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WAGNER ANTONIO BERNARDES

ESTUDO FITOQUÍMICO, ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS DE

Aspidosperma macrocarpon Mart.(APOCYNACEAE)

Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Cássio Sola Veneziani Co-orientador: Prof. Dr. Wilson Roberto Cunha.

Franca 2005

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Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca

Bernardes, Wagner Antonio B444e Estudo fitoquímico, ensaios farmacognósticos e avaliação da atividade

tripanocida de extratos de Aspidosperma macrocarpon mart.(apocynaceae) / Wagner Antonio Bernardes ; orientador: Rodrigo Cássio Sola Veneziani, co-orientador: Wilson Roberto Cunha. – 2005

80 f. : 30 cm.

Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu na Área de Química de Produtos

Naturais – Mestre em Ciências

1. Química – Farmacognosia (plantas). 2. Aspidosperma macrocarpon. 3. Triterpeno. 3. Atividade tripanocida. I. Universidade de Franca. II. Título.

CDU – 54:615.322:616.937

WAGNER ANTONIO BERNARDES

ESTUDO FITOQUÍMICO, ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS DE Aspidosperma macrocarpon

Mart.(APOCYNACEAE)

Presidente: ____________________________________________ Nome: Prof. Dr. Rodrigo Cássio Sola Veneziani Instituição: Universidade de Franca - UNIFRAN Titular 1: ___________________________________________

Nome: Prof. Dr. Paulo Sérgio Pereira Instituição: Universidade de Ribeirão Preto - UNAERP Titular 2: ____________________________________________

Nome: Prof. Dr. Élcio Rivelino Rodrigues Instituição: Universidade de Franca - UNIFRAN

Franca, ____/____/____

RESUMO BERNARDES, W.A. Estudo fitoquímico, ensaios farmacognóstico, e avaliação da atividade tripanocida de extratos de Aspidosperma macrocarpon Mart.(Apocynaceae). 2005. 80 f. dissertação de Mestrado em Ciências – Universidade de Franca. A doença de Chagas é um sério problema de saúde pública em países sul americanos, dentre eles o Brasil. O seu agente etiológico é o protozoário Tripanossoma cruzi . O presente trabalho teve como objetivos: avaliar in vitro a atividade tripanocida dos extratos brutos, das frações obtidas e das substâncias puras isoladas; avaliar qualitativamente através de ensaios farmacognósticos o perfil químico do vegetal e fracionar os extratos brutos visando o isolamento e a identificação dos componentes químicos presentes em extratos que apresentarem atividade biológica relevante. As folhas e o caule desse vegetal foram estabilizados, pulverizados e submetido à extração com hexano, diclorometano e etanol. Com os ensaios farmacognósticos observou-se a presença de vários metabólitos secundários como: taninos condensados, flavonóides, alcalóides, quinonas, esteróides livres e triterpenos. No extrato diclorometânico (atividade tripanocida significante) foi isolado um triterpeno (ácido ursólico) sendo sua estrutura elucidada através de análise de espectros de RMN de 1H, 13C e massas. Palavras-chave: Aspidosperma macrocarpon; Triterpeno; Atividade tripanocida.

ABSTRACT BERNARDES, W.A. Estudo fitoquímico, ensaios farmacognóstico, e avaliação da atividade tripanocida de extratos de Aspidosperma macrocarpon Mart.(Apocyaneae). 2005. 80 f. dissertação de Mestrado em Ciências – Universidade de Franca.

Chagas disease, a severe public healthy issue in South American countries (including Brasil) is caused by the protozoan Tripanossoma cruzi. It is important to search for new active compounds to be used in the therapeutics and prevention of this disease. The aim of this work is: in vitro evaluation of tripanocidal activity of the extracts, its fractions and isolated compounds; to perform pharmacognostic assays to obtain a chemical profile of the plant and also to isolate chemical compounds of the most active extracts. The leaves and the stem of Aspidosperma macrocarpon (Apocynaceae) were collected, dried and pulverized and then extracted with hexane, dichloromethane and ethanol. Through pharmacognostic assays, it was possible to detect the presence of condensed tannins, flavonoids, alkaloids, quinines, steroids and triterpenes on those extracts. From the dichloromethane extract (the most active extract against Tripanossoma cruzi) was isolated a triterpene (ursolic acid) identified through mass, RMN 1H and 13C spectrometry. Keywords: Aspidosperma macrocarpon, ursolic acid, tripanocidal activity.

AGRADEÇO aos meus pais Antônio e Nair, meus irmãos Adriana, Charles, Rosimeire e demais familiares, a minha namorada Neide, as minhas amigas Maria Valda, Ilda, Valci, Cleide, Maria Goretti,Terezinha, Maria de Fátima, Iêda e Gisélia pelo incentivo, apoio e paciência ao longo desse período e ao professor Isaías pelo incentivo; ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Cássio Sola Veneziani e co-orientador: Prof. Dr. Wilson Roberto Cunha, pela paciência nos momentos de dificuldades, pelo companheirismo, amizade e o tempo dedicado a esse trabalho; aos companheiros de viagem Ronaldo, Jéferson e Lílian pela companhia durante as seis horas semanais de estrada ao longo desses dois anos; ao professores Amir, Alvimar, Jacques Eurípedes e Ivan pelo apoio; ao senhor Silas Brasileiro e sua equipe Karina, Glauce e Dora pela valiosa colaboração; à Secretaria De Estado da Educação por ter concedido o meu afastamento durante um ano desse curso o que muito contribuiu para a sua conclusão; aos professores Dr. Marcos e Dr. Élcio pela contribuição durante a qualificação; á professora Drª Alba pela identificação da planta e o professor Dr. Sérgio pelos ensaios. aos professores e colegas do mestrado pelo incentivo; aos técnicos do laboratório Lécio e Izabel pela colaboração; aos alunos do curso de Ciências Biológicas em especial o 8º período pelo apoio e compreensão.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Vegetação do Cerrado........................................................................ 04Figura 2 Distribuição das áreas de cerrado no Brasil........................................ 05Figura 3 A Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart.................................. 07Figura 3 B Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart.................................. 08Figura 4 Inflorescência de Aspidosperma macrocarpon Mart........................... 08Figura 5 A Fruto de Aspidosperma macrocarpon Mart........................................ 09Figura 5 B Fruto e semente de Aspidosperma macrocarpon Mart....................... 09Figura 6 Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Triatoma

infestans.............................................................................................. 11Figura 7 Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Rhodnius

prolixus................................................................................................ 12Figura 8 Exemplar fêmea da espécie Panstrongylus megistus......................... 12Figura 9 Formas amastigotas do Trypanosoma cruzi desenvolvendo-se

em uma fibra muscular lisa do intestino grosso..................................

13

Figura 10 Forma epimastigota do protozoário encontrada no intestino dos triatomídeos.........................................................................................

14

Figura 11 Trypanosoma cruzi no sangue, em sua fase tripomastigota, apresentando a forma fina................................................................... 14

Figura 12 Trypanosoma cruzi, na fase tripomastigota sangüícola,apresentando a forma larga.................................................................................. 15

Figura 13

Estrutura química das drogas usadas no controle da doença de Chagas...............................................................................................

17

Figura 14 Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7..................... 38Figura 15 Testes nas Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7... 38

Figura 16 Frações do extrato etanólico. Testes com reagente de Hager e Meyer...................................................................................................

41

Figura 17 Frações do extrato etanólico hidrolisado............................................. 43

Figura 18 Testes nas Frações do extrato etanólico hidrolisado nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7......................................................................................

45

Figura 19 Frações do extrato diclorometânico.Testes com reagente de Hager e Meyer respectivamente...............................................................

47

Figura 20 Testes nas Frações do extrato diclorometânico para constituintes fenólicos em meio alcoólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7.......................

48

Figura 21 Testes nas Frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros........................................................

51

Figura 22 Frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis...............................

52

Figura 23 Testes para fenóis nas frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis......................................................................................

52

Figura 24 Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos hexânico, diclorometânico e etanólico......................................

54

Figura 25 Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida das frações do extrato diclorometânico.......................................................................

55

Figura 26 Cromatograma das frações diclorometano/acetato de etila 1:1 e acetato de etila respectivamente obtidas do extrato diclorometânico...................................................................................

56

Figura27 Cromatograma do precipitado branco obtido do fracionamento da fração diclorometano/acetato de etila 1:1............................................

57

Figura 28 Cromatograma Mistura ácido ursólico + oleanóico (Padrão) e precipitado branco...............................................................................

57

Figura 29 Esqueleto tipo ursano.......................................................................... 58Figura 30 Estrutura do ácido ursólico.................................................................. 59

LISTA DE ORGANOGRAMAS

Organograma 01 Abordagem Fitoquímica – Extrato Etanólico............................. 42Organograma 02 Abordagem Fitoquímica – Extrato Etanólico Hidrolisado.......... 46Organograma 03 Abordagem Fitoquímica – Extrato Diclorometânico.................. 50Organograma 04 Abordagem Fitoquímica – Extrato Diclorometânico (hidrólise

alcalina).....................................................................................

53

LISTA DE QUADROS

Quadro 01 Testes efetuados nos tubos de ensaio............................................... 24Quadro 02 Método de análise do resultado do teste efetuado no tubo1.............. 25Quadro 03 Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos

2, 3, 4 e 5............................................................................................

25Quadro 04 Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos 6

e 7.......................................................................................................

25Quadro 05 Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico.......... 38Quadro 06 Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico

Hidrolisado..........................................................................................

45

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Massas dos extratos brutos obtidos de Aspidosperma macrocarpon.. 23Tabela 02 Massas obtidas do fracionamento do extrato diclorometânico............ 35Tabela 03 Dados dos principais sinais de RMN 13C da substância isolada

(DMSO, δ ppm, 100 MHz) e valores de δ da literatura para o ácido ursólico.................................................................................................

59

LISTA DE ABREVIATURAS

CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLV – Coluna Líquida a Vácuo

DMSO – Dimetilsulfóxido

EM – Espectrômetro de Massas

RMN13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

RMN1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RPMI – Roswell Park Memorial Institute

UV – Ultravioleta

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO....................................................................................................... 01

1 CONSIDERACÕES GERAIS.................................................................. 01

2 O ECOSSISTEMA CERRADO............................................................... 03

3 A FAMÍLIA APOCYNACEAE E O GÊNERO ASPIDOSPERMA............. 06

4 DOENÇA DE CHAGAS........................................................................... 10

5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICO.,FITOQUÍMICA E BIOMONITORA -

MENTO...................................................................................................

18

OBJETIVOS........................................................................................................... 20

MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 21

1 ESPECIFICAÇÕES................................................................................ 21 1.1 Instrumentos........................................................................... 21 1.2 Colunas e fase estacionária.................................................... 21 1.3 Solventes e reagentes............................................................ 22

2 COLETA E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS....................................... 22 3 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO......... 23

3.1 Operações preliminares ............................................................. 23 3.2 Testes efetuados......................................................................... 23 3.3 Ensaios para saponinas.............................................................. 26 3.4 Testes para alcalóides................................................................ 27

4 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO HI -

DROLISADO........................................................................................... 28

4.1 Operações preliminares ............................................................. 28 4.2 Testes para quinonas.................................................................. 28 4.3 Testes para cumarinas................................................................ 28 3.4 Testes para aglicanas e flavanóides........................................... 29

5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO DICLOROMETÂ -

NICO.......................................................................................................

29

5.1 Operações preliminares ............................................................. 29 5.2 Separação de ácidos fixos fracos e fenóis.................................. 30 5.3 Testes para constituintes fenólicos (em meio alcoólico)............. 30

5.4 Testes para constituintes fenólicos (em meio imiscível com

água) ........................................................................................ 30

5.4.1 Teste para quinonas......................................................... 31 5.4.2 Teste para antranois........................................................ 31 5.4.3 Teste para cumarinas....................................................... 31

6 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICO NO EXTRATO DICLOMETÂNICO

HIDRÓLISE ALCALINA.......................................................................... 32

6.1 Separação do Insaponificável..................................................... 32 6.1.1 Teste de esteróides e triterpenos..................................... 33

6.2 Separação dos ácidos do material saponificado......................... 33 6.21 Testes para fenóis............................................................. 33

7 ENSAIOS BIOLÓGICOS........................................................................ 34 8 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO.................................................... 35

8.1 Coluna cromatográfica à vácuo – sílica gel 60............................ 35 8.2 Coluna cromatográfica à vácuo................................................... 36

RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 37 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................. 37 2 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO......... 37 3 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO HI -

DROLISADO...........................................................................................

43

4 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO DICLOMETÂNICO 47 5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICO NO EXTRATO DICLOROMETÂNI -

CO HIDRÓLISE ALCALINA....................................................................

51

6 RESULTADOS DOS ENSAIOS BIOLÓGICOS...................................... 54 6.1 Avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos... 54 6.2 Biomonitoramento da atividade tripanocida das frações............. 55

7 RESULTADOS DO FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ATIVOS..... 56 8 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA SUBSTÂNCIA ISOLADA................. 58

CONCLUSÕES ...................................................................................................... 60

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 61

ANEXOS................................................................................................................. 64

INTRODUÇÃO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS.

É provável que a utilização das plantas como medicamento e tão antiga

quanto o próprio homem. Numerosas etapas marcaram a evolução da arte de curar;

porém, torna-se difícil delimitá-las com exatidão, já que a medicina esteve por muito

tempo associada a práticas mágicas, místicas e ritualísticas[1].

Há mais de 3000 anos a.C. os chineses já faziam uso e cultivavam

plantas medicinais, que hoje ainda são utilizadas com eficácia tanto na medicina

popular, como por laboratórios de produtos farmacêuticos.Também os egípcios,

assírios e hebreus, desde 2300 a.C., faziam uso e cultivavam plantas como

medicamentos para cura de várias enfermidades, além de trazerem de suas

expedições outras tantas, as quais introduziam nas suas regiões. Já nessa época

fabricavam cosméticos e embalsamavam seus mortos com preparados à base de

plantas; outras eram usadas como especiarias de cozinha. Entre 460-375 a.C., o

valor terapêutico ou tóxico das plantas tornou-se bem conhecido através da obra

“Corpus Hipocrateum” em que Hipócrates indica para cada enfermidade, o

tratamento adequado. Dioscórides, no começo da Era Cristã, listou em seu tratado

“De Matéria Médica” mais de 500 drogas de origem vegetal, indicando o valor

terapêutico de muitas delas. Na Idade Média na Europa, os druidas e curandeiros

mantinham em segredo a formulação de várias porções curativas preparadas à base

de plantas medicinais. A medicina e o estudo de plantas medicinais nessa época

estagnaram-se. Após essa época apenas alguns mosteiros na Europa mantiveram

viva a literatura medicinal [1].

No Brasil, antes mesmo do seu descobrimento, os índios utilizavam

plantas para cura de doenças, para o preparo de corantes e para ajudar na pesca,

1

além disso, tais conhecimentos eram passados de geração a geração. Com a

colonização do Brasil, a utilização das plantas, para tratamento de doenças,

fundamentalmente apresenta influências não só da cultura indígena, mas também

da africana e européia [1].

O Brasil apresenta imensa disponibilidade de tais recursos que

precisam ser estudados sob o ponto de vista químico e terapêutico. Tais estudos

devem ser realizados urgentemente devido ao declínio e desequilíbrio que os

ecossistemas sofrem (o que leva a extinção de espécies). Também é importante que

instituições e pesquisadores brasileiros realizem tais estudos na tentativa de se

evitar que laboratórios se aproveitam da falta de regulamentação sobre

biodiversidade para patentear plantas com substâncias medicinais utilizadas na

medicina popular e indígena, sem nada pagar ao país de origem. Exemplos podem

ser citados, como os da muirapuama, planta amazônica, patenteada no Japão como

remédio para impotência ou o quebra-pedra patenteado nos EUA para tratamento da

hepatite. Nestes casos, o lucro é somente dos laboratórios, que repassam à

população os altos custos dos medicamentos industrializados, e os países de onde

as substâncias originais são retiradas perdem, anualmente, uma quantia avaliada de

5,4 milhões de dólares em royalties [2].

A magnitude da diversidade brasileira não é conhecida com precisão,

tamanha a sua complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de

espécies distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com a

maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000

espécies catalogadas [3], de um total estimado entre 350.000 e 550.000.

Considerando-se que mais da metade dessas espécies se encontra nas florestas

tropicais, cuja área corresponde a apenas 7% da superfície da terra [4], essas

regiões devem ser consideradas como prioritárias no estabelecimento de programas

de conservação in situ de germoplasma vegetal.

As plantas são uma fonte importante de produtos naturais

biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese

de um grande número de fármacos. Pesquisadores da área de produtos naturais

mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza

revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura

2

e de propriedade físico-químicas e biológicas [5]. Apesar do aumento de estudos

nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15% a 17% das plantas

foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal [4].

Ao se considerar a perspectiva de obtenção de novos fármacos, dois

aspectos distinguem os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade

molecular e a função biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é

muito superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar dos avanços

consideráveis, ainda é limitada. Além disso, como produtos de organismos que

possuem muita similaridade com o metabolismo dos mamíferos, os produtos

naturais muitas vezes exibem propriedades adicionais às antimicrobianas a eles

associadas [6].

No Brasil, estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento, em

1996, da indústria farmacêutica nacional, sejam originados de medicamentos

derivados de plantas. Apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foi

estudada em busca de compostos bioativos e 1.100 espécies vegetais foram

avaliadas em suas propriedades medicinais [7]. Destas, 590 plantas foram

registradas no Ministério de Saúde para comercialização [8].

2 O ECOSSISTEMA CERRADO.

O Brasil possui uma grande diversidade de espécies de plantas que

cobrem sua extensa área territorial, dividida atualmente em seus complexos

ecossistemas: a floresta amazônica, o cerrado, a caatinga, a floresta atlântica, o

pantanal matogrossense e as pradarias de campo limpo [1].

Estima-se que o cerrado contribui com 10.000 espécies de plantas das

60.000 fanerógamas distribuídas pelo país. Sendo uma vegetação que ocupa 1/5 do

território brasileiro e situa em regiões de maior desenvolvimento do Brasil Central, é

natural que as espécies que compõem essa vegetação exerçam forte influência na

medicina popular [1].

3

Pequenas árvores de troncos torcidos e recurvados, de folhas grossas,

esparsas em meio a uma vegetação rala e rasteira, misturando-se às vezes, com

campos limpos ou matas de árvores não muito altas – esses são os cerrados (fig. 1),

uma extensa área de cerca de 200 milhões de hectares, equivalente, em tamanho, a

toda a Europa Ocidental. A paisagem é agressiva e por isso, durante muito tempo,

foi considerada uma área perdida para a economia do país [9].

Os cerrados apresentam relevos variados, embora predominem os

amplos planaltos. Metade do cerrado situa-se entre 300 e 600m acima do nível do

mar, e apenas 5,5% atinge uma altitude acima de 900m. Em pelo menos 2/3 da

região, o inverno é demarcado por um período de seca que prolonga-se por cinco a

seis meses. Seu solo esconde um grande manancial de água, que alimenta seus

rios[9].

A área total é de aproximadamente 2.100.000 km2, com ação antrópica:

700.000 km2 (fig.2) [9].

Figura 1

– Vegetação do Cerrado.

4

Figura 2 – Distribuição das áreas de cerrado no Brasil. Fonte: Ministério do Meio Ambiente. Disponível em: <http://www.mma.org.br>..

Nesse complexo vegetacional encontram-se uma grande variedade de

sistemas ecológicos, variados tipos de solos, climas, relevo e altitude, prevalecendo

em toda sua extensão uma combinação peculiar de condições edáficas e climáticas,

que deu origem à vegetação que a caracteriza – uma vegetação xeromorfa, que

ocorre preferencialmente em clima estacional (mais ou menos seis meses secos),

podendo, não bastante, ser encontrada também em clima ombrófilo[1].

A concentração de princípios ativos ou fármacos na planta depende do

controle genético e dos estímulos proporcionados pelo meio ambiente. Esses

estímulos são caracterizados como situações de estresse, ou seja, excesso ou

deficiência de algum fator de produção para a planta [1].

A grande variedade de sistemas ecológicos no ambiente de cerrado e

a capacidade das plantas que nele vivem, em produzir metabólitos para garantir sua

sobrevivência, justifica o grande interesse em estudos fitoquímicos desse tipo de

vegetação.

5

3 A FAMÍLIA APOCYNACEAE E O GÊNERO ASPIDOSPERMA.

A família Apocynaceae compreende 300 gêneros com mais de 2000

espécies de distribuição marcadamente tropical e subtropical em todo o mundo. São

plantas de hábito variado, ervas, subarbustos, árvores e trepadeiras, na maioria

latescentes e vivem tanto nos campos como nas matas. No Brasil, ocorrem cerca de

376 espécies subordinadas a 41 gêneros[10,11].

Aspidosperma é um gênero de cerca de 43 espécies de distribuição

neotropical [10].

A espécie Aspidosperma macrocarpon Mart. é popularmente chamada:

amargosa, bolsinha, guatambu, orelha de elefante, pau-pereira, pereiro, peroba,

peroba-amargosa, peroba-cetim, peroba-comum, peroba-mirim, peroba-miúda,

peroba-do-rio, peroba-rosa e peroba-de-são-paulo [12].

É uma árvore hermafrodita (fig. 3 A e 3B) de até 15 metros, pubescente

ou velutino, salvo a face ventral das folhas, face anterior do perianto, androceu, face

interna do fruto e semente glabras; tronco e ramos suberosos e látex branco. As

folhas são alternas, simples, pecioladas; limbo com 9 a 23 x 5 a 16 cm, oval ou

aboval, cartáceo a coriáceo; ápice geralmente arredondado a obtuso; base obtusa a

subcordada; nervação igualmente elevada em ambas as faces, nervuras

secundárias 6 a 15 pares, ascendentes, com tendência à bifurcação, formando uma

nervura submarginal; nervuras terciárias pouco evidentes e pecíolo com 1 a 3,2 cm

de comprimento. A inflorescência cimeira congesta, pedunculada, com 30 a 50

flores(fig. 4). Essas com cerca de 1,5 cm, actinomorfas; 5 sépalas, livres, elíptica,

agudas; corola branca, tubulosa, com 5 lobos elípticos-lineares, de prefloração

torcida e fauce calosa; 5 estames, inclusos; filetes curtos, anteras abcordadas,

rimosas, introrsas; ovário súpero; 2 carpelos livres, multiovulados; 1 estilete; 1

estigma, em carretel. O fruto folículo com até 18 cm de comprimento, cinza-escuro,

hemicordado, compresso; valvas crustáceo-lenhosas, de superfície rugosa (fig. 5 A e

5B). As sementes (fig. 5B), com aproximadamente 6,7 a 9 cm de comprimento,

cremes, longo-funiculadas, arredondadas, planas, aladas; núcleo seminífero central;

ala circunjacente, ondulada, margens recortadas [12].

6

A floração ocorre normalmente de agosto a outubro com pico em

outubro, em alguns anos iniciando-se mais cedo, em maio, junho ou julho [13].

A frutificação ocorre principalmente entre março e junho (época seca),

após longo período de maturação [12].

Encontra-se no bioma cerrado e cerradão distróficos, sendo

amplamente distribuída nos seguintes estados: Bahia, Goiás, Maranhão, Mato

Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Pará, Piauí, São Paulo, Tocantins e no

Distrito Federal [12].

Sua madeira é usada na construção civil e naval, como cabos de

ferramentas, dormentes, marcenaria, carpintaria, confecção de peças flexíveis e

xilografia. A árvore é ornamental por apresentar copa com folhas prateadas,

principalmente quando novas. Pode ser aproveitada para o paisagismo, em geral, e

para plantios mistos em áreas degradadas de preservação permanente. Em

artesanato, os frutos e as sementes são utilizados na montagem de arranjos [12].

As plantas do gênero Aspidosperma apresentam importância como

detentoras de alcalóides [13,14], grupo de substâncias com notórias aplicações

antimicrobianas. Esses aspectos fundamentam um estudo aprofundado dessas

plantas.

Figura 3 A – Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart..

7

Figura 3 B – Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart..

Figura 4 – Inflorescência de Aspidosperma macrocarpon Mart..

8

Figura 5 A – Fruto de Aspidosperma macrocarpon Mart..

Figura 5 B – Fruto e semente de Aspidosperma macrocarpon Mart..

9

4 DOENÇA DE CHAGAS.

A doença de Chagas ou tripanossomíase é uma zoonose que tem

como agente

, seu transmissor e seu

diagnóstico f

O parasito faz parte de um ecossistema exclusivamente americano,

sendo encon

gas humana é encontrada nos seguintes

estados: Rio

hagas afeta mais de 18

milhões de

ínicas, os fatores

prognosticad

etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi .

A doença assim como seu agente etiológico

oram descritos pelo pesquisador Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas,

em 1909.

trado em extensas áreas do continente, desde o sul dos Estados

Unidos até o sul da Argentina e do Chile.

No Brasil, a doença de Cha

Grande do Sul, parte de Santa Catarina e Paraná, São Paulo, Minas

Gerais, Goiás e estados do Nordeste. Na Amazônia, a doença de Chagas humana é

rara, mas muito comum entre os animais silvestres [15,16].

Dados estatísticos indicam que a doença de C

pessoas nas Américas causando aproximadamente 400.000 mortes

anualmente [17]. No Brasil, um estudo realizado no Município de Londrina (PR), em

1995, apresenta uma estatística, na qual 834 crianças, de idade entre 7 e 14 anos,

apresentaram sorologia positiva para doença de Chagas. Nas Américas, em torno

de 100 milhões de pessoas no continente estão expostas ao risco de serem

infectadas [17,18]. Entre os 211 milhões de habitantes do cone sul do continente

americano, 11 milhões estão infectados e cerca de 54 milhões correm o risco de

também serem, representando 31% da população. De acordo com a Organização

Mundial de Saúde, mais de 50 mil pessoas morrem anualmente em conseqüência da

doença de Chagas [18]. Acima de 6 milhões de pessoas foram infectadas só no

Brasil e próximo de 30% desenvolveram lesões especialmente no músculo do

coração, que caracteriza a fase crônica, incurável da doença [17].

Durante os últimos 80 anos, as manifestações cl

os, complicações e muitos outros aspectos da fase crônica da doença,

tem sido estudados. No entanto, no final da década de 20, em vez de alcançar o

10

controle ou erradicação da doença, há em diversos países da América Latina, tanto

casos agudos como aqueles reportados no começo do século [19].

Um estudo com pessoas acima de 74 anos, na região de Ribeirão

Preto, Estado de São Paulo, revelou que 13 % das doenças cardíacas eram

decorrentes da doença de Chagas [20].

A doença é normalmente transmitida através de seu vetor o triatomíneo

conhecido com “barbeiro”, pertence à ordem Hemiptera, família Reduviidae e à

subfamília Triatominae. É um inseto grande, medindo de 1 a 4 centímetros de

comprimento. Pode ser facilmente distinguido de outros hemípteros por ser

hematófago e possuir uma probóscida retilínea com apenas três segmentos. Os

gêneros de maior interesse para a medicina são: Triatoma, Panstrongylus e

Rhodnius, reconhecíveis pela morfologia da cabeça. As espécies mais eficientes no

contágio humano são Rhodnius prolixus, Triatoma infestans e Panstrongylus

megistus (fig. 6,7 e 8). O contágio ocorre habitualmente durante o repasto sangüíneo

ou logo após, momento em que o inseto normalmente defeca [15].

Figura 6 – Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Triatoma infestans.

Fonte: REY , 1991,prancha V, foto D.

11

Figura 7 –Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Rhodnius prolixus. Fonte: REY, 1991, prancha V, foto F.

Figura 8 – Exemplar fêmea da espécie Panstrongylus megistus Fonte: http: // www.sucem.sp.gov.br/doença /chagas acesso 09/09/2004.

12

O parasito é um flagelado da classe Mastigophora, família

Trypanosomatidae e pertence ao subgênero Schizotrypanum [15].

Em seu ciclo vital, o parasito exibe formas amastigota, epimastigota e

tripomastigota, ou de transição entre elas (fig. 9,10,11 e 12).

No organismo dos vertebrados (reservatórios naturais), os parasitos

assumem a forma de tripomastigotas (no sangue) ou de amastigotas (no interior de

diversos tecidos), enquanto que nos insetos triatomídeos encontram-se no tubo

digestivo principalmente como epimastigotas ou tripomastigotas [15].

Figura 9 – Formas amastigotas do Trypanosoma cruzi desenvolvendo-se em uma fibra muscular lisa do intestino grosso. Fonte: REY, 1991, prancha IV.

13

Figura 10 – Forma epimastigota do protozoário, encontrada no intestino dos triatomíneos.

Figura 11 – Trypanosoma cruzi no sangue, em sua fase tripomastigota, apresentando a forma fina. Fonte: REY, 1991, prancha V, foto A.

14

Figura 12 – Trypanosoma cruzi, na fase tripomastigota sangüícola, apresentando a forma larga. Fonte: REY, 1991, prancha V, foto B.

Segundo o Ministério da Saúde, a transmissão através do barbeiro está

sob controle em nosso país, restringindo-se apenas a algumas áreas endêmicas.

Entretanto uma outra maneira de se contrair a doença, ainda mais preocupante por

atingir grandes centros urbanos, é através de transfusão de sangue contaminado em

hospitais, apesar da realização de testes sorológicos com doadores [21].

A transfusão sangüínea constitui o segundo mecanismo de importância

epidemiológica na transmissão da doença de Chagas. O risco varia com o nível de

parasitemia dos doadores, com o volume de sangue transfundido e com o número

de transfusões feitas. A população de alto risco é representada principalmente pelos

hemofílicos e por outros pacientes poli-transfundidos [15]. Além dos testes

sorológicos, a adição de substâncias químicas no sangue armazenado é realizado

com a finalidade de se eliminar o parasita, sendo uma medida profilática que pode

prevenir esse mecanismo de transmissão. Atualmente, a violeta genciana (fig. 13-3)

é a única substância empregada com tal propósito. Ela é eficaz, mas pode causar

efeitos indesejáveis nos pacientes, pois, sendo um corante, deixa o sangue com

uma coloração púrpura podendo os pacientes adquirir essa coloração

temporariamente em sua pele e mucosas. Também foi descrito seu efeito

carcinogênico em roedores [22].

15

Outra modalidade de transmissão é a congênita, que ocorre quando

existem ninhos de amastigotas na placenta, que liberam tripomastigotas em nível da

placenta fetal. Nesses casos pode haver aborto, maceração do feto, prematuridade

ou natimortos. A mortalidade após o nascimento é alta. Mais de cem casos já foram

assinalados no Brasil e no Chile. A transmissão oral pode acontecer em várias

situações como amamentação, pois o Trypanosoma cruzi já foi encontrado em leite

materno na fase aguda da infecção; animais ingerindo triatomíneos infectados;

canibalismo entre diferentes espécies de animais; pessoas ingerindo alimentos

contaminados com fezes ou urina de triatomíneos infectados [15]. Em março de

2005 a imprensa nacional noticiou uma possível contaminação por transmissão oral

no Estado de Santa Catarina, município de Navegantes. A vigilância sanitária até o

momento acredita que a contaminação ocorreu por ingestão de caldo de cana

contaminado.

O transplante de órgãos pode desencadear fase aguda grave, pois o

indivíduo que recebe um órgão transplantado infectado, toma drogas

imunodepressoras e, conseqüentemente, torna-se menos resistente à infecção [15].

Acidentes de laboratório também podem ocorrer entre pesquisadores e

técnicos que trabalham com o parasito, seja no sangue de animais, pessoas

infectadas, meios de cultura ou vetor. A contaminação pode se dar por contato do

parasito com a pele lesada, mucosa oral ou ocular e auto – inoculação [15].

A transmissão pelo coito foi comprovada experimentalmente, em

animais. Porém, na espécie humana, não há relatos [15].

A terapêutica da doença de Chagas continua parcialmente ineficaz,

apesar dos ingentes esforços que vêm sendo desenvolvidos por vários laboratórios e

pesquisadores, em especial de brasileiros, argentinos e chilenos [15].

Diversas drogas vêm sendo testadas em animais e, algumas delas já

estão sendo usadas no homem, mas nenhuma consegue suprimir a infecção pelo

Trypanosoma cruzi e promover uma cura definitiva [15].

Duas das drogas que já estão sendo usadas são o Nifurtimox (fig.13-1)

e o Benzonidazol (fig.13-2). Estes medicamentos são indicados especialmente nos

casos agudos que tenham ocorrido por transmissão natural, por transfusão

sangüínea ou acidental. Precocemente, o objetivo é diminuir a infecção. Nos casos

16

crônicos, apesar da pouca eficiência dos medicamentos, é aconselhável o seu

emprego, principalmente em crianças ou nos acometidos com a forma indeterminada

da doença [16].

OO2N N

H

N

S OO

CH3

N

NNO2

NH

O

(1) Benzonidazol(2) Nifurtimox

NNCH3

CH3CH3

H3C

NH3C CH3

+

(3) Violeta de Genciana

Figura 13 - Estrutura química das drogas usadas no controle da “Doença de Chagas”.

O Nifurtimox tem efeito supressivo na fase aguda da infecção,

provocando queda da temperatura e acelerando o desaparecimento das outras

manifestações clínicas. Age contra as formas sanguíneas e parcialmente contra as

formas teciduais. Os efeitos colaterais (que aumentam com doses mais prolongadas)

são: anorexia, emagrecimento, parestesias, hiperexcitabilidade e depressão

medular. Recentemente, esta droga foi retirada do mercado. Tanto os testes de

laboratório como os ensaios clínicos têm revelado que a eficiência dessa droga varia

com a linhagem do parasito. Por seus efeitos colaterais e necessidade de

acompanhamento laboratorial, ela não pode ser utilizado nos tratamentos de larga

escala e nos casos individuais, requerem consentimento esclarecido do paciente ou

de seus responsáveis [15].

O Benzonidazol tem a mesma eficiência que o Nifurtimox no tratamento

da infecção. Possui efeito apenas contra as formas sanguíneas. Nos casos agudos,

17

esta droga produz remissão rápida da febre e dos outros sintomas, ao mesmo tempo

em que cai a parasitemia. Em 10% dos casos, entretanto, mantém-se a parasitemia,

sem que se saiba se a razão está em um déficit de absorção da droga ou na

resistência de algumas linhagens do Trypanosoma cruzi. Os efeitos colaterais

observados são: anorexia, perda de peso, vertigens, dermatites urticariformes,

cefaléia, sonolência e dores abdominais [15].

O grande número de pessoas contaminadas, as diversas formas de

contágio e a terapêutica que continua parcialmente ineficaz tornam a doença de

chagas um problema de saúde pública nos países sul americanos, justificando os

estudos que objetivam a busca de substâncias ativas para terapia e profilaxia da

doença.

5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS, FITOQUÍMICA E BIOMONITORAMENTO.

Nos primórdios da humanidade, as doenças eram mandadas pelos

maus espíritos e forças sobrenaturais. O corpo era regido pelos deuses e a saúde

dos homens dependia de uma boa relação com eles. Era aí que entravam os ofícios

de sacerdotes e xamãs, médicos do corpo e da alma que tinham aprendido com os

animais o que podia ou não ser ingerido. Por meio das plantas, invocavam entidades

do além capazes de tratar a pessoa doente. Mas logo se constatou que, se as

plantas curavam, também podiam matar. Era preciso testá-las uma a uma, até que

se descobrisse seu efeito. O aprendizado envolveu um doloroso exercício de

tentativa e erro – e assim foi sendo desenhada a história da medicina [23].

O termo farmacognosia foi criado em 1815 para designar a ciência que

estudava as matérias de origem natural, usadas no tratamento de enfermidades.

Este termo atualmente se refere com exclusividade às matérias de origem vegetal e

animal. A história, a produção, o armazenamento, a comercialização, o uso, a

identificação, avaliação e o isolamento de princípios ativos de drogas são aspectos

tratados em farmacognosia [24]. Os ensaios farmacognósticos usados nesse

trabalho, foram feitos com o objetivo de definir qualitativamente os principais

18

metabólitos secundários produzidos pelo vegetal. A partir desses ensaios definiu-se

o perfil químico da planta, direcionando os trabalhos de fracionamento e

biomonitoramento.

A pesquisa fitoquímica tem por objetivos conhecer os constituintes

químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença [25]. O estudo químico de

plantas tem despertado ao longo da história o interesse de farmacêuticos, químicos,

médicos, agrônomos e mais recentemente de leigos, com vistas à descoberta ou à

justificativa das atividades usadas como medicinais [26].

Uma das principais aplicações destes estudos se encontra no âmbito

das ciências farmacêuticas, responsáveis pela criação e produção de novos

medicamentos de origem vegetal, seja freqüentemente subestimada. Numerosas

substâncias deste tipo fazem parte do arsenal terapêutico da medicina do século XX.

Rutina, papaína, morfina, codeína, pilocarpina, reserpina, ergonovina, d-

tubocurarina, digitoxina, vincaleucoblastina, vincristina, atropina etc., são apenas

algumas delas entre muitas [26].

Para uma grande parte dessas aplicações, torna-se necessária a

utilização de métodos de separação, purificação e identificação dos produtos

naturais presentes em plantas e outros organismos. Dessa forma, o

desenvolvimento do estudo químico de plantas (fitoquímica) está diretamente

relacionado à utilização e ao desenvolvimento de técnicas rápidas e precisas, que

permitam o isolamento de compostos de interesse, normalmente presente em

pequenas quantidades, concomitantemente com constituintes químicos já

conhecidos e de grande ocorrência em plantas [27].

Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao

isolamento de substâncias ativas, podem ser monitorados por ensaios direcionados

para avaliação da atividade biológica [28]. Mais recentemente, também vem sendo

utilizado o monitoramento das frações por cromatografia líquida de alta eficiência

acoplada a espectrômetro de massas (CLAE/UV/EM) ou de ressonância magnética

nuclear (CLAE/RMN). Essa combinação possibilita direcionar as operações de

fracionamento para o isolamento daqueles compostos considerados de maior

interesse em função dos dados espectrais obtidos [29].

19

OBJETIVOS Os objetivos do estudo da espécie Aspidosperma macrocarpon Mart. foram:

A. Avaliar in vitro a atividade tripanocida dos extratos brutos, das frações obtidas e

das substâncias puras isoladas.

B. Avaliar qualitativamente através de ensaios farmacognósticos o perfil químico do

vegetal.

C. Fracionar os extratos brutos visando o isolamento e a identificação dos

componentes químicos presentes em extratos que apresentarem atividade

biológica relevante.

20

21

MATERIAL E MÉTODOS 1 ESPECIFICAÇÕES 1.1 Instrumentos

- As concentrações das soluções foram efetuadas em evaporador rotativo sob

pressão reduzida (Marconi, MA 120).

- Revelador CCDC, lâmpada de UV (254 a 366 nm), Mineralight, modelo UVGL –

25.

- Espectro de RMN de 1H e 13C, foram obtidos em espectrômetro BRÜCHER DPX

e DRX.

- Os espectros foram obtidos em espectrômetro Quattro-LC Micromass

(Manchester, Inglaterra).

- As substâncias foram introduzidas no espectrômetro através de bomba de

infusão Harvard Apparatus modelo Holliston MA 01746.

1.2 Colunas e fase estacionária

- Na coluna líquida à vácuo (CLV), foi utilizada sílica Gel 60 (0,0063-0,200 mm

Merk).

- Nas placas cromatográficas em camada delgada comparativa (CCDC), foram

utilizadas placas de vidro (5 x 20 e 10 x 20), sílica Gel 60 GF254 da marca Merk

22

aplicada na forma de suspensão em água (1:2), com espalhador do tipo Desaga

formando-se uma camada de sílica de 0,25mm de espessura.

- Também para CCDC foram utilizadas placas pré-cobertas com sílica 60 F254

multitamanho picotado em 5 x 10 cm da marca Merk.

1.3 Solventes e reagentes

- Para obtenção dos espectros de RMN de 1H e 13C, foram utilizados solventes

deuterados da marca Aldrich.

- Para fracionamento dos extratos brutos em coluna cromatográfica foram

utilizados os seguintes solventes: hexano, diclorometano, etanol, metanol e

acetato de etila.

- Para revelar as placas, foi utilizado ácido sulfúrico P.A., através de nebulização

seguido de aquecimento em chapa a 100oC, por cinco minutos.

2 COLETA DO VEGETAL E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS

As folhas e caules da planta estudada foram coletados numa área de

cerrado, próximo à Usina de Peixoto (MG), no mês de outubro. Sua identificação foi

feita pela Prof. Dra. Alba Regina Barbosa, docente da Universidade de Franca

(UNIFRAN), São Paulo e a exsicata de número UEC 38672, depositada no herbário da

Universidade de Campinas (UNICAMP), São Paulo.

O material coletado foi desidratado em estufa de ar circulante a 40oC e

depois moídas em moinho de facas, produzindo 640g de pó.

A extração exaustiva foi feita durante seis semanas através de maceração

química, usando hexano, diclorometano e etanol, sendo duas semanas para cada

23

solvente. A cada semana a mistura foi filtrada e concentrada em evaporador rotativo

com baixa pressão.

As massas dos extratos brutos obtidas estão na tabela a seguir: Tabela 01 - Massas dos extratos brutos obtidos de Aspidosperma macrocarpon.

Espécie Extrato Massa (g)

Aspidosperma macrocarpon

Hexânico

Diclorometânico

Etanólico

8,19

16,30

10,10

3 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS DO EXTRATO ETANÓLICO

3.1 Operações preliminares [26]:

A ressuspensão foi feita com 3g do extrato etanólico de Aspidosperma

macrocarpon com 50mL de álcool etílico 70% e filtrou-se a fração obtida, diluindo-a em

100mL de álcool etílico 70%. Separou-se sete porções de 4mL em tubos de ensaios

numerados e uma porção de 10mL num béquer.

O conteúdo do béquer foi evaporado até a secura (mistura usada para os

ensaios de saponinas). O restante do extrato foi concentrado até obter a metade do

volume, aproximadamente 30mL, sendo acidulado com ácido clorídrico 0,1 mol/L (pH =

4) e filtrado (solução usada para os testes para alcalóide e os testes do extrato

etanólico hidrolisado).

24

3.2 Testes efetuados nos tubos de ensaio preparados na etapa anterior, para analisar a

presença de fenóis, taninos, antocianinas, antocianidinas, flavonóides,

leucoantocianidinas, catequinas, flavanonas, flavonóis, flavanonóis e xantonas.

Os testes efetuados nos sete tubos de ensaio estão representados no

quadro a seguir: Quadro 01 – Testes efetuados nos tubos de ensaio [26].

Tubo Método Metabólitos Testados

01

02

03

04

05

06

07

Na amostra do extrato foram adicionadas três gotas

de solução alcoólica de FeCl3.

Na amostra do extrato foram adicionadas cinco

gotas de HCl 3 mols/L, acidulando (pH = 3).

Na amostra do extrato foram adicionadas cinco

gotas de NaOH 1 mol/L, acalinizando (pH = 8,5).

Na amostra do extrato foram adicionadas sete gotas

de NaOH 1 mol/L, acalinizando (pH = 11).

Na amostra de extrato foram adicionadas sete gotas

de HCl 3 mols/L e aquecida sobre chama por 3

minutos , acidulando (pH = 1).

Na amostra de extrato foram adicionadas sete gotas

de NaOH 1 mols/L e aquecida sobre chama por 3

minutos, acalinizando (pH = 11).

Na amostra do extrato foi adicionada uma fita de

magnésio e 0,5mL de HCl concentrado.

Fenóis e taninos.

Flavonóides, antocianinas

e antocianidinas.


e antocianidinas.


e antocianidinas.

Catequinas, flavanonas e

leucoantocianidinas.

Catequinas, flavanonas e

leucoantocianidinas.

Flavanonas, flavanonóis, flavonóis e xantonas.

25

3.2.1 Método de análise dos resultados

Os métodos de análise dos resultados estão representados nos quadros a

seguir:

Quadro 02 - Método de análise do resultado do teste efetuado no tubos1 [26].

Constituintes Cor

Fenóis Entre azul e vermelho

Taninos hidrolisáveis Precipitado de tonalidade azul

Taninos condensados Precipitado de tonalidade verde

Os resultados dos testes nos tubos 2, 3, 4, 5, 6 e 7, foram analisados

observando o aparecimento de cores diversas, de acordo com os quadros a seguir: Quadro 03 – Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos 2, 3, 4 e

5. Os traços indicam que não ocorrem alterações na coloração da

mistura[26].

Cor em meio Constituintes pH = 3 pH = 8,5 pH = 11

Antocianinas e antocianidinas Vermelha Lilás Azul púrpura

Flavonas, flavonóis e xantonas - - Amarela

Chalconas e auromas Vermelha - Vermelho púrpura

Flavanonóis - - Vermelho laranja

Quadro 04 - Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos 6 e 7.

Os traços indicam que não ocorrem alterações na coloração da mistura [26].

Cor em meio Constituintes pH = 1-3 pH = 11

Leucoantocianidinas Vermelha -

Catequina (taninos condensados) Pardo-amarelada -

Flavonas - Vermelho alaranjada

26

3.3 Ensaios para saponinas [26].

O extrato seco obtido em 3.1, foi extraído duas vezes com 2mL de

clorofórmio, triturando os resíduos; a solução foi filtrada usando algodão e uma pipeta

Pasteur. A mistura foi colocada em um béquer e acrescentada uma pequena porção de

sulfato de sódio anidro. A mistura foi novamente filtrada, usando funil e papel de filtro. A

mistura obtida foi submetida aos seguintes ensaios:

3.3.1 Ensaio I para indicar a presença de esteróides livres e triterpenos pentacíclicos

livres.

A mistura foi colocada em um tubo de ensaio com 1mL de anidrido

acético agitando suavemente. Adicionou-se três gotas de ácido sulfúrico concentrado e

continuou a agitar suavemente.

A análise dos resultados foi feita observando a coloração. A presença de

azul evenescente seguida de verde permanente indica a presença de esteróides livres.

A coloração pardo-avermelhada indica a presença de triterpenóides pentacíclicos livres.

3.3.2 Ensaio II para indicar a presença de saponinas e/ou heterosídeos de saponinas.

Os resíduos insolúveis em clorofórmio obtidos 3.3 foram redissolvidos em

10mL de água destilada e filtrado para um tubo de ensaio e este agitado por três

minutos.

A análise dos resultados foi feita observando a formação de um colarinho

de espuma persistente e abundante.

27

3.3.3 Ensaio III foi usado para confirmar o ensaio II.

No tubo preparado para o ensaio II (3.3.2) foram adicionados 2mL de

ácido clorídrico concentrado, deixando-o por uma hora imerso em banho-maria a 50oC.

Depois de esfriar, neutralizou-se a solução com hidróxido de sódio 1 mol/L e agitou por

três minutos.

A análise dos resultados foi feita observando a presença de precipitado e

a não formação de espuma.

3.4 Testes para alcalóides.

Em 1/3 do extrato concentrado obtido em 3.1 foi adicionado NH4OH até

obter pH = 11. As bases orgânicas foram extraídas em três porções sucessivas de

30mL, 20mL e 10mL da mistura éter etílico-clorofórmio (3:1) em um funil de separação.

A solução éter etílico-clorofórmio foi tratada com sulfato de sódio anidro para eliminar o

excesso de água. As bases orgânicas foram reextraídas usando três porções de 20mL

de ácido clorídrico 0,1 mol/L. A solução éter etílico-clorofórmio foi descartada e a

solução aquosa ácida foi distribuída em dois tubos de ensaio e adicionadas a eles três

gotas dos reagentes de precipitação de alcalóides: “Hager” e “Mayer” (ver página 41).

Os resultados foram analisados observando a formação de precipitado

floculoso.

28

4 ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO ETANÓLICO HIDROLISADO

4.1 Operações preliminares [26].

Em 2/3 do extrato etanólico obtido em 3.1 foi adicionado ácido clorídrico

concentrado até obter uma solução 6mols/L, que foi aquecida sob refluxo por quatro

horas. Durante o refluxo foi observada a formação de precipitado. Depois de esfriar foi

feita a extração usando éter etílico em três etapas: 40mL após uma noite, e em seguida

30mL e 20mL. A solução aquosa ácida foi desprezada e o excesso de água da solução

etérea foi eliminado com sulfato de sódio anidro.

4.2 Teste para quinonas [26].

Em 5mL da solução etérea obtida em 4.1 foi adicionado 2mL de solução

6mols/L de hidróxido de amônia. A mistura foi agitada e em seguida foi colocada em

repouso, ocorrendo à formação de duas fases.

Os resultados foram analisados através da observação da cor vermelha,

na camada aquosa alcalina.

4.3 Teste de cumarinas [26].

O restante da solução etérea usada no teste para quinonas (4.2) foi

concentrado até a secura e redissolvido em 15mL de etanol e filtrado em funil comum

com papel de filtro. Com um capilar foram feitas duas manchas de 1,5cm de diâmetro

em um pedaço de papel de filtro não fluorescente. Em uma das manchas foi aplicado

29

hidróxido de potássio alcoólico 1 mol/L. As duas manchas foram cobertas parcialmente

com um papel opaco não fluorescente e expostas em conjunto à luz UV.

Os resultados foram analisados observando o desenvolvimento de

fluorescência azulada, forte, bem visível na metade não encoberta da mancha

alcalinizada.

4.4 Teste para aglicanas e flavonóides [26].

O restante da solução preparada para o teste de cumarina (4.3) foi

distribuído em sete tubos de ensaio. Sendo efetuados os procedimentos representados

no quadro 01 (ver página 24).

As análises dos resultados foram feitas de acordo à metodologia

representada nos quadros 02, 03 e 04 (ver página 25).

5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO DICLOROMETÂNICO

5.1 Operações preliminares [26].

A ressuspensão de 3g de extrato diclorometânico de Aspidosperma

macrocarpon foi feita em 50mL de diclorometano, a solução obtida foi filtrada, e ao

filtrado adicionado 35mL de ácido clorídrico 0,1 mol/L por três vezes em funil de

separação. A solução aquosa ácida foi alcalinizada com hidróxido de amônia

concentrado e adicionados 20mL, 15mL e 10mL de éter etílico-clorofórmio na proporção

(3:1), em um funil de separação. A solução éter etílico-clorofórmio foi filtrada e dividida

em dois recipientes. Um dos recipientes foi reservado para análise de ácidos fixos

fracos, fenóis e para hidrólise; no outro foi feita à extração da fase aquosa ácida por três

30

vezes usando 5mL de ácido clorídrico 1mol/L no funil de separação. A solução aquosa

ácida foi filtrada e submetida aos testes para alcalóides (ver item 3.4 página 27).

5.2 Separação dos ácidos fixos fracos e fenóis [26].

A solução éter etílico-clorofórmio obtida na etapa 5.1 foi particionada em

funil de separação sob agitação, com três porções sucessivas de 40mL, 30mL e 20mL

de hidróxido de sódio 2% e uma porção de 50mL de água destilada. A solução aquosa

obtida foi filtrada e acidulada com ácido clorídrico concentrado até pH = 2. A extração

de ácidos e fenóis livres ocorreu por meio de três lavagens sucessivas de 20mL, 15mL

e 10mL de éter etílico, intercalado com vigorosa agitação durante cinco minutos,

seguida de dez minutos de repouso. A solução aquosa foi desprezada. A fase orgânica

foi lavada com 20mL de água destilada e tratada com sulfato de sódio anidro e depois

filtrada; o filtrado foi submetido aos seguintes testes:

5.3 Teste para constituintes fenólicos (em meio alcoólico) [26].

A metade da solução etérea obtida na etapa 5.2 foi concentrada e depois

redissolvida em 15mL de álcool etílico. A solução alcoólica foi distribuída nos sete tubos

e submetida aos testes de acordo com os procedimentos representados no quadro 01

(ver página 24).

As análises dos resultados foram feitas de acordo à metodologia


31

5.4 Testes para constituintes fenólicos (em meio imiscível com água) [26].

5.4.1 Teste para quinonas.

Em 4mL da solução etérea obtida em 5.2 foram adicionados 2mL de

solução de hidróxido de amônia 6 mol/L. A mistura foi agitada e na seqüência foi

colocada em repouso, ocorrendo a formação de duas fases.

Os resultados foram analisados através da observação da cor vermelha,

na camada aquosa alcalina.

5.4.2 Teste para antranóis.

No tubo do teste anterior (5.4.1) foi adicionado 1mL de água oxigenada

concentrada, sendo agitado e observado por dez minutos.

A análise do resultado foi feita observando coloração. A presença de cor

vermelha, progressivamente mais intensa na fase aquosa, indica a presença de

antranóis.

5.4.3 Teste para cumarina.

O restante da solução etérea usada no teste para quinonas (5.4.1) foi

concentrado até a secura e redissolvido em 15mL de etanol e em seguida filtrado.

Usando um capilar, foram feitas duas manchas de aproximadamente 1,5cm de diâmetro

em um pedaço de papel de filtro não fluorescente. Em uma das manchas foi aplicado

hidróxido de potássio alcoólico 1 mol/L; as manchas foram cobertas parcialmente com

um papel opaco não fluorescente e expostas em conjunto à luz UV.

32

O resultado foi analisado a partir da observação do desenvolvimento de

fluorescência azulada, forte, bem visível na metade não encoberta da mancha

alcalinizada.

6 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS DOS CONSTITUINTES DO EXTRATO DICLOROMETÂNICO APÓS A HIDRÓLISE ALCALINA DOS CONSTITUINTES NEUTROS.

O extrato original em solvente orgânico (reservado do extrato em solvente

diclometânico 5.1) foi evaporado até secura. Aos resíduos foram adicionados 15mL de

metanol e 15mL de solução de hidróxido de sódio a 70%. A mistura foi aquecida sob

constante agitação até quase secura com o objetivo de assegurar a saponificação

completa [26].

6.1 Separação do insaponificável [26].

No extrato saponificado foi adicionado 100mL de água. A mistura foi

aquecida sob agitação até a homogeneização. Após esfriar, foi feita a extração da

fração insaponificável com funil de separação agitando a mistura com três porções de

20mL de éter etílico. A fase aquosa alcalina foi reservada e a solução etérea lavada

com 30mL de água. A solução etérea foi tratada com sulfato de sódio anidro e em

seguida filtrada e concentrada até a secura.

33

6.1.1 Teste de esteróides e triterpenóides.

Os resíduos insaponificáveis obtidos no procedimento anterior (6.1) foram

redissolvidos em 5mL de clorofórmio. A mistura foi tratada com sulfato de sódio anidro

e colocada em um tubo de ensaio com 1mL de anidrido acético, que foi agitado

suavemente e adicionados cuidadosamente, três gotas de ácido sulfúrico concentrado.

Os resultados foram analisados observando as colorações da solução. A

coloração azul evanescente seguida de verde permanente é indicativo da presença de

esteróides livres. A coloração pardo-avermelhada indica triterpenóides pentacíclicos

livres.

6.2 Separação dos ácidos do material saponificado [26].

A solução aquosa alcalina reservada (separação insaponificável 5.1) foi

filtrada e acidulada com ácido clorídrico 3 mols/L até pH = 2, depois de esfriar foram

adicionados 100mL de éter etílico. A mistura foi agitada num funil de separação que

ficou em repouso separando as fases. A solução etérea foi retirada do funil e lavada

com 30mL de água destilada, tratada com sulfato de sódio anidro e concentrada até a

secura.

6.2.1 Teste para fenóis.

Os resíduos concentrados na etapa anterior (6.2) foram dissolvidos em

5mL de etanol 70% e filtrado. A mistura obtida foi distribuída em sete tubos de ensaio,

sendo efetuados os testes representados no quadro 01 (ver página 24).

34

As análises dos resultados foram feitas de acordo com a metodologia


7 ENSAIOS BIOLÓGICOS - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DOS EXTRATOS BRUTOS DE Aspidosperma macrocarpon Mart., DAS FRAÇÕES OBTIDAS DO EXTRATO EM DICLOROMETANO E SUBSTÂNCIA ISOLADA.

Os ensaios sobre as formas tripomastigotas foram obtidos de cultura de

macrófagos peritoneais. As células foram cultivadas em meio RPMI, suplementado com

2 x 10-6 mol/L de L-glutamina, 10-5 mol/L de NaHCO3, 100U/mL de penicilina, 100

µg/mL de estreptomicina e 5% de soro bovino fetal inativado, em microplacas de 96

poços (2 x 105 macrófagos/poço, contados por meio de câmara de Neubauer) a 37oC

em ambiente a 5% de CO2, com umidade de 95%.

As formas tripomastigotas foram adicionadas à cultura na proporção de

3:1. Após 7 dias, o sobrenadante foi retirado, centrifugado, sendo então obtidas as

formas do parasita, livres para a realização dos ensaios. Em uma placa de

microtitulação de 96 poços foram adicionados, então, aproximadamente 106 formas do

parasita, e posteriormente foi adicionada à substância em análise (extratos brutos,

frações do extrato diclorometânico e substância isolada), onde, após 24 horas de

incubação, foi realizada a verificação da atividade biológica por meio da técnica

colorimétrica por sal de tetrazolium [MTT; 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide], de acordo com o descrito na literatura [30], sendo a leitura

realizada em um leitor de microplacas, em comprimento de ondas de 595nm. Os

ensaios foram realizados em triplicata.

Soluções estoques foram preparadas pela dissolução dos extratos e

frações em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Alíquotas desta solução foram

adicionadas ao sangue infectado, nas doses 0,9, 1,5 e 2,1 µg/mL.

35

8 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO

8.1 Coluna Cromatográfica à Vácuo - sílica gel 60.

A ressuspensão foi feita com 8,8g do extrato diclorometânico de

Aspidosperma macrocarpon com 30mL de diclorometano, acrescentando a mistura,

sílica gel 60 até a absorção completa do solvente.

A coluna cromatográfica foi montada em funil com sílica gel 60, extrato

mais sílica gel 60 , areia lavada e papel de filtro.

A eluição foi feita sob baixa pressão usando 4 litros de cada solvente na

seguinte ordem: hexano, diclorometano, diclorometano/acetado de etila 1:1, acetato de

etila e metanol.

As frações obtidas em cada eluição foram concentradas em evaporador

rotativo sob pressão reduzida. As massas obtidas estão representadas na tabela 2.

Tabela 02 - Massas obtidas do fracionamento do extrato diclorometânico.

Fração Massa (g)

Hexano

Diclorometano

Diclorometano/acetato de etila 1:1

Acetato de etila

Metanol

0,2

0,7

2,8

0,8

0,5

As cinco frações obtidas foram diluídas com diclorometano e aplicadas em

placa cromatográfica com sílica gel 60. As placas foram submetidas à seguinte

seqüência de solventes: hexano/acetato de etila 30%, diclometano/acetato de etila 50%,

acetato de etila e metanol/acetato de etila 20%.

36

8.2 Coluna Cromatográfica à Vácuo.

Conforme o monitoramento em CCDC (ver item 8 página 56), observou-se

que a fração diclorometano/acetato de etila apresentava mancha única e, para refinar

seu isolamento, esta foi submetida à cromatografia à vácuo utilizando 60g de celite e

20g de carvão ativo, areia lavada e anteparo de papel de filtro.

A eluição foi feita sob pressão reduzida usando um litro de solvente

diclorometano/acetato de etila (1:1). A fração obtida foi concentrada em evaporador

rotativo sob baixa pressão e colocada em câmara à vácuo para evaporação do

solvente.

Após repetir a CCDC com a fração purificada, esta foi submetida à

obtenção de espectros de RMN 1H e 13C e de massas visando sua elucidação

estrutural.

37

RESULTADOS E DISCUSSÃO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS Com a aplicação de marcha analítica prospectiva é possível detectar os

principais grupos de constituintes químicos micromoleculares de origem vegetal. São

eles: ácidos fixos fortes e fracos, ácidos graxos, alcalóides, antocianidinas,

antocianinas, antranóis, auronas, bases quaternárias, catequinas, chalconas, cumarina,

esteróides, fenóis simples, flavonas, flavonóis, flavanonas, flavanonóis, glicerina,

heterosídios cianogênicos, leucoantocianidinas, quinonas, resinas, saponinas, taninos

condensados, taninos hidrolisáveis, triterpenóides e xantonas [26]. Nesse trabalho foi

desenvolvida uma marcha analítica com o objetivo de identificar os principais

metabólitos secundários presentes nos extratos etanólico, etanólico hidrolisado,

diclorometânico e diclorometânico hidrolisado.

2 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO

2.1 Resultados dos testes efetuados nos tubos de ensaio:

A figura 14 apresenta os tubos antes da aplicação dos testes e a figura 15

apresenta as mesmas frações após os testes. Os resultados estão representados no

quadro 05.

Figura 15 - Testes nas Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7.

Figura 14 - Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7

Quadro 05 - Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7

Precipitado

verdes

indica

taninos

Negativo

Negativo

Vermelho

laranja

indica

flavonóis

Pardo

amarelado

indica

catequinas

Vermelho

alaranjado

indica

flavanonas

Vermelho

intenso

indica

flavanonas,

flavonóis e

flavanonóis

Os polifenóis são substâncias redutoras e, portanto, oxidam-se com

facilidade, resultando em substâncias coradas. A cor desses produtos de oxidação

deve-se ao elevado grau de conjugação. Oxidantes, tais como o cloreto férrico (FeCl3),

são empregados para a caracterização de polifenóis em geral; nesse caso a

positividade é evidenciada pelo desenvolvimento de azul a verde-azulada [25].

A precipitação escura de tonalidade verde indica a presença de taninos

condensados. Os taninos condensados estão amplamente distribuídos em plantas

lenhosas [25].

Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela poli-

condensação de duas unidades flavan-3-ol e flavan-3,4-diol. Essa classe de taninos

também é denominada como proantocinidina, devido ao fato de os taninos

38

39

condensados produzirem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas, tais

como cianidina e delfinidina, após degradação com ácido mineral diluído a quente [25].

Os testes nos tubos 2 ,3 e 4 com pH ácido (3,0), alcalino (8,5) e alcalino (11,0) deram

negativos, não sendo possível detectar a presença de alguns compostos fenólicos

simples, como antocianinas, antocianidinas, flavonas, flavonóis, xantonas, chalconas e

auronas, derivados da degradação do tanino condendado ou flavonóides. No tubo 4 pH

alcalino (11,0) foi possível detectar mudança de coloração para vermelho alaranjado,

sendo essa alteração indicativo da presença de flavanonois (di-hidroflavonas), um dos

representantes da classe dos flavonóides. No tubo 5 após acidulação e aquecimento

observou-se mudança intensa de coloração (pardo-amarelado) o que provavelmente é

indicativo da presença catequina, um dos compostos participantes da biogênese do

tanino condensado. No tubo 6 após alcalinização e aquecimento, observou-se

mudança intensa de coloração (vermelho-alaranjado), o que provavelmente é indicativo

da presença flavanonas, uma outra substância da classe dos flavonóides. O teste da

cianidina ou Shinoda (HCl concentrado e magnésio em pó), costuma ser empregado

para a detecção de flavonóides por ser característico para o maior número de

substâncias dessa classe. Através dessa reação, pode-se caracterizar compostos

contendo um núcleo α-benzopirona, pelo desenvolvimento de cor laranja a vermelho

[25]. No tubo 7 após a acidificação com HCl e o acréscimo de magnésio observou-se

mudança de coloração para o vermelho intenso, o que é indicativo da presença de

substâncias da classe dos flavonóides (flavonóis, flavanonas, flavanonóis e/ou

xantonas).

2.2 Ensaios para saponinas.

2.2.1 Ensaio I

Nesse ensaio observou-se coloração de azul evanescente seguida de

verde permanente, indicando a presença de esteróides livres. A reação de Liebermann-

40

Burchard (anidrido acético-ácido sulfúrico concentrado), é empregada na detecção de

esteróides e triterpenos, os primeiros desenvolvem coloração mutável com o tempo,

enquanto que os últimos desenvolvem coloração estável [31].

2.2.2 Ensaio II

Para detectar a presença de saponinas, emprega-se o teste de formação

de espuma, estável na presença de ácidos minerais diluídos [25]. Nesse ensaio não foi

observada a formação de espuma persistente e abundante indicando a ausência de

saponina na fração analisada.

2.2.3 Ensaio III

Não ocorreu a formação de precipitado confirmando o resultado do teste

anterior (2.2.2).

2.3 Teste para alcalóides.

As reações gerais para alcalóides baseiam-se na formação de complexos

insolúveis (precipitados). Como resultados falso-positivo são bastante comuns para

essas reações, previamente à análise, o material a ser analisado deve ser submetido a

extrações ácido/base. As reações gerais empregam os reagentes de Dragendorff (iodo-

bismuto de potássio), Mayer (iodo-mercúrio de potássio) e Wagner (iodo-iodeto de

potássio) e Bertrand (ácido sílico-túngstico) [25]. O reagente de Hager (solução

saturada de ácido pícrico) também é usado para os testes de alcalóide [26].

Nesse teste usando os reagente Hager e Meyer foi observada a formação

de precipitado (fig.16) nos dois tubos testados, sendo indicativo da presença de

alcalóides.

Figura 16 - Frações do extrato etanólico. Testes com reagente de Hager e Meyer respectivamente.

A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato etanólico está

representada no organograma 01:

41

Organograma 02: Abordagem fitoquímica - Extrato Etanólico hidrolisado

42

Fase aquosa alcalina com coloraçãovermelha, indica presença dequinona

Foi agitado ena sequência repousoformando duas fases

Solucão etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L

Negativo para cumarina

Adicionou KOH alcoólico 1mol/Lem papel de filtro e exposto a luz UV

Concentrado atésecura e redissolvidocom 15mL de etanol

Solução etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L

Presença detanino condensado

Tubo 1FeCl3

Negativo

Tubo 2 HCl 3 mols/LpH = 3

Negativo

Tubo 3 NaOH 1 mol/LpH = 8.5

Presença deflavonóis

Tubo 4 NaOH 1 mol/LpH = 11

Presença decatequina

Tubo 5 HCl 3 mols/LpH=1 e aquecido

Presença deflavanonas

Tubo 6 NaOH 1mol/LpH=11 e aquecido

Presença de flavonóis,flavanonas e flavanonóis

Fita de magnésioe HCl concentrado

Testesnos

tubos


acificada com HCl até 6 mols/Laquecido sob refluxo

extração com éter etílico

40 mL de soluçãoetanólico

3 ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO ETANÓLICO HIDROLISADO

3.1 Teste para quinonas.

Como os derivados antraquinônicos ocorrem nos vegetais em vários níveis

de oxidação, o material a ser analisado deve ser convenientemente tratado para que

ocorra uma oxidação total destes até antraquinonas. A reação característica para

antraquinonas é conhecida como reação de Borntrager. O meio dessa reação é apolar

e, por isso, ela é direcionada para a detecção da agliconas antraquinônicas. Assim,

anteriormente à reação, deve-se proceder à hidrólise [25].

Em meio alcalino, as quinonas hidroxiladas transformam-se nos ânions

fenolatos correspondentes, os quais apresenta intensa coloração púrpura a violeta. A

alcalinização necessária para essa reação pode ser obtida inclusive por soluções de

bases fracas como, por exemplo, hidróxido de amônia [25].

A fase aquosa alcalina (fig.17) obtida para esse teste, apresentou

coloração vermelha sendo indicativo de quinonas (especialmente antraquinonas

hidroxiladas).

Figura 17 - Frações do extrato etanólico hidrolisado Na proveta a fração hidrolisada e no funil a fração alcalinizada para o teste.

43

44

3.2 Teste de cumarinas.

A caracterização das cumarinas no extrato pode ser feita pela observação

do mesmo sob luz ultravioleta (360 nm), pois a maioria possui fluorescência azul

brilhante ou verde. As cumarinas em solução alcalina desenvolvem coloração amarela,

devido ao rompimento do anel lactônico [25].

As famílias mais citadas na literatura pelo conteúdo em cumarinas são:

Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae, Farbaceae, Oleaceae, Moraceae e

Thymeleaceae[25].

No teste realizado com o extrato etanólico hidrolisado não foi observada

fluorescência azulada na metade não encoberta da mancha alcalinizada, indicando a

ausência de cumarina.

3.3 Teste para aglicanas e flavonóides

Os heterosídeos são compostos resultantes da ligação covalente formada

entre uma ou mais unidades de açúcar e outra estrutura diferente, chamada de

aglicana. A rigor, a biogênese de um heterosídeo deve ser considerada desde a

formação da aglicana até a ligação desta a uma ou mais unidade de açúcar[25]. Com

hidrólise é possível romper a ligação e liberar os seus constituintes e estes podem ser

detectados por um marcha analítica.

Foram repetidos os mesmos testes realizados no extrato etanólico sem a

hidrólise, observando os mesmos resultados (figura 18 e quadro 06).

Figura 18 - Testes nas Frações do extrato etanólico hidrolisado nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7.

Quadro 06 - Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico Hidrolisado TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7

Precipitado

verdes

indica

taninos

Negativo

Negativo

Vermelho

laranja

indica

flavonóis

Pardo

amarelado

indica

catequinas

Vermelho

alaranjado

indica

flavanonas

Vermelho

intenso

indica

flavanonas,

flavonóis e

flavanonóis

A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato etanólico hidrolisado

está representada no organograma 02:

45

Organograma 02: Abordagem fitoquímica - Extrato Etanólico hidrolisado

46

Fase aquosa alcalina com coloraçãovermelha, indica presença dequinona

Foi agitado ena sequência repousoformando duas fases

Solucão etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L

Negativo para cumarina

Adicionou KOH alcoólico 1mol/Lem papel de filtro e exposto a luz UV

Concentrado atésecura e redissolvidocom 15mL de etanol


Presença detanino condensado

Tubo 1FeCl3

Negativo


Negativo


Presença deflavonóis


Presença decatequina

Tubo 5 HCl 3 mols/LpH=1 e aquecido

Presença deflavanonas

Tubo 6 NaOH 1mol/LpH=11 e aquecido

Presença de flavonóis,flavanonas e flavanonóis


Testesnos

tubos


acificada com HCl até 6 mols/Laquecido sob refluxo

extração com éter etílico

40 mL de soluçãoetanólico

4. ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO DICLOMETÂNICO

O solvente diclorometano é usado para extrair preferencialmente as

seguintes substâncias: bases livres de alcalóides, antraquinonas livres, óleos voláteis,

glicosídeos cardiotônicos [25].

4.1 Teste de alcalóide.

Nesse teste usando os reagente Hager e Meyer foi observada a formação

de precipitado (fig 19) nos dois tubos testados, sendo indicativo da presença de

alcalóides.

Figura 19 - Frações do extrato diclorometânico.Testes com reagente de Hager e Meyer respectivamente.

47

4.2 Teste para constituintes fenólicos (em meio alcoólico)

Figura 20 - Testes nas Frações do extrato

diclorometânico para constituintes fenólicos

em meio alcoólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7

respectivamente.

Os testes negativos em todos o tubos são indicativos da ausência de

ácidos e fenóis livres em meio alcoólico.

4.3 Testes para constituintes fenólicos (em meio imiscível com água).

4.3.1 Teste para quinonas.

Teste negativo indicativo da ausência de quinonas em meio imiscível com

água.

4.3.2 Teste para antranóis.

48

Teste negativo indicativo da ausência de antranóis em meio imiscível com

água.

49

4.3.3 Teste para cumarina.

Teste negativo indicativo da ausência de cumarina em meio imiscível com

água.

A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato diclorometânico está

representada no organograma 03:

Organograma 03: Abordagem fitoquímica - Extrato Diclorometânico

Formação de precipitadopresença de alcalóides

Reagente deHager

Formação de precipitadopresença de alcalóides

Reagente deMayer

Extraçao da fase aquosaácido com HCl 1mol/L

Negativo

Tubo 1FeCl3

Negativo


Negativo


Negativo


Negativo

Tubo 5 HCl 1 mol/LpH = 1 aquecido

Negativo

Tubo 6 NaOH 1 mol/LpH = 11 aquecido

Negativo

Tubo 7 Fita de magnésioe HCl concentrado

Solução etérea concentrada eredissolvida em álcool etílico

Negativo paraquinona

Negativo paraantranóis

Adicionou águaoxigenada concentrada

Adicionou NH4OH 6 mols/L agitou e colocouem repouso separando duas fases

Negativo paracumarina

Adicionou KOH alcoólico 1mol/Lem papel de filtro e exposto

a luz UV.

Concentrado até secura eredissolvido em 15ml de etanol

Fase etérea lavada e tratadacom sulfato de sódio anidro

Extração de ácidose fenóis com éter

Separação sob agitação comNaOH 2% e água destilada

adicionou soluçãoéter-clorofórmio 3:1

Adicionou HCl 1 mol/Le a soluçao aquosaácido alcalinizada

com NH4OH

Ressuspensão de 3g em50mL de diclorometano

Extrato Diclorometânico

50

5 ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO DICLOMETÂNICO APÓS A HIDRÓLISE ALCALINA DOS CONSTITUINTES NEUTROS.

Observou-se material pastoso se desprendendo do fundo do recipiente,

indicando material saponificado.

5.1 Teste de esteróides e triterpenóides

A reação de Liebermann-Brüchard (anidrido acético – ácido sulfúrico

concentrado) é empregada para a detecção de esteróides e triterpenos; os primeiros

desenvolvem coloração mutável com o tempo, enquanto que os últimos desenvolvem

coloração estável [31].

A presença de coloração estável parda até vermelha, indica a presença de

triterpenos pentacíclicos (fig. 21).

Figura 21 - Testes nas frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos insaponificáveis, para esteróides livres e triterpeno pentacíclico.

51

5.2 Teste para fenóis.

Figura 23 - Testes para fenóis nas frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis.

Figura 22 - Frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis.

Os resultados negativos dos testes em todos os tubos é indicativo da

ausência de fenóis simples, catequinas e flavonóides no saponificado.

A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato diclometânico após a

hidrólise alcalina dos constituintes neutros está representada no organograma 04:

52

Organograma 04: Abordagem Fitoquímica - Extrato diclorometano (hidrólise alcalina)

Presença de triterpenospentacíclicos

Tratada com sulfatode sódio anidro etrês gotas H2SO4

concentrado

Resíduos insaponificáveisredissolvido e 5mL de clorofórmio

Negativo

Tubo 1FeCl3

Negativo


Negativo


Negativo


Negativo

Tubo 5 HCl 3 mols/LpH = 1 e aquecido

Negativo

Tubo 6 NaOH 1 mol/LpH = 11 e aquecido

Negativo


Testes nostubos

Resíduos concentradosdissolvidos em 5mL

de etanol 70% efiltrado

Solução aquosa alcalina foi filtrada e acidicadacom HCl 3 mols/L pH = 2,adicionou éter sendo

essa solução lavada com água destilada econcentrada até a secura

Adicionou água e aqueceusob agitação e extração dafração insaponificáveis com

éter etílico

Observou-se a presençade material saponificado

Evapou até a secura eadicionou metanol ehidróxido de sódio e

aqueceu até a secura

Adicionou soluçãoéter-clorofórmio 3:1

Adicionou HCl 1 mol/Le a solução aquosaácida foi alcalinizada

NH4OH

Ressuspensão de 3g em50 mL de diclorometano

Extratrato diclorometânico

53

6 RESULTADOS DOS ENSAIOS BIOLÓGICOS.

6.1 Avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos obtidos de

Aspidosperma macrocarpon Mart.

Visando avaliar atividade tripanocida dos extratos obtidos, foram feitos

ensaios em cada etapa desse trabalho. O ensaio com o extrato diclorometânico

apresentou, em torno de 70% de lise parasitária contra 40% de lise no extrato etanólico

e 20% de lise no extrato hexânico, como mostra a figura 24. Esse resultado direcionou

os fracionamentos para o extrato diclorometânico bem como o biomonitoramento das

frações obtidas.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ext. HexânicoExt. DiclorometânicoExt. Etanólico

log dose (µg/mL)

% d

e lis

e

Figura 24 – Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos hexânico, diclorometânico e etanólico.

54

6.2 Biomonitoramento da atividade tripanocida das frações obtidas do fracionamento do

extrato diclorometânico de Aspidosperma macrocarpon Mart.

O extrato diclorometânico de Aspidosperma macrocarpon Mart. foi o que

apresentou maior porcentagem de lise parasitária. Este extrato foi fracionado (conforme

descrito nos itens 8.1 e 8.2 de material e métodos ver páginas 35 e 36).

Todas as frações resultantes foram avaliadas quanto a possível atividade

tripanocida (biomonitoramento). Os resultados obtidos estão representados na figura

25.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

25

50

75

100

Aspilo/z Acetado de etilaAspilo M MetanolAspilo M DiclorometanoAspilo/z hexanoAspilo M Diclorometano/ Acetado de etila

log dose (µM)

% li

se

Figura 25 - Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida das frações do extrato diclorometânico.

Observou-se em torno 80% de lise parasitária na dose de 2,1 µM na

fração diclorometano/acetato de etila 1:1.

55

7 RESULTADOS DO FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ATIVOS.

As frações obtidas (conforme descrito no item 8.1 de material e métodos ver

página 35) foram aplicadas em placas cromatográficas de sílica gel 60. Foi observada

no cromatograma (fig. 26) a presença de uma substância, direcionando os trabalhos de

biomonitoramente e fracionamento para a fração diclorometano/acetato de etila 1:1. Figura 26 - Cromatograma das frações diclorometano/acetato

de etila 1:1 e acetato de etila respectivamente obtidas do extrato diclorometânico.

Com o fracionamento em coluna celite à vácuo (descrita no item 8.2 de

material e métodos ver página 36) da fração diclorometano/acetato de etila 1:1 foi

observada a formação de um precipitado branco. O cromatograma dessa substância

está representado a seguir (fig. 27).

56

Figura 27 - Cromatograma do precipitado branco obtido do fracionamento da fração diclorometano/acetato de etila 1:1.

A análise da RMN e da espectroscopia de massa indica a presença no

precipitado de um triterpeno predominando o ácido ursólico. A placa cromatográfica (fig.

28) feita usando o ácido ursólico como padrão confirmam esse resultado.

1 2

Figura 28 – 1. Mistura ácido ursólico + oleanóico (Padrão); 2.

Precipitado branco obtido do fracionamento da fração diclorometano/acetato de etila 1:1

57

8 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA SUBSTÂNCIA ISOLADA.

Conforme dados da literatura [32 33], foi possível perceber que a

substância isolada tratava-se de um triterpeno ácido, com esqueleto tipo ursano (fig.

29).

18

734

5

92

6

10

17

14

20

25

21

181311

12

16

19

15

30

29

24

27

22

2826

23

Figura 29 – Esqueleto tipo ursano.

O sinal em δ = 5,20 corresponde ao hidrogênio ligado ao C – 12. Em δ =

4,30 pode ser observado o sinal relativo ao hidrogênio da hidroxila em C – 3. Já o

hidrogênio ligado diretamente em C – 3 está representado pelo sinal em δ = 3,00. O

dupleto em δ = 2,10 correspondente ao hidrogênio alílico ligado à C – 18. Com base

nestes dados foi possível identificar a molécula como sendo o ácido ursólico (figura 30),

o que pode ser confirmado através do espectro de RMN 13C (tabela 03) em comparação

com valores obtidos da literatura [34]. O triterpeno ácido ursólico apresenta atividade

contra a forma tripomastigota do tripanossoma cruzi [35].

58

COOH

OH

18

734

5

92

6

10

17

14

20

25

21

181311

12

16

19

15

30

29

24

27

22

26

23

28

Figura 30 – Estrutura do ácido ursólico. Tabela 03 – Dados dos principais sinais de RMN 13C da substância isolada (DMSO, δ ppm, 100 MHz) e valores de δ da literatura para o ácido ursólico.

Carbonos Substância isolada (DMSO)

Ácido ursólico [34] CDCl3)

C – 3

C – 12

C – 13

C – 18

C – 28

77,2

124,9

138,5

52,7

177.6

78,8

125,5

143,4

52,8

177,7

Através da obtenção de um espectro de massas da substância isolada foi

possível a detecção do pico íon molecular em 455,57, compatível com a fórmula

molecular do ácido ursólico (C30H4803).

Os espectros de RMN1H e 13C e de massas, com os sinais relevantes

para identificação estrutural assinalados, estão dispostos nos anexos 01,02 e 03

respectivamente.

59

60

CONCLUSÃO

Com relação à atividade tripanocida, foi possível constatar que o

extrato bruto diclorometânico apresentou resultados significativos. Entre as frações

desse extrato, a que apresentou maior atividade foi a obtida com acetato de etila e

diclometano (1:1).

Os ensaios farmagnósticos permitiram conhecer qualitativamente o

perfil químico do vegetal. Alguns metabólitos secundários como os taninos

condensados, flavonóides, esteróides livres, quinonas, triterpenos e alcalóides foram

identificados.

O estudo fitoquímico usando o fracionamento biomonitorado permitiu

isolar a provável substância responsável pela atividade. A análise de espectros de

RMN de 1H e 13C e massas permitiu concluir que essa substância é o triterpeno

ácido ursólico.

61

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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14 SOUTHON, I.W.; BUCKINGHAM, J.(ed). Dictionary of alkaloids. London: Chap-man and Hall, v.1-2, 1989. 15 REY, Luís. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nas Américas e na África. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 16 NEVES, D. P. Parasitologia Humana. 10. ed. São Paulo: Atheneu, 2001. 17 OMS. Tropical Disease Research. Genebra: Organização Mundial da Saúde, 1993. 18 BONAMETTI, A. M.; CASTELO, A. F.; RAMOS, L. R., CAMARGO, E. NAKAMURA, P. M.; BALDY, J. L. S.; MATSUO, T. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. v.93, n.6, p.727-732, 1998. 19 PARADA, H.; CARRASCO, A. H.; AÑEZ, N.; FUENMAYOR, C.; INGLESSIS,.Cardiac involvement is a Constant finding in acute Chagas disease: a clinical, parasitological and hispathological study. International Journal of Cardiology, v. 60, p. 49-54, 1997. 20 LOPES, N. P. Metabólitos secundários de Virola surinamensis (Miristicaceae). 1997. 204 f. Tese (Doutorado em Química). Universidade de São Paulo, São Paulo. 21 CHIARI, E. Chemoprophylaxys in Chagas’ Disease: potential use of natural produts of plant origin and related synthetic compound. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. V.89, p. 40-41, 1994. 22 WENDEL, S. ; DIAS , J . C. P. Chagas disease ( American Trypanosomiasis ): its impact on transfusion and clinical medicine . In: ISTB Brazil 92, Wendel, S.; Brener, Z. ; Camargo, M .E. ; Rossi, A. (eds), cap. 7, 103-133, 1992. 23 LUCCA, R. A Cura Ameaçada. Revista Terra. São Paulo, n.146, p. 60-71, jun. 2004. 24 OLIVEIRA, F.; AKISUE, G.; AKISUE, M.K.. Farmacognosia. 1aed. São Paulo: Editora Atheneu, 1998. 25 SIMÕES, C.O.; SCHENKEL, E.P.; DE MELLO, P.J.; PETROVICK, P.R. (Org.). Farmacognosia: Da Planta ao Medicamento. 5a ed. Porto Alegre: UFRGS/UFSC, 2003. 26 MATOS, F.J. A., Introdução a Fitoquímica Experimental. 2a ed. Fortaleza: Edições UFC, 1997. 27 DI STASI, L. C.(Org), Plantas Medicinais: Arte e Ciência. São Paulo:Editora da UNESP, 1995. 28 DEY, P.M.; HARBORNE, J.B.(ed.). Methods in plant biochemistry. San Diego: Academic, v.6, 1991.

63

29 HOSTETTMANN, K.; WOLFENDER, J.-L.; RODRIGUEZ, S. Rapid detection and subsequent isolation of bioactive constituents of crude plant extracts. Planta Med. v.63, n.1, p. 2-10, 1997. 30 MUELAS, S. S; NOGAL, J.J. R.; GÓMEZ, A.B., Setting a Colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitol Res., v. 86, p. 999-1002, 2000. 31 HASHIMOTO, Y. Diferenciação de esteróides e triterpenóides pela reação corada. An. Acad. Bras. Ciênc., v. 42 (Sup.), p. 95-96, 1970. 32 SOUZA, M.P.; MATOS, E.O.; MACHADO, M.L.I.; BRAZ FILHO, R.; VENCATO, I.; MASCARENHAS, Y.P.. Triterpenoids from guettes Angelica. Phytochemistry. v.23, p. 2589-2592, 1984. 33 HONGQVAN, D.; YOSHIHISA, I.; MOMOTA, H.; OHMOTO, Y.; TAKI, T.; JIA, Y.; LI, D.. Triterpenoids fron Tripteygium wilfordii. Phytochemistry. v.53, p. 805-810, 2000. 34 MAHATO, S.B.; KUNDU, A.P.. 13C MNR spectra of pentaciclic triterpenoids: a compilation and same salient features (REVIEW). Phytochemistry. v.37, p. 1517-1575, 1994.

35 CUNHA, W.R.; MARTINS, C.; FERREIRA, D.S.; CROTTI, A.E.M.; LOPES, N.P.; ALBUQUERQUE, S.. In Vitro Trypanocidal Activity of Triterpenes from Miconia Species. Planta Med., v. 69, p. 470-472, 2003.

ANEXO 01

PROTON OMSO u jlcl 9

Current Data ParametersNAME .rcOamlEXPNO JPROCNO 1

F2 - ACQulsltion ParametersDate_TimeINSTRUMPR08HOPULPAOGTOSOLVENTNSOSSHHFlORESAORGOWOETE01

2004091016.32spect

5 mm OUL 13Czg30

65536OMSO

162

8278.146 Hz0.126314 Hz

3.9584243 see90.5

60.400 use e6.00 use e

300. O K1.00000000 see

.e" ••••• 'CHANNEL fi ••••••••NUCI IHPI . 25.00 useePL 1 -3.00 caSFOI 400.1324710 MHz

/V':J:

c.CDO:J:(,w

:J:c.CDoI~N

l,..-r-,):J:

:J: g.c. (")CD I

(") ~

t N'

I~!I~(l~(~~1

F2 - Proeess ing parametersSI 32768SF 400.1300008 MHzWDW EMSSO OL8 0.30 HzG8 OPC 1.00

t t--------L0ti5 10 NMA plot parameters

CX 20.00 emCY 12.50 emFI P 11 . 000 ppnFI 4401.43 HzF2P -I. 000 ppmF2 -400.13 HzP?MCM 0.60000 ppm/cmHZCM 240.07800 Hz/emi

r-r-r-r-r-r-r-r-r I I' I I i' i L i i I I j I i i I i I i I i i I I t I \ I i I i I i i t I i i j I i i, i i i i I i I i i i i i i i I i I i·i i i i i i I i i i i I t i I t I 'I' I j i I I i i i i I i i i i i I i i I i i i i i i I i I

ppm 10 8 6 . 4 2 O

64

ANEXO 02

65

C13CPD DMSO u jlcl 9

"""O"""1.l1ruCT1 •...... W"'<DUlceOOCOf'.C\l,....,r--.,......,....- ~ .... -~/ I

~ '" tOUl r-, '"ID ~ Ulo <r ce

iII"""0 o-o~owcoco,.....-m~w •......coo_ru"""~woo~_m~~ru,.... oo~m~MmMN"""m •......wm~~mNmN"""O~C\lW~C\l"""moo mO-Mm~-,.....-m~NOCOW~C\loo"""co~rn~mru~m..... , " .~- mO,.....C\lOO~C\l,.....-ooornrnmmcocowcom_,.....,....w~

n\~;ppo.o.

oIo

o J: oI I

o ...JI. o ....• ...JI.W ~....• co

I IN ...JI. ...JI.co ...JI. N CD U1

w

1N...JI. co ...JI. ......•....• U, N N....•

W.a:o. coU, cn <.o....• N It....• t ....•

t tI

Current Data ParametersNAME ..,cO.olEXPNO 15PAOCNO I

F2 - ACQu 1s 1t ion ParametersO.te_Tlm.INSTAUMPAoBHOPlI..PADGTOSoLVENTNSOSSWHFlORESAOA,OWDETE01011012

•••••••• CHANNELNUClPIPUSfOl

200~09!!6.56

scect5 mm OUL 13C

'0093065535

OMSO15350

423980.814 H,0.355918 H'

1.3664756 sec4597.620.850 usec

6,00 usec300.0 K

2.00000000 sec0.03000000 •• c0.00002000 sec

fi········13C

20.00 usec2.00 dB

100.6227B9B HH,

••••• ". CHANNEL f2 ••••••••CPOPRG2 .,ltz 16NUC2 lHPCP02 120.00 U9.CPL2 -4.00 dBPL12 9.76 dBPL13 15.00 dB51'02 400.1316005 MlJz

F2 - Processlng parametersSI 3276BSF 100.6127793 MIJ,HOW EMSSB OLB 1.00 H,GB OPC 1. 40

JO NMR plot perametersCX 20.00 emCY 12.50 emFIP 215.000 ppmFI 21631.75 H,f2P -5.000 DomF2 -503.06 H,PPHCH li. 00000 pom/cmHZCM 1106.74060 Hz/cm

T I I i I I i I i', I I i I I i i I i I j I Ippm 200 175 150 125 100 75 50 25 O

ANEXO 03

AMOSTRA WILSON AM • 1 • CONE 20 - ESI - NEG 9393201004 - AMOSTRA WILSON AM - 1 - CONE 20 - ESI - NEG 1 (0.503) Sm (SG, 2xO.61)100 253.21

15:42: 16 20-0ct-2004Scan ES-

2.97e6

228.35H

133.08

125 150 175 200 225 250

212.29

%

113.23

31135 455.57. 345.46 l293.30

II ," I, .~m"", "".,""'"".",,,,,,',,,"'""'''''"""""'"""",mJ,275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700

66

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










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http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











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http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









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http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









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http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







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