Projektgruppe Mammakarzinom TZM, 14.4.2011

Zirkulierende Apoptose-Marker als diagnostische und prädiktive Faktoren

Oliver J Stötzer, Debora Fersching, Christoph Salat,Oliver J Stötzer, Debora Fersching, Christoph Salat, Volker Heinemann, Stefan Holdenrieder

Hämato-onkologische Schwerpunktpraxis MünchenInstitut für Klinische Chemie, Medizinische Klinik III,

Klinikum der Universität MünchenKlinikum der Universität MünchenInstitut für Klin Chemie und Klin Pharmakologie, Universität Bonn

Biomarker:Laborparameter als Entscheidungshilfe für die Diagnosestellung undLaborparameter als Entscheidungshilfe für die Diagnosestellung und

Therapieentscheidung

Therapie- Therapie-Diagnose

PrimärtumorRezidivdiagnose

P

Fortgeschr. Tumor

Monitoring

1000

MonitoringPrognosePrädiktion

PrognosePrädiktion

Neo/AdjCTxatio

n

800

1000

CTx2CTx1OPOP Neo/AdjCTx

Kon

zent

ra

600

CTx2CTx1OPOP

Mar

ker K

400

IndividuelleBasiswerte 0

200

Zeit0

Werteverteilung von CEAi hi d P ti tin verschiedenen Patientengruppen

Healthy (n=143)

Benign Diseases

100

Healthy (n=143)Benign Diseases (n=2529)Cancers (n=6641)

[%]

Healthy Cancer

80 Cutoff(Reference Range)

Cutoff (Diagnostic Certainity)

60

(Reference Range) (Diagnostic Certainity)

20

40

0<1 2-<3 5-<7 10<-20 30<-40 50<-75 100<-

200500-

<10002500-<5000

>10000[ng/ml]

200 <1000 <5000

Dr. Petra Stieber, Inst. f. Klin. Chemie, Klinikum der Universität München -Großhadern-

Mammakarzinom:Bedeutung von CA15-3/CA27.29 und CEA

DATENLAGE (ASCO-Guidelines, R.J.Bast et al., 2007)• Keine Daten zur PrimärdiagnostikKeine Daten zur Primärdiagnostik• Erhöhung von CA15-3/CA27.29 ggf. mit ungünstiger

Prognose assoziiertPrognose assoziiert=> Bestimmung aufgrund unklarer Datenlage nicht

empfohlenempfohlen• Keine positiven Daten zum Therapiemonitoring in

f üh St difrühen Stadien • „Früherkennung“ von Rezidiv/Metastasierung

(ca. 5-6 Monate vor klinischer Manifestation) => Bestimmung aufgrund unklarer Konsequenzen

für Krankheitsverlauf nicht empfohlen

Mammakarzinom:Bedeutung von CEA und CA 15 3Bedeutung von CEA und CA 15-3

Therapiemonitoring (metastasierte Situation)

]

Lokales Mamma-CA Metastasiertes Mamma-CA

Therapiemonitoring (metastasierte Situation)CA15-3(CA27.29), CEA

8580

100

ivity

[%]

50

70

60

80

Sens

it

23 25 28

50

4023 25

20

0CEA CA 15-3 CEA or

CA 15-3CEA CA 15-3 CEA or

CA 15-3

Dr. Petra Stieber, Inst. f. Klin. Chemie, Klinikum der Universität München -Großhadern-

Wege zur Identifikation neuer Bio-Markerg

PATHWAYS

Gene Array

Apoptose: Definition/Charakteristikap p• Caspase-vermittelte Form des programmierten

Zelltod• Komplex regulierter aktiver Zelltodmechanismus

(im Ggs. zur Nekrose), der durch äußere oder zellinterne Stimuli initiiert wird (z.B. Zytostatika, ( y ,Antikörper, Zytokine)

• Ablauf in der Regel ohne Schädigung der NachbargewebeNachbargewebe

• Aktivierung von Caspasen mit subsequenter Proteindegradierung und DNA-Spaltung in nukleosomale Fragmente definierter Größe (x200bp) unter Erhalt der Zellmembran

Zellkern einer apoptotischen

Darzynkiewicz Z et al: Cytometry 27: 1-20 (1997)

Zellkern einer gesunden ZelleZellkern einer apoptotischen

Zelle DNA-Spaltung in nukleosomale Fragmente

Klinische Bedeutung der ApoptoseKlinische Bedeutung der Apoptose

erhöhte Zelltodrate

TraumaTrauma

Ischämie

Degenerative Prozesse

Infektionen / Sepsis

ProliferationDegenerative Prozesse

Autoimmun-Erkrankungen

SpontanZelltod Maligne Tumore

pTherapie-induziert

Core signaling pathways and processes genetically altered in t ti B V l t i S i 2008most pancreatic cancers. B.Vogelstein; Science 2008

• Pathway No.altered genes Fraction • Apoptosis 9 100%• DNA damage control 9 83%g• Regulation of G1/S Ph. 19 100%• Hedgehog sinaling 19 100%

Homophilic cell adhesion 30 79%• Homophilic cell adhesion 30 79%• Integrin signaling 24 67%• C-Jun-N-terminal kinase sign. 9 96%• KRAS signaling 5 100%• Regulation of invasion 46 92%• Small GTP-ase dept sign 33 79%Small GTP-ase dept. sign. 33 79%• TGFß 37 100%• Wnt/Notch signaling 29 100%

N h i A t d kt i SNachweis von Apoptoseprodukten im Serum

- Tumor-assoziierte nukleosomale frei zirkulierende DNA-Fragmente aus apoptotischen Zellen können im Patientenserum nachgewiesen werden (quantitative PCR, immunchemisch mittels Nukleosomen-ELISA)

der quantitative Nachweis freier kurzer DNA Fragmente im Serum von- der quantitative Nachweis freier kurzer DNA-Fragmente im Serum von Mammakarzinompatientinnen korreliert mit der Krankheitsstadium und der Prognose (B.Fisher)

- Die Integrität zirkulierender DNA-Fragmente (Ratio längerer zu kürzeren DNA-Fragmente) ist bei Patientinnen mit fortgeschrittenen Mamma- undDNA-Fragmente) ist bei Patientinnen mit fortgeschrittenen Mamma- und Ovarialkarzinomen deutlich erhöht

- Die DNA-Integrität gemessen im Serum bei Patientinnen mit lokal fortgeschrittenen Mammakarzinomen korreliert mit dem Lymphknotenbefall

Signalwege der ApoptoseSignalwege der Apoptose

Fas-RFas-L

DISCExtrinsischer

SignalwegZellmembran p53

DNA-Läsion Intrinsischer

Signalweg

Pro-CASP-8

B l 2

BaxZellzyklus-

arrest

CASP-8BID Bcl-2 Reparatur

CASP-3Cyto c APAF-1CASP-9

Apoptosom

AIF

Apoptosom

CAD/ICADZellkern Apoptotische Substrate

SmacDIABLOIAPs

ChromatinZellkern

Nukleosomale DNA Fragmente

Apoptotische Substrate(Zytokeratine, Lamine, Aktine etc)

MakrophagenMakrophagen Blutkreislauf

DNAse HMGB1

Faktoren

FAS lö li h F d FAS R t k A t d hsFAS lösliche Form des FAS-Rezeptors, kann Apoptose durch Bindung des Liganden blockieren;erhöhte Serum-Spiegel korrelieren neg. mit Überleben

M30 erkennt eine Caspase-Spaltstelle in CK 18;ein signifikanter M30-Anstieg nach Chemotherapiegabe

h i t it i b A h k lischeint mit einem besseren Ansprechen zu korrelieren

Survivin Inhibiert den mitochondrialen (intrinsischen) Apoptose-Pathway (inhibiert Caspasen); eine Überexpression vonPathway (inhibiert Caspasen); eine Überexpression von Survivin korreliert mit Aggressivität und Chemoresistenz

MIF MIF inhibiert p53-abhängige Apoptose; eine Überexpressionp g g p p ; pscheint ein prinzipiell günstiger Prognosefaktor zu sein

HMGB-1 Ist ein DAMP (damage associated molecular pattern); kann die TLR (T ll lik R t ) E i f T ll fö dTLR (Toll like Rezeptor)-Expression auf Tumorzellen fördern,die wiederum den Immunescape bedingen; ein TLR4 Polymorphismus mit verminderter HMGB Bindung führt zu frühem Relapse nach Anthrazyklintherapie

RAGE HMGB1 bindet an RAGE; die Aktivierung von RAGE kann Chemotherapie und Radiotherapieresistenz triggernChemotherapie- und Radiotherapieresistenz triggern

Klinische St dieKlinische Studie• Titel: Monitoring von Apoptose-Produkten im Serum bei Patientinnen

mit Mammakarzinomen(positives Ethikvotum vom 16 6 2008)(positives Ethikvotum vom 16.6.2008)PD Dr. Holdenrieder/ Dr.O.J.Stötzer/ Prof. C. Salat/ Dr. Hamann/ PD. Dr Braun/ Dr. von Koch/ Dr. Steinkohl/ Prof. Dr. Feller/ Prof. Dr. Heitmann/ Prof. Dr. Heinemann

Ei hl i G P ti ti /P b di• Einschluss von vier Gruppen von Patientinnen/Probandinnen:– Gesunde Probandinnen / Patientinnen mit benignen Mammaerkrankungen– Patientinnen mit histologisch gesicherten Mammakarzinom, bei denen die g g ,

Durchführung einer adjuvanten Chemotherapie vorgesehen ist– Patientinnen mit stanzbioptisch gesichertem Mammakarzinom, bei denen die

Durchführung einer primären / neoadjuvanten systemischen Chemotherapie g p j y pgeplant ist

– Patientinnen messbaren Metastasen eines Mammakarzinoms, bei denen eine neue systemische palliative Chemotherapie eingeleitet wirdneue systemische palliative Chemotherapie eingeleitet wird

• Durchführung:– Blutabnahmen vor / nach OP, Tag 1 und Tag 8 des 1. Chemotherapiezyklus, Tag

1 d 2 Ch th i kl d E d d Th i1 des 2. Chemotherapiezyklus und Ende der Therapie– Sofortige Serumpufferung und Lagerung bei –80°C

MethodenMethoden• Immunchemischer Nachweis von Apoptosemarkern

• Nukleosomen als Apoptose-Produkte werden durch den Cell Death D t ti ELISA l R h Di ti b ti tDetection-ELISA plus von Roche Diagnostics bestimmt.

• Apotose-typische Fragmente des Zytokeratin-18 werden mit Hilfe eines ELISA gegen das M30-Antigen (Peviva) nachgewiesen.ELISA gegen das M30 Antigen (Peviva) nachgewiesen.

• Die nachfolgenden Marker ebenfalls über ELISA-Technik: sFAS (Millipore), MIF (Millipore), Survivin (Stressgen), HMGB1 (IBL/SHINO-Test) CEA u CA15 3Test), CEA u. CA15-3

• Molekularbiologischer Nachweis von DNA-Fragmenten• Nach einer Proteindeaktivierung erfolgt eine quantitative pCR. DabeiNach einer Proteindeaktivierung erfolgt eine quantitative pCR. Dabei

werden kommerziell erhältliche Assays der Fa. Roche verwendet. • Es erfolgt eine quantitativer Nachweis kurzer (fragmentierter) DNA-

S üb i ALU b i t P i (ALU 115) i iSequenzen über einen ALU basierten Primer (ALU 115) sowie einen Primer für längere DNA Sequenzen (ALU 247) mittels quantitativer PCR-Methodik.

Fragestell ngFragestellung• Kann durch die Bestimmung von Apoptosemarker im Serum von

Patientinnen, die eine neoadjuvante Chemotherapie erhalten, das Ansprechen vorhergesagt werden?

Kö M k fil id tifi i t d di it d• Können Markerprofile identifiziert werden, die mit dem Krankheistsstadium korrelieren?

Patientinnen(insgesamt N = 243; bisher ausgewertet N = 119)

Patients and Controls N Age Histology N %Localized breast cancer 44 46,2 Invasive ductal carcinoma 36 81,8Metastatic breast cancer 31 64,4 Invasive lobular carcinoma 2 4,6Benign disease of the breast 13 44,7 Adenocarcinoma 2 4,6Healthy women 31 41,9 unknown 4 9,1

Neoadjuvant Chemotherapy N %Patients with primary breast cancer treated by neoadjuvant chemotherapy Neoadjuvant Chemotherapy N %UICC stage before therapy N % EC 6 13,6I 0 0 EC + Doce 23 52,3II 35 79 6 EC + Doce +Pacli 2 4 6

treated by neoadjuvant chemotherapy

II 35 79,6 EC + Doce +Pacli 2 4,6III 8 18,2 EC + Pacli 11 25not known 1 2,3 EC/5FU + Doce 2 4,6UICC stage after therapy N %UICC stage after therapy N %no residual tumor detectable 8 18,2 Response to the therapy N %I 9 20,5 Response (R) 31 70,5II 18 40 9 N R (NR) 13 29 6II 18 40,9 Non-Response (NR) 13 29,6III 9 20,5

Ergebnisse Diagnostikg g

Gesunde Probanden v.s.Pat mit benignen Erkrankungen vsPat. mit benignen Erkrankungen vs.

Pat. mit Mamma-CA lokal fortgeschritten vs. P t it M CA t t i tvs. Pat. mit Mamma-CA metastasiert

Zwischenanalysey

W t t il CEAWerteverteilung CEA

P=0.162 P<0.001

103

P=0.063 P<0.001

102

101

CE

A (μg

/l)

100

C

Gesunde (n=30) Benigne (n=13) Lok. MaCa (n=39) Met. MaCa (n=30)( ) g ( ) ( ) ( )

W t t il N kl (S )Werteverteilung Nukleosomen (Serum)

P=0.635 P=0.913

103

P=0.507 P=0.801

) (n

g/m

l)

102

men

(S

erum

)

101N

ukle

osom

Gesunde (n=30) Benigne (n=13) Lok. MaCa (n=42) Met. MaCa (n=31)

101

( ) g ( ) ( ) ( )

W t t il RAGEWerteverteilung sRAGE

P<0.001 P=0.196

104

P=0.096 P=0.378

l)G

E1

(pg/

m

103

sRA

Gesunde (n=30) Benigne (n=13) Lok. MaCa (n=38) Met. MaCa (n=30)( ) g ( ) ( ) ( )

W t t il FASWerteverteilung sFAS

P<0.001 P<0.001

102

P=0.201 P=0.001

101

AS

(pg

/ml)

100

sFA

Gesunde (n=31) Benigne (n=13) Lok. MaCa (n=42) Met. MaCa (n=31)( ) g ( ) ( ) ( )

W t t il MIFWerteverteilung MIF

P=0.003 P<0.001

102

P=0.088 P=0.003

101

MIF

(pg

/ml)

100

M

Gesunde (n=31) Benigne (n=13) Lok. MaCa (n=42) Met. MaCa (n=31)10

-1

( ) g ( ) ( ) ( )

W t t il M30 A tiWerteverteilung M30-Antigen

P=0.081 P=0.014

103

P=0.166 P=0.062

M30

(U

/l)M

Gesunde (n=30) Benigne (n=13) Lok. MaCa (n=41) Met. MaCa (n=31)

102

( ) g ( ) ( ) ( )

W t t il HMGB1Werteverteilung HMGB1

P=0.695 P=0.020

101

P=0.287 P=0.021

)

100

GB

1 (n

g/m

lH

MG

Gesunde (n=28) Benigne (n=12) Lok. MaCa (n=41) Met. MaCa (n=31)10

-1

( ) g ( ) ( ) ( )

ZusammenfassungZusammenfassunggesunde Probandinnen RAGE↑Gesunde Probandinnen RAGE↑Pat. mit benignen Erkrankungen Nukleosomen↑

MIF↑↑↑lokales Mammakarzinom MIF↑↑

FAS↑↑FAS↑↑M30↑RAGE↓

metastasiertes Mammakarzinom MIF↑↑↑Survivin↑↑Survivin↑↑FAS↑↑↑M30↑↑CEA↑↑↑CEA↑↑↑CA15.3↑↑↑Nukleosomen↑HMGB1↓↓HMGB1↓↓

ROC K Di l k l M CAROC Kurven Diagnose lokales Mamma-CA

100 FAS (AUC 80.8%)[%]

80MIF (AUC 79.7%)

sICAM (AUC 57.7%)sitiv

ität

60tPAI-1 (AUC 40.5%)

M30 (AUC 55.5%)

Sen

40Survivin (AUC 57.2%)

Nukleosomen (AUC 48.3%)

20

( )

DNAse (AUC 63.4%)

HMGB1 (AUC 45.5%)

0

HMGB1 (AUC 45.5%)

FAS + MIF (AUC 87.0%)

100 80 60 40 20 0

Spezifität [%]100 80 60 40 20 0

Zusammenfassung DIAGNOSTIKZusammenfassung DIAGNOSTIK

• Bzgl des Nachweises von RAGE Nukleosomen MIF• Bzgl. des Nachweises von RAGE, Nukleosomen, MIF, M30, Fas, HMGB1 und Survivin finden sich zum Teil signifikante Unterschiede in den unterschiedlichensignifikante Unterschiede in den unterschiedlichen Kohorten (gesund, benigne, MC lokal, MC metastasiert)

• Die Spezifität und Sensitivität des Markerpanels übertrifft die von CEA und CA15 in allen Gruppen mit Ausnahmedie von CEA und CA15 in allen Gruppen mit Ausnahme der metastasierten Gruppe deutlich.

• Die Anzahl der gesunden Probandinnen und der Patientinnen mit benignen Erkrankungen ist noch zu klein (und zu heterogen), Keine Pat. in der Nachsorge

Prädiktion von TherapieansprechenPrädiktion von Therapieansprechen im neoadjuvanten Therapieansatz

MESSUNGMESSUNG

CHEMOTHERAPIE Induktion von ApoptoseFreisetzung von Apoptose-assoziiertenFaktoren im Verlauf

Erfolgskontrolle durchden Pathologen

• Welche Patientinnen sprechen nicht gut auf die Therapie an (Prädiktion Non-Response)?a ( äd t o o espo se)

• Welche erreichen mglw. eine komplette Remission?

Th i h CA 15 3Therapieansprechen CA 15-3

Basiswert vor dem 1. Zyklus Basiswert vor dem 2. Zyklus

103

103

P=0.852 P=0.949

102

) 102

)

15.

3 (U

/ml)

15.

3 (U

/ml)

101C

A

101C

A

CR+PR (n=28) NC (n=11)10

0

CR+PR (n=27) NC (n=11)10

0

Th i h N kl (S )Therapieansprechen Nukleosomen (Serum)

Basiswert vor dem 1. Zyklus Basiswert vor dem 2. Zyklus

103

103

P=0.038 P=0.867

) (n

g/m

l)

) (n

g/m

l)

102

men

(S

erum

)

102

men

(S

erum

)

Nuk

leos

om

Nuk

leos

om

CR+PR (n=30) NC (n=12)10

1

CR+PR (n=32) NC (n=11)10

1

Th i h HMGB1Therapieansprechen HMGB1

Basiswert vor dem 1. Zyklus Basiswert vor dem 2. Zyklus

101 10

1

P=0.054 P=0.512

) l)

100

GB

1 (n

g/m

l

100

GB

1 (n

g/m

HM

G

HM

CR+PR (n=29) NC (n=12)10

-1

CR+PR (n=32) NC (n=11)10

-1

Th i h RAGETherapieansprechen sRAGE

Basiswert vor dem 1. Zyklus Basiswert vor dem 2. Zyklus

104

104

P=0.054 P=0.374

l) l)

103

AG

E1

(pg/

m

103

AG

E1

(pg/

m

sRA

sRA

CR+PR (n=27) NC (n=11)10

2

CR+PR (n=28) NC (n=11)10

2

Estimation of Therapy EfficacyMIF Verlauf (Mediane), R=CR+PR, NC=NC

Prätherap. Tag C1d8 Posttherapeut.Vor C2

5

p g C d8 pC

4

L)

2

3 RNC

F (p

g/m

L

1

2

MIF

01 2 3 4

Bl t b h Z it ktBlutabnahme-Zeitpunkte

ROC Kurven TherapieansprechenROC Kurven Therapieansprechen(Prädiktion NON-Response)

100

[%]

80CA 15-3 (AUC 57.8%)si

tivitä

t

60

Sen

40

20CEA (AUC 51.6%)

0100 80 60 40 20 0

Spezifität [%]100 80 60 40 20 0

ROC K Th i hROC Kurven Therapieansprechen

100 sFas (AUC 49.7%)[%]

80

MIF (AUC 65.7%)

sICAM1 (AUC 49.0%)

PAI1 (AUC 57.2%)sitiv

ität

60

( )

M30 (AUC 57.6%)

Survivin (AUC 47.1%)

Sen

40

Nucleosomes (AUC 65.2%)

DNAse (AUC 49.8%)

HMGB1 (AUC 67.7%)

20

( )

HMGB1+Nucs (AUC 73,4%)

MIF+Nucs (AUC 78.3%)

0

CA 15-3 (AUC 57.8%)

CEA (AUC 51.6%)

100 80 60 40 20 0

Spezifität [%]100 80 60 40 20 0

Prädiktion von Therapieansprechen imdj t Th i tneodjuvanten Therapieansatz

die prätherapeutische Bestimmung von- die prätherapeutische Bestimmung von MIF, HMGB1, M30 und Nukleosomen kann zwischen der Gruppe der Responder (CR und PR) und der Nicht- Responder diskriminieren) p

- für eine frühe Identifizierung der Patientinnen, bei denen eine pCR erreicht wird eignet sich

↓

bei denen eine pCR erreicht wird, eignet sich besonders der Nachweis von RAGE

Fazit

Durch die Bestimmung zirkulierdender Apoptosemarker im Patientenserum können zusätzliche Informationen zurPatientenserum können zusätzliche Informationen zur Differential/Ausbreitungsdiagnostik und zur Responseinschätzung gewonnen werden. Die vorliegenden Daten sind aber aufgrund der geringen Fallzahlen nicht ausreichend und müssen an einem größeren Patientinnenkollektiv überprüft werden.

Ausblick

• Einschluss weiterer Patientinnen in die laufende Studie d D t t ( d P b diund Datenauswertung (gesunde Probandinnen,

Patientinnen mit benignen Mamma-Tumoren, in dj t Sit ti N h R idi it tiadjuvanter Situation, Nachsorge, Rezidivsituation,

metastasierter Situation), Berücksichtigung weiterer klinischer Datenklinischer Daten

• Aufnahme weiterer Apoptose-assoziierter Marker • Korrelation mit Markerveränderungen im Tumorgewebe

(Vgl. Stanzbiopsie/Histologie)• Untersuchung Interaktion von HMGB-1/RAGE mit dem

Immunsystem (Kooperation Fr.Prof.Dr.H.Schmetzer)

Das Team

• PD Dr. Stefan Holdenrieder1,2, Debora Fersching1, Barbara Siegele1,Dr. Dorothea Nagel1, 1Institut für Klinische Chemie, Klinikum der LMU Großhadern, 2Institut für Klin. Chemie und klin. Pharmakologie, Universität Bonn

• Dr. U. Hamann, PD Dr. Braun, Frauenklinik Taxisstraße• Dr von Koch Dr Steinkohl Brustzentrum Klinikum 3 Orden• Dr. von Koch, Dr. Steinkohl, Brustzentrum Klinikum 3.Orden• Prof. Dr. A.-M.Feller, Prof. Dr. C. Heitmann, Brustzentrum am

Englischen Garteng• Prof. Dr. C. Salat und unser gesamtes Praxisteam• Prof. Dr. V. Heinemann, Prof. Dr. W. Hiddemann, Medizinische

Klinik und Poliklinik III der LMU, Klinikum Großhadern