VPLIV NOTRANJIH IN ZUNANJIH OKOLJSKIH DEJAVNIKOV NA ... · Slika 1: Organizacija genoma HPV-16...

UNIVERZA V NOVI GORICI

FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU

VPLIV NOTRANJIH IN ZUNANJIH OKOLJSKIH

DEJAVNIKOV NA NASTANEK VIRUSOV HPV

DIPLOMSKO DELO

Jana Sitar

Mentorica: doc. dr. Martina Bergant Marušič

Nova Gorica, 2017

III

ZAHVALA

Predvsem bi se rada zahvalila mentorici doc. dr. Martini Bergant Marušič za izkazano zaupanje pri izvajanju diplomskega dela, za vso predano znanje, za potrpežljivost ter pomoč tekom celotnega eksperimentalnega in pisnega izvajanja diplomskega dela. Zahvalila bi se tudi družini in fantu, ki so me v tem času vedno podpirali in verjeli vame.

V

IZVLEČEK

Humani virusi papiloma so eden najpogostejših vzrokov spolno prenosljivih bolezni in nastanka nekaterih vrst raka, kot so rak materničnega vratu, rakava obolenja na spolovilih ter rak glave in vratu. V diplomskem delu smo ugotavljali vpliv notranjih in zunanjih dejavnikov na nastanek in infektivnost virusov HPV-16, določali pa smo tudi strukturne lastnosti virusnega plašča. Kot notranji dejavnik smo uporabili gostiteljski protein SNX17, ki je ključen za okužbo HPV, kot zunanji dejavnik pa nanodelce titanovega dioksida, ki so pogosta sestavina kozmetičnih izdelkov. Pri pridobivanju virusnih delcev HPV-16 v celični liniji 293TT smo ugotovili, da protein SNX17 in nanodelci TiO2 ne vplivajo na količino virusnih delcev, vplivajo pa na njihovo infektivnost. Potrdili smo, da je protein SNX17 ključnega pomena za okužbo HPV, saj so imeli mutirani virusni delci AA2 bistveno zmanjšano stopnjo okužbe. Podobno smo ugotovili pri uporabi nanodelcev TiO2, kjer je bil upad infektivnosti sorazmeren koncentraciji uporabljenih nanodelcev med fazo nastanka virusnih delcev. Pri strukturnih lastnostih virusnega plašča smo analizirali količino in vrsto vključene reporterske DNA, stabilnost plašča in razmerje proteinov L1 : L2 v plašču. Ugotovili smo, da vezava plaščnega proteina L2 s SNX17 in prisotnost nanodelcev TiO2 na te lastnosti ne vplivata. Zaključili smo, da izbrani okoljski dejavniki, protein SNX17 in nanodelci TiO2 ne vplivajo na osnovne značilnosti nastanka virusnih delcev HPV-16, vplivajo pa na njihovo učinkovitost okužbe gostiteljskih celic. Ključne besede: HPV, plaščni proteini, okužba, TiO2, SNX17

ABSTRACT

Human papillomaviruses are one of the most common causes of sexually transmited diseases and development of certain types of cancer, such as cervical cancer, cancer on genial areas and neck and head cancer. In this paper we evaluated influence of internal and external factors on production and infectivity of the HPV16, we also determined structual properties of viral capsids. As an internal factor, we used SNX17 host protein, which is essential for HPV infection, and as an external factor, we used TiO2 nanoparticles, that are common ingredient in cosmetic products. In the production of HPV16 viral particles in 293TT cell line, we found that SNX17 protein and TiO2 nanoparticles have no effect on the amount of viral particles, but they do affect their infectivity. We confirmed that the SNX17 protein is crucial for HPV infection, as the mutant viral particles AA2 had a significant reduced infection rate. Similar effect was also observed in the use of TiO2

nanoparticles, where the decline of infectivity was proportional to the concentration of nanoparticles used during the production phase. In the structural properties of the viral capsid, we analized the amount and type of the reporter DNA, the capsid stability and the L1:L2 protein ratio in the capsid. We have found that binding of the L2 capsid protein with SNX17 and presence of TiO2 nanoparticles, do not affect these properties. We concluded that the selected environmental factors, SNX17 protein and TiO2 nanoparticles, do not affect the basic characteristics of the viral partices of the HPV16, but affect their infection efficiency in host cells.

Key words: HPV, capsid proteins, infection, TiO2, SNX17

VI

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ......................................................................................................................................... 1 1.1 Namen in hipoteze diplomskega dela................................................................................. 1

2 TEORETIČNE OSNOVE ......................................................................................................... 3 2.1 Humani virusi papiloma .......................................................................................................... 3 2.2 Celični cikel HPV......................................................................................................................... 4 2.3 Vpliv okoljskih dejavnikov na okužbo s HPV ................................................................... 5 2.4 Cepiva za viruse HPV ................................................................................................................ 6 2.5 Plaščni proteini HPV ................................................................................................................. 6 2.6 Protein Sorting Nexin 17 (SNX17) ....................................................................................... 8 2.7 Nanodelci titanovega dioksida (TiO2NP) ........................................................................... 9

3 EKSPERIMENTALNI DEL .................................................................................................. 11 3.1 Laboratorijska oprema ......................................................................................................... 11

3.1.1 Aparature ......................................................................................................................................... 11 3.1.2 Steklovina in potrošni material............................................................................................... 11 3.1.3 Kemikalije in raztopine .............................................................................................................. 12 3.1.4 Celični liniji ...................................................................................................................................... 13

3.2 Priprava in tretiranje celic .................................................................................................. 13 3.2.1 Gojenje in presajanje celic ......................................................................................................... 13

3.3 Pridobivanje PsVs ................................................................................................................... 14 3.3.1 Transfekcija ..................................................................................................................................... 14 3.3.2 Izolacija psevdovirusnih delcev .............................................................................................. 15

3.4 Določanje uspešnosti produkcije psevdovirusnih delcev HPV-16 ....................... 15 3.4.1 Priprava vzorcev PsVs ................................................................................................................ 15 3.4.2 Potek elektroforeze SDS-PAGE ................................................................................................ 16 3.4.3 Imunodetekcija proteinov L1 in L2 ....................................................................................... 16

3.5 Test infektivnosti .................................................................................................................... 17 3.6 Določanje stabilnosti psevdovirusnih plaščnih proteinov ...................................... 18 3.7 Analiza enkapsidirane DNA z gelsko elektroforezo ................................................... 18 3.8 Statistična analiza ................................................................................................................... 19

4 REZULTATI in DISKUSIJA ................................................................................................ 20 4.1 Produkcija psevdovirusov ................................................................................................... 20 4.2 Infektivnost psevdovirusnih delcev ................................................................................. 22 4.3 Enkapsidacija reporterske DNA ........................................................................................ 24 4.4 Zgradba in stabilnost virusnega plašča .......................................................................... 26

4.4.1 Razmerje L1 : L2 ............................................................................................................................ 27

5 ZAKLJUČEK ........................................................................................................................... 29

6 VIRI ......................................................................................................................................... 30

PRILOGE ............................................................................................................................................ I

VII

SEZNAM TABEL

Tabela 1: Sestava ločevalnega in zbiralnega gela proteinske gelske elektroforeze SDS-PAGE. ............................................................................................................................. 16

VIII

SEZNAM SLIK

Slika 1: Organizacija genoma HPV-16 (Poljak idr., 2005) .................................................. 3 Slika 2: Življenjski cikel virusa HPV v epiteliju (prirejeno po Doorbar idr., 2012) ................. 5 Slika 3: Rekonstrukcija HPV-16 psevdoviriona (Buck idr., 2013). ....................................... 7 Slika 4: Prikaz primarne okužbe virusov HPV (Day in Schelhaas, 2014). ........................... 8 Slika 5: Metoda pridobivanja HPV psevdovirionov (Prirejeno po protokolu Ozbun in Campos, Smith idr., 2007 ) .............................................................................................. 14 Slika 6: Imunokemijsko določanje plaščnega proteina L2 pri produkciji psevdovirusnih delcev HPV-16 ................................................................................................................. 20 Slika 7: Elektroforezni gel (SDS-PAGE) supernatantov celične kulture 293TT po produkciji PsVs HPV-16. .................................................................................................................. 21 Slika 8: Produkcija virusnih delcev HPV-16 v celicah 293TT v prisotnosti različnih notranjih in zunanjih dejavnikov. ..................................................................................................... 22 Slika 9: Infektivnost psevdovirusnih delcev HPV-16, ki so bili pripravljeni v prisotnosti različnih notranjih in zunanjih dejavnikov ......................................................................... 23 Slika 10: Izolacija DNA iz supernatantov celične kulture 293TT, ki smo jih dobili pri produkciji psevdovirusnih delcev HPV-16 ........................................................................ 24 Slika 11: Količina plazmida pGL3 v vzorcih supernatantov psevdovirusnih delcev HPV-16. ........................................................................................................................................ 25 Slika 12: Testiranje stabilnosti virusnega plašča pri psevdovirusnih delcih HPV-16 s tripsinom. Prvih pet vzorcev (*) ni bilo tretiranih (kontrola), medtem ko smo drugi set petih vzorcev (**) tri ure inkubirali s tripsinom ........................................................................... 26 Slika 13: Razmerje L1 : L2 pri psevdovirusnih delcih HPV-16 .......................................... 27

IX

SEZNAM OKRAJŠAV

A ….. amper APS ….. amonijev persulfat CaCl2 ….. kalcijev klorid CO2 ….. ogljikov dioksid C-terminal ….. karboksi terminal Da ….. dalton (1/12 mase atoma 12C) dH2O ….. destilirana voda ddH2O ….. deionizirana in destilirana voda DNA ….. deoksiribonukleinska kislina DMEM ….. Eaglovo gojišče, modificirano po Dulbeccu D-PBS ….. Dulbeccova fiziološka raztopina v fosfatnem pufru DTT ….. ditiotreitol EDTA ….. etilendiamin tetraacetat ECL ….. elektrokemoluminiscenca EtBr ….. etidijev bromid FBS ….. fetalni goveji serum FERM ….. 4.1 protein, ezrin, radixin, moesin IgG ….. imunoglobin G HBS ….. hepes pufer HPV ….. humani virus papiloma HRP ….. hrenova peroksidaza HSPG ….. hepran sulfat proteoglikan H2O ….. voda KCl ….. kalijev klorid KH2PO4 ….. kalijev dihidrogenfosfat L ….. liter LAR ….. reagent za luciferazni test (angl. luciferase assay reagent) LCR ….. nekodirajoča dolga regija LDL ….. lipoprotein z nizko gostoto (angl. low-density lipoprotein) M ….. molarna koncentracija MgCl2 ….. magnezijev klorid NaCl ….. natrijev klorid NaDS ….. natrijev dodecilsulfat Na2EDTA*2H2O ….. dinatrijev-EDTA dihidrat Na2HPO4 ….. dinatrijev hidrogensulfat NPs ….. nanodelci N-terminal ….. amino terminal Ori ….. mesto začetka podvojevanja PAGE ….. poliakrilamidna gelska elektroforeza PAH ….. policiklični aromatski ogljikovodiki PBS ….. fiziološka raztopina v fosfatnem pufru PDVF ….. poliviniliden difluorid pH ….. (angl. potential of hidrogen) POD ….. promielocitne levkemijske onkogene domene pRB ….. beljakovina retinoblastoma

X

PsVs ….. psevdovirusni delci PX ….. proteinska domena phox RCF ….. relativna centrifugalna sila SDS ….. natrijev dodecilsulfat SNX ….. protein sorting nexin TAE ….. tris-acetat-EDTA pufer TE ….. tris-EDTA pufer Temed ….. N, N, N', N' – tertrametiletilendiamin TiO2 ….. titanov dioksid Tris ….. tris(hidroksimetil)aminometan UV žarki ….. ultravijolični žarki URR ….. (angl. upstream regulatory region) V ….. volt VLP ….. virusom podobni delci WT ….. divji tip °C ….. stopinja Celzija

1

1 UVOD

Virusi papiloma (PV) so razširjena skupina virusov, ki jih najdemo tako v sesalcih kot tudi v ptičih, plazilcih in drugih živalskih vrstah. Poznanih je več kot 150 tipov humanih virusov papiloma (HPV) in ti so eden najpogostejših vzrokov spolno prenosljivih bolezni. HPV se pogosto prenaša prek spolnega občevanja, manj pogosto se HPV prenaša z matere na dojenčka v obdobju rojstva (Valentino idr., 2015). Humane viruse papiloma lahko razdelimo na nizko- in visokorizične. Nizkorizični tipi HPV so redko povezani z neoplazijo ali rakom in tipično povzročajo neopazne okužbe ali benigne tvorbe. Te lahko v telesu vztrajajo več mesecev ali let in so na koncu odstranjene zaradi delovanja gostiteljevega imunskega sistema. Običajno gre za genitalne bradavice in proliferativne lezije. V primerjavi z nizkorizičnimi tipi HPV pa lahko visokorizični tipi HPV povzročajo različne vrste raka pri ljudeh, čeprav v večini primerov pride le do pojavljanja neopaznih oralnih ali genitalnih lezij. Najpogostejše oblike raka so rak materničnega vratu, različna rakava obolenja na genitalijah, pa tudi rak glave in vratu. Rak se pojavi po dolgotrajni okužbi s HPV, ki je imunski odziv ne prepozna in je ne odstrani (Doorbar idr., 2012). Večino primerov raka materničnega vratu povzročata HPV-16 in HPV-18, za katera so že razvili cepiva, ki so zelo učinkovita. Cepivo je izključno profilaktično in ne prepreči razvoja bolezni, če je okužba s HPV že vzpostavljena. Poročilo o HPV iz leta 2016 navaja, da letno na svetu za rakom materničnega vratu zboli več kot pol milijona žensk in več kot 250.000 naj bi jih zaradi bolezni umrlo (HPV information center, 2017). V Sloveniji se letno pojavi okoli 140 novih primerov obolenj za rakom materničnega vratu, okoli polovica obolelih pa umre. Pri moških pride do pojava raka analne odprtine, raka na penisu in raka na žrelu (HPV information center, 2017). Rak materničnega vratu je lahko ozdravljiv, če je odkrit dovolj zgodaj, za kar v Sloveniji skrbi preventivni program Zora, ki vključuje ženske med 20. in 64. letom (ZORA, 2017). HPV je izredno kužen, z inkubacijsko dobo med 3–4 tedni, pa do več mesecev ali let. Dolžina inkubacijske dobe je odvisna od količine virusa, ki jo oseba dobi (Doorbar idr., 2012), pa tudi od drugih dejavnikov, kamor štejemo dejavnike gostiteljskih celic, in zunanjih dejavnikov. Ti dejavniki lahko vplivajo tako na potek okužbe kot tudi na razvoj bolezni, ki so povezani z okužbo s HPV. Okužba se začne, ko virus okuži zarodne celice v bazalni plasti poškodovanega epitelija. S tem se začne izražanje virusnih genov, ki omogočajo primerno okolje v celicah, da potečeta virusni celični cikel in pomnoževanje virusne DNA. Rezultat virusnega celičnega cikla je zrel virus z vključenim virusnim genomom, ki se izloči iz zgornje plasti povrhnjice (Doorbar idr., 2012).

1.1 Namen in hipoteze diplomskega dela

Namen diplomskega dela je ugotoviti, kako izbrani notranji in zunanji dejavniki okolja vplivajo na osnovne lastnosti nastajanja virusnih delcev HPV. Kot notranji dejavnik smo izbrali gostiteljski protein SNX17, ki dokazano vpliva na potek okužbe s HPV, njegov vpliv na fazo nastajanja pa še ni bil raziskan. Kot zunanji dejavnik smo izbrali nanodelce TiO2, ki

2

so med drugim tudi sestavina krem za sončenje in tako neposredno prisotni na mestu okužbe HPV. Naša hipoteza je, da vezava plaščnega proteina L2 z gostiteljskim proteinom SNX17 vpliva na nastanek in stabilnost virusnih delcev HPV. Ker nanodelci pogosto spremenijo znotrajcelični vezikularni transport, katerega pomemben del so tudi proteini SNX, je naša hipoteza, da na podoben način kot protein SNX17, tudi nanodelci vplivajo na nastanek in stabilnost virusnih delcev HPV.

3

2 TEORETIČNE OSNOVE

2.1 Humani virusi papiloma

Humani virusi papiloma so relativno majhni, goli virusi brez virusne ovojnice, ki okužijo sluznični in kožni epitelij. Vsebujejo krožno dvoverižno DNA, genetski material virusa pa je obdan z dvoplastnim proteinskim plaščem. Plašč je sestavljena iz dveh vrst proteinov, njena simetrija pa je ikozaedrična. Vsak plašč je zgrajen iz 72 podenot virusnega plašča (kapsomer), sestavljenih iz malega in velikega plaščnega proteina. L1 ali veliki plaščni protein pomaga pri stabilizaciji plašča in ima povprečno molekulsko maso 54 kDa. L1 sestavlja 80–90 % vseh proteinov virusnega plašča. Mali plaščni protein ali L2 pa predstavlja ostali del beljakovinskega virusnega plašča z molekulsko maso okoli 75 kDa (Poljak idr., 2005; Fernandes idr., 2013). Genom HPV vsebuje približno 8000 baznih parov in je razdeljen na tri območja (Slika 1). Prvo območje je nekodirajoče območje URR (angl. upstream regulatory region), ki služi kot regulator transkripcije virusnih genov E6 in E7. URR služi tudi kot mesto ori, ki je mesto začetka podvojevanja virusnega genoma. Drugo območje je zgodnje območje E, ki ga sestavlja najmanj šest različnih genov (E1, E2, E4, E5, E6 in E7). Ti nosijo zapis za proteine, ki sodelujejo pri podvojevanju virusne DNA, uravnavanju prepisovanja virusnega genoma in transformaciji okuženih celic. Tretje območje je območje L ali pozno območje, ki vsebuje zapis za strukturne plaščne proteine (Poljak idr., 2005; Fernandes idr., 2013).

Slika 1: Organizacija genoma HPV-16 (Poljak idr., 2005)

4

2.2 Celični cikel HPV

Celični cikel HPV se začne z okužbo zarodnih celic v bazalni plasti epitelija. Da sploh pride do okužbe, je v večini primerov potrebna poškodba epitelija ali mikro rane, ki virusu omogočajo dostop do bazalne lamine, ki ločuje povrhnljico od usnjice. Ko se rana postopoma celi, je omogočeno razširjanje okuženih celic. Pot infekcije je lahko različna ter odvisna od tipa HPV in vrste okuženih celic (Doorbar idr., 2012).

Virusni plašč se pri okužbi veže na bazalno plast epitelijskih celic. Življenjski cikel HPV poteka ves čas med diferenciacijo kožnih celic keratinocitov vse do zgornjih plasti povrhnjice. Podvojevanje genoma HPV se zgodi že v jedru bazalne plasti celic. Število kopij proste neintegrirane virusne (episomalne) DNA je nizko in s tem je nizko tudi število virusnih proteinov. To pripomore k temu, da jih imunski sistem ne zazna in virus se v telesu lahko ohranja. Ohranjanje virusnega genoma v episomalni obliki je predpogoj za vzdrževanje virusnega cikla (Fernandes idr., 2013).

Ko virus vstopi v celico, pride najprej do izražanja genov E1, E2, E6 in E7. To pripomore k vzdrževanju virusnega genoma in povzroči celično razmnoževanje. S tem pa se poveča tudi število epitelijskih celic, okuženih s HPV. Podvojevanje HPV se začne, ko se elementi gostiteljske celice povežejo z območjem LCR virusne DNA in pride do transkripcije zgodnih genov (E6, E7). Geni E1 in E2 sodelujejo pri začetku podvojevanja DNA, E6 in E7 pa uravnavajo regulatorje celičnega cikla, da celice ohranjajo dolgoročno zmožnost celičnega razmnoževanja. Število kopij genov E1 in E2 mora biti nizko, ker protein E2 zavira izražanje genov E6 in E7. Nizko število genov E2 omogoči nekontrolirano nastajanje virusnih proteinov E6 in E7, ki povzročijo razgradnjo tumor-supresorskih proteinov p53 in pRB (retinoblastni protein). Podvojevanje virusne DNA je koordinirano s podvojevanjem kromosomov gostiteljske celice. Virusni genomi se z delitvijo okuženih bazalnih celic prenesejo v hčerinske celice. V diferenciranih keratinocitih zgornjih plasti epitelija se poveča število kopij DNA, sintetizirajo se plaščni proteini in prične se sestavljanje virusnih delcev (Poljak idr., 2005; Fernandes idr., 2013). Diferenciacija okuženih celic se začne z aktivacijo ustreznega celičnega promotorja, ko le-te zapustijo bazalno plast. Aktivira se tudi izražanje virusnega gena E4, katerega produkti vplivajo na ojačenje podvojevanja virusnega genoma. S tem se poveča število kopij virusa na celic z nekaj sto na več tisoč. Povečano izražanje virusnega proteina E2 zmanjša transkripcijo proteinov E6 in E7, kar se kaže v sprostitvi celičnih proteinov p53 in pRB, to pa omogoča normalne diferenciacijske procese gostiteljske celice. Začne se tudi izražanje genov L1 in L2. V granularni plasti se produkti poznih genov, mali (L2) in veliki (L1) plaščni protein, združijo v virusni plašč, ki vsebuje tudi virusno DNA. Nastane nov virus HPV, ki se sprosti iz poroženele plasti povrhnjice. Ko se celice luščijo, se virus izloči v okolje in omogočeno je njegovo razširjanje (Fernandes idr., 2013). Celični cikel HPV je strogo vezan na diferenciacijo gostiteljskih keratinocitov, medtem ko je sestavljanje virusnega plašča omejeno na dokončno diferencirane suprabazalne celice povrhnjice. Ko sta proteina L1 in L2 enkrat izražena, pride do sestavljanja plašča, tako da se proteini povežejo v ikozaedrični plašč s pomočjo proteinskih šaperonov. Pri vključevanju virusne nukleinske kisline v plašč sodelujeta proteina HPV L2 in E2. V poroženeli plasti povrhnjice se proteini E1, E2, E3 in E4 povežejo z omrežjem keratinskih

5

celic in s tem povzročijo njihov propad, na ta način pa je omogočena sprostitev zrelih virusov HPV iz celic (Conoway in Meyers, 2009).

Slika 2: Življenjski cikel virusa HPV v epiteliju (prirejeno po Doorbar idr., 2012). Slika prikazuje življenjski cikel HPV. Različne barve prikazujejo izražanje različnih virusnih proteinov tekom virusnega življenjskega cikla. V prvih fazah so tako pomembni proteini E1, E2, E4, E5, E6 in E7, v fazi sproščanja novih virusnih delcev pa pride do izražanja plaščnih proteinov L1 in L2.

2.3 Vpliv okoljskih dejavnikov na okužbo s HPV

Na okužbo s HPV oziroma na razvoj raka vplivajo tako genetski kot tudi okoljski dejavniki. Življenjske navade, kot so spolno življenje in kajenje, skupaj s onesnaževali v zraku povečujejo možnosti za razvoj raka na materničnem vratu pri ženskah. Med nevarne onesnaževalce v zraku spadajo predvsem emisije izpušnih plinov (trdni delci) in sestavljene komponente, kot so benzeni in policiklični aromatski ogljikovodiki (PAH). Te snovi negativno vplivajo na zdravje, nekateri med njimi so uvrščeni tudi kot rakotvorni (Scheurer idr., 2014). Scheurer idr. so v raziskavi dokazali, da nevarna onesnaževala v zraku vplivajo na povečan nastanek displazije materničnega vratu, ki je predhodnik raka na materničnem vratu. Enako velja tudi za cigaretni dim. Kajenje ali izpostavljenost cigaretnemu dimu povečuje možnost za razvoj raka na materničnem vratu (Scheurer idr., 2014). Možna povezava med kajenjem in HPV je ta, da kajenje poveča celično razmnoževanje in s tem poveča tudi podvojevanje HPV ter nastanek virusnih delcev. Druga možnost pa je, da kajenje oslabi celični imunski odziv, kar prav tako vodi do povečanega števila virusov HPV (Xi idr., 2009).

6

2.4 Cepiva za viruse HPV

Virus HPV z gostiteljem doseže ravnovesno stanje, tako da gostitelj ni resno poškodovan zaradi okužbe, virus pa se je še vedno sposoben podvojevati in razširjati, saj je imunski odgovor običajno počasen in slabo učinkovit. Cepiva HPV delujejo tako, da telo spodbudijo k proizvajanju protiteles, ki se ob naslednjem stiku z virusi HPV vežejo na virus in s tem preprečijo okužbo celic. Trenutna cepiva temeljijo na virusu podobnih delcih (angl. virus like particles – VLPs). Te pripravijo tako, da protein L1 izrazijo v kvasovkah ali v žuželčjih celičnih kulturah. Tako nastali proteini L1 se spontano povežejo v delce VLP. Ti niso infektivni, ker ne vsebujejo virusne DNA, vendar pa so zelo podobni naravnemu virusu. Cepiva HPV so pomembna, ker spodbudijo nastanek velikega števila protiteles, ki poleg delcev VLP prepoznavajo tudi naravne viruse izbranega tipa (Mariani in Venuti, 2010). Trenutno so razvita tri cepiva in vsa temeljijo na L1 VLP (Gardasil, Gardasil9 in Cervarix). Cervarix je bivalentno cepivo (HPV-16 in 18), Gardasil je kvadrivalentno cepivo (HPV 6, 11, 16 in 18) in Gardasil9 je nonavalentno cepivo (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 in 58). Cervaxil je namenjen le ženskam, ostala dva pa sta tudi za moške. Ocenjeno je, da naj bi cepiva preprečila 70 % raka materničnega vratu, 80 % analnega raka, 60 % vaginalnega raka, 40 % raka vulve ter nekatere oblike raka glave in vratu. Cepljenje proti HPV se izvaja v dveh ali treh odmerkih, odvisno od starosti in stanja imunskega sistema. Za ženske je cepljenje priporočljivo med 9. in 25. letom starosti, za moške pa med 9. in 26. letom (Harper in DeMars, 2017). Poudariti je treba, da cepljenje s trenutnimi cepivi ne zdravi že obstoječih okužb HPV, prav tako pa ne vpliva na morebitne okužbe z drugimi nizko- in visokorizičnimi tipi HPV, ki v cepivu niso zajeti.

2.5 Plaščni proteini HPV

Osnovna struktura HPV je gol ikozaedričen plašč. Vsak virusni delec je sestavljen iz 360 molekul proteina L1 in največ 72 molekul proteina L2 (razmerje med L1 in L2 je najmanj 5 : 1). Protein L2 ima vezavno mesto za L1 na C-terminalnem delu. Vezava L1 na L2 je omogočena prek hidrofobnih interakcij. To področje je bogato s prolinom, ki omogoča ostro upogibanje proteina in olajšano vezavo obeh proteinov (Fahey idr., 2009). Veliki plaščni protein L1 je protein velikosti 55 kD, ki ima sposobnost, da se spontano sestavi v virusom podobne delce (angl. virus-like particles; VLP). L1 predstavlja celotno zunanjo površino stabiliziranih zrelih virusnih delcev in omogoča začetno povezavo na tkivo oziroma celice gostitelja. Po vezavi na celice se L1 prostorsko spremeni, da omogoči izpostavitev proteina L2 in prehod virusa v ciljno celico (Buck idr., 2013). Zunanja površina virusnega delca je zelo vozljata (slika 3). Sestavljena je iz 72 pentamerov proteina L1. C- in N-terminalni deli L1 so postavljeni kot podaljšane roke, ki povezujejo kapsomerne vozlje. Vsaka roka C-terminalnega dela L1 se ovije okoli kapsomere in tvori disulfidna vez s C-terminalnim delom L1 sosednje kapsomere, kar je ključno za stabilnost virusnega delca (Buck idr., 2013).

7

Slika 3: Rekonstrukcija HPV-16 psevdoviriona (Buck idr., 2013). Začetna interakcija virusnega plašča z gostiteljem je omogočena z vezavo virusnega proteina L1 s heparan sulfat proteoglikani (HSPG) na gostiteljskih celicah, ki je bistvenega pomena za uspešno okužbo in vivo (Giroglou idr., 2001). Interakcija s HSPG vodi do konformacijske spremembe plašča. Ob vezavi se sprosti N-terminalni del proteina L2, ki ga delno odcepi encim furin. Cepitev je pomembna za okužbo in naj bi omogočala proteinu L2 izvajanje ostalih procesov tekom okužbe (Day idr., 2008). Sledi vezava virusnega plašča na sekundarni receptor na celični površini keratocitov, ki pa še ni natančno poznana (Buck idr., 2013). Prvi del okužbe HPV je v večini odvisen od plaščnega proteina L1, pri kasnejših korakih pa se njegov prispevek bistveno zmanjša. V primerjavi z L1 so funkcije malega plačnega proteina L2, ki je skrit v notranjosti plašča, manj definirane. Dokazano je bilo, da L2 sodeluje z virusnim genomom in je ključni protein pri vključevanju virusne DNA v plašč. Poleg tega ima L2 zelo pomembno vlogo pri virusni okužbi, tako na površini celice kot tudi pri znotrajceličnem transportu virusne DNA do jedra okužene celice (Fahey idr., 2009; Wang in Roden, 2013). Da pride do uspešne okužbe, morajo virusni delci preiti celično membrano, vstopiti v gostiteljsko celico in prenesti virusni genom v jedro. Virusi HPV vstopajo v celico z različnimi načini endocitoze in potujejo prek zgodnjega do poznega endosoma. Postopno zniževanje pH povzroči denaturacijo virusnega plašča (Day in Schelhaas, 2014). Protein L1 potuje v lizosom in se tam razgradi. Protein L2 in virusna DNA pa potujeta prek Golgijevega aparata do jedra (Day idr., 2013). V transportu virusnih komponent sodelujejo številni proteini, vključeni v endocitotski transport snovi, kot so na primer proteini retromernega kompleksa (Lipovsky idr., 2013) in proteini SNX (angl. sorting nexins) (Bergant Marušič idr., 2013; Pim idr., 2015).

8

Vstop v jedro se zgodi med procesom celične delitve – mitozo – in je povezan z razgradnjo jedrne ovojnice. Skupaj v virusno DNA v jedro vstopi tudi L2. Virusna DNA se akumulira na mestih POD (angl. PML oncogenic domains), kjer se začne prepisovanje virusnih genov (Day idr., 2004). Potek primarne okužbe virusov HPV je prikazan na Sliki 4.

Slika 4: Prikaz primarne okužbe virusov HPV (Day in Schelhaas, 2014). Slika prikazuje vezavo virusov HPV na zunajcelične receptorje in znotrajcelični transport virusnih komponent do jedra gostiteljske celice. Običajni celični cikel virusov HPV je odvisen od končne diferenciacije celic epitelija, zato je težko dobiti zadostne količine virusnih delcev HPV za eksperimente in vitro. V ta namen so Buck idr. (2005) razvili postopek produkcije virusnih delcev HPV v enoslojni kulturi celic 293TT. Ugotovili so namreč, da že sam protein L1 lahko tvori virusom podobne delce z 72-pentamerno ikozaedrično strukturo (VLP). Če sta izražena oba proteina, tako L1 kot tudi L2, pride do nastanka L1L2 VLP. VLP, ki vsebujejo oba proteina, so morfološko gledano enaki naravnim virusnim delcem HPV. Kadar v takšne virusne delce vključimo reportersko DNA, govorimo o psevdovirusih (PsVs). PsVs so po sestavi in po zgradbi zelo podobni pravim virusom, namesto virusnega genoma pa imajo vključeno plazmidno DNA z izbranim reporterskim genom za ugotavljanje okužbe, ki je običajno gen za luciferazo (Buck idr., 2005).

2.6 Protein Sorting Nexin 17 (SNX17)

Proteini SNX (angl. sorting nexins) so družina proteinov, ki sodelujejo pri znotrajceličnem transportu proteinov. Proteine SNX zaznamuje prisotnost homologne domene phox (PX), ki se veže na fosfatidilinozitol fosfat. Ta domena naj bi igrala pomembno vlogo pri usmerjanju proteinov do specializiranih membranskih domen, obogatenih s specifičnimi

9

fosfolipidi. Družina SNX zajema številne membranske in citoplazmatske proteine, ki so vključeni v endocitozo, endosomski znotrajcelični transport in endosomsko signaliziranje (Cullen, 2008). Protein SNX17 ima poleg PX domene še domeno FERM (angl. protein four. 1, ezrin, radixin, moesin). Nahaja se v zgodnjih endosomih in tubulih za recikliranje ter je primarno vključen v endosomsko recikliranje transmembranskih receptorjev, kot so receptorji LDL in integrini β1 (Stockinger idr., 2002; Böttcher idr., 2012). SNX17 je izrednega pomena za okužbo z virusom HPV-16, saj se močno veže s proteinom L2, ne pa tudi s proteinom L1. V primeru zmanjšane ali onemogočene interakcije s SNX17 virusi HPV hitro preidejo v lizosome in se tam razgradijo, kar bistveno zmanjša stopnjo okužbe s HPV (Bergant Marušič idr., 2012). SNX17 je vključen v zgodnje stopnje endosomskega transporta HPV-16. Interakcija med L2 in SNX17 omogoči zadrževanje virusnih delcev HPV v poznem endosomu, razprtje virusnega plašča in izstop kompleksa L2-virusna DNA iz endosomov (Bergant Marušič idr., 2017). Povezava proteina HPV-16 L2 in SNX17 je ključnega pomena pri vstopu virusne DNA v samo jedro celice. Poleg tega lahko ta povezava neposredno prispeva k stabilizaciji proteina L2 v sklopu virusnega plašča (Bergant Marušič idr., 2012). Proteini SNX, med katere sodi SNX17, so tudi del endocitotske poti, prek katere onesnaževala in druge snovi iz okolja vstopajo v organizem. Na ta način verjetno vstopajo tudi nanodelci TiO2. Vstop onesnaževal v organizem povzroči različne fiziološke spremembe celic, kar med drugim vodi do vnetnih odzivov. Avio idr. (2015) so tako ugotovili, da mikroplastika z vezanimi onesnaževali povzroči povečano izražanje proteinov, ki so vključeni v zorenje endosomov, endocitotski transport snovi in v lizosomsko razgradnjo. Med drugim so ugotovili tudi povečano izražanje proteinov SNX. Prav tako lahko onesnaževala spremenijo tudi signalne poti, v katerih sodelujejo proteini SNX, kar so dokazali Berg idr.(2011) na primeru polikloriranih bifenilov (PCB). Tucci idr. (2013) so nanodelce TiO2 opazili v fagosomih izpostavljenih keratinocitov, kjer najdemo tudi proteine SNX, medtem ko jih v drugih organelih ni bilo. Zgornje raziskave kažejo, da onesnaževala vplivajo na endocitotske procese, v katere so vključeni proteini SNX. To pa bi posledično lahko vplivalo tudi na potek okužbe HPV.

2.7 Nanodelci titanovega dioksida (TiO2NP)

Nanodelci so delci, ki merijo med 0,1 in 100 nm. V primerjavi z volumnom imajo zelo veliko površino. To jim omogoča veliko reaktivnost, zaradi česar se v industriji pogosto uporabljajo kot katalisti. Obstajajo v okroglih, cevastih in nepravilnih oblikah, najdemo pa jih kot aerosole, suspenzijo ali kot emulzijo. Delimo jih lahko na naravne in antopogene nanodelce. Po kemijski sestavi jih lahko delimo na ogljikove in anorganske. Tiste nanodelce, ki vsebujejo ogljik, lahko razdelimo na biogene, geogene, atmosferske in pirogene. Antropogeni nanodelci so pogosto stranski proizvod gorenja ali pa so proizvedeni namensko zaradi njihovih posebnih lastnosti. Primer antropogenih nanodelcev so tudi nanodelci titanovega dioksida (TiO2) (Nowack, 2007). Nanodelci TiO2 (TiO2 NP) se zaradi svojih katalitičnih sposobnosti uporabljajo v raznolikih farmacevtskih in kozmetičnih izdelkih, prav tako so pogosta sestavina zidnih barv za beljenje (Oh idr., 2010). TiO2 se pojavlja kot bel prah, njegova pogosta uporaba v kozmetični industriji pa je posledica njegove lastnosti, da ne obarva kože po nanosu

10

(Crosera idr., 2015). Uporablja se tudi v sončnih kremah kot zaščita pred ultravijoličnimi žarki (UV-žarki). Nanodelci TiO2 vsebujejo inertne delce, ki odbijejo in razpršijo ultravijolično sevanje ter na ta način ščitijo pred nevarnim sončnim sevanjem. Prav tako naj bi bili fotostabilni, kar pomeni manjšo možnost draženja kožne (Lin idr., 2011). TiO2 NP, ki se pojavljajo v kozmetičnih izdelkih, lahko prodirajo skozi rožene plasti v spodnje plasti kože prek medceličnih kanalov, lasnih mešičkov in znojnic. V primeru, da koža ni poškodovana, se nanodelci TiO2 zadržijo na kožni površini ali impregnirajo samo prve rožene plati. S poškodbo poroženele plasti pa se poveča možnost prenosa nanodelcev v globje plasti kože (Crosera idr., 2015). Uporaba TiO2 NP v kozmetičnih izdelkih ni povsem brez stranskih učinkov. Tucci idr. (2013) so v raziskavi ugotovili, da imajo nanodelci TiO2 toksične učinke v različnih celicah. Ugotovili so povečano celično smrt, nastanek vnetnih citokinov in nastanek vnetja ter kisikovih radikalov. Kisikovi radikali nastanejo zaradi delovanja TiO2 NP na celično dihanje v mitohondriju. Vnetje in kisikovi radikali lahko vodijo tudi do fizioloških in genotoksičnih sprememb tkiv, kar poveča možnost mutageneze in nastanka neoplazij. Vnetne reakcije so odvisne od mase delcev, števila in velikosti, aglomeracije in površine. Kažejo se kot direktni celični odzivi ali kot lizosomalne poškodbe. Makrofagi so tiste fagocitne celice, ki igrajo pomembno vlogo pri nastanku vnetnega imunskega odziva. Raziskave so pokazale, da nanodelci TiO2 ne prodirajo v globlje plasti kože (povrhnjica), zaradi česar ne pride do vnetnih reakcij, pri katerih sodelujejo makrofagi (Xu idr., 2011; Zhang idr., 2012). Drugače pa je pri inhaliranih nanodelcih, ki lahko povzročijo vnetje v pljučih. Imunski odziv alveolarnih makrofagov se z izpostavljenostjo TiO2 nanodelcem zmanjša, pride tudi do poškodb celične strukture in poslabšanja delovanja mitohondrijev (Liu idr., 2010; Shi idr., 2013).

11

3 EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 Laboratorijska oprema

3.1.1 Aparature

Tehtnica znamke Kern 440-45N, Slovenija,

laminarij znamke Thermo Scientific Forma 1400 Series, Thermo Fisher Scientific, ZDA,

celični inkubator znamke Hera cell 150, Thermo Fischer Scientific, ZDA,

zamrzovalna skrinja do temperature zamrzovanja –20 °C, Gorenje, Slovenija,

zamrzovalna skrinja do temperature zamrzovanja –80 °C, Thermo elecron

corporation, ZDA,

hladilnik do temperature hlajenja +4 °C, Gorenje Körting, Slovenija,

avtomatske pipete (10–1000 μL, 10–100 μL, 3–30 μL, 0,3–3 μL),

pipetor za serološke pipete (1–100 mL),

Neubauerjeva števna komora za štetje celic, PAA, Nemčija,

centrifuga znamke 5415 R, Eppendorf, Nemčija,

centrifuga znamke AllegraTM X-22R, Beckman Coulter, ZDA,

sistem za gelsko elektroforezo SDS-PAGE, PowerPacTM basic, Bio Rad, ZDA,

sistem za DNA gelsko elektroforezo PowerPacTM 300, Bio Rad, ZDA,

sistem za prenos znamke Western, PowerPacTM HC, Bio Rad, ZDA in SemiphorTM,

Hoefer, UK,

orbitalni stresalnik znamke Red Rotor, Hoefer, UK,

vortex znamke Maxi Mix II, Thermo Fischer Scientific, ZDA,

čitalec mikrotiterskih plošč znamke Victor X2, serija 2030, Perkin Elmer in

programska oprema WorkStation 2030, ZDA,

sistem za detekcijo kemiluminiscence Uvitec Alliance,

pribor za razvijanje kemiluminiscenčnih filmov Amersham Biosciences.

3.1.2 Steklovina in potrošni material

Pipetni nastavki (1–1000 μL),

gojilne posode za celične kulture (25 cm2, 75 cm2,

plošče za celične kulture s 24 luknjicami,

plošče za celične kulture z 12 luknjicami,

mikrotiterske plošče s 96 luknjicami,

plastične serološke pipete (2 mL, 5 mL, 10 mL),

sterilne steklene pipete,

sterilne centrifugirke (15 in 50 mL),

sterilne mikrocentrifugirke (1,5 mL, epice),

nitrocelulozna membrana Thermo Scientific,

12

kemiluminiscenčni film HiperfilmTM MP, GE Healthcare Life Sciences,

čaše,

merilni valji.

3.1.3 Kemikalije in raztopine

Rastno gojišče DMEM (DMEM + 10 % fetalnega govejega seruma (FBS) + 1 % L-

glutamina + 100 μg/mL penicilin + 100 μg/mL streptomicin), Lonza,

rastno gojišče DMEM/F12 (DMEM/F12 + 10 % fetalnega govejega seruma (FBS) +

100 μg/mL penicilin + 100 μg/mL streptomicin), Lonza,

fosfatni pufer s soljo (DPBS), Gibco,

0,25 % tripsina/EDTA, Lonza,

pufer 2 x HBS, pH 7,12,

2,5 M CaCl2,

pufer TE,

nanodelci TiO2 (Degussa, P25),

reporterski plazmid pGL3 z genom za luciferazo,

plazmid pXULL (divji tip in z mutiranim plaščnim proteinom L2),

akrilamid/bis-akrilamid 37.5:1 (40-odstotna raztopina), Fisher, BioReagents,

temed, AppliChem, Nemčija,

pufer SDS, 10-odstotni,

pufer APS, 10-odstotni

pufer za pripravo koncentracijskega gela PAGE: 1 M Tris (pH 6,8),

pufer za pripravo ločevalnega gela PAGE: 1,5 M Tris (pH 8,8),

pufer TAE,

lizacijski pufer,

etidijev bromid, 0,07-odstotni Applichem, Nemčija,

DN- lestvica Quick-load 1 kb, BioLabs,

proteinska lestvica GeneRulerTM 1kb, Fermentas,

agaroza, Fermentas,

pufer za prenos Western (prenašalni pufer),

metanol, Applichem, Nemčija,

pufer za blokiranje z mlekom,

mleko v prahu, Pomurske mlekarne,

pufer za spiranje,

PBS v prahu, ChemCruz,

lizacijski reagent, Cell Culture Lysis 5x Reagent,

eksonukleaza, BioLabs,

benzonaza nukleaza, Novagen,

barvilo Coomassie Brilliant Blue R-250, AppliChem,

raztopina za razbarvanje,

detergent Tween-20, Chem Cruz,

13

barvilo Ponceau S, AppliChem,

razvijalna raztopina, Kodak,

fiksirna raztopina, Kodak,

mišje monoklonsko primarno protitelo HPV-16 L1, Camvir,

mišje nekomercialno primarno protitelo HPV-18 L2, Martin Muller, German Cancer

Research Center, Heidelberg, Nemčija,

antimišje sekundarno protitelo IgG,

razstopine za kemiluminiscenco ECL, HRP Chemoilumiescent Substrate reagent

kit, Novax,

kit za detekcijo luciferaze, Luciferase Assay System, Promega.

Sestava pufrov je podana v Prilogi A.

3.1.4 Celični liniji

293TT je trajna celična linija, pridobljena iz ledvičnega epitelija humanega zarodka, transformirana z DNK adenovirusa tipa 5. Integracija dveh kopij virusnega proteina Large T omogoča celicam nastanek velikega števila rekombintnih proteinov (Buck in sod., 2005). HaCat je spontano preoblikovana nesmrtna keratinocitna celična linija, izolirana iz kože odraslega človeka. Pogosto se uporablja za raziskave diferenciacije kožnih celic (Wilson, 2014) in kot modelni sistem za študij okužb HPV (Day in Schelhaas, 2014).

3.2 Priprava in tretiranje celic

3.2.1 Gojenje in presajanje celic

Za gojenje celic smo uporabili ploske gojilne posode (25 cm2) za celične kulture, ki smo jih hranili v inkubatorju pri 37 °C, 5-odstotni nasičenosti s CO2 in 100-odstotni vlagi. Ko so celice dosegle od 70- do 90-odstotno konfluentnost (največjo gostoto), smo jih tripsinizirali in presadili v novo posodo. Za celično linijo 293TT smo uporabili rastno gojišče DMEM, za celično linijo HaCaT pa rastno gojišče DMEM/F-12. Postopek presajanja celične linije 293TT in HaCaT: S stekleno pipeto smo odstranili gojišče in celice sprali s 5 mL DPBS, ki smo ga nato odstranili. Dodali smo 1 mL 0,25-odstotnega tripsina/EDTA. Gojilno posodo s tripsinom smo postavili v inkubator za 2–10 minut na 37 °C. Tripsin smo nevtralizirali s 5–6 mL rastnega gojišča. Vzorec celic smo prenesli na števno komoro in jih pod mikroskopom prešteli. Približno 10 % celic smo prenesli v novo gojilno posodo. Skupni volumen gojišča in celic je znašal 6 mL. Celice smo šteli s pomočjo Neubauerjeve komore za štetje celic. Celice smo šteli pod 100-kratno povečavo v 4 kvadrantih s 16 kvadratki. Po specifikacijah števne komore smo končno število celic delili s številom preštetih kvadrantov in množili z 104. Na ta način smo dobili število celic v 1 mL gojišča (Celeromics, 2017).

14

3.3 Pridobivanje PsVs

Za pridobivanje psevdovirusov smo uporabili celice 293TT. Metoda pridobivanja je predstavljena na Sliki 5.

Slika 5: Metoda pridobivanja HPV psevdovirionov (Prirejeno po protokolu Ozbun in Campos, Smith idr., 2007 )

3.3.1 Transfekcija

Dan pred transfekcijo smo v 10-cm petrijevke za celične kulture nasadili 1,2 x 106 celic. Za vsako produkcijo PsVs HPV-16 smo pripravili 6 petrijevk. Za postopek transfekcije smo potrebovali dva niza mikrocentrifugirk. V prvi niz mikrocentrifugirk smo dali 25 μL 2,5 M CaCl2 + 160 μL pufra TE (pH 8) + 18 μL mešanice plazmidne DNK. Mešanico smo po kapljicah dodajali v drugi niz mikrocentrifugirk, ki je vseboval 200 μL 2 x HBS (pH 7,12). Mešanica plazmidne DNK je bila sestavljena iz 12 μL reporterskega plazmida pGL3, ki je vseboval gen za luciferazo, ter iz 6 μL plazmida pXULL, ki je vseboval zapis za plaščna proteina HPV-16 L1 in L2. V štiri petrijevke smo celicam dodali plazmid pXULL divjega tipa (WT), v eno petrijevko pa smo dodali plazmid pXULL z mutiranim plaščnim proteinom L2

15

(SNX17-mutant AA). Zadnja petrijevka ni bila transficirana z DNA za virusne plaščne proteine in je služila kot kontrola. Po 20-minutni inkubaciji na sobni temperaturi smo mešanico po kapljicah dodali celicam, ki smo jih nato gojili v inkubatorju 48 ur. 4–6 ur po transfekciji smo trem vzorcem, ki so vsebovali divji tip plazmida pXULL, dodali nanodelce TiO2 (Degussa p25), in sicer v koncentraciji 5 μg/mL, 15 μg/mL ali 30 μg/mL.

3.3.2 Izolacija psevdovirusnih delcev

Po 48 urah smo iz petrijevk pobrali gojišče skupaj s suspendiranimi celicami in ga prenesli v 50 ml centrifugirke. Petrijevke smo sprali s PBS, ki smo ga nato posrkali s stekleno pipeto. Dodali smo 1 mL tripsina in petrijevke postavili v inkubator na 37 °C, da so se preostale celice odlepile od podlage. Po nekaj minutah smo dodali 3 mL gojišča za nevtralizacijo tripsina, vso tekočino pa prenesli v centrifugirke. Na koncu smo petrijevke sprali še z 1 mL gojišča, ki smo ga prav tako prenesli v centrifugirke. Centrifugirke smo centrifugirali 5 minut pri 200 rcf (relativna centrifugalna sila) in 15 °C ter še dodatno 8 minut pri 400 rcf. Supernatant smo posrkali s stekleno pipeto, nato pa smo usedlino resuspendirali v 1 mL PBS in vse skupaj prenesli v mikrocentrifugirke. Celično suspenzijo smo centrifugirali 6 minut pri 4800 rcf. PBS smo spet posrkali in potem celicam dodali 9,5 mM MgCl2 + PBS v enakem volumnu, kot je bil volumen celičnege usedline (približno 20 μL). V vsako mikrocentrifugirko smo dodali še 1/20 10-odstotnega Tritona 100/PBS (končno 0,5 %; 2 μL), 0,3 % encima benzonaze (0,2 μL) in 2 U/100 μL encima endonukleaze V (0,2 μL). Na ta način smo razbili celične membrane in razgradili celično DNK ter omogočili učinkovito ekstrakcijo PsVs. Vzorce smo nato za 24 ur inkubirali na 37 °C (maturacija psevdovirusnih plaščev). Po maturaciji smo v vzorce stabilizirali, tako da smo jim dodali 0,17 volumna PBS + 5M NaCl (6,8 μL) in jih shranili v skrinji na –80 °C.

3.4 Določanje uspešnosti produkcije psevdovirusnih delcev HPV-16

3.4.1 Priprava vzorcev PsVs

Celične ekstrakte PsVs smo odmrznili, jih ponovno na hitro zamrznili in še enkrat odmrznili. Na ta način smo omogočili nastanek kristalov, popolno razbitje celic in boljšo ekstrakcijo PsVs. V vsako mikrocentrifugirko smo dodali 50 μL pufra HBS in centrifugirali 10 minut pri 4000 rcf. Supernatant smo prenesli v nove centrifugirke. Iz vsakega vzorca smo vzeli 30 μL vzorca za določanje uspešnosti produkcije, preostanek vzorcev pa smo ponovno zamrznili na –80 °C. Uspešnost posamezne produkcije PsVs smo ugotavljali z eletroforezo SDS-PAGE in barvanjem proteinov z barvilom Coomassie Brilliant Blue. Vzorcem za analizo na gelu SDS-PAGE smo dodali 6 μL 6 x nanašalnega pufra in jih za 3 minute postavili na 90 °C, da so se proteini denaturirali in povezali s SDS.

16

3.4.2 Potek elektroforeze SDS-PAGE

Za potrebe elektroforeze smo pripravili elektroforezni gel, ki je bil sestavljen iz zbiralnega in ločevalnega akrilamidnega gela z različno zamreženostjo. Sestava obeh gelov je prikazana v Tabeli 1.

Tabela 1: Sestava ločevalnega in zbiralnega gela proteinske gelske elektroforeze SDS-

PAGE.

Ločevalni gel – 10 mL Zbiralni gel – 2 mL

H2O 4,824 mL 1,444 mL

40-odstotni akrilamid 2,475 mL 0,254 mL

1,5 M Tris pH 8,8 2,5 mL

1 M Tris pH 6,8 0,26 mL

10-odstotni SDS 0,1 mL 0,02 mL

10-odstotni APS 0,1 mL 0,02 mL

Temed 0,006 mL 0,002 mL

Med dve stekleni plošči z vmesnikom smo vlili ločevalno akrilamidno raztopino za ločevalni gel. Ko se je ta strdila, smo vlili še akrilamidno raztopino za zbiralni gel, v katero smo vstavili glavniček. Nastali žepki so služili nanosu vzorcev. V elektroforetsko banjico smo nalili elektroforetski pufer SDS-PAGE, da je bil gel popolnoma prekrit. V prvi žepek smo nanesli 5 μL velikostnega proteinskega standarda (Precision Plus Protein All Blue Prestained Standard), ki nam je omogočal, da smo določili velikosti proteinov v naših vzorcih. V preostale jamice smo razporedili naše vzorce, katerih končni volumen je bil 36 μL. Posodo z gelom in vzorci smo pokrili s pokrovom ter jo priključili na konstantno napetost 100 V. Proces je tekel 2 uri. Potem smo gel en dan barvali v barvilu Coomassie Brilliant Blue. Gel smo nato razbarvali, da smo lahko videli ločitev proteinov v vzorcih. Gele smo slikali z aparaturo za slikanje gelov znamke Uvitec Alliance.

3.4.3 Imunodetekcija proteinov L1 in L2

3.4.3.1 Prenos Western

Prisotnost plaščnih proteinov HPV-16 L1 in L2 v izolatih PsVs ter njuno razmerje smo določali z uporabo specifičnih protiteles. Vzorce izolatov (4 μL) smo najprej ločili z elektroforezo SDS-PAGE (Poglavje 1.3.3.2). Po elektroforezi smo izvedli še prenos Western, kjer smo proteine iz gela prenesli na nitrocelulozno membrano PDVF. Membrano smo izrezali tako, da je prekrila gel, in jo skupaj z več plastmi filter papirja dobro namočili v prenašalni pufer (Priloga A). Posamezne komponente za prenos smo zložili v naslednjem vrstnem redu: pozitivna elektroda – filter papir – membrana – gel – filter papir – negativna elektroda. Proteini z vezanim SDS so bili negativno nabiti in so potovali proti pozitivnemu polu oziroma na membrano.

17

Uporabili smo sistem za polsuhi prenos proteinov. Postopek je potekal 90 minut pri konstantnem toku 3 mA/cm2 akrilamidnega gela. Po tem času smo membrano odstranili in jo obarvali z barvilom Ponceau S rdeče, da smo videli uspešnost prenosa proteinov na membrano. Membrano smo nato razrezali na dva dela, in sicer približno pri velikosti 65 kDa, da smo ločili proteina L1 (53 kDa) in L2 (75 kDa). Membrani smo potem sprali z vodo, da smo odstranili barvilo Ponceau S rdeče, in ju čez noč inkubirali v 100 mL 5-odstotnega posnetega nemastnega mleka v PBS, da smo blokirali nespecifična vezavna mesta. Naslednji dan smo membrani iz pufra za blokiranje prestavili vsako v svojo posodo in dodali mišja primarna protitelesa. Za L1 smo uporabili protitelo HPV-16 L1 (Camvir), ki smo ga redčili v razmerju 1 : 3000 s 5-odstotnim posnetim mlekom v PBS/0,5 % Tween 20, za L2 pa smo uporabili nekomercialno protitelo HPV-18 L2 (M. Mueller, GCRC), ki navzkrižno reagira tudi s proteinom HPV-16 L2. Posodici smo nato za 90 minut postavili na stresalnik. Membrani smo nato spirali trikrat po 10 minut z 0,5-odstotno raztopino detergenta Tween 20 v PBS (0,5 % Tween/PBS). Po spiranju smo dodali sekundarno protitelo, ki se je vezalo na primarno protitelo. Kot sekundarno protitelo smo uporabili protitelo s protimišjim IgG z vezanim encimom hrenove peroksidaze (HRP) v razmerju 1 : 1000. Membrani s sekundarnimi protitelesi smo inkubirali na stresalniku eno uro, nato smo ju spirali štirikrat po 15 minut z 0,5-odstotno raztopino Tween/PBS. Po izpiranju smo membrani položili na stiroporno ploščo in ju za eno minuto namočili v substrat za encim HRP (ECL, Chemiluminescent Substrat Reagent Kit), ki smo ga pripravili z mešanjem reagentov A in B v razmerju 1 : 1. Tekočino smo po eni minuti popivnali s filter papirjem in nastalo kemiluminiscenco analizirali z aparaturo Uvitec Alliance. Na mestih, kjer sta se vezali primarno in sekundarno protitelo, smo dobili signal proteinov L1 in L2.

3.5 Test infektivnosti

Za test infektivnosti smo uporabili celice HaCaT, ki smo jih nasadili v celične plošče s 24 luknjicami. V posamezno luknjico smo dali 25000 celic v 200 μL gojišča. Ploščo smo nato inkubirali 48 ur v inkubatorju na 37 °C. Po dveh dneh smo v luknjice dodali vzorce naših PsVs izolatov, ki so vsebovali reporterski gen za luciferazo, in sicer po 4 μL vzorca, vsak vzorec pa smo testirali v dveh paralelkah. Ploščo smo nato ponovno za dva dneva postavili v inkubator na 37 °C. Po dveh dneh smo odstranili gojišče s stekleno pipeto in celice sprali z enako količino PBS, ki smo ga ponovno odstranili. V vsak vzorec smo dali 30 μL lizacijskega reagenta (Cell Culture Lysis 5x Reagent), ki smo ga redčili z vodo v razmerju 1 : 5. Ploščo smo stresali 10 minut na stresalniku, potem pa še centrifugirali 6 minut pri sobni temperaturi in 800 rcf. 10 μL supernatanta vsakega vzorca smo odstranili in ga prenesli v mikrotitrsko ploščo s 96 luknjicami za merjenje luminiscenčnega signala. V vsak vzorec smo dodali 50 μL substrata za luciferazo (Luciferase Assay System) in s čitalcem Victor X2 2030 (PerkinElmer) izmerili nastalo bioluminiscenco.

18

3.6 Določanje stabilnosti psevdovirusnih plaščnih proteinov

Za določanje stabilnosti plaščnih proteinov smo izolate PsVs izpostavili razgradnji z encimom tripsinom in ugotavljali hitrost razgradnje plaščnih proteinov L1 in L2 ter nastanek razgradnih produktov. Manj kot je bilo razgradnih produktov, bolj je bil plašč stabilen. Za test stabilnosti smo uporabili po 13 μl izhodnih vzorcev PsVs (Poglavje 3.4.1), ki smo jim dodali 13 μL 0,05-odstotne raztopine tripsina v EDTA. Reakcijske mešanice smo tri ure inkubirali na 37 °C, potem smo jim dodali 6 μL nanašalnega pufra SDS-PAGE (6x). Vse vzorce smo nato za tri minute postavili na 90 °C in jih do analize shranili na –80 °C. Kontrolnim vzorcem smo nanašalni pufer SDS-PAGE (6x) dodali takoj po dodatku tripsina in jih po toplotni obdelavi shranili na –80 °C. Po razgradnji s tripsinom smo vzorce skupaj s kontrolnimi vzorci nanesli na gel za elektroforezo SDS-PAGE. Za detekcijo L1 smo porabili 1/5 količine vzorca, za L2 pa 4/5 vzorca, saj je tega proteina veliko manj. Pripravili smo dva elektroforezna gela SDS-PAGE z različno zamreženostjo. Za L1 smo pripravili 8-odstotni gel, za L2 pa 10-odstotni gel, da smo na ta način najbolj optimalno ločili oba proteina in njune razgradne produkte. Postopek priprave gelov je opisan v Poglavju 3.4.2. Sledila je imunska detekcija plaščnih proteinov L1 in L2 (Poglavje 3.4.3), s to razliko, da membran po prenosu Western nismo razrezali, saj smo za vsak protein pripravili svoj gel. Zaradi boljše občutljivosti smo v tem primeru za ugotavljanje prisotnosti plaščnih proteinov uporabili fotografske filme za detekcijo kemiluminiscence in reagente za fotografsko razvijanje filmov v temnici. Film smo različno dolgo izpostavili membrani z imunsko označenimi proteini in ga potem razvili in fiksirali v fotografskih raztopinah v temi. Na mestih, kjer sta se vezali primarno in sekundarno protitelo, smo dobili lise proteinov L1 in L2.

3.7 Analiza enkapsidirane DNA z gelsko elektroforezo

Količino enkapsidirane reporterske DNK smo določili tako, da smo DNK najprej izolirali iz vseh vzorcev PsVs HPV-16 in jo v drugem koraku analizirali na agaroznem gelu. Uporabili smo 20 μL posameznega vzorca PsVs, ki smo mu dodali 5 μL ekstrakcijske mešanice za izolacijo DNK (Priloga A). Po mešanju smo vzorce za 15 minut inkubirali pri 50 °C in jih nato analizirali na agaroznem gelu. Za analizo smo pripravili 0,8-odstotni agarozni gel. Uporabili smo 60 mL pufra 1x TAE (Priloga A) in 0,5 g agaroze. Slednjo smo s pomočjo mikrovalovne pečice segrevali, da se je stopila, in potem dodali dve kapljici raztopine etidijevega bromida (EtBr). EtBr se vriva med bazne pare in povzroči, da DNK fluorescira v oranžnem delu spektra. Vsebino smo premešali in počakali, da se je rahlo ohladila. Potem smo jo zlili v nosilec za elektroforezo in vstavili glavniček. Po 30 minutah smo glavniček odstranili in gel prenesli v elektroforetsko banjico, tako da je bil popolnoma prekrit s pufrom TAE. V nastale žepke smo dodali vzorce izolirane DNA, ki smo jim pred tem dodali 5 μL 6x nanašalnega pufra DNA (Priloga A). Kot kontrolni vzorec smo uporabili 100 ng čistega reporterskega plazmida pGL3. Za velikostno lestvico smo uporabili dva markerja, in sicer Quick load 1 kB DNA ladder (10 μL) ali Gene ruler (1 μL + 4 μL nanašalnega pufra).

19

Elektroforetsko banjico smo priključili na električno napetost 80 V za eno uro. Zaradi negativnega naboja je DNA potovala od negativne proti pozitivni elektrodi. Po poskusu smo gel analizirali s transiluminatorjem in ga slikali s pomočjo programa GeneSnap. Količino izolirane DNK smo analizirali s programom ImageJ.

3.8 Statistična analiza

Za statistično analizno smo uporabili programsko opremo GraphPad Prism 7.0. Rezultati so predstavljeni s stolpičastimi grafi, prikazana sta povprečna vrednost in standardni odklon (SD). Kadar smo primerjali dva vzorca, smo uporabili Studentov t-test, primerjavo večjega števila vzorcev pa smo analizirali s testom variance ANOVA. Eksperimente smo izvedli s tremi ali štirimi ponovitvami. Izjema je bila analiza enkapsidacije DNA, kjer smo opravili le en preliminarni poskus, saj smo za to analizo potrebovali veliko količino vzorca.

20

4 REZULTATI in DISKUSIJA

4.1 Produkcija psevdovirusov

V diplomskem delu smo preverjali, kako izbrani notranji in zunanji dejavniki vplivajo na produkcijo virusnih delcev HPV. V delu smo obravnavali gostiteljski protein SNX17 kot notranji dejavnik, saj je bilo ugotovljeno, da je njegova vezava s plaščnim proteinom L2 zelo pomembna pri okužbi s HPV (Bergant Marušič idr., 2012). Kot zunanji dejavnik smo izbrali nanostrukturirane delce TiO2, saj so ti pogosta sestavina krem za sončenje, ti pa prehajajo v zgornjo plast kože, kjer poteka nastajanje novih virusnih delcev HPV. Za pridobivanje psevdovirusov HPV-16 (PsVs) smo uporabili produkcijsko celično linijo 293TT, v katero smo s transfekcijo vnesli plazmid z obema plaščnima proteinoma L1 in L2. Hkrati smo vnesli tudi reporterski plazmid, ki je imel informacijo za encim luciferazo. Pri vsakem poskusu smo imeli 6 vzorcev, od katerih je bil eden kontrola brez vnesenih plazmidov za produkcijo PsVs. Štirje vzorci so vsebovali divji tip plaščnih proteinov HPV-16, ki smo jih 24 ur po transfekciji izpostavili trem različnim koncentracijam TiO2, oziroma pustili netretirane. Za zadnji vzorec smo uporabili plazmid z mutirano obliko proteina L2 (vzorec AA2), ki se ni sposoben vezati na gostiteljski protein SNX17. Z njim smo ugotavljali, kako nezmožnost vezave plaščnega protein L2 s proteinom SNX17 vpliva na nastanek in stabilnost nastalih virusnih delcev. 48 ur po transfekciji smo celice 293TT lizirali in jih inkubirali 24 ur pri 37 °C. Po zorenju smo PsVs v supernatantu odstranili in jih analizirali z elektroforezo SDS-PAGE. Gel smo pobarvali z barvilom Coomassie Brilliant Blue ali pa smo naredili prenos Western ter imunokemijsko določanje proteinov L1 in L2. S pomočjo obeh poskusov smo lahko kvantitativno določili absolutno količino plaščnega proteina L2 v lizatu posameznega vzorca in relativno vrednost glede na izhodno število produkcijskih celic. Količina proteina L2 nam je služila kot ocena o količini celotnih virusnih delcev. Količino PsVs smo določili glede na prisotnost manjšega plaščnega proteina HPV-16 L2. Po prenosu Western smo debelino lise L2 pri 75 kDa (Slika 6), ki v kontrolnem vzorcu ni bil prisoten, določili denzitometrično s pomočjo programa ImageJ.

Slika 6: Imunokemijsko določanje plaščnega proteina L2 pri produkciji psevdovirusnih delcev HPV-16. Slika je reprezentativni vzorec štirih poskusov. Na sliki 6 je prikazana količina proteinov L2 v posameznem vzorcu, ki smo jih dobili s pomočjo elektroforeze SDS-PAGE in prenosa Western. Uporabili smo protitelo anti-L2. Linija 1 predstavlja vzorec brez PsVs, kjer ni bilo signala, linija 2 predstavlja vzorec z

21

mutantom SNX17 (AA2), linija 3 je vzorec PsVs divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2, vzorci 4, 5 in 6 pa so bili izpostavljeni različnim koncentracijam TiO2 (5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL). Relativne vrednosti nastalih HPV-16 PsVs na enoto produkcijskih celic smo določili tako, da smo količino proteina L2 normalizirali na število izhodnih produkcijskih celic. Kot oceno števila celic smo uporabili količino izraženega konstitutivnega celičnega proteina, ki je bil po velikosti izven območja virusnih proteinov (Slika 7). Tudi v tem primeru smo količino proteina določili denzitometrično s pomočjo programa ImageJ.

Slika 7: Elektroforezni gel (SDS-PAGE) supernatantov celične kulture 293TT po produkciji PsVs HPV-16. Slika je reprezentativni vzorec štirih poskusov.

Na sliki 7 je prikazan elektroforezni gel, pobarvan z barvilom Coomassie Brilliant Blue. Označeni deli prikazujejo celični protein, ki je služil za normalizacijo produkcije PsVs na enoto celic. Linija 1 je kontrola brez produkcije PsVs, linija 2 je vzorec z mutantom SNX17 (AA2), linija 3 je vzorec PsVs divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2, vzorci 4, 5 in 6 pa so bili izpostavljeni različnim koncentracijam TiO2 (5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL). Desna slika za boljšo predstavo prikazuje isti gel brez oznak. Količino proteina L2 v posameznem vzorcu smo normalizirali glede na izraženost konstitutivnega celičnega proteina v istem vzorcu. Dobljene rezultate smo preračunali in jih prikazali kot količino nastalih virusnih delcev HPV-16 na enoto celic, pri čemer smo kot osnovo uporabili vzorec PsVs HPV-16 divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2 (WT).

22

Slika 8: Produkcija virusnih delcev HPV-16 v celicah 293TT v prisotnosti različnih notranjih in zunanjih dejavnikov. Prikazano je povprečje ±SD (n = 4). Na sliki 8 so prikazani relativni deleži PsVs HPV-16 na enoto produkcijskih celic. Vzorcu PsVs divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2 (WT) smo določili vrednost 1 in ga primerjali z mutantom SNX17 (AA2) oziroma z vzorci divjega tipa PsVs, ki so bili med produkcijo izpostavljeni različnim koncentracijam nanodelcev TiO2 (5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL). Kot prikazujejo rezultati na Sliki 8, je bila produkcija virusnih delcev v vseh pogojih zelo podobna (p > 0,2, ANOVA). Ugotovili smo, da na količino nastalih virusnih delcev PsVs ne vpliva povezava med plaščnim proteinom L2 in gostiteljskim proteinom SNX17. To nakazuje, da je povezava med plaščnim proteinom L2 in gostiteljskim proteinom SNX17 sicer pomembna v prvi fazi okužbe, na nastanek virusnih delcev pozneje v življenjskem ciklu pa HPV ne vpliva. Vpliv nanodelcev TiO2 smo opazili pri produkcijskih celicah, ki so bile po izpostavitvi slabo pritrjene na dno petrijevke in so plavale v mediju. Vendar na celične procese, ki so vpleteni v produkcijo PsVs HPV-16, nizke koncentracije nanodelcev TiO2 očitno niso vplivale. Nekoliko manjšo produkcijo PsVs smo opazili le pri visoki koncentraciji nanodelcev TiO2, kjer pa je bila tudi največja variabilnost med vzorci.

4.2 Infektivnost psevdovirusnih delcev

Po produkciji psevdovirusnih delcev HPV-16 smo želeli ugotoviti, kakšna je njihova infektivnost v tarčnih celicah. Za ugotavljanje infektivnosti PsVs smo uporabili naravne gostiteljske celice HaCaT, ki so netransformirani humani keratinociti. Celice smo inficirali s supernatanti, ki smo jih dobili pri produkciji in ki so vsebovali PsVs z vključenim reporterskim genom za encim luciferazo. Po 48 urah inkubacije v celičnem inkubatorju smo celice lizirali in supernatant shranili. Lizatom, ki so vsebovali encim luciferazo, smo dodali substrat in izmerili nastalo bioluminiscenco s čitalcem mikrotitrskih plošč. Kot kontrolo smo celice HaCaT inficirali s supernatantom, ki ni vseboval PsVs.

23

Pri ugotavljanju infektivnosti psevdovirusnih delcev smo testirali več različnih dejavnikov, pri čemer smo vzorec z divjim tipom virusa HPV-16, ki med produkcijo ni bil izpostavljen izbranim dejavnikom notranjega ali zunanjega okolja (WT), uporabili kot osnovo za primerjavo. Vse poskuse produkcije PsVs smo testirali na infektivnost nastalih PsVs. Infektivnost smo ugotavljali na podlagi bioluminiscentnega odziva. Iz dobljenih rezultatov smo izračunali povprečne vrednosti, ki smo jih nato normalizirali glede na vrednost okužbe pri vzorcu WT.

Slika 9: Infektivnost psevdovirusnih delcev HPV-16, ki so bili pripravljeni v prisotnosti različnih notranjih in zunanjih dejavnikov. Prikazano je povprečje ±SD (n = 4). Na sliki 9 so prikazni deleži okužbe PsVs HPV-16 v celicah HaCaT. Vzorcu PsVs divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2 (WT) smo določili vrednost 1 in ga primerjali z mutantom SNX17 (AA2) oziroma z vzorci divjega tipa PsVs, ki so bili med produkcijo izpostavljeni različnim koncentracijam nanodelcev TiO2 (5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL). Rezultati okužbe, prikazani na Sliki 9, kažejo na to, da prisotnost različnih notranjih in zunanjih dejavnikov vpliva na infektivnost virusnih delcev HPV-16. Kot prvo smo potrdili, da je infektivnost PsVs mutanta SNX17 (AA2) bistveno nižja kot pri vzorcu, ki je vseboval divji tip HPV-16 (p < 0,05, Studentov t-test). Infektivnost PsVs z mutiranim proteinom L2 je bila zmanjšana za 65 %, kar je v skladu z dosedanjimi študijami (Bergant idr., 2013). S tem smo dokazali, da je povezava med L2 in SNX17 bistvenega pomena za infektivnost virusov HPV-16. S tem, ko je bila ta povezava onemogočena, virusna DNA ni vstopila v jedro celice, kar se je pokazalo kot zmanjšana stopnja okužbe (Bergant idr., 2013).

24

Pokazali smo, da kljub nezmanjšani produkciji PsVs HPV-16 (Slika 8) ti niso enako učinkoviti pri okužbi celic HaCaT kot divji tip PsVs (WT). Ta del nam je služil kot kontrola poskusa ter za kasnejšo primerjavo z vzorci WT, ki so nastali v prisotnosti nanodelcev TiO2. Rezultati tega dela kažejo, da je infektivnost PsVs HPV-16, ko so bili med procesom nastanka izpostavljeni različnim koncentracijam nanodelcev TiO2, zmanjšana. Upad infektivnosti je sorazmeren koncentraciji uporabljenih delcev. Čeprav je bila relativna količina nastalih delcev zelo podobna kot pri divjem tipu WT (Slika 8), smo pri delcih PsVs HPV-16, ki so bili izpostavljeni nanodelcem TiO2, opazili do 60 % manjšo infektivnost (p < 0,05, ANOVA). To je primerljivo z vzorci mutanta SNX17 (AA2) in kaže na močan vpliv zunanjih dejavnikov (TiO2) na infektivnost virusnih delcev HPV-16. Razlog za zmanjšano infektivnost PsVs, ki so nastali v prisotnosti nanodelcev TiO2, je lahko ta, da smo skupaj s supernatanti prenesli tudi nekaj nanodelcev. Ti bi lahko zasedli receptorje in virusi ne bi mogli vstopiti v celico. Zaradi tega tudi ni bilo transporta reporterske DNA do jedra in nastanka encima, ki je potreben za reakcijo LAR. Ta možnost je sicer malo verjetna, ker smo v postopku ekstrakcije supernatante centrifugirali. Verjetnejša razlaga je, da so se nanodelci TiO2 vezali na plaščne proteine L1 in L2 med produkcijo psevdovirusov in na ta način blokirali vezavo plaščnih proteinov na celične receptorje in vstop virusov HPV v celico.

4.3 Enkapsidacija reporterske DNA

Pomemben pokazatelj infektivnosti virusov HPV je vključitev virusne DNA. V diplomskem delu smo želeli ugotoviti, kako različni okoljski dejavniki vplivajo na enkapsidacijo reporterske DNA v psevdovirusne delce HPV-16. DNA smo izolirali iz supernatantov enega testnega poskusa produkcije PsVs HPV-16 v celicah 293TT, kjer smo imeli na razpolago dovolj testnega materiala. Rezultati zato služijo le kot preliminarna ocena o vsebnosti DNA. Izolirano DNA smo analizirali z agarozno elektroforezo, pri čemer smo kot pozitivno kontrolo uporabili čisti izolat plazmida pGL3, ki je vseboval gen za luciferazo.

Slika 10: Izolacija DNA iz supernatantov celične kulture 293TT, ki smo jih dobili pri produkciji psevdovirusnih delcev HPV-16. Slika predstavlja rezultate preliminarnega poskusa izolacije DNA.

25

Na sliki 10 je prikazan agarozni gel (1 %) z označenimi vzorci supernatantov PsVs, supernatanta celične kulture brez produkcije PsVs (0) in vzorec kontrolne DNA. Kontrolo predstavlja čisti izolat plazmida pGL3 (100 ng). S puščico na levi strani slike je označena razvita krožna oblika plazmida.

Slika 10 prikazuje izolirano DNA iz supernatantov celične kulture 293TT. Pri vseh vzorcih, ki so vsebovali psevdovirusne delce, smo dokazali prisotnost reporterske DNA v velikosti približno 7 kilobaz. V kontrolnem vzorcu plazmida pGL3 smo poleg razvite plazmidne DNA opazili tudi velik delež superzavite plazmidne DNA. Ta oblika je značilna za čiste izolate plazmidne DNA in zaradi svoje kompaktne oblike po agaroznem gelu potuje hitreje (Lee idr., 2012). Ugotovili smo, da se ta oblika plazmidne DNA ne vključuje v virusni plašč med nastankom PsVs HPV-16. Količino izoliranega plazmida pGL3 smo določili s programom ImageJ in dobljene rezultate prikazali na grafu (Slika 11).

Slika 11: Količina plazmida pGL3 v vzorcih supernatantov psevdovirusnih delcev HPV-16. Slika predstavlja rezultate preliminarnega poskusa izolacije DNA. Vzorcu PsVs divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2 (WT) smo določili vrednost 1 in ga primerjali z mutantom SNX17 (AA2) oziroma z vzorci divjega tipa PsVs, ki so bili med produkcijo izpostavljeni različnim koncentracijam nanodelcev TiO2 (5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL). Slika 11 prikazuje, da je enkapsidacija reporterske DNA v psevdovirusne delce HPV-16 zelo podobna med različnimi vzorci. Zaključili smo, da na količino in vrsto enkapsidirane plazmidne reporterske DNA ne vpliva niti vezava plaščnega proteina L2 s proteinom SNX17 niti prisotnost nanodelcev TiO2 med procesom enkapsidacije pri sestavljanju virusnega plašča.

26

4.4 Zgradba in stabilnost virusnega plašča

Zgradba in stabilnost virusnega plašča je naslednji dejavnik, ki pomembno vpliva na infektivnost in obstojnost virusov HPV v okolju. V diplomskem delu smo ugotavljali, kakšno je razmerje med plaščnima proteinoma L1 in L2 ter kakšna je stabilnost nastalih PsVs. Stabilnost smo testirali tako, da smo vzorce supernatantov izpostavili encimu tripsinu. Tripsin je serinska proteaza, ki cepi proteine na mestu aminokislin lizin in arginin in ki se kot proteolitski encim pogosto uporablja v biotehnologiji, prav tako pa tudi za testiranje stabilnosti plaščnih proteinov HPV (Day idr., 2015). Vzorce PsVs HPV-16, ki smo jih pripravili v prvem delu naloge, smo izpostavili encimu tripsin in ugotavljali razgradnjo plaščnih proteinov L1 in L2 v različnih vzorcih.

Slika 12: Testiranje stabilnosti virusnega plašča pri psevdovirusnih delcih HPV-16 s tripsinom. Prvih pet vzorcev (*) ni bilo tretiranih (kontrola), medtem ko smo drugi set petih vzorcev (**) tri ure inkubirali s tripsinom. Slika je reprezentativni vzorec treh poskusov. Na sliki 12 sta prikazana plaščna proteina L2 in L1 ter njuni razgradni produkti, ki smo jih dobili s pomočjo elektroforeze SDS-PAGE in prenosa Western. Uporabili smo protitelo anti-L2 in anti-L1. WT je PsVs divjega tipa brez izpostavljenosti TiO2, AA2 je vzorec z mutantom SNX17, zadnji trije vzorci pa so bili izpostavljeni različnim koncentracijam TiO2 (5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL). Slika 12 nam prikazuje nativna plaščna proteina L2 in L1 ter njune razgradne produkte, ki so nastali, ko je tripsin začel razgrajevati plašč virusov. Razgradni produkti imajo manjšo molekulsko maso v primerjavi z nativnimi plaščnimi proteini, njihova količina pa je odvisna od stabilnosti plašča. Če plašč ni pravilno sestavljen in dovolj kompakten, ima tripsin boljši dostop in tako je razgradnja hitrejša. Vrsta in količina razgradnih produktov se med vzorci nista bistveno razlikovali, kar pomeni, da ni večjih razlik, kar se tiče same stabilnosti plašča. Je pa razvidno, da se občutljivost plašča na tripsin poveča pri daljši izpostavljenosti.

27

4.4.1 Razmerje L1 : L2

Na koncu smo ugotavljali tudi razmerje med proteinoma L1 in L2. Razmerje L1 : L2 v literaturi ni natančno določeno in se giblje od 5 : 1 pa vse do 12 : 1 ali celo več (Buck idr., 2008). V postopkih produkcije PsVs (Poglavje 4.1) smo imunokemijsko določali prisotnost in količino plaščnih proteinov L1 in L2. Ker smo za detekcijo uporabili različni protitelesi, natančnega razmerja v številu posameznih proteinov nismo mogli izračunati. Lahko pa smo primerjali, ali se delež obeh proteinov spreminja pri različnih eksperimentalnih pogojih. Na podlagi rezultatov prenosa Western smo s programom ImageJ izračunali površine proteinov L1 in L2 ter jih primerjali med sabo, da smo dobili razmerje. Dobljene rezultate smo pretvorili v odstotke, pri čemer smo vzorcu z divjim tipom (WT) dali vrednost 1. Na podlagi vseh poskusov smo izračunali povprečje.

Slika 13: Razmerje L1 : L2 pri psevdovirusnih delcih HPV-16. Prikazano je povprečje ±SD (n = 4). Slika 13 prikazuje razmerje med L1 in L2 v različnih eksperimentalnih pogojih. Količina je bila izmerjena na podlagi denzitometrije vzorcev imunokemijskega določanja proteinov L1 in L2 v poskusih produkcije PsVs. Prikazano je razmerje L1 : L2 v primerjavi z vzorcem divjega tipa WT, ki smo mu določili vrednost 1. V našem primeru se razmerje obeh proteinov ni bistveno spreminjalo. To kaže, da SNX17 in nanodelci TiO2 ne vplivajo na spreminjanje razmerja med proteinoma L1 in L2 ter posledično na spremenjeno strukturo virusnega plašča. Za gostiteljski protein nukleofozmin je bilo dokazano, da vpliva na pravilno povezavo proteinov L2 in L1. S tem je omogočeno tudi pravilno sestavljanje plašča. V primeru, da je povezava med proteinom nukleofozminom in L2 onemogočena, se v plašč vgradi manjše število proteina L2, kar

28

vodi do razlik v samem razmerju (Day idr., 2015). Tega pri našem izbranem proteinu SNX17 nismo ugotovili. Rezultati o razmerju proteinov L1 : L2 potrjujejo prejšnje rezultate o stabilnosti virusnih delcev, saj bi spremenjeno razmerje plaščnih proteinov zelo verjetno zmanjšalo njihovo stabilnost.

29

5 ZAKLJUČEK

Okužbe s humanimi virusi papiloma so še vedno velik zdravstveni problem. Z namenom zmanjševanja okužbe z virusom HPV je treba javnost izobraževati o samem virusu in načinih preventivne zaščite, med katere spada cepivo. Predpogoj za to pa je, da dobro poznamo dejavnike, ki vplivajo na različne faze okužbe s HPV. V diplomskem delu smo ugotavljali povezavo med nastankom virusnih delcev HPV in nekaterimi dejavniki iz okolja, v katerem poteka življenjski cikel HPV. Kot notranji dejavnik smo proučevali vpliv proteina Sorting nexin 17 gostiteljskih celic, kot zunanji dejavnik pa nanodelce titanovega dioksida. Potrdili smo, da je protein SNX17 bistvenega pomena za okužbo virusov HPV, saj je onemogočena povezava z L2 (mutant AA2) zmanjšala stopnjo okužbe za 65 %. Naša hipoteza je bila, da lahko na enak način kot pri okužbi povezava med SNX17 in L2 vpliva tudi na nastanek virusa. To se je izkazalo za napačno, saj nismo ugotovili razlike v produkciji virusnih delcev med virusom HPV z mutacijo v plaščnem proteinu L2 in kontrolnim vzorcem z divjim tipom virusa. Zaključili smo, da povezava med plaščnim proteinom L2 in gostiteljskim proteinom SNX17 ni bistvena za nastanek virusnih delcev HPV, kar do sedaj še ni bilo raziskano. Produkcijo virusnih delcev HPV smo analizirali tudi v prisotnosti zunanjih okoljskih dejavnikov, kjer smo uporabili nanodelce TiO2. Ugotovili smo, da nanodelci TiO2, ki so prisotni v kulturi, ne vplivajo na količino nastalih virusnih delcev HPV-16. Opazili pa smo njihov vpliv na produkcijske celice. Te so po končani produkcijski dobi plavale v mediju, kar kaže, da je prišlo do nekaterih citopatoloških sprememb. Med analiziranjem nastalih virusnih delcev smo ugotovili velik vpliv na okužbo, saj je bila ta zmanjšana tudi do 60 %, če so bili med produkcijo prisotni nanodelci TiO2. Upad infektivnosti je bil sorazmeren s koncentracijo uporabljenih delcev. Predpostavljamo, da je do tega prišlo zaradi vezave nanodelcev na plašč virusov HPV in posledično oviranja vezave virusov na celične receptorje. Poleg produkcije in okužbe virusnih delcev HPV smo izvedli še poskuse enkapsidacije virusne DNA, stabilnosti virusnega plašča in razmerja L1 : L2. Pri vseh poskusih se je izkazalo, da protein SNX17 in nanodelci TiO2 ne vplivajo na proučevane parametre. Zaključili smo, da notranji dejavnik SNX17 ni vplival na nastanek in zgradbo virusnih delcev, je pa zelo pomemben za okužbo z virusi HPV. Nanodelci, ki so služili kot zunanji dejavnik, ne vplivajo na količino in osnovne lastnosti virusnih delcev, lahko pa zmanjšajo njihovo infektivnost, kar je zanimivo tudi s stališča uporabe kozmetičnih pripravkov, ki te delce vsebujejo.

30

6 VIRI

Avio, C. G., Gorbi, S., Milan, M., Benedetti, M., Fattorini, D., d'Errico, G., Pauletto, M., Bargelloni, L. in Regoli, F. 2015. Pollutants bioavilability and toxicological risk from microplastics to marine mussels. Environmental pollution 198: 211-222. Berg, K., Puntervoll, P., Klungsøyr J. in Goksøyr A. 2011. Brain proteome alterations of Atlantic cod (Gadus morhua) exposed to PCB 153. Aquatic Toxicology 105: 206-217. Bergant, M. in Lawrence, B. 2013. SNX17 Facilitates Infection with Diverse Papillomavirus Types. Journal of Virology, 87, 2: 1270-1273. Bergant, M., Ozbun, A. M., Campos, K. S., Myers, P. M. in Banks, L. 2012. Human Papilloavirus L2 facilitates viral escape from late endosoma via Sorting Nexin 17. Traffic, 13, 3: 455-467. Bergant, M., Peternel, Š., Pim, D., Broniarczyk, J. in Banks, L. 2017. Characterizating the spatio-temporal role of sorting nexin 17 in human papillomavirus trafficking. Journal of General Virology 98, 4: 715-725. Böttcher, R. T., Stremmel, C., Meves, A., Meyer, H., Widmaier, M., Tseng, H.Y. in Fässler, R. 2012. Sorting nexin 17 prevents lysosomal degradation of β1 integrins by binding to the β1-intgrin tail. Nature cell biology 14, 6: 584-592. Buck, C. B., Day, P. M. in Trus, B. L. 2013. The Papillomavirus major capsid protein L1. Virology 455, 0: 169-174. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R. in Schiller, J. T. 2005. Generation of HPV pseudovirions using transfection and their use in neutralization assays. Methods in Molecular Medicine, 119: 445-462. Buck, C. B., Cheng, N., Thompson, C. D., Lowy, D. R., Steven, A. C., Schiller, J. T., Trus, B. L. 2008. Arrangement of L2 within the papillomavirus capsid. Journal of virology 82: 5190–5197. Cell counting with Neubauer Chamber, basic Hemocytometer usage. Celeromics. http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (16. okt 2017). Conoway, M. J. in Meyers, C. 2009. Replication and Assembley of Human Papillomaviruses. Journal of Dental Research, 88: 307-317. Crosera, M., Prodi, A., Mauro, M., Pelin, M., Florio, C., Bellomo, F., Adami, G., Apostoli, P., De Palma, G., Bovenzi, M., Campanini, M. in Filon, F. L. 2015. Titanium Dioxide Nanoparticle Penetration into the Skin and Effects on HaCaT Cells. International Journal of Environmental Research and Public Health, 12: 9282-9297.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Klungs%C3%B8yr%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21762652

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Goks%C3%B8yr%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21762652

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21762652

http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php%20(16

31

Cullen, P. J. 2008. Endosomal sorting and signalling: an emerging role for sorting nexins. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9: 574-582. Day, P. M. in Schelhaas, M. 2014. Concept of papillomavirus entry into host cells. Current Opinion in Virolgy 0: 24-31. Day, P. M., Lowy, D. R. in Schiller, J. T. 2008. Hepran sulfate-independant cell binding and infection with furin-precleaved papillomavirus capsid. Journal of Virology 82, 24:12565-12568. Day, P. M., Baker, C. C., Lowy, D. R. in Schiller, J. T. 2004. Establishment of papillomavirus infection is enhanced by promyelocytic leukemia protein (PML) expression. Proceeding of the national academy of science 101, 39: 14252-14257. Day, P. M., Thompson, C. D., Schowalter, R. M., Lowy, D. R. in Schiller, J. T. 2013. Identification of a role for the trans-Golgi network in human papillomavirus 16 pseudovirus infection. Journal of Virology 87, 7: 3862-3870. Day, P. M., Thompson, C. D., Pang, Y. Y., Lowy, D. R. in Schiller, J. T. 2015. Involvment of Nucleophosmin (NPM1/B23) in Assembly of infectious HPV-16 capsids. Papillomavirus research 1: 74-89. Doorbar, J., Quint, W., Banks, L., Bravo, G. I., Stoler, M., Broker, R. T. in Stanley, A. M. 2012. The Biology and Life-Cycle of Human Papillomaviruses. Vaccine 30S: F55-F70. Fahey, L. M., Raff, A. B., Da Silva, D. M. in Kast, M. W. 2009. A major role for the minor capsid protein of human papillomavirus type 16 in immune escape. Journal of Immunology 183, 10: 6151-6156. Fernandes, J. V., Arujo, J. M. G. in Fernandes, T. A. A. M. 2013. Biology and natural history of human papillomavirus infection. Journal of Clinical Trials, 5: 1-12. Giroglou, T., Florin, L., Schafer, F., Streeck, R. E. in Sapp, M. 2001. Human papillomavirus infection requires cell surface hepran sulfate. Journal of Virology 75, 3: 1565-1570. Hacat Cells. Thermo Fisher Scientific. https://www.thermofisher.com/si/en/home/technical-resources/cell-lines/h/cell-lines-detail-347.html (15. mar. 2017). Harper, D. M. in DeMars, L. R. 2017. HPV vaccines. Gynecologic oncology 146: 196-204. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y. in Kim, Y. H. 2012. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments 62: 3923. Lin, C. C. in Lin, W. J. 2011. Sun protection factor analysis of sunscreens containing titaniun dioxide nanoparticles. Journal of food and drug anaylsis 19, 1: 1-8.

32

Lipovsky A, Popa A, Pimienta G, Wyler M, Bhan A et al. 2013. Genome-wide siRNA screen identifies the retromer as a cellular entry factor for human papillomavirus. Proceedings of the national academy of science 110: 7452-7457. Liu, R., Zhang, X., Pu, Y., Yin, L., Li, Y., Zhang, X., Liang, G., Li, X. in Zhang, J. 2010. Small-sized titanium dioxide nanoparticles mediate immune toxicity in rat pulmonary alveolar macrophages in vivo. Journal of nanoscience and nanotechnology 10: 5161-5169. Mariani, L. in Venuti, A. 2010. HPV vaccine: an overview of immune response, clinical protection, and new approaches for the future. Journal of Translational medicine 8: 105. Nowack, B. in Bucheli T. D. 2007. Occurrence, behavior and effects of nanoparticles in the environment. Environmental pollution 150: 5-22. Oh, C., Yoon, S., Kim, E., Han, J., Chung, H. in Jeong, H. 2010. Non-destructive determination of TiO2 concentration in cream formulation using Raman spectorcopy. Journal of Pharmaceutical and biomedical Analysis, 53: 762-766. Pim, D., Broniarczyk, J., Bergant, M., Playford, M. P. in Banks, L. 2015. A novel PDZ domain interaction mediates the binding between HPV-16 L2 and sorting nexin 27 and modulates virion trafficing. J virology 89: 10145-10155. Poljak, M., Kocjan, B. J., Seme, K., Fujs, K., Potočnik, M., Luzar, B. in Gale, N. 2005. Humani virusi papiloma (HPV). Onkologija 9: 60-72. Scheurer, M. E., Danysh, H. E., Follen, M. in Lupo, P.J. 2014. Association of traffic-related hazardous air polutants and cervical dysplasia in an urban multiethnic population: a cross-sectional study. Environmental health 13: 52. Shi, H., Magaye, R., Castranova, V. in Zhao, J. 2013. Titanium dioxide nanoparticles: a review of current toxicological data. Particle and fiber toxicology 10: 15. Slovenia, Human Papilomavirus and Related Cancers, Fact Sheets 2017. ICO Information center on HPV and Cancer (9. apr. 2017). http://www.hpvcentre.net/statistics/reports/SVN_FS.pdf (28. apr. 2017). Smith, J. L., Campos, S. K., Ozbun, M. A. 2007. Human papillomavirus type 31 uses a caveolin 1- and dynamin 2-mediated entry pathway for infection of human keratinocytes. Journal of Virology 81: 9922-9931. Stockinger, W., Sailler, B., Strasser, V., Recheis, B., Fasching, D., Kahr, L., Schneider, W. in Nimpf, J. 2002. The PX-domain protein SNX17 interacts with members of the LDL receptor family and modulates endocytosis of the LDL receptor. The EMBO Journal 21, 16: 4259-4267. Tucci, P., Porta, G., Agostini, M., Dinsdale, D., Iavicoli, I., Cain, K., Finazzi-Agro, A., Melino, G. in Willis, A. 2013. Metabolic effects of TiO2 nanoparticles, a common component of sunscreens and cosmetics, on human keratinocytes. Cell Death and Disease, 4, e549.

33

Valentino K. in Poronsky, C. B. 2016. Human papillomavirus infection and vaccination. Journal of Pediatric Nursing, 31: 155-166. Wang, J. W. in Roden, R. B. S. 2013. L2, the minor capsid protein of papillomavirus. Virology, 445: 175-186. Wilson W. G., 2014. Growth and Differentiation of HaCaT Keratinocytes. Methods in Molecular Biology, 1195: 33-41. Xi, L. F., Koutsky, L. A., Castle, P. E., Edelstein, Z. R., Meyers, C., Ho, J. in Schiffman, M. 2009. Relationship between cigarette smoking and human papillomavirus type 16 and 18 DNA load. Cancer epidemiol Biomarkers 18, 12: 3490-3496. Xu, J., Sagawa, Y., Futakuchi, M., Fukamachi, K., Alexander, D. B., Furukawa, F., Ikarashi, Y., Uchino, T., Nishimura, T., Morita, A., Suzui, M. in Tsuda, H. 2011. Lack of promoting effect of titanium dioxide particles on ultraviolet B-Initiated skin carcinogenesis in rats. Food and chemical Toxicology 49, 6: 1298-1302. Za ženske, rak materničnega vratu. Zora, državni program zgodnjega odkrivanja predrakavih sprememb materničnega vratu. https://zora.onko-i.si/za-zenske/rak-maternicnega-vratu/ (12. apr. 2017). Zhang, J., Song, W., Guo, J., Zhang, J., Sun, Z., Li, L., Ding, F. in Gao, M. 2012. Cytotoxicity of different sized TiO2 nanoparticles in mouse macrophages. Toxicology and industrial health 29, 6: 523-533.

https://zora.onko-i.si/za-zenske/rak-maternicnega-vratu/

https://zora.onko-i.si/za-zenske/rak-maternicnega-vratu/

I

PRILOGE

Sestava pufrov in raztopin

Pufer TE 10 mM TrisCl (AppliChem, Nemčija), pH=8

1 mM EDTA (Seva, Nemčija)

Pufer HBS 5 mL 2,8 M NaCl (AppliChem, Nemčija)

10 mL 250 mM Hepes (Sigma, Nemčija), pH=7

0,5 mL 150 mM Na2HPO4 (Fluka, Nemčija)

do 50 mL ddH2O; pH=7,12

Elektroforezni pufer TAE 4,84 g Tris (AppliChem, Nemčija)

1,14 mL ocetne kisline (Merck, Nemčija)

372 mg Na2EDTA*2H2O (AppliChem, Nemčija)

do 1000 mL ddH2O

Pufer PBS 8 g NaCl (AppliChem, Nemčija)

0,2 g KCl (AppliChem, Nemčija)

1,44 g Na2HPO4 (AppliChem, Nemčija)

0,24 g KH2PO4 (AppliChem, Nemčija)

do 1000 mL ddH2O

2X [6X] lizacijski pufer LB 2,25 mL [1 mL] TrisCl, pH= 6,8 (AppliChem, Nemčija)

0,93 g [4,81,5 mg] DTT (AppliChem, Nemčija)

1,2 g [600 mg] NaDS (AppliChem, Nemčija)

60 mg [5mg] bromfenol modro (AppliChem, Nemčija)

6 mL [3 mL] glicerol (AppliChem, Nemčija)

do 30 mL [10 mL] ddH2O

Prenašalni pufer 3,33 g TrisCl (AppliChem, Nemčija

14,4 g glicin (AppliChem, Nemčija)

200 mL metanol (Fluka, Nemčija)

do 1000 mL ddH2O

Pufer za blokiranje PBS

5% posnetega mleka (Pomurske mlekarne, Slovenija)

Pufer za spiranje PBS

0,5% Tween-20 (AppliChem, Nemčija)

Raztopina za razbarvanje 150 mL 30% metanola (Applichem, Nemčija)

50 mL 10% ocetne kisline (Merck, Nemčija)

300 mL dH2O

II

Pufer za elektroforezo SDS PAGE 30,3 g Tris base (AppliChem, Nemčija)

144 g glicina (AppliChem, Nemčija)

10 g SDS

1,5 M TrisCL, pH=8,8 18,15 g TrisCl (AppliChem, Nemčija)

80 mL dH2O

1 M TrisCl, pH=6,8 181,65 g TrisCl (AppliChem, Nemčija)

700 mL ddH2O

Pufer APS 10% 5 g APS

50 mL ddH2O

Pufer SDS 10% 100 g SDS

1000 mL ddH2O

Comassie puffer za barvanje 25 mL ocetne kisline (10%) (Merck, Nemčija)

12,5 mL glicerola (5%) (AppliChem, Nemčija)

212,5 mL dH2O

Ekstrakcijski pufer DNA 100 mM Tris pH8

100 mM DTT (AppliChem, Nemčija)

100 mM EDTA (Seva, Nemčija)

1% SDS

1% proteinza K

Nanašalni pufer DNA (6x) 0.025 g Bromofenol modro (0.25%)

0.025 g ksilen cianol FF (0.25%)

3 ml 30% glicerola (AppliChem, Nemčija)

Do 10 mL ddH2O

VPLIV NOTRANJIH IN ZUNANJIH OKOLJSKIH DEJAVNIKOV NA ... · Slika 1: Organizacija genoma HPV-16...

Documents

Transcript of VPLIV NOTRANJIH IN ZUNANJIH OKOLJSKIH DEJAVNIKOV NA ... · Slika 1: Organizacija genoma HPV-16...