莫能菌素生物合成中 转录调控因子的分析

姓 名：逄爱萍

指导教师：赵广荣

日 期： 2013 年 4 月 10号

肉桂地链霉菌莫能菌素生物合成基因簇

抗生素转录因子调控

通过分析抗生素转录因子的调控作用，进而对菌株进行改造，可以提高抗生素的产量。

1、目标基因的克隆：从 S. cinnamonensis克隆monRI 、 monRII 、 monH基因。

2、表达载体的构建：选择合适的载体，将上述基因与启动子、终止子等连接，构建高效表达载体。

3、蛋白的优化表达与纯化：将载体转化到大肠杆菌中，优化表达条件，纯化可溶性蛋白。

4、转录因子与核酸的杂交：通过 EMSA实验，确定与转录因子结合的启动子。

提取基因组 PCR获得目的片段

构建表达载体

测序验证

电转到宿主菌优化表达并纯化可溶性蛋白EMSA实验

技术路线

纯化质粒提取质粒

monRII 的 PCR产物电泳（左）pET28a-monRII 酶切电泳（右）

1、表达载体 pET28a-monRII构建过程

1 ： 37℃ ， 1.0 mmol/L ，包涵体； 2 ： 37℃ ， 1.0 mmol/L，上清； 3 ： 37℃ ， 0.8 mmol/L，包涵体；4 ： 37℃ ， 0.8 mmol/L，上清； 5 ： 30℃ ， 1.0 mmol/L ，包涵体； 6 ： 30℃ ， 1.0 mmol/L，上清；

7 ： 30℃ ， 0.8 mmol/L，包涵体； 8 ： 30℃ ， 0.8 mmol/L，上清；M ： protein marker

1 、 BPES362/pET28a-monRII

1 ：孵育后； 2 ：第一次洗涤； 3 ：第二次洗涤； 4 ：第三次洗涤； 5：第四次洗涤；

6 ：第五次洗涤； 7 ：第一次洗脱； 8：第二次洗脱；M ： protein marker

用 Ni-NTA 树脂纯化 BPES362

BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化（ 37℃， IPTG=1.0mmol/L）

用 Ni-NTA 树脂纯化 BPES362

1 ：第九次洗脱； 2 ：第八次洗脱； 3 ：第七次洗脱； 4 ：第六次洗脱；5 ： protein rulerII ； 6 ：第五次洗脱； 7 ：第四次洗脱； 8 ：第三次洗脱

BPES362/pET28a-monRII蛋白纯化（ 37℃， IPTG=1.0mmol/L）

目的蛋白

莫能霉素启动子的标记实验

从图中可以看出，启动子浓度在 15.5fmol/ul 时，标记后依然清晰可见。因此，选定启动子浓度为 15.5fmol/ul 做 EMSA 。

EMSA实验

启动子 T启动子 E 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

结合

未结合

启动子 AI 1 2 3 4 5 6

启动子 AIX 1 2 3 4 5 6

启动子 AVII 1 2 3 4 5 6

启动子 D 1 2 3 4 5 6

启动子 AX 1 2 3 4 5 6

启动子 RII 1 2 3 4 5 6

结论：只有启动子 E 和 T 与转录因子 monRII 结合。

2、表达载体 pET28a-monRI构建过程

monRI 的 PCR产物电泳（左）pET28a-monRI 酶切电泳（右）

1 ： 1.0 mmol/L ，包涵体； 2 ： 1.0 mmol/L，上清； 3 ： 0.8 mmol/L，包涵体；4 ： 0.8 mmol/L，上清； 5 ： 0.6 mmol/L ，包涵体； 6 ： 0.6 mmol/L，上清；

7 ： 0.4 mmol/L，包涵体； 8 ： 0.4 mmol/L，上清； 9：空白对照；M ： protein marker

3 、 BPES361/pET28a-monRI （ 37℃ ）

1 ： 0.1 mmol/L ，包涵体； 2 ： 0.1 mmol/L，上清； 3 ： 0.3 mmol/L，包涵体；4 ： 0.3 mmol/L，上清； 5 ： 0.5 mmol/L ，包涵体； 6 ： 0.5 mmol/L，上清；

7 ： 0.8 mmol/L，包涵体； 8 ： 0.8 mmol/L，上清； 9 ：空白对照； M ： protein marker

BPES361/pET28a-monRI (30℃)

1 ： 0.3 mmol/L ，包涵体； 2 ： 0.3 mmol/L，上清； 3 ： 0.1 mmol/L，包涵体； 4 ： 0.1 mmol/L，上清； 5 ： 0.05mmol/L ，包涵体； 6 ： 0.05mmol/L，上清； 7 ：空白对照； M ： protein

marker

BPES361/pET28a-monRI (20℃)

BPES361/pET28a-monRI 的最佳表达条件为： 20℃ ， IPTG终浓度0.5mM。

但以此条件进行蛋白的纯化，没有得到满意的效果

3、表达载体 pET28a-monH构建过程

monH基因直接PCR 没有成功，于是分两段 PCR 。由于monH基因中间有 PstI 酶切位点，可以从这里分段。

monH1 的 PCR产物电泳（左）pET28a-monHI 酶切电泳（右）

monH2 的 PCR产物电泳（左）pET28a-monH酶切电泳（ EcoRI 、 HindIII）（右）

BPES363/pET28a-monH 37℃ 诱导表达

1 ： 0.1 mmol/L 上清； 2 ： 0.1 mmol/L，包涵体； 3 ： 0.3mmol/L，上清； 4 ： 0.3 mmol/L，包涵体； 5 ： 0.6mmol/L ，上清； 6 ：0.6mmol/L，包涵体； 7 ： 0.9mmol/L，上清 8 ： 0.9mmol/L，包涵体；M ： marker

monH7C 的 PCR产物电泳（左）pGEX4T2-monH7C 酶切电泳（右）

4、表达载体 pGEX4T2-monH7C构建过程

BPES364/pGEX4T2-monH7C(37℃）

1：空白对照； 2 ： 0.002 mmol/L ，上清； 3 ： 0.002 mmol/L，包涵体；4 ： 0.02 mmol/L，上清； 5 ： 0.02mmol/L，包涵体； 6 ： 0.1mmol/L，上

清； 7 ： 0.1 mmol/L，包涵体； 8 ： 0.4 mmol/L ，上清 9 ： 0.4 mmol/L，包涵

体；

用 GST 树脂纯化 BPES364

1：离心后； 2 ：孵育后； 3 ：第一次洗涤； 4 ：第二次洗涤； 5 ：第三次洗涤；6：第四次洗涤； 7 ：第五次洗涤； 9 ：第一次洗脱； 10：第二次洗脱；M ： protein marker

BPES364/pGEX4T2-monH7C蛋白纯化（ 37℃， IPTG 0.4mM)

目的蛋白

用 GST 树脂纯化 BPES364

BPES364/pGEX4T2-monH7C蛋白纯化（ 37℃， IPTG 0.4mM)

1 ：第三次洗脱； 2 ：第四次洗脱； 3 ：第五次洗脱； 4 ：第六次洗脱；

5 ：第七次洗脱； 6 ：第八次洗脱； 7:第九次洗脱M ： protein rulerII ；

目的蛋白

1、转录调控因子 monRII 的 EMSA实验已经完成，下一步需要确定具体结合位点。

2、调控基因 monH关键区域的表达载体已经构建好，并纯化出可溶性蛋白，下一步需要进行 EMSA实验。

3、调控基因 monRI的表达载体已经构建好，下一步需要优化并纯化出可溶性蛋白。

3 、结论