莫能菌素生物合成中 转录调控因子的分析
姓 名:逄爱萍
指导教师:赵广荣
日 期: 2013 年 4 月 10号
肉桂地链霉菌莫能菌素生物合成基因簇
抗生素转录因子调控
通过分析抗生素转录因子的调控作用,进而对菌株进行改造,可以提高抗生素的产量。
1、目标基因的克隆:从 S. cinnamonensis克隆monRI 、 monRII 、 monH基因。
2、表达载体的构建:选择合适的载体,将上述基因与启动子、终止子等连接,构建高效表达载体。
3、蛋白的优化表达与纯化:将载体转化到大肠杆菌中,优化表达条件,纯化可溶性蛋白。
4、转录因子与核酸的杂交:通过 EMSA实验,确定与转录因子结合的启动子。
提取基因组 PCR获得目的片段
构建表达载体
测序验证
电转到宿主菌优化表达并纯化可溶性蛋白EMSA实验
技术路线
纯化质粒提取质粒
monRII 的 PCR产物电泳(左)pET28a-monRII 酶切电泳(右)
1、表达载体 pET28a-monRII构建过程
1 : 37℃ , 1.0 mmol/L ,包涵体; 2 : 37℃ , 1.0 mmol/L,上清; 3 : 37℃ , 0.8 mmol/L,包涵体;4 : 37℃ , 0.8 mmol/L,上清; 5 : 30℃ , 1.0 mmol/L ,包涵体; 6 : 30℃ , 1.0 mmol/L,上清;
7 : 30℃ , 0.8 mmol/L,包涵体; 8 : 30℃ , 0.8 mmol/L,上清;M : protein marker
1 、 BPES362/pET28a-monRII
1 :孵育后; 2 :第一次洗涤; 3 :第二次洗涤; 4 :第三次洗涤; 5:第四次洗涤;
6 :第五次洗涤; 7 :第一次洗脱; 8:第二次洗脱;M : protein marker
用 Ni-NTA 树脂纯化 BPES362
BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化( 37℃, IPTG=1.0mmol/L)
用 Ni-NTA 树脂纯化 BPES362
1 :第九次洗脱; 2 :第八次洗脱; 3 :第七次洗脱; 4 :第六次洗脱;5 : protein rulerII ; 6 :第五次洗脱; 7 :第四次洗脱; 8 :第三次洗脱
BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化( 37℃, IPTG=1.0mmol/L)
目的蛋白
莫能霉素启动子的标记实验
从图中可以看出,启动子浓度在 15.5fmol/ul 时,标记后依然清晰可见。因此,选定启动子浓度为 15.5fmol/ul 做 EMSA 。
EMSA实验
启动子 T启动子 E 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
结合
未结合
启动子 AI 1 2 3 4 5 6
启动子 AIX 1 2 3 4 5 6
启动子 AVII 1 2 3 4 5 6
启动子 D 1 2 3 4 5 6
启动子 AX 1 2 3 4 5 6
启动子 RII 1 2 3 4 5 6
结论:只有启动子 E 和 T 与转录因子 monRII 结合。
2、表达载体 pET28a-monRI构建过程
monRI 的 PCR产物电泳(左)pET28a-monRI 酶切电泳(右)
1 : 1.0 mmol/L ,包涵体; 2 : 1.0 mmol/L,上清; 3 : 0.8 mmol/L,包涵体;4 : 0.8 mmol/L,上清; 5 : 0.6 mmol/L ,包涵体; 6 : 0.6 mmol/L,上清;
7 : 0.4 mmol/L,包涵体; 8 : 0.4 mmol/L,上清; 9:空白对照;M : protein marker
3 、 BPES361/pET28a-monRI ( 37℃ )
1 : 0.1 mmol/L ,包涵体; 2 : 0.1 mmol/L,上清; 3 : 0.3 mmol/L,包涵体;4 : 0.3 mmol/L,上清; 5 : 0.5 mmol/L ,包涵体; 6 : 0.5 mmol/L,上清;
7 : 0.8 mmol/L,包涵体; 8 : 0.8 mmol/L,上清; 9 :空白对照; M : protein marker
BPES361/pET28a-monRI (30℃)
1 : 0.3 mmol/L ,包涵体; 2 : 0.3 mmol/L,上清; 3 : 0.1 mmol/L,包涵体; 4 : 0.1 mmol/L,上清; 5 : 0.05mmol/L ,包涵体; 6 : 0.05mmol/L,上清; 7 :空白对照; M : protein
marker
BPES361/pET28a-monRI (20℃)
BPES361/pET28a-monRI 的最佳表达条件为: 20℃ , IPTG终浓度0.5mM。
但以此条件进行蛋白的纯化,没有得到满意的效果
3、表达载体 pET28a-monH构建过程
monH基因直接PCR 没有成功,于是分两段 PCR 。由于monH基因中间有 PstI 酶切位点,可以从这里分段。
monH1 的 PCR产物电泳(左)pET28a-monHI 酶切电泳(右)
monH2 的 PCR产物电泳(左)pET28a-monH酶切电泳( EcoRI 、 HindIII)(右)
BPES363/pET28a-monH 37℃ 诱导表达
1 : 0.1 mmol/L 上清; 2 : 0.1 mmol/L,包涵体; 3 : 0.3mmol/L,上清; 4 : 0.3 mmol/L,包涵体; 5 : 0.6mmol/L ,上清; 6 :0.6mmol/L,包涵体; 7 : 0.9mmol/L,上清 8 : 0.9mmol/L,包涵体;M : marker
monH7C 的 PCR产物电泳(左)pGEX4T2-monH7C 酶切电泳(右)
4、表达载体 pGEX4T2-monH7C构建过程
BPES364/pGEX4T2-monH7C(37℃)
1:空白对照; 2 : 0.002 mmol/L ,上清; 3 : 0.002 mmol/L,包涵体;4 : 0.02 mmol/L,上清; 5 : 0.02mmol/L,包涵体; 6 : 0.1mmol/L,上
清; 7 : 0.1 mmol/L,包涵体; 8 : 0.4 mmol/L ,上清 9 : 0.4 mmol/L,包涵
体;
用 GST 树脂纯化 BPES364
1:离心后; 2 :孵育后; 3 :第一次洗涤; 4 :第二次洗涤; 5 :第三次洗涤;6:第四次洗涤; 7 :第五次洗涤; 9 :第一次洗脱; 10:第二次洗脱;M : protein marker
BPES364/pGEX4T2-monH7C蛋白纯化( 37℃, IPTG 0.4mM)
目的蛋白
用 GST 树脂纯化 BPES364
BPES364/pGEX4T2-monH7C蛋白纯化( 37℃, IPTG 0.4mM)
1 :第三次洗脱; 2 :第四次洗脱; 3 :第五次洗脱; 4 :第六次洗脱;
5 :第七次洗脱; 6 :第八次洗脱; 7:第九次洗脱M : protein rulerII ;
目的蛋白
1、转录调控因子 monRII 的 EMSA实验已经完成,下一步需要确定具体结合位点。
2、调控基因 monH关键区域的表达载体已经构建好,并纯化出可溶性蛋白,下一步需要进行 EMSA实验。
3、调控基因 monRI的表达载体已经构建好,下一步需要优化并纯化出可溶性蛋白。
3 、结论