijn niet pathogeen. Dit is dus een verklaring waarom er voor deze culturen zoveel
resultaten werden gegenereerd met hoge Ct-waarden. Daarnaast bleven reinculturen 3A8 89
en 1C6 92 over. 3A8 89 is een Yersinia met lage virulentie waarbij dan ook telkens hoge Ct-
waarde (>32) werd verkregen. Bij 1C6 92 was het ongekend tot welke biogroep deze behoorde
en bij deze werd voor geen enkele primer een amplificatie verkregen waardoor er wordt
verondersteld dat het hier gaat om een niet-pathogene Yersinia stam.
3.2.5.2 EFFICIËNTIE PRIMERS
De efficiëntie werd niet meer uitgetest voor de Yersinia primers aangezien de selectie al
gebaseerd was op de resultaten die bekomen werden bij de functionaliteitstest.
77
3.2.5.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
Voor Yersinia werd dezelfde techniek gebruikt als bij voorgaande bacteriën. Dit werd bij de 1ste
4 negatieve stalen echter op slechts 3 van de primerparen uitgevoerd: voor het yst gen werd
gekozen voor primerparen p648-p650 en p652-p653 aangezien deze het minste aspecifieke
amplificatie vertoonden wanneer ze getest werden op functionaliteit met reinculturen. Bij de
andere fecesstalen werd p648-p650 geëlimineerd en dus enkel verder gewerkt met p652-
p653. Voor het ail gen werd verder gewerkt met p654-p655. De gekozen positieve fecesstalen
waren beide positief voor Y. enterocolitica omdat bij dit pathogeen de beste resultaten
verkregen werden bij voorafgaande testen.
Hier werd opnieuw aspecifieke amplificatie verkregen bij 3 van de 4 negatieve fecesstalen.
Deze amplificaties hadden opnieuw een hoge Ct-waarde en een afwijkende smelttemperatuur.
Daarnaast werd ook geconstateerd dat bij staal 219264001 hoge Ct-waarden verkregen werd,
met een smelttemperatuur die licht afweek van de verwachtte smelttemperatuur. Bij het 2de
positieve fecesstaal werd echter wel een goede amplificatiecurve verkregen met Ct-waarde
die varieert van 20 tot 22 en een correcte smelttemperatuur. Voor staal 209571701 werd bij
p652-p653 een zeer late aspecifieke amplificatie geconstateerd, waarvoor geen smeltcurve
werd verkregen. Voor staal 215900401 werd bij p654-p655 aspecifieke amplificatie
geconstateerd, deze keer wel met smeltcurve maar de smelttemperatuur was afwijkend.
3.3.5.4 FUNCTIONALITEIT VAN PROBES
De uitvoering van het onderzoek naar functionaliteit van de combinatie van primers en probes
werkzaam op Yersinia werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij voorgaande bacteriën. Dit
werd uitgevoerd op 3 reinculturen: 3A8 89, 3A9 68 en ATCC 23715. Net zoals bij voorgaande
testen werd voor beide primer-probes geen amplificatie verkregen bij 3A8 89 en 3A9 68. Voor
ATCC 23715 werd bij beide primer-probes wel amplificatie verkregen zoals verwacht werd,
echter was deze voor de primers werkzaam op het ail gen laat, met een Ct-waarde van 31.94.
Bij herhaling werd wel een betere Ct-waarde verkregen. Na verder in silico onderzoek op de
gebruikte probe, werd gezien dat deze een lage fluorescentie vertoonde, een G had
ingebouwd op zijn 2de base en dat de probe 23 nt lang was. Dit verklaart de eerder bekomen
hoge Ct-waarde.
Enkel voor de primer werkzaam op het yst gen werd een verdere efficiëntie-bepaling
uitgevoerd op een reincultuur. Hierbij werd opnieuw gewerkt zoals bij voorgaande bacteriën.
Voor de efficiëntie werd echter enkel rekening gehouden met de Ct-waarden voor de 10x, 100x
en 1000x verdunning, wat neerkomt op slechts 3 verschillende stalen. Dit komt doordat de Ct-
waarde die bekomen werd voor de 1000x en de 10000x verdunning nagenoeg dezelfde was.
Hierdoor zal er uit de bekomen efficiëntie van 80% geen concreet besluit kunnen worden
getrokken.
Bij verdere efficiëntiebepaling op plasmides werd voor p652-p653-662 94.0% efficiëntie
bekomen en voor p654-p655-663 98.1% efficiëntie bekomen.
78
3.3.5.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
De specificiteit van de probes werd getest op 4 mengsels, opgebouwd uit verschillende
reinculturen en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen zijn verzameld in tabel
28 en 29.
Beide primer-probeparen gaven goede resultaten voor zowel de reincultuurmengsels als voor
de fecesstalen. Enkel bij staal 219264001 gaven beide een vals negatief resultaat. Er wordt
van uitgegaan dat het hier gaat om een niet-pathogene Yersinia stam.
Dankzij deze voorgaande testen werden 2 primer-probecombinaties overgehouden voor
Yersinia spp. Met deze kan er worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze
geselecteerde primers en probes zijn in het groen aangeduid in tabel 38.
3.2.6 ESCHERICHIA COLI
Er werden 32 primercombinaties getest voor de detectie van E. coli en hun specifieke
toxinegenen (zie tabel 8), uitgevoerd op basis van reinculturen en het positief materiaal
verzameld in tabellen 14 en 15. In tabel 39 wordt de selectie van primers en probes
voorgesteld. De methode om hiertoe te komen wordt hieronder besproken.
Tabel 39: Overzicht primers en probes E. coli.
Sybr select QPCR Taq Man fast GI-TAC v1.0
Functionaliteit/
specificiteit efficiëntie
FW RV FW RV FW RV probe FW RV Probe
E. coli
EPEC
eae p580b p581 p580 p581
eae p582a p583 p582 p583 p582 p583 669 p582 p583 669
bfpA p584 p585 p584 p585
bfpA p586 p587 p586 p587 p586 p587 670 p586 p587 670
bfpA p588 p589 p588 p589
EAEC
aggR p590 p591 p590 p591 p590 p591 671 p590 p591+592 671
STEC
stx1 p593 p596 p593 p596
stx1 p594 p596 p594 p596
stx1 p595 p596 p595 p596
stx1 p597 p599 p597 p599
stx1 p598 p600 p598 p600 p598 p600 672 p598 p600 672
stx2 p601 p603 p601 p603
stx2 p602 p603 p602 p603 p602 p603 673 p602 p603 673
stx2 p604 p605 p604 p605
79
ETEC
estA p606 p608 p606 p608
estA p606 p609 p606 p609
estA p606 p610 p606 p610
estA p606,1 P610 p606,1 P610 p606,1 P610 674 p606,1 + p606,2 P610 674
estA p606,2 p610 p606,2 p610
estA p607 p608 p607 p608
estA p607 p609 p607 p609
estA p607 p610 p607 p610
estB p611 p612 p611 p612
estB p611 p613 p611 p613
eltB p614 p615 p614 p615 p614 p615 675 p614 p615 675
eltB p616 p617 p616 p617
eltB p618 p619 p618 p619
eltB p618 p620 p618 p620
eltB p621 p622 p621 p622
eltB p621 p623 p621 p623
EIEC
ipaH p624 p626 p624 p626 p624 p626 676 p624 p626 676
ipaH p625 p626 p625 p626 aPrimers en probes aangeduid in het groen zijn correct functionerend
bPrimers en probes aangeduid in het oranje zijn niet correct functionerend
3.2.6.1 FUNCTIONALITEIT PRIMERS
Voor het onderzoek naar de primers voor E. coli werd gebruik gemaakt van 5 verschillende
DNA extracten van reinculturen, elk van een andere categorie waar DEC toe kunnen behoren.
Dit experiment werd opnieuw op dezelfde manier uitgevoerd als bij voorgaande bacteriën.
Door het grote aantal te testen primers werd niet voor elk primerpaar getest op alle stalen.
Voor elke E. coli type zijn er telkens 1 of 2 plaatsen voorzien op de TaqMan Array kaart,
afhankelijk van de genen waarop zal getest worden. In eerste instantie werden de primerparen
enkel getest op het E. coli waarvoor ze actief zijn (bv. De EPEC primerparen enkel op het
EPEC staal). Daarna werd er voor elk van de genen waarvoor een plaats beschikbaar is op
de TAC 1 primerpaar uitgekozen en die werd getest op de overige 4 E. coli stalen.
Voor ETEC wordt er op 2 genen getest: estA en eltB. Alle 8 primerparen complementair aan
het estA gen werden getest met MBC 124. Hierbij werd overal een amplificatiecurve
waargenomen met te hoge Ct-waarden. Uit deze primerparen werd primerpaar p606-p610
gekozen om ook te testen op de 4 andere E. coli stalen, waarbij telkens aspecifieke amplificatie
werd verkregen met een hoge Ct-waarde. Aangezien op de 4de base van primer 606 zowel
een A als een G kon worden ingebouwd, werd besloten om 2 nieuwe primers te bestellen:
606.1 waarbij op de 4de base een A werd ingebouwd en 606.2 waarbij op de 4de base een G
werd ingebouwd. Beide primers werden opnieuw gepaard met primer 610 en ook uitgetest op
MBC 124, in de hoop dat deze een betere amplificatiecurve zouden generen. Dit was echter
80
niet het geval, er werd opnieuw bij beide primerparen een hoge Ct-waarde (>38) verkregen.
Bij verdere onderzoeken in combinatie met probes wordt geopteerd om bij de aanmaak van
de PCR mix telkens gebruik te maken van een mengsel waarbij een even grote hoeveelheid
aan 606.1 als 606.2 aanwezig is.
Daarnaast werden ook de 8 primerparen complementair aan het eltB gen uitgetest op MBC
124. Hiervoor onstond bij de positieve stalen telkens een mooie amplificatiecurve. Wanneer er
met p614-p615 verder getest werd op de overige E. coli stalen, werd er nergens aspecifieke
amplificatie geconstateerd.
Voor EIEC werd onderzoek gedaan naar 2 verschillende primerparen, p624-p626 en p625-
p626. Uit de 1ste test waarbij enkel gewerkt werd met MBC122 kwam voort dat voor beide een
goede amplificatiecurve werd verkregen met een lage Ct-waarde op het EIEC staal. Daarna
werd p624-p626 verder getest op alle andere E. coli DNA, waarbij nergens een amplificatie
werd verkregen. Daarom werd er besloten om dit primerpaar te behouden.
Voor EPEC zijn primerparen p580-p581 en p582-p583 werkzaam voor het eae gen. Ook E.
coli die vallen onder de STEC categorie hebben dit gen. De primers moeten dus een
amplificatie vertonen voor zowel MBC 123 als MBC 022. Dit werd bekomen bij p582-p583,
maar hij krijgt wel een aspecifieke amplificatie bij het ETEC staal. Deze is echter zeer laat
tijdens de amplificatie, bij Ct-waarde 40. p580-p581 vertoonde enkel een amplificatiecurve
voor MBC 123. De 3 overige EPEC primerparen zijn complementair aan het bfpA gen. Deze
primerparen zouden enkel een positief resultaat mogen vertonen voor MBC 123. Wanneer
hierop getest werd, werd echter een vals negatief resultaat verkregen voor zowel p586-p587
als p588-p589. Bij p584-p585 werd voor MBC 123 aspecifieke amplificatie bekomen met een
hoge Ct-waarde (40) en een afwijkende smelttemperatuur. Om te testen op de overige E. coli
stalen werd gekozen voor p586-p587. Hierbij werd nergens aspecifieke amplificatie bekomen.
Voor EAEC werd er op slechts 1 primerpaar getest: p590-p591. Deze gaf bij alle E. coli stalen
het gewenste resultaat, behalve bij MBC 124 waarbij er aspecifieke amplificatie geconstateerd
werd. Toch werd er geen smeltcurve verkregen.
Wanneer er voor STEC alleen getest werd op MBC 022 werd overal een goede amplificatie
bekomen, behalve voor p594-p596. Hierbij werd een zeer hoge Ct-waarde bekomen. Om te
testen op de overige E. coli stalen werd gekozen voor p598-p600 en p602-p603, die beide
nergens aspecifieke amplificatie vertoonden.
3.2.6.2 EFFICIËNTIE PRIMERS
Enkel bij STEC en ETEC was het door de voorgaande test nog niet volledig duidelijk welke
primers zouden weerhouden worden. Daarom werden er enkel voor deze 2 E. coli categorieën
verdunningsreeksen aangemaakt. Hierbij werden voor alle primerparen, met uitzondering van
primerpaar 618-620, slechts Ct-waarden bekomen tot en met de 1000x verdunning. Hierdoor
was het onmogelijk om een accurate bepaling te maken van de efficiëntie.
81
3.2.6.3 SPECIFICITEIT PRIMERS IN AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
In het labo wordt er niet getest op E. coli waardoor het onmogelijk is om te weten of een
fecesstaal positief of negatief zal zijn. Daardoor was het niet mogelijk om deze test uit te
voeren.
3.2.6.4 FUNCTIONALITEIT VAN PROBES
De uitvoering van het onderzoek naar functionaliteit van de combinatie van primers en probes
werkzaam op E. coli werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij voorgaande bacteriën. Hier
werd dit uitgevoerd op de Vircell DNA controles; elke primer-probe werd uitgetest op de Vircell
DNA controle waarop hij positief zou moeten reageren. Daarnaast werd elke primer-probe ook
getest op molecular grade water, dat dienst doet als negatieve controle. Nergens werd er
aspecifieke amplificatie verkregen voor de negatieve controle. Echter werd er wel driemaal
een vals negatief resultaat verkregen: bij p586-p587-670, getest op MBC 123 en bij zowel
p606-p610-674 als bij p606.1-p606.2-p610-674, getest op MBC 124.
Bij E. coli werd de efficiëntiebepaling enkel uitgevoerd op plasmides. De bekomen waarden
hiervan zijn verzameld in tabel 40.
Tabel 40: Bekomen efficiëntiewaarden voor E.coli.
Gen Primers//probe Efficiëntie (%) Herhaling Gemiddelde
EPEC eae 582-583//669 103,5
EPEC bfpA 586-587//670 114,2
EAEC aggR 590-591//671 95,1
STEC stx1 598-600//672 107,9
STEC stx2 602-603//673 108,6
ETEC ST(estA) 606,1&2-610//674 83,2 122,0 102,6
ETEC LT(eltB) 614-615//675 105,6
EIEC ipaH 624-626//676 96,1
3.2.6.5 SPECIFICITEIT VAN PROBES BIJ AANWEZIGHEID VAN VREEMD DNA
De specificiteit van de probes werd getest op 4 mengsels, opgebouwd uit verschillende
reinculturen, en 11 fecesstalen. De gebruikte mengsels en fecesstalen zijn verzameld in tabel
28 en 29.
Alle gebruikte primerparen voor E. coli gaven juiste resultaten wanneer ze getest werden op
specificiteit met de reincultuurmengsels. Ook werd hierbij aangetoond dat Shigella
gedetecteerd wordt met de primer voor EIEC.
Ook bij de fecesstalen werden zo goed als overal de juiste resultaten verkregen, enkel p582-
p583-669 vertoonde 2 keer aspecifieke amplificatie met hoge Ct-waarde: voor stalen
209873401 en 209873401. Aangezien het labo niet test op het feit of fecesstalen positief of
negatief zijn voor E. coli hadden we geen E. coli positieve fecesstalen. Daarom werd geopteerd
om de specificiteit van de primers en probe voor het eae gen te testen op fecesstalen die
gespiked werden met de STEC vircell DNA controle, aangezien het eae gen ook aanwezig is
82
in STEC. Dit werd enkel voor dit primer-probe paar gedaan omdat deze de enige was die
aspecifieke amplificatie veroorzaakte. Bij deze gespikede fecesstalen werd een goede
amplificatie verkregen.
Door middel van alle voorgaande testen kunnen 8 primer-probecombinaties geselecteerd
worden voor E. coli. Hiermee kan worden overgegaan tot validatie van de TAC-kaart. Deze
geselecteerde primers en probes zijn in het groen aangeduid in tabel 39.
In totaal bleven 20 primerparen over voor de 6 pathogenen en die zullen aangebracht worden
op een TAC-kaart ter verdere validatie. De overgebleven primerparen en hun probe zijn
verzameld in tabel 41.
Tabel 41: Overgebleven geschikte primerparen met hun probe
Pathogeen Target primer selectie probe
Clostridium difficile 16 S p503-p506 678
Clostridium difficile Toxin A tcdA p514-p515 656
Clostridium difficile Toxin B tcdB p518-p519 657
Clostridium difficile binair Toxin A cdtA p520-p521 658
Clostridium difficile binair Toxin B cdtB p524-p525 659
Campylobacter spp. 16S p560-p561 664
Campylobacter jejuni cadF p562-p563 665
Campylobacter coli ceuE p566-p567 679
Salmonella spp. ompF p568-p569 667
Salmonella spp. ssaN p578-p579 668
STEC stx1 p598-p600 672
STEC stx2 p602-p603 673
EPEC eae p582-p583 669
EPEC bfpA p586-p587 670
EAEC aggR p590-p591 671
ETEC LT (eltB) p614-p615 675
ETEC ST (estA) p606.1-606.2-p610 674
EIEC/Shigella ipaH p624-p626 676
Yersinia enterocolitica yst p652-p653 662
Yersinia enterocolitica ail p654-p655 663
3.4 ELEKTROFORESE
In punt 3.2.5.1 werd gezien dat voor sommige Yersinia reinculturen geen goede amplificatie
verkregen werd. Vooraleer tot de verklaring werd gekomen, ook uitgeschreven onder punt
3.2.5.1, werd besloten om dit fenomeen te proberen verklaren door middel van elektroforese.
In figuur 26 zijn laan 2 tot en met 5 de Yersinia culturen. Hierbij werd voor ATCC 23715 telkens
een goede amplificatie verkregen en voor 3A9 68 een slechte amplificatie. Er werd besloten
om beide reinculturen te amplificeren met 2 verschillende primerparen en deze op gel te zetten.
Er wordt verwacht dat wanneer de PCR reactie goed doorgaat, er één duidelijk bandje zal
worden verkregen. Zoals te zien in de figuur werd er voor ATCC 23715, zoals verwacht werd,
83
een duidelijk bandje verkregen terwijl bij 3A9 68 aspecifieke bandjes worden verkregen. Voor
3A9 68 is de amplificatie dus duidelijk niet goed doorgegaan en deze is waarschijnlijk geen
pathogene stam.
Ook werd op dezelfde gel een aantal Campylobacter stalen uitgetest in laan 6 tot en met 11.
Bij een herhaling van de test op functionaliteit van de primers werd voor 3A9 79 en 3A9 89 bij
p562-p563 en p564-p565 aspecifieke amplificatie verkregen aangezien beide reinculturen
positief zijn voor C. coli en deze primers specifiek zijn voor C. jejuni. De 96-well die hiervoor
gebruikt werd, werd bijgehouden en deze stalen werden op gel gezet. Hierbij wordt bij elk
laantje een bandje verkregen, wat wijst op aspecifieke amplificatie voor p562-p563 en p564-
p565.
Figuur 26: Resultaat na elektroforese van de amplicaons van Campylobacter en Yersinia. Laan 1 en 12 zijn de
ladders. Laan 2 is het amplicon van ATCC 23715 met p646-p647. Laan 3 is het amplicon van 3A9 68 met p646-
p647. Laan 4 is het amplicon van 3A9 68 met p649-p651. Laan 5 is het amplicon van ATCC 23715 met p649-p651.
Laan 6 is het amplicon van 3A9 78 met p560-p561. Laan 7 is het amplicon van 3A9 78 met p562-p563. Laan 8 is
het amplicon van 3A9 78 met p564-p565. Laan 9 is het amplicon van 3A9 89 met p560-p561. Laan 10 is het
amplicon van 3A9 89 met p562-p563. Laan 11 is het amplicon van 3A9 89 met p564-p565.
Zoals eerder vermeld onder punt 3.2.3.3 waren er 4 fecesstalen waarvan verondersteld werd
negatief te zijn voor Campylobacter maar die toch amplificatie vertoonden bij de detectie
hiernaar. Daarom werd er gekozen om een sequenering van het amplicon uit te voeren voor
deze fecesstalen om dan later met behulp van BLAST te controleren of de bekomen DNA
sequentie overeenkomstig is met Campylobacter sequenties. Vooraleer deze sequenering
84
uitgevoerd kan worden is het nodig om een elektroforese uit te voeren. Enkel voor stalen
waarbij één duidelijk bandje wordt bekomen zal een sequenering worden uitgevoerd. Het
resultaat van deze elektroforese wordt voorgesteld in figuur 27. Hierbij zijn de 4 met rood
omcirkelde bandjes de bekomen bandjes van de Campylobacterstalen. Er wordt telkens
slechts 1 bandje verkregen met sterke fluorescentie, waardoor het mogelijk is om de
sequenering uit te voeren.
Figuur 27: Resultaat elektroforese van amplicons ter voorbereiding van sequenering.
3.5 DNA SEQUENERING
Zoals vermeld onder punt 3.2.3.3 werd er gewerkt met 4 fecesstalen die mogelijks toch positief
waren voor Campylobacter spp. Daarom werden deze gesequeneerd met primerpaar p560-
p561 voor het 16S gen. Deze sequenering was echter niet heel erg succesvol, bij 3 van de 4
stalen was er na het sequeneren te veel achtergrond aanwezig waardoor analyse onmogelijk
werd. Voor fecesstaal 236704101 werd volgende sequentie verkregen: CTTTAATC-
GGGACGAAACATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACT.
Deze sequentie werd onderzocht met een nucleotide BLAST. Ook dit was niet succesvol
aangezien er alleen hits werden gevonden voor “uncultured bacteria” waardoor het nog steeds
onmogelijk was om hieruit een conclusie te trekken. Wel werd er gecontroleerd of de sequentie
van de probe voor dit primerpaar of zijn reversed complement aanwezig waren in de verkregen
sequentie. Dit was niet het geval.
85
3.6 KWALITEITSCONTROLE
Tijdens het extractieproces van fecesstalen wordt een kleine contratie van Phocine Distemper
Virus (PDV) of Seal Herpes Virus (SHV) toegevoegd aan het geëxtraheerde staal. Wanneer
er geen inhibitie optreedt, en er dus een goede staalextractie is doorgegaan, moet er steeds
SHV of PDV, afhankelijk van de extractiemethode, teruggevonden worden in het staal met een
bepaalde Ct-waarde. Daarom wordt er een extractiecontrole uitgevoerd: 2 qPCRs die
amplificatie zullen vertonen wanneer er ofwel PDV ofwel SHV aanwezig is in het fecesstaal.
Ook kan het zijn dat het tijdens de voorbereiding op extractie van het fecesstaal nodig is om
dit fecesstaal te verdunnen. Dit kan gebeuren met AVE buffer (Qiagen) of DNAzol reagent
(lifetechnologies). Daarom is het nodig om bij deze kwaliteitscontrole ook na te gaan of deze
reagentia geen inhibitie kunnen veroorzaken. De kwaliteitscontrole werd uitgevoerd met
fecesstalen 208897001 en 216009201. Van beide werden drie verdunningen uitgevoerd: 20x
verdund, 10x verdund en 5x verdund. Elke verdunning werd 2 maal uitgevoerd met DNAzol
reagent (lifetechnologies) en 2 maal met AVE buffer (Qiagen). Ook werden er blanco stalen
aangemaakt van zowel DNAzol reagent (lifetechnologies) en AVE buffer (Qiagen). De helft
van deze stalen werden geëxtraheerd met PDV en de anderen met SHV. Daarna werd de
kwaliteitscontrole uitgevoerd op deze geëxtraheerde stalen. Bij de controle op PDV werd een
gemiddelde Ct-waarde verkregen van 31.9 en bij de controle op SHV werd een gemiddelde
Ct-waarde verkregen van 32.4.
86
4. SAMENVATTEND BESLUIT
In deze masterproef werden telkens minimaal twee functionele qPCRs geselecteerd voor de
detectie van 6 bacteriële veroorzakers van gastro-enteritis met het ultieme doel deze te spotten
op een TaqMan Array Card (TAC) voor de detectie van virale, bacteriële en parasitaire
oorzaken van infectieuze gastro-enteritis. De primerparen voor de detectie van virale en
parasitaire pathogenen komen in dit eindwerk niet aan bod. De TAC maakt het mogelijk om
op een snelle, routinematige en effectieve manier de oorzaak van gastro-enteritis te kunnen
verklaren uit fecesstalen met behulp van een Real-Time PCR. De bekomen eerste versie van
deze TaqMan Array kaart wordt hieronder weergegeven in figuur 28.
Een eerste selectie uit de meerdere species specifieke targetgenen voor de 6 behandelde
pathogenen werd gemaakt op basis van een literatuurstudie. Hiervoor werden 63 primerparen
en 23 probes ontwikkeld die 22 verschillende targetsequenties konden detecteren. In een
eerste fase van de selectie werden enkel de primers op deze targetgenen getest op zowel
functionaliteit, efficiëntie als specificiteit bij hoge primerconcentratie met behulp van een PCR
reactie met de SYBR Select Mastermix. Om daarna de specificiteit te kunnen bepalen werd er
gewerkt met fecesstalen. Volgens Salonen et al, 2010, zorgen fecale stalen voor niet-invasief
materiaal voor analyse van gastro-intestinale micro-organismen. De lyse van de bacteriële
cellen aanwezig in deze stalen kan gebeuren op een aantal manieren, zoals mechanische,
enzymatische, chemische of een combinatie hiervan. In dit werk wordt geopteerd voor een
fysische lyse. Hierbij worden de fecale stalen eerst ingevroren zodat de stalen een vries-dooi
cyclus kunnen ondergaan. Hierdoor kunnen de sporen en cellen van de bacteriën makkelijker
openbreken bij extractie. De volledige extractiemethode werd verder uitgediept in hoofdstuk
2.6.
Op basis van de bekomen gegevens werden voor C. difficile vijf, voor Salmonella spp. twee,
voor Campylobacter spp. drie, voor Shigella spp. één, voor Yersinia spp. twee en voor E. coli
acht primerparen geselecteerd.
87
Organism
Target gene
Target gene
Organism
Norovirus GI
Norovirus GII
Norovirus GIV
Adenovirus
Adenovirus
Astrovirus
Sapovirus
Sapovirus
Sapovirus
Cntr 18S
Cntr PDV
Cntr hDNA
Rotavirus A
Rotavirus A
Enterovirus
Hepatitis E virus
Giardia lamblia
Cryptosporidium spp.
Entamoeba spp.
Entamoeba histolytica
Entamoeba dispar
Strongyloides stercoralis
Strongyloides stercoralis
Dientamoeba fragilis
ORF1-ORF2
ORF1-ORF2
ORF1-ORF3
hexon
hexon
capsid
RdRp/VP1 junction
RdRp/VP1 junction
RdRp/VP1 junction
18S
PDV
hDNA
NSP3
NSP3
5'UTR (192 nt)
ORF3 regio
18S
DNA J-like protein
18S
18S
18S
18S rRNA
28S rRNA
18S-rRNA
5.8S-rRNA
18S
16S
tcdA
tcdB
cdtA
cdtB
16S
cadF
ceuE
ompF
ssaN
stx1
stx2
eae
bfpA
aggR
LT (eltB)
ST (estA)
ipaH
yst
ail
28S rRNA
28S rRNA
Dientamoeba fragilis
Blastocystis
Clostridium difficile
C. difficile Toxin A
C. difficile Toxin B
C. difficile binair Toxin A
C. difficile binair Toxin B
Campylobacter sp.
Campylobacter jejuni
Campylobacter coli
Salmonella sp.
Salmonella sp.
STEC
STEC
EPEC
EPEC
EAEC
ETEC
ETEC
EIEC/shigella
Yersinia enterocolitica
Yersinia enterocolitica
Schistosoma mansoni , intercalatum ,
haematobium, guineensis
Schistosoma mekongi , japonicum
Figuur 28: Schematische voorstelling van de gewenste indeling van de Taqan array kaart. De genen aangeduid
in het blauw zijn de genen die in deze masterproef onderzocht werden.
88
Deze 20 primerparen werden gecombineerd met een Minor Groove Binders (MGB) probe ter
verdere optimalisatie. Van deze combinatie moest opnieuw de functionaliteit, efficiëntie en
specificiteit bepaald worden, ditmaal met behulp van een PCR reactie met de TaqMan Fast
Virus 1-step MasterMix. Hieruit bleek dat de meeste primer-probecombinaties functioneel
waren. Voor het C. difficile 16S gen en voor het C. coli ceuE gen was het nodig om de probe
aan te passen. Ook werd er besloten om de primer-probecombinatie voor Shigella te laten
vallen. De test op Shigella zal doorgaan samen met EIEC aangezien deze beide het ipaH gen
bevatten.
Aan de hand van de resultaten van dit eindwerk, het eindwerk van Jeroen Haers, die naast de
optimalisatie van de extractiemethode ook een aantal qPCRs geevalueerd heeft voor de
detectie van parasitaire organismen in zijn eindwerk in academiejaar 14-15, en de selectie van
een aantal virale qPCR, zijn we uiteindelijk tot de bovenstaande eerste versie van de gastro-
intestinale TAC gekomen.
Hiermee is de optimalisatie van de TAC nog niet beëindigd. De verschillende primer-
probecombinaties moeten gespot worden door middel van lyofilisatie op een TAC waarna een
validatie kan worden uitgevoerd. Een eerste validatiestap gebeurt dan met behulp van
plasmides die samen alle targetgenen bevatten waarop er met de TAC kan worden getest.
Van deze plasmides wordt een verdunningsreeks gemaakt. Deze verdunningsreeksen worden
gespot op de TAC en doorlopen een PCR. Aangezien er wordt gewerkt met plasmides
waarvan de sequenties gekend zijn, kan er snel worden aangetoond of de TAC al dan niet
zorgt voor aspecifieke amplificatie. Ook kan, door het werken met een verdunningsreeks, de
efficiëntie van elk primerpaar worden bepaald, waarbij het opnieuw de bedoeling is om een
waarde tussen 90% en 110% te verkrijgen. Daarna wordt de validatie uitgevoerd met behulp
van een groot aantal klinische fecesstalen, die opnieuw op de TAC zullen worden aangebracht
en een PCR zullen doorlopen.
89
5. BRONNENLIJST
Abbasi P., Kargar M., Doosti A., Mardaneh J. Ghorbani-Dalini S. & Dehyadegari M.A. (2014). Characterization of Shiga-toxin producing E. coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) using multiplex Real-Time PCR assays for stx1, stx2, eaeA. Iranian journal of microbiology. 6(3):169-174
Al-Talib H., Latif B.& Mohd-Zain Z. (2014). Pentaplex PCR Assay for Detection of Hemorrhagic Bacteria from Stool Samples. Journal of Clinical Microbiology. 52(9):3244-3249
Auvray F., Lecureuil C., Dilasser F., Tache J. & Derzekke S. (2008). Development of a real-time PCR assay with an internal amplification control for the screening of Shiga toxin-producing Escherichia coli in foods. The Society for Applied Microbiology, Letters in applied microbiology.48:554-559
Barletta F., Ochoa T.J. & Cleary T. G. (2013). Multiplex Real-Time PCR (MRT-PCR) for Diarrheagenic. PCR Detection of Microbial Pathogens; Second Edition
Bélanger S.D., Boissinot M., Clairoux N., Picard F.J. & Bergeron M. G. (2003). Rapid Detection of Clostridium difficile in Feces by Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiology. 41(2):730-734
Best E.L., Powell E.J., Swift C., Grant K.A. & Frost J.A. (2003). Applicability of a rapid duplex real-time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates. FEMS Microbiology Letters. 229:237-241
Bielaszewska M., Idelevich E. A., Zhang W., Bauwens A., Schaumburg F., Mellmann A., Karch H. (2012). Effects of Antibiotics on Shiga Toxin 2 Production and Bacteriophage Induction by Epidemic Escherichia coli O104:H4 Strain. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56(6):3277–3282
Bottone E.J. (2015). Yersinia enterocolitica: Revisitation of an Enduring Human Pathogen. Clinical Microbiology Newsletter. 37(1):1-8.
Bowen R.A. (2000). Principles of Gel Electrophoresis. Geraadpleegd op 12 december 2015 via <http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html>.
Bugarel M., Martin A., Fach P. & Beutin L. (2011). Virulence gene profiling of enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli strains: a basis for molecular risk assessment of typical and atypical EPEC strains. BMC Microbiology. 11:142
Carter G.P., Rood J.I. & Lyras D. (2012). The role of toxin A and toxin B in the virulence of Clostridium difficile. Trends in microbiology. 20(1):21-29
Chen J., Zhang L., Paoli G. C., Shi C., Tu S. & Shi X. (2010). A real-time PCR method for the detection of Salmonella enterica from food using a target sequence identified by comparative genomic analyses. International Journal of Food Microbiology. 137:168-174
Cohen S.H., Gerding D.N., Johnson S., Kelly C.P., Loo V.G., McDonald C., Pepin J. & Wilcox M.H. (2010). Clinical Practice Guidelines for Clostridium difficile Infection in Adults: 2010 Update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA). Infection Control and Hospital Epidemiology. 31(5):431-455
Corpus G. (2010). Get in the “groove” with new molecular technology. Medical laboratory observer.
Cremonesi P., Pisani L.F., Lecchi C., Ceciliani F., Martino P., Bonastre A.S., Karus A., Balzaretti C. & Castiglioni B. (2015). Development of 23 individual TaqMan_real-
90
time PCR assays for identifitying common foodborne pathogens usin a singles set of amplification conditions. Food Microbiology. 43:35-40
Crocker J. & Murray P.G. (2003). Molecular biology in cellular pathology. (2de druk). West Sussex: John Wiley & Sons ltd.
Croxen M.A., Law R.J., Scholz R., Keeney K.M., Wlodarska M. & Finlay B.B. (2013). Recent Advances in Understanding Enteric Pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26(4):822-880
Crump J.A., Sjölund-Karlsson M., Gordon M.A. & Parry C.M. (2015). Epidemiology, Clinical Presentation, Laboratory Diagnosis, Antimicrobial Resistance, and Antimicrobial Management of Invasive Salmonella Infections. Clinical Microbiology Reviews. 28(4):901-937
Davis J., Wang J., Tropea J.E., Zhang D., Dauter Z., Waugh D.S. & Wlodawer A. (2008). Noel fold of virA, a type III secretion system effector protein from Shigella flexneri. Protein science. 17 (12):2167-2173
de Boer R. F., Ott A., Kesztyu B., Kooistra-Smid A. M. D. (2010). Improved Detection of Five Major Gastrointestinal Pathogens by Use of a Molecular Screening Approach. Journal of Clinical Microbiology. 48(11):4140-4146
de Jong E., de Jong A.S., Bartels C.J.M., van der Rijt-van den Biggelaar C., Melchers W.J.G. & Sturm P.D.J. (2012). Clinical and laboratory evaluation of a real-time PCR for Clostridium difficile toxin A and B genes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31:2219-2225
Elfving K., Andersson M., Msellem M.I., Welinder-Olsson C., Petzold M., Björkman A., Trolfors B., Martensson A. & Lindh M. (). Real-Time PCR Threshold Cycle Cutoffs Help To Identify Agents Causing Acute Childhood Diarrhea in Zanzibar. Journal of Clinical Microbiology. 52(3):916-923
Fàbrega A. & Vila J. (2012). Yersinia enterocolitica: pathogenesis, virulence and antimicrobial resistance. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica. 30(1):24-32
Fàbrega A. & Vila J. (2013). Salmonella enterica Serovar Typhimurium Skills to Succeed in the Host: Virulence and Regulation. Clinical Microbiology Reviews. 26(2):308-341
Fei Y. (2014). DNA Sequencing, Sanger and Next-Generation Sequencing. Applications of Molecular Genetics in Personalized Medicine.
Feng P., Weagant S.D. & Jinneman K. (2011). Diarhaegenic Escherichia coli. Bacteriological analytical manual Chapter 4A.
Hardegen C., Messler S., Henrich B., Pfeffer K., Würthner J. & MacKenzie C.R. (2010). A set of novel multiples Taqman real-time PCRs for the detection of diarrhoeagenic Escherichia coli and its use in determining the prevalence of EPEC and EAEC in a university hospital. Clinical Microbiology and Antimicrobials. 9:5-11
Hazen T.H., Humphrys M.S., Ochieng J.B., Parsons M., Bopp C.A., O’Reilly C.E., Mintz E. & Rasko D.A. (2014). Draft Genome Sequences of Nine Enteropathogenic Escherichia coli Strains from Kenya. Genome announcements. 2(3):1-2
Hebbelstrup Jensen B., Olsen K.E.P., Struve C., Angeliki Krogfelt K. & Munk Petersen A. (2014). Epidemiology and Clinical Manifestations of Enteroaggregative Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 27(3):614-630
Hensel M., Shea J.E., Raupach B., Monack D., Falkow S., Gleeson C., Kubo T. & Holden D.W. (1997). Functional analysis of ssaJ and the ssaK/U operon, 13 genes encoding components of the type III secretion apparatus of Salmonella pathogenicity island 2. Molecular microbiology. (24)1:155-167
Hoffmann M., Hurlebause J. & Weilke C. (2007). High-Performance Melting Curve Analysis. Using the lightcycler 480 system for discovery and analyses of genetic variation. Genetic engineering and biotechnology news. 27(21).
91
Hsu W., Wang J., Chen P., Lu Y. & Chen J. (2007). Detecting Low Concentrations of Shigella sonnei in Environmental Water Samples by PCR. Federation of European Microbiological Societies. 270:291–298
Humphries R. M. & Linscott A. J. (2015). Laboratory Diagnosis of Bacterial Gastroenteritis. Practical Guidance for Clinical Microbiology. 28(1):3-31
Jamal W., Pauline E.M. & Rotimi V.O. (2014). Comparative performance of the GeneXpert C. difficile PCR assay and C. diff Quik CHek Complete kit assay for detection of Clostridium difficile antigen and toxins in symptomatic community-onset infections. International Journal of Infectious Diseases. 29:244-248
Jensen M. B. F., Olsen K. E. P., Nielsen X. C., Hoegh A. M., Dessau R. B., Atlung T. & Engberg J. (2014). Diagnosis of Clostridium difficile: real-time PCR detection of toxin genes in faecal samples is more sensitive compared to toxigenic culture. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases.
Jiménez K. B., McCoy C. B. & Achí R. (2010). Detection of Shigella in Lettuce by the Use of a Rapid Molecular Assay with Increased Sensitivity. Brazilian Journal of Microbiology. 41: 993-1000
Jinneman K.C., Yoshitomi K.J. & Weagant S.D. (2003). Multiples real-time PCR method to identify Shiga toxin genes stx1 and stx2 and Escherichia coliO157:H7/H- serotype. Applied and Environmental Microbiology. 69(10):6327-6333
Josefsen M.H., Jacobsen N.R. & Hoorfar J. (2004). Enrichment Followed by Quantitative PCR both for Rapid Detection and as a Tool for Quantitative Risk Assessment of Food-Borne Thermotolerant Campylobacters. Applied and Environmental Microbiology. 70(6):3588-3592
Kaakoush N.O., Castaño-Rodríguez N., Mitchell H.M., Man S.M. (2015). Global Epidemiology of Campylobacter Infection. Clinical Microbiology. 28(3):687-720
Karger B.L. & Guttman A. (). DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30(1):196–202.
Knight D.R., Elliott B., Chang B.J., Perkins T.T. & Riley T.V. (2015). Diversity and Evolution in the Genome of Clostridium difficile. Clinical Microbiology Reviews. 28(3):721-741
Kutyavin V., Afonina I.A., Mills A., Gorn V.V., Lukhtanov E. A., Belousov E. S., Singer M. J., Walburger D. K., Lokhov S. G., Gall A. A., Dempcy R., Reed M. W., Meyer R. B. & Hedgpeth J. (2000). 3’-Minor Groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Research. 28(2):655-661
Lambertz S.T., Nilsson C., Hallanvuo S. & Lindblad M. (2008). Real-Time PCR Method for Detection of Pathogenic Yersinia enterocolitica in Food. Applied and Environmental Microbiology. 74(19):6060-6067
Lamps L.W., Havens J.M., Gilbrech L.J., Dube, P.H. & Scott M.A. (2006). Molecular Biogrouping of Pathogenic Yersinia enterocolitica, Development of a Diagnostic PCR Assay with Histologic Correlation. American Society for Clinical Pathology. 125:658-664
Life technologies (2012). TaqMan® Fast Virus 1-Step Master Mix. Geraadpleegd op 10 december 2015 via <http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents /generaldocuments/cms_084608.pdf>.
Life technologies (2015). SYBR® Select Master Mix. Geraadpleegd op 10 december 2015 via <http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4472903>.
Lin L.H., Tsai C.Y., Hung M.H., Fang Y.T. & Ling Q.D. (2011). Rectal swab sampling followed by an enrichment culture-based real-time PCR assay to detect Salmonella enterocolitis in children. Clinical Microbiology and Infection. 14:1421-1425
Liu J., Gratz J., Amour C., Kibiki G., Becker S., Janaki L., Verweij J.J., Taniuchi M., Sobuz S.U., Haqua R., Haverstick D.M. & Houpta E.R. (2013). A Laboratory-Developed TaqMan Array Card for Simultaneous Detection of 19 Enteropathogens. Journal of Clinical Microbiology. 51(2):472-480
92
Lothigius Å., Janzon A., Begum Y., Sjöling Å., Qadri F.,Svennerholm A.-M. & Bölin I. (2008). Enterotoxigenic Escherichia coli is detectable in water samples from an endemic area by real-time PCR. Journal of Applied Microbiology. 104:1128-1136
Maervoet V. (2014). Moleculaire bioctechnologie [cursus]. Universiteit Gent, Faculteit Bio-Ingenieurswetenschappen.
Maervoet V. & Van Hoorde K. (2015). Biochemische en moleculaire analyse [cursus]. Universiteit Gent, Faculteit Bio-Ingenieurswetenschappen.
Maher M., Finnegan C., Collins E., Ward B., Carroll C. & Cormican M. (2003). Evaluation of Culture Methods and a DNA Probe-Based PCR Assay for Detection of Campylobacter Species in Clinical Specimens of Feces. Journal of Clinical Microbiology. 41(7):2980-2986
Med-info (2011). Gastro-enteritis. Geraadpleegd op 7 december 2015 via <http://www.med-info.nl/Afwijking_MDL%20-%20Algemeen%20 -%20gastroenteritis.html>.
Morin N., Santiago A.E., Ernst R.K., Guillot S.J. & Nataro J.P. (2013). Characterization of the AggR Regulon in Enteroaggregative Escherichia coli. Infection and Immunity. 81(1):122-132
Mutters R., Nonnenmacher C., Susin C., Albrecht U., Kropatsch R. & Schumacher S. (2009). Quantitative detection of Clostridium difficile in hospital environmental samples by real-time polymerase chain reaction. Journal of Hospital Infection. 71:43-48
Nielsen E.M. & Andersen M.T. (2003). Detection and Characterization of Verocytotoxin-Producing Escherichia coli by Automated 5’ Nuclease PCR Assay. Journal of Clinical Microbiology. 41(7)2884-2893
Niyogi S.K. (2007). Increasing Antimicrobial Resistance – An Emerging Problem In The Treatment Of Shigellosis. Clinical Microbiology and Infection. 13(12):1141-1143
Omiccioli E., Amagliani G., Brandi G. & Magnani M. (2009). A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli 0157 in milk. Food Microbiology. 26:615-622
Persson S., Torpdahl M. & Olsen K. E. P. (2008). New multiplex PCR method for the detection of Clostridium difficile toxin A (tcdA) and toxin B (tcdB) and the binary toxin (cdtA ⁄ cdtB) genes applied to a Danish strain collection. European Society of Clinical Microbiology and Infectious diseases. 14:1057–1064
Prakash V.P., Leblanc L., Alexander-Scott N.E., Skidmore J., Simmons D., Quiliam D. & Chapin K.C. (2015). Use of a Culture-Independent Gastrointestinal Multiplex PCR Panel during a Shigellosis Outbreak: Considerations for Clinical Laboratories and Public Health. Journal of Clinical Microbiology. 53(3):1048-1049
Rainey F.A., Ward-Rainey N.L., Janssen P.H., Hippe H. & Stackebrandt E. (1996). Clostridium paradoxum DSM 730aT contains multiple 16s rRNA genes with heterogeneous intervening sequences. Microbiology. 142:2087-2095
Rohlke F. & Stollman N. (2012). Fecal Microbiota Transplantation in Relapsing Clostridium difficile Infection. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 5(6):403-420
Rosner B.M., Werber D., Höble M. & Stark K. (2013). Clinical aspects and self-reported symptoms of sequelae of Yersinia enterocolitica infections in a population-based study, Germany 2009-2010. BMC infectious diseases. 13:236
Sansonetti P.J. (2001). III. Shigellosis: From Symptoms to Molecular Pathogenesis. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 280(3):319:323
Sharma V.K. & Dean-Nystrom E.A. (2003). Detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 by using a multiplex real-time PCR assay for genes encoding intimin and Shiga toxins. Veterinary Microbiology. 93:247-260
93
Shin J., Oh S., Oh K., Park J. Jang E.J., Chung G.T., Yoo C., Bae G. & Cho S. (2015). An outbreak of foodborne illness caused by enteroaggregative Escherichie coli in a high school, South Korea. Japanese Journal of Infectious Diseases.
Sigma-Aldrich (2008). qPCR technical Guide.
Soli K.W., Maure T., Kas M.P., Bande G., Bebes S., Luang-Suaria D., Siba P.M., Morita A., Umezaki M., Greenhill A.R. & Horwood P.F. (2014). Detection of enteric viral and bacterial pathogens associated with paediatric diarrhea in Goroka, Papua New Guinea. International Journal of Infectious Diseases. 27:54-58
SourceBioscience (2016). Solid Phase DNA Extraction Methods. Geraadpleegd op 30 januari 2016 via <http://www.sourcebioscience.com/resources/solid-phase-dna -extraction-methods/>.
Souza dos Reis R. & Horn F. (2010). Enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella, Shigella and Yersinia: cellular aspects of hostbacteria interactions in enteric diseases. Gut pathogens. 2:8
Spina A., Kerr K.G., Cormican M., Barbut F., Eigentler A., Zerva L., Tassios P., Popescu G.A., Rafila A., Eerola E., Batista J., Maass M., Aschbacher R., Olsen K.E.P. & Allerberger F. (2015). Spectrum of enteropathogens detected by the FilmArray GI Panel in a multicenter study of community-acquired gastroenteritis. Clinical Microbiology and Infection. 21:719-728
Szmolka A., Wiener Z., Elsheimer Matulova M., Varmuzova K. & Rychlik I. (2015). Gene Expression Profiles of Chicken Embryo Fibroblasts in Response to Salmonella Enteritidis Infection. Plos one. 1-10
Tatavarthy A. & Cannons A. (2010). Real-time PCR detection of Salmonella species using a novel target: the outer membrane porin F gene (ompF). The Society for Applied Microbiology. Letters in Applied Microbiology. 50:645-652
Tawe J. (2014). Validation of PCR assays for detection of STEC O104:H4 and O121 in food.
Thiem V.D., Sethabutr O., von Seidlein L., Tung T.V., Canh D. G., Chien B.T., Tho L.H., Lee H., Houng H., Hale T.L., Clemens J.D., Mason C. & Trach D.D. (2004). Detection of Shigella by a PCR Assay Targeting in the ipaH Gene Suggests Increased Prevalence of Shigellosis in Nha Trang, Vietnam. Journal of Clinical Microbiology. 42(5):2031-2035
Thoerner P., Bin Kingombe C.I., Boëgli-Stuber K., Bissig-Choisat B., Wassenaar T.M., Frey J. & Jemmi T. (2003). PCR Detection of Virulence Genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and Investigation of Virulence Gene Distribution. Applied and Environmental Microbiology. 69(3):1810-1816
Uyeda J., Harmon K. & Wesley I. (1997). A PCR ELISA Method For The Detection Of Yersinia Enterocolitica. Swine Research Report, 1996. Paper 52.
van den Berg R.J., Kuijper E.J., Bruijnesteijn van Coppenraet L.E.S. & Claas E.C.J. (2006). Rapid diagnosis of toxinogenic Clostridum difficile in faecal samples with internally controlled real-time PCR. Clinical Microbiology and Infection. 12(2):184-186
Vandesompele J. (2013). qPCR Guide. Eurogentec.
Van Houdt S. (2012). Biochemische analysetechnieken [cursus]. Hogeschool Gent, Faculteit Natuur en Techniek.
Větrovský T. & Baldrian P. (2013). The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. PLOS ONE. 8(2):1-10
Vital P.G., Dimasuay K.G.B., Widmer K.W., Rivera W.L. (2014). Microbiological Quality of Fresh Produce from Open Air Markets and Supermarkets in the Philippines. The Scientific World Journal. 1:7
Voss T. (2014). Method for isolating nucleic acids. Geraadpleegd op 30 januari 2016 via <https://www.google.com/patents/US20140199689>.
94
Wang J., Duan R., Liang J. Huang Y., Xiao Y., Qiu H., Wang X., Jing H. (). Real-Time TaqMan PCR for Yersinia enterocolitica Detection based on the ail land foxA Genes. Journal of Clinical Micobiology. 52(12):4443-4444
Wroblewski D., Hannett G. E., Bopp D. J., Dumyati G.K., Halse T. A., Dumas N.B. & Mussen K. A. (2009). Rapid Molecular Characterization of Clostridium difficile and Assessment of Populations of C. difficile in Stool Specimens. Journal of Clinicial Microbiology. 47(7): 2142–2148
Yoshida Y., Miki T., Ono S., Haneda T., Ito M., Okada N. (2014). Functional Characterization of the Type III Secretion ATPase SsaN Encoded by Salmonella Pathogenicity Island 2. PLOS ONE. 9(4):1-12
Zhang G., Brown E.W., Gonzalez-Escalona N. (2011). Comparison of Real-Time PCR, Reverse Transcriptase Real-Time PCR, Loop-Mediated Isothermal Amplification, and the FDA Conventional Microbiological Method for the Detection of Salmonella spp. In Produce. Applied and Environmental Microbiology. 77(18):6495-6501
95
6. BIJLAGEN
Vanwege de grote omvang van de gebruikte tabellen zijn alle bijlagen terug te vinden op
bijgevoegde CD-ROM. Hieronder wordt de volgorde van de bijlagen weergegeven.
Bijlage 1: Functionaliteit primers
Tabblad 1: Clostridium difficile: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen
omtrent de functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op C. difficile.
Tabblad 2: Campylobacter: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent
de functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Campylobacter.
Tabblad 3: Salmonella: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de
functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Salmonella.
Tabblad 4: E. coli: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de
functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op E. coli.
Tabblad 5: Shigella: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de
functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Shigella.
Tabblad 6: Yersinia: Alle bekomen Ct-waarden en smelttemperaturen omtrent de
functionaliteit van de geselecteerde primers werkzaam op Yersinia.
Bijlage 2: Efficiëntiebepaling primers
Tabblad 1: Clostridium difficile: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van
geselecteerde primers werkzaam op C. difficile.
Tabblad 2: Salmonella: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van
geselecteerde primers werkzaam op Salmonella.
Tabblad 3: E. coli: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van geselecteerde
primers werkzaam op E. coli.
Tabblad 4: Shigella: Resultaten bekomen uit de efficiëntiebepaling van geselecteerde
primers werkzaam op Shigella.
Bijlage 3: Specificiteit primers:
Tabblad 1: Primerspecificiteit: Alle bekomen resultaten omtrent de specificiteit van de
geselecteerde primers.
96
Bijlage 4: Functionaliteit probes:
Tabblad 1: Clostridium difficile: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit
van de geselecteerde primers en probes werkzaam op C. difficile.
Tabblad 2: Campylobacter: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van
de geselecteerde primers en probes werkzaam op Campylobacter.
Tabblad 3: Salmonella: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de
geselecteerde primers en probes werkzaam op Salmonella.
Tabblad 4: E. coli: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de
geselecteerde primers en probes werkzaam op E. coli.
Tabblad 5: Shigella: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de
geselecteerde primers en probes werkzaam op Shigella.
Tabblad 6: Yersinia: Alle bekomen Ct-waarden omtrent de functionaliteit van de
geselecteerde primers en probes werkzaam op Yersinia.
Bijlage 5: Efficiëntiebepaling probes:
Tabblad 1: Reinculturen: Bekomen efficiënties van geselecteerde primers en probes
uitgevoerd op reinculturen.
Tabblad 2: Plasmides: Bekomen efficiënties van geselecteerde primers en probes
uitgevoerd op plasmides.
Bijlage 6: Specificiteit probes:
Tabblad 1: Mengsels: Alle bekomen resultaten omtrent de specificiteit van
geselecteerde primers en probes uitgevoerd op reincultuurmengsels.
Tabblad 2: Fecesstalen: Alle bekomen resultaten omtrent de specificiteit van
geselecteerde primers en probes uitgevoerd op fecesstalen.
Bijlage 7: Controle PDV en SHV:
Tabblad 1: PDV: Alle bekomen resultaten van de controletest uitgevoerd op PDV.
Tabblad 2: SHV: Alle bekomen resultaten van de controletest uitgevoerd op SHV.
Top Related