UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

ANTONIO JACKSON FORTE BELEZA

PERFIL DE SENSIBILIDADE DE ENTEROBACTÉRIAS EM

CANÁRIOS BELGAS (Serinus canaria, Linnaeus, 1758) DA REGIÃO

NORDESTE DO BRASIL

FORTALEZA-CEARÁ

2017

ANTONIO JACKSON FORTE BELEZA

PERFIL DE SENSIBILIDADE DE ENTEROBACTÉRIAS EM

CANÁRIOS BELGAS (Serinus canaria, Linnaeus, 1758) DA REGIÃO NORDESTE

DO BRASIL

Dissertação apresentada ao curso de Mestrado

Acadêmico em Ciências Veterinárias do

programa de Pós-graduação em Ciências

Veterinária da Faculdade de Veterinária da

Universidade Estadual do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do titulo de Mestre em

Ciências Veterinárias. Área de concentração:

Reprodução e sanidade animal. Linha de

Pesquisa: Sanidade de aves.

Orientador: Prof. Dr. William Cardoso Maciel

FORTALEZA-CEARÁ

2017

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Estadual do Ceará

Sistema de Bibliotecas

Beleza, Antonio Jackson Forte.

Perfil de sensibilidade de enterobactérias em

canários belgas (Serinus canaria, Linnaeus, 1758) da

região nordeste do Brasil [recurso eletrônico] /

Antonio Jackson Forte Beleza. - 2017.

1 CD-ROM: il.; 4 ¾ pol.

CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do

trabalho acadêmico com 78 folhas, acondicionado em

caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm).

Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade

Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária,

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2017.

Área de concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Orientação: Prof. Dr. William Cardoso Maciel.

Coorientação: Prof. Ph.D. Régis Siqueira de Castro Teixeira.

1. Serinus canaria. 2. Escherichia coli. 3. Isolamento de enterobactérias. 4. Antibiograma. 5.

APEC. I. Título.

ANTONIO JACKSON FORTE BELEZA

PERFIL DE SENSIBILIDADE DE ENTEROBACTÉRIAS EM

CANÁRIOS BELGAS (Serinus canaria, Linnaeus, 1758) DA REGIÃO NORDESTE

DO BRASIL

Dissertação apresentada ao curso de Mestrado

Acadêmico em Ciências Veterinárias do

Programa de Pós- Graduação em Ciências

Veterinárias da Faculdade de Veterinária da

Universidade Estadual do Ceará, como

requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Veterinárias. Área de

concentração: Reprodução e sanidade animal.

Linha de Pesquisa: Sanidade de aves.

Aprovada em: 21 /07 / 2017

BANCA EXAMINADORA

Dedico primeiramente a Deus. A minha

mãe, Maria de Fatima Forte Beleza, que

me apoiou durante todos os momentos

bons e ruins do mestrado, ao meu Pai, já

falecido, Antonio Fernando dos Santos

Pinheiro, por sempre acreditar em meus

sonhos e querer sempre o meu melhor. A

minha Tia, Maria Jozeneide Forte Aguiar

por favorecer meu crescimento

profissional. Ao meu irmão, Francisco

Jefferson Forte Beleza e a toda minha

família.

AGRADECIMENTOS

Á Deus por me dar toda a energia necessária para realização deste projeto, e favorecer a

conclusão do mestrado.

Agradeço à Universidade Estadual do Ceará (UECE), principalmente ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias (PPCGV), juntamente com seu corpo docente e

funcionários pelo profissionalismo e integridade demonstrados em todo o momento em que

pude conviver com essas pessoas.

Ao Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO) pela oportunidade que me concedeste

para realização da pesquisa científica, possibilitando o meu crescimento profissional e

pessoal. Em especial ao meu orientador, Prof. Dr. William Cardoso Maciel por me aceitar

como aluno de mestrado e pelo apoio que me concedeu a oportunidade de realizar o mestrado

e de conhecer esse mundo da canaricultura no Ceará.

Ao Laboratório de Toxinologia Molecular (LTM) da Universidade Federal do Ceará que

muito contribuiu para os ensinamentos moleculares dos micro-organismos isolados no

presente estudo. Ao professor Alexandre Havt pela oportunidade que nos foi concedida para

realizar nossos trabalhos em seu laboratório. A Mariana Duarte Bona pela paciência,

competência em nos ensinar os primeiros passos dos estudos moleculares.

A FUNCAP (Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico),

pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio durante os cursos de mestrado,

contribuindo para uma fase importante em minha vida. A Fundação Oswaldo Cruz, onde a

amostra de Salmonella spp. foi sorotipada.

Ao meu amigo co-orientador Regis Siqueira de Castro Teixeira que com sua admirável

paciência e tranquilidade sempre que esteve do meu lado em todos os momentos me apoiando

e aconselhando para que tudo desse certo, essa foi a melhor orientação acadêmica que tive e

tenho a todo o momento, obrigado por tudo.

A minha amiga Elisangela de Souza Lopes por contribuir com meu aprendizado e me

apresentou o mundo da microbiologia, e que teve toda a paciência do mundo para repassar

seus conhecimentos sobre os micro-organismos Gram negativos.

Aos meus amigos casal de Doutorandos, Ruben Horn Vasconcelos e Windleyanne Gonçalves

Amorim Bezerra por sempre me aconselhar a fazer as coisas certas, de aguentar meus

momentos estressantes e por favorecer momentos inesquecíveis de brincadeiras infames.

A minha amiga e companheira mestranda Fernanda Conceição Gaio por sempre acreditar em

meus objetivos e sempre me apoiar me aconselhando em momentos que foram essenciais para

o meu desenvolvimento

A minha amiga Suzan Vitória Girão Lima por favorecer a realização deste trabalho,

contribuindo diretamente com o meu conhecimento da microbiologia, bem como da parte

molecular deste trabalho, e agradeço também por sempre me apoiar para realização do

mesmo.

Aos meus amigos futuros Veterinários alunos de iniciação científica Bruno Pessoa Lima,

Felipe Rebouças Oliveira, Neilton Monteiro Pascoal Filho, Adson Ribeiro Marques, Cecilia

Casimiro do Carmo, Isaac Mourão, Karen Emanuelly e Marcel Freitas de Lucena, obrigada

(o) a todos (as) por esses anos de dedicação, amizade, companheirismo, e momentos muitos

felizes de descontração ao lado de todos vocês.

Aos membros da banca que reservaram um tempo para corrigir o trabalho de mestrado.

Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para realização desse trabalho. Meus

sinceros agradecimentos.

‘’ Não ganhe o mundo e perca sua alma, sabedoria é melhor do que prata e

ouro.

(Boby Marley)

RESUMO

A criação de canário belga (Serinus canaria), chamada de Canaricultura, atualmente é

considerada a atividade que reúne a maior quantidade de criadores de aves domésticas do

mundo, fato esse devido ser uma ave de baixo custo de manutenção, cores exuberantes e

dóceis. Salmonella spp. e Escherichia coli e outras espécies da família enterobacteriaceae já

foram relatadas e descritas nessas aves em diversas partes do mundo, contudo no Brasil são

escassos os trabalhos e informações acerca deste assunto. Sendo assim, o objetivo desse

estudo consistiu em realizar uma pesquisa das enterobactérias em fezes de canários belgas

criados em cativeiro para exposição, avaliar o perfil de sensibilidade dos isolados, bem como

analisar a presença de cepas de E. coli diarreiogênicas (DEC) e E. coli patogênica aviária

(APEC) nesses animais. Para tanto, este trabalho obteve aprovação do Comitê de Ética para o

Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará. Desta forma, no ano de 2015, foram

coletadas 88 amostras de canários belgas de diversos criadores do Nordeste do Brasil, que

esteve reunido em uma exposição regional. Cada amostras era proveniente de pools de fezes

do fundo de cinco gaiolas de canários que participavam do evento de exposição ocorrida em

Fortaleza/CE. As amostras foram enviadas para o Laboratório de Estudos Ornitológicos da

Universidade Estadual do Ceará. Para o processamento microbiológico, foram empregadas

etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo, plaqueamento e posterior

identificação utilizando bateria de provas bioquímicas. Para realização do teste de

sensibilidade aos antimicrobianos foi empregado o método de disco difusão. As cepas de

Escherichia coli foram avaliadas quanto a presença de 8 genes de virulência de DEC (stx1,

stx2, eltB, estA, eaeA, ipaH, aatA e aaiC) e 5 de APEC (iroN, iss, hlyF, ompT e iutA) por

reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional. Neste estudo foi possível o isolamento

de bactérias da espécie Enterobacter cloacae, Serratia rubidaea, Serratia liquefaciens,

Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica subsp enterica (rugosa), Escherichia coli,

Cronobacter sakazakii, Hafnia alvei, Shigella sonnei, sendo Pantoea agglomerans a mais

prevalente. O teste de sensibilidade revelou maior resistência à amoxicilina e ampicilina.

Apenas uma cepa de E. coli foi positiva para o gene iss e outra para os genes iutA e hlyF, que

são genes de virulência do patotipo de E. coli patogênica para aves (APEC). A partir dos

resultados obtidos, concluiu-se que canários belgas albergam importantes enterobactérias, e

que essas cepas apresentam relevantes taxas de resistência.

Palavras-chaves: Enterobactérias. APEC. Salmonella . Serinus canaria.

ABSTRACT

Canary (Serinus canaria) breeding is currently considered the activity that gather the larger

number of domestic bird breeders in the world. This occurs due to the low cost of

maintenance, exuberant colors and docile behavior these birds present. Members of the

Enterobacteriaeceae family, such as Salmonella spp. and Escherichia coli have been reported

and described in these birds in several parts of the world. However, there are scarce studies

and data in Brazil approaching this subject. Therefore, this study aimed to survey the presence

of Enterobacteriaceae in feces of canaries bred for expositions and to evaluate antimicrobial

susceptibility profiles of the isolates. In addition, this study also aimed to analyze the presence

of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) and Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) in

the samples. This study was submitted and approved by the local Ethics Committee for the

Use of Animals, State University of Ceará. In 2015, 88 samples were collected from canaries

of several breeders in Northeastern Brazil that gathered in a regional exposition. Each sample

was comprised of pooled feces from the bottom of five canary cages that participated in the

exposition in Fortaleza, Brazil. Samples were transported to the Laboratory of Ornithological

Studies in State University of Ceará for processing. Microbiological procedure was performed

with pre-enrichment, selective enrichment, plating and biochemical identification. Disk

diffusion technique was used for antimicrobial susceptibility test. Escherichia coli strains

were evaluated for the presence of eight DEC diagnostic genes (stx1, stx2, eltB, estA, eaeA,

ipaH, aatA and aaiC) and five APEC predictor genes (iroN, iss, hlyF, ompT and iutA) with

conventional polymerase chain reaction (PCR). The following species were isolated:

Enterobacter cloacae, Serratia rubidaea, Serratia liquefaciens, Klebsiella pneumoniae,

Salmonella enterica subsp enterica (rough strain), Escherichia coli, Cronobacter sakazakii,

Hafnia alvei, Shiguella sonnei, and Pantoea agglomerans, which was the most frequent.

Amoxicillin and ampicillin presented the most elevated resistance rates in antimicrobial

susceptibility tests. One E. coli strain was positive for iss and one for iutA and hlyF, which are

virulence genes of APEC. These results demonstrate that canaries host important members of

the Enterobacteriaceae family with elevated antimicrobial resistance rates.

Keywords: Enterobacteria. APEC. Salmonella enterica. Serinus canaria.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ilhas Canária..................................................................................................... 16

Figura 2 - Juan de Bithencourt.......................................................................................... 17

Figura 3 - John II da Espanha............................................................................................ 17

Figura 4 - Isabel de Baviera da França............................................................................. 18

Figura 5 - Canário de canto (Fife Fancy - 1)..................................................................... 19

Figura 6 – Canário Flautas de Harz................................................................................... 19

Figura 7 - Canário de porte (Gibber Italicus)................................................................... 20

Figura 8 - Canário com fator vermelho (Topete Alemão)............................................... 21

Figura 9 - Canário Selvagem.............................................................................................. 24

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Frequências absolutas e relativas de enterobactérias isoladas de

canários belgas (Serinus canaria).............................................................................…

54

Quadro 2 - Frequência absoluta (n) e relativa (%) de enterobactérias isoladas de

canários belgas (Serinus canaria) resistentes a antibióticos

…......................................................................................................................................

55

Quadro 3 - Multirresistência de enterobactérias isoladas de Canários belgas

(Serinus canaria)

...............................................................................................................………

56

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

APEC Escherichia coli patogênica para aves

CDT Escherichia coli produtora de toxina distensora

CDET Escherichia coli desprendimento de células

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CEUA Comitê de Ética de Experimentação Animal

DAEC Escherichia coli difusamente aderente

DEC Escherichia coli diarreiogênica

EPEC Escherichia coli enteropatogênica

ExPEC Escherichia coli extraintestinal

EIEC Escherichia coli enteroinvasiva

EAEC Escherichia coli enteroagregativa

EHEC Escherichia coli enterohemorrágica

ETEC Escherichia coli enterotoxigênica

FOB Federação Ornitológica do Brasil

NMEC Escherichia coli causadora de meningite neonatal

PAI Ilha de patogenicidade

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

STEC Escherichia coli produtora de toxina de shiga

UPEC Escherichia coli uropatogênica

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 14

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................... 16

2.1 HISTORIA DA CANARICULTURA NO MUNDO................................................ 16

2.2 HISTORIA DA CANARICULTURA NO BRASIL................................................. 22

2.3 O CANÁRIOO BELGA (Serinus canaria)............................................................... 24

2.3.1 Taxonomia................................................................................................................ 24

2.3.2 Características gerais.............................................................................................. 24

2.4 FAMÍLIA ENTEROBACTEREACEAE.................................................................. 25

2.4.1 Salmonella spp.......................................................................................................... 27

2.4.2 Escherichia coli......................................................................................................... 29

2.4.3 Pantoea sp................................................................................................................. 35

2.4.4 Klebsiella sp.............................................................................................................. 35

2.4.5 Outras Enterobactérias........................................................................................... 36

2.5 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA..................................................................... 37

3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 40

4 HIPOTESE............................................................................................................... 41

5 OBJETIVOS............................................................................................................ 42

5.1 OBJETIVOS GERAIS............................................................................................... 42

5.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.................................................................................... 42

6 CAPITULO 1........................................................................................................... 43

7 CONCLUSÕES........................................................................................................ 57

8 PERSPECTIVAS..................................................................................................... 58

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 59

APÊNDICE.............................................................................................................. 74

APÊNDICE A - MOMENTOS EXPOPÁSSARO 2016. A – LOCAL QUE

PESSOAS TRANSITAVAM ONDE NO QUAL FORAM ALOJADAS AS

AVES; B – GALERIA DE EXPOSIÇÃO DAS AVES; C; MOMENTOS COM O

PRESIDENTE DA UNIÃO CEARENSE DE ORNITOLOGIA (UNICO),

WILLIAM CARDOSO

MACIEL....................................................................................................................

73

APÊNDICE B - MOMENTO EM QUE OCORREU PROCESSAMENTO DAS

AMOSTRAS..............................................................................................................

74

APÊNDICE C - MOMENTOS DO PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS. A –

PLACA DE MACCONKEY COM CRESCIMENTO DE ESCHERICHIA COLI;

B – PLACAS DE TESTE DE SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA

(ANTIBIOGRAMA) C; BACTÉRIAS EM TSI; D AGAR NUTRIENTE

CONTENDO A ESPÉCIE SALMONELLA ENTERICA SUBSP ENTERICA

(RUGOSA) ISOLADA NO PRESENTE

ESTUDO.....................................................................................................

74

ANEXO..................................................................................................................... 75

ANEXO A – CERTIFICADO CEUA....................................................................... 76

ANEXO B – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO PRIMEIRO ARTIGO...... 77

1 INTRODUÇÃO

O Canário belga (Serinus canaria, Linnaeus, 1758) é uma ave inclusa na família

Fringillidae que é da ordem Passeriforme (MANTEL, 2005). Os primeiros registros desta ave

foram feito nas Ilhas Canárias, que se localiza na Costa Africana do Oceano Atlântico. No

início do século XV, os monges foram os primeiros povos a domesticar essa ave hoje

chamado de Canaricultura é considerada uma atividade que reúne a maior quantidade de

criadores de aves domésticas do mundo (OBJO, 2001; ARNAIZ-VILLENA et al., 2012).

Os canários belgas criados em cativeiros no Brasil são alimentados com diversas

sementes além de farinhadas vendidas no mercado. (CAMILLO & NOGUEIRA, 2007).

Rosskopf (1996) descreveu em um estudo sobre a microbiota de aves granívoras, através de

suabe cloacal, relatou que bactérias Gram-negativas não pertencem à microbiota digestória

normal dessas aves e a presença destas bactérias em aves clinicamente saudáveis estão

diretamente ligadas ao contato direto com o homem.

As principais bactérias da família Enterobacteriaceae que estão envolvidas nas doenças

gastrintestinais de espécies de aves da Ordem Passeriformes, mas que também podem afetar

outras aves e mamíferos são: Salmonella spp., Escherichia coli, Klebsiella sp., Serratia sp.,

Enterobacter sp., Proteus sp., e Yersinia sp. (SANCHES & GODOY, 2014). Dentre essas

bactérias, Escherichia coli e Salmonella spp. destacam-se por apresentar elevado potencial

patogênico, sendo consideradas indicativo de problemas de manejo (CORRÊA et al., 2013) e

já foram relatadas em aves da família Fringillídae como importantes causadoras de doenças

(MACWHIRTER, 1994; DORRESTEIN, 1997).

Bactérias do gênero Salmonella spp., é de grande importância na família

Enterobacteriacea. Acreditam que Salmonella spp., e Escherichia coli descendem de um

ancestral em comum que existiu há 160 a 180 milhões de anos atrás, no período terciário, em

paralelo com os invertebrados (LÁZARO et al., 2008; BRASIL, 2011). As salmoneloses são

doenças causadas por bactérias do gênero Samonella que ocorre no mundo todo, é

considerada uma doença zoonótica a qual tem se verificado elevados registros de sua

frequência nos últimos anos em homens e animais, principalmente em países desenvolvidos

(PINTO, 2000). Já a espécie Escherichia coli pode causar doenças infecciosas em seres

humanos e é o agente etiológico mais frequente das infecções do trato urinário (ITUs),

afetando principalmente mulheres e crianças (KAPER et al., 2004).

Salmonella spp., Escherichia coli e outras enterobactérias já foram descritas em

canários belgas em diversas partes do mundo (HARRINGTON et al., 1975; RAIDAL, 1998;

14

SÁNCHEZ‐CORDÓN et al., 2007; MADADGAR et al., 2009; GHOLAMI –

AHANGARAM & ZIA – JAHROMI, 2014; GIACOPELLO et al., 2015). No Brasil, a

literatura científica registra apenas uma pesquisa de enterobactérias em canários belgas, que

foi a de Horn et al.(2015) que analisaram canários belgas pertencente a criadores da região

Metropolitana de Fortaleza-CE, e identificaram a presença de Escherichia coli e outras

enterobactérias.

Devido à escassez de dados, pesquisas com estes animais e estas espécies bacterianas são

importantes. Estudos referentes à sanidade dos animais exóticos devem ser implementados

para melhorar a prevenção de possíveis surtos em animais domésticos, evitar prejuízos

econômicos aos criadores e problemas de saúde pública (ZENI et al., 2008; MONTEIRO et

al., 2008 ).

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 HISTÓRIA DA CANARICULTURA NO MUNDO

Há mais de cinco séculos os canários têm sido apreciados por milhões de pessoas no

mundo todo por suas cores e capacidade de canto, podendo formar duetos e quartetos

musicais. O primeiro registro feito da espécie Canário (Serinus canaria) foi relatado nas ilhas

Canárias (figura 1), um arquipélago pertencente à Espanha, desde o século XV. Este conjunto

de ilhas se localiza a 100 quilômetros da Costa Africana no Oceano Atlântico, próximo ao

deserto do Saara, e trata-se de uma região coberta por vegetação e fauna quase inexistentes

em outras partes do mundo, portanto, todos oriundos de um clima quase tropical. Esta ilha

curiosamente recebeu este nome pelos romanos não pelos canários, mas devido à espécie de

cães (canis em latim) que possuíam um tamanho elevado onde ali habitavam (SEIXAS e

SEIXAS, 1998; SILVA, 2004; ARNAIZ-VILLENA, et al., 2012).

Figura 1 - Ilhas Canária

Fonte: https://ilhascanarias.wordpress.com/

No inicio do século XV os monges que viviam na própria ilha começaram a

domesticar essa ave com o intuito inicial de criação para lazer, mas que logo chamou atenção

dos conquistadores e os monges locais viram o potencial econômico da sua domesticação. Os

exemplares vendidos eram caríssimos, sendo comercializados apenas os machos. O

argumento utilizado era de que só os machos cantavam, porém na verdade tinham receio de

que se vendessem as fêmeas poderiam perder o monopólio (GISMONDI, 1995).

16

Figura 2 - Juan de Bithencourt

Fonte: Arnaiz-Villena, et al. 2012.

Foi Juan de Bithencourt (figura 2) por volta do ano de 1402, quem realizou as

primeiras exportações dos primeiros canários criados em cativeiro. Primeiramente, ele

presenteou John II da Espanha (figura 3), logo em seguida levou alguns exemplares até a

França, onde presenteou a rainha Isabel da Baviera (figura 4), e esses monarcas seriam os

primeiros criadores Europeus. O canário era considerado uma ave de luxo nos tribunais

europeus nesta época e tornou-se moda entre a aristocracia (MANTEL, 2005).

Figura 3 - John II da Espanha

Fonte: https://br.pinterest.com/rlportugal/kings-reis-de-portugal/

17

Diversas expedições para as Ilhas Canárias foram organizadas no início do século

XVI, com o intuito de realizar caça sistemática e exportação de canários. Os primeiros

destinatários de canários foram à Espanha Peninsular e Flandres, na Bélgica. Foi dos portos

espanhóis que se espalhou para a Itália, onde foi formado um centro de aclimatação

importante. Quanto à situação nas Ilhas Canárias, as primeiras organizações de criadores já

haviam se formado ainda naquele século. Sendo esse um fator importante quanto à proteção

da natureza insular, uma vez que sua criação não dependeu mais da caça, mais da reprodução

em cativeiro, o que foi essencial na domesticação da espécie (ARNAIZ-VILLENA, et al.,

2012).

Figura 4 - Isabel de Baviera da França

Fonte:https://en.wikipedia.org/wiki/Isabeau_of_Bavaria

Até a Revolução Industrial, quando não existiam máquinas barulhentas, alguns

artesãos costumavam manter canários em suas lojas para entretenimento. Essa prática de criar

canários em cativeiro foi muito importante para a economia da região Europeia de Tirol no

século XVI, cuja população em sua maioria era contratada pelas minas de carvão. Devido às

baixas remunerações, a criação em cativeiro de canários era uma possibilidade de aumento da

renda familiar. Entretanto, estas aves também foram utilizadas como alarme, pois morriam

rapidamente dentro das minas quando havia vazamento de gás. No século XVII, em

Nuremberg, na Alemanha, os artesões chegaram a criar mais de oito mil canários anualmente,

havendo uma expansão do comércio naquela região, porém as autoridades se viram obrigadas

a ditar leis severas para aqueles comerciantes que fossem desonestos e que vendessem

canários de outras regiões como autênticos nurembergueses (GISMMONDI, 1995).

18

No século XVIII, houve criação de canários em grande escala na Suíça e no sul da

Alemanha que se espalharam por diversos países como, Inglaterra, Rússia, Egito, Turquia,

Suécia, Holanda, França e Bélgica (MANTEL, 2005).

Figura 5 - Canário de canto (Fife Fancy - 1)

Fonte: Arquivo pessoal

Como o resultado dos trabalhos dos criadores, os ingleses começaram a fazer

experiências com os tamanhos e formas que um canário poderia apresentar, conseguiram criar

algumas variações da raça, entre elas o Norwich, o Yorkshire, Lancashire, Lizard, Smallom e

o Gloster. Já os franceses e italianos preferiram lidar com a postura dos canários e obtiveram

vários exemplares com diferentes curvaturas da espinha tais como o Frisado Parisiense,

frisado do sul e do norte, bem como no que diz respeito à seleção de músicas diferentes

(MANTEL, 2005).

Figura 6 – Canário Flautas de Harz

Fonte: Google imagens

19

A primeira mutação registrada em cativeiro em que gerou o canário de cor amarelo foi

em 1585. Aparentemente, o amarelo vem do Serin (Serinus serinus) através de cruzamentos

entre alguns casais doados por Sir Walter Raleigh e pela Rainha Elizabeth I da Inglaterra.

Sobretudo, Shakespeare escreveu um soneto glossing relacionando tudo o que tocava a rainha

Elizabeth I "virava-se para o ouro", referindo-se a aparência do seu canário totalmente

amarelo (ARNAIZ-VILLENA et al., 2012).

Figura 7 - Canário de porte (Gibber Italicus)

Fonte: Elaborado pelo Autor.

A criação de canários de cor teve um extraordinário desenvolvimento, com a introdução

do FATOR VERMELHO. Ocorreu que em 1926, O geneticista Hans Dunker estava andando

pelas ruas da cidade Alemã de Bremen. Perto da catedral ele ouviu o que ele acreditava ser o

canto de um rouxinol. Isso parecia muito estranho em meio aos edifícios da cidade e no meio

do ano naquela região. Na verdade, o que ele estava ouvindo era um criador de canário, logo

ocorreu uma amizade e cooperação entre eles. O Geneticista sugeriu o cruzamento com o

Pintasilgo da Venezuela ou Tarim da Venezuela (Spinus cucullata) para introduzir os genes

vermelho do Tarim em canários amarelos da raça Roller. Os híbridos eram férteis e por cruzar

as aves com gerações sucessivas, selecionando os híbridos mais vermelhos para cruza-lo

novamente com o Tarim da Venezuela, foi possível introduzir genes da cor vermelha no

canário. Assim, foi construído o primeiro animal que foi projetado por engenharia entre um

criador e um geneticista (DUTRA, 1992; ARNAIZ-VILLENA et al., 2012).

20

Figura 8 - Canário com fator vermelho (Topete Alemão)

Fonte: Elaborado pelo Autor

Até o fim do século XIX, a canaricultura não era um atrativo com critérios racionais,

como nos dias atuais. A criação de canários até então era um atrativo de tantos quantos se

dedicavam a ela, sobretudo um motivo de se reunirem, embora houvesse raras exceções,

como são de fato bastante conhecidos por todos, ocorridos em fins do século citado, na região

de Saint-Andresberg, na Turínga e posteriormente em Hamburgo, Hanover, Frankfurt e em

Berlim, onde verdadeiras estruturas empresariais (comércio, industrias, laboratórios, etc.)

foram instaladas com um único objetivo: a criação e comercialização de canários, ou seja, dos

canários Flautas de Harz (Figura 6), por nós conhecidos como Rollers (DUTRA, 1992).

Com a evolução e o avanço técnico do mundo moderno, os canários saíram do acaso, e

sua criação foi encarada como critérios racionais, e passou a ser ciência, arte e técnica. Desta

forma na medida em que os canários eram criados em cativeiro, com os cruzamentos

induzidos além das alterações na sua alimentação natural, a base de sementes, frutas nativas e

insetos, começaram a surgir várias modificações em sua forma, na cor de suas plumagens, no

seu canto e até em sua estrutura óssea, o que levou a espécie na atualidade existir diversas

mutações em cativeiro onde no qual foram fixadas e estabelecidas com o passar dos anos

(MANTEL, 2005).

A partir deste momento, começou a surgir também nas nomenclaturas das exposições

regionais, nacionais e internacionais a separação dos canários por grupos de canto, porte

(forma ou tipo) e de cor (DUTRA, 1992).

21

Tal separação é feita com base nos critérios de seleção empregados, visando os

predicados que são considerados como mais desejados em cada um dos três grupos. Dentre os

canários de canto clássico, existem diferentes linhagens: Harzer Roller, Malinolis, Timbrado

espanhol, Waterslager e Cantor americano. No Brasil, tais canários não são muito freqüentes e

quase não são encontrados à venda, sendo o mais comum o Harzer Roller. Existe ainda a

confusão de chamarem os canários de cor e porte como sendo "rollers", porém os verdadeiros

rollers possuem característica de cantar com o bico fechado, e são canários com canto baixo,

porém muito suave, melodioso, e “rolado”, daí a origem de seu nome. Os canários de cor,

contam hoje com quase 500 cores, agrupados basicamente, de acordo com a presença ou

ausência de melanina na plumagem, da seguinte forma: canários da linha clara (sem melanina

na plumagem - brancos, amarelos ou vermelhos) e canários da linha escura (presença de

melanina na plumagem - verdes, cobres, canelas, feos, acetinados). Também podem ser

agrupados de acordo com o lipocromo em canários sem fator vermelho (brancos, amarelos,

verdes, azuis) ou canários com fator vermelho (vermelhos, cobres). Em relação aos canários

de porte, existem cerca de quarenta e cinco raças reconhecidas em nosso país. Dentre elas,

existem raças com penas frisadas (Frisado parisiense, Frisado do norte e sul, Fiorino, Gibber

(figura 7), Padovano), raças de topete (Gloster, Lancashire, Topete alemão (figura 8)), raças

de postura (Scotch fancy, Hoso japonês, Bossu Belga,), raças de formato (Border, Yorkshire,

Norwich, Raça espanhola) e raças de desenho (Lizard). Existem raças não reconhecidas em

nosso país, porém criadas na Europa (Mheringer, Arlequim Português), Estados Unidos

(Stafford Canary), assim como em outros países (FOB, 2016).

2.2 HISTORIA DA CANARICULTURA NO BRASIL

No Brasil a espécies Serinus canaria é conhecido popularmente como ‘‘canário belga'',

isso faz alusão aos primeiros canários importados para o país, provavelmente de origem

Belga, já que a Bélgica é um tradicional país na criação destas aves, sendo estes primeiros

canários importados os possíveis ancestrais da raça de porte hoje conhecida como Bossu

Belga (FOB, 2016). Sobretudo, segundo Mantel (2005), não se sabe ao certo quando os

primeiros canários surgiram em terras brasileiras, contudo Silva (2015) relata que os

marinheiros europeus, principalmente os franceses, no século XIX, por volta de 1890,

trouxeram esses pássaros para o Brasil onde vendiam por um preço elevado nos cais dos

portos.

22

De inicio, a canaricultura no Brasil tinha como destaque os canários de canto,

posteriormente, os de porte foram trazidos, principalmente os frisados parisienses, que foram

expostos, desde a primeira década do século XX, pelas primeiras sociedades ornitológicas do

Brasil, uma localizada no Rio de Janeiro/RJ e outra em Pelotas/RS. Ambas foram

denominadas “Sociedade Expositora de Canários” e há registro que mostra a entidade de

Pelotas como sendo premiada com medalha de ouro pela comissão organizadora da grande

Exposição Nacional que ocorreu no ano de 1908 no estado do Rio de Janeiro. Nos anos

seguintes, várias sociedades e clubes ornitológicos surgiram, sendo a maioria localizada no

Rio de Janeiro, Rio Grande de Sul e Minas Gerais. Na medida em que essas entidades se

organizavam, começaram a surgir também várias raças inglesas na década de 40 e os canários

de cor na década de 50 (SILVA, 2015).

Alguns eventos da época merecem destaque na história da canaricultura brasileira. Como

a primeira grande exposição de canários de canto e de cor, realizada pela UCRB - União de

Criadores de Roller do Brasil em 1949. Os pássaros julgados nessa exposição garantiram ao

Brasil a participação no 1° Congresso Latino Americano, realizado em Buenos Aires. Nesse

congresso o Brasil conquistou dois primeiros lugares; um em canários de Canto Clássico na

categoria de filhotes e outro, na Cor avermelhada. Dois anos depois, em 1951, ainda sob a

liderança da UCRB, foi realizado o 2° Congresso Latino Americano, em São Paulo e a

evolução da nossa canaricultura era evidente. O Brasil foi Campeão em Canário de Canto e

obteve vários primeiros lugares em Canários de Cor. No ano seguinte, no Pavilhão de Vidro

do Parque de Água Branca (palco de vários "Brasileiros", inclusive o último da COB —

Confederação Ornitológica Brasileira), aconteceu o 1° Concurso Nacional de Canaricultura,

do qual participaram sociedades de várias regiões. No dia 12 de agosto, no decorrer desse

evento, foi realizado o 1° Campeonato Brasileiro de Canaricultura, no qual se decidiu fundar

uma entidade de âmbito nacional que consagrasse os nossos clubes. Nascia, então, a

Federação Brasileira de Canaricultura — FBC, cujo presidente era Jerônimo Rocha. A

entidade passaria por vários nomes e estágios até que, em 24 de setembro de 1988, foi

denominada Federação Ornitológica do Brasil — FOB, sucessora das outras entidades, tão

somente, do ponto de vista histórico. Com a expansão da canaricultura por todo pais, A

Federação Ornitológica do Brasil (FOB), passou a realizar campeonatos a nível regional,

estadual e nacional (MANTEL, 2005).

23

2.3 O CANÁRIO BELGA (SERINUS CANARIA)

2.3.1 Taxonomia

Classe: Ave

Subclasse: Neornithes

Ordem: Passeriformes

Subordem: Passeres

Família: Fringillidae

Subfamília: Carduelinae

Gênero: Serinus

Espécie: Serinus canaria

2.3.2 Características gerais

Figura 9 - Canário Selvagem

Fonte: http://www.hbw.com/ibc/species/island-canary-serinus-canaria

O canário (Figura 9) (Serinus canaria) possui aproximadamente doze centímetros,

comprimento de asa que mede 17 milímetros, pesa vinte gramas, e os machos de vida livre

das ilhas Canárias possuem cores esverdeadas e amareladas, enquanto que as fêmeas

apresentam partes castanhas acinzentadas, de cores menos vistosas, com tonalidades mais

pardas (GISMONDI, 1995). A primeira obra sobre canário que foi escrita pelo naturalista

24

suíço, Conrad Gessner, em 1550, ele descreveu o canário silvestre nidificando em pequenos

arbustos (MANTEL, 2005). Desde a época do descobrimento do canário silvestre, até os dias

atuais, muito se fez através da criação em cativeiro, resultado esse de mais de 600 anos de

seleção pelos criadores de acordo com suas preferências pessoais, concomitantemente com a

ocorrência de algumas mutações, atualmente a Federação Ornitológica do Brasil (FOB),

classifica os canários em três categorias distintas: canários de porte, canários de cantos

clássicos e canários de cor (GISMONDI, 1995; FOB, 2016).

Quando em cativeiro, os canários belgas ou canários do reino como são chamados no

Brasil podem ser alimentados com diversas sementes tais como: níger, colza, alpiste, perila,

nabão, aveia, linhaça, painço e cânhamo. São alimentados também com diversas frutas, tais

como: uva, pêra, alface, maçã, couve, pinho e espinafre, além de diversas farinhadas vendidas

no mercado. A ração farinhada também pode ser um bom aporte de proteína, vitaminas e

minerais. É imprescindível na época de reprodução, podendo ser associada ao osso de ciba,

para facilitar absorção de cálcio necessitado pelas fêmeas para postura, visando assim inibir o

acontecimento de retenção de ovos (GISMONDI, 1995; CAMILO & NOGUEIRA, 2007).

São aves que apresentam bico curto, grosso, cônico e de cor clara, embora algumas

variedades tenham a ponta do bico escura. Os machos cantam facilmente, principalmente na

época reprodutiva, enquanto que as fêmeas geralmente vocalizam com menos frequência,

(GISMONDI, 1995; JACKSON et al., 2003; COELHO, 2004). Desta forma, os machos são

mais caros no mercado pet, quando comparados às fêmeas (ABREU, 2009).

Considera uma ave que se reproduz monogamicamente em sua vida selvagem,

diferente do que ocorre em cativeiro, uma vez que um único macho pode ser usado para

copular com até quatro fêmeas, isso dependendo de como o proprietário deseja trabalhar em

sua criação. A maturidade sexual é atingida dentre cinco e oito meses de idade (COELHO,

2004).

2.4 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE

Inúmeras são as doenças bacterianas que afetam as aves de cativeiro, sejam como

agentes primários ou secundários. O grupo das bactérias Gram-negativas apresenta maior

importância na medicina de aves por serem mais patogênicas e aparecerem como agentes

primários ou secundários nas infecções (SEGABINAZI, 2004).

25

As espécies pertencentes à família Enterobacteriaceae, também conhecidas como

enterobactérias, são algumas das bactérias mais frequentemente isoladas de amostras clínicas

humanas e animal (MEYER JÚNIOR et al., 2006). Estes micro-organismos estão amplamente

distribuídos na natureza, pois podem ser encontrados na água, no solo, em vegetais e no trato

intestinal de seres humanos e animais (NUNES et al., 2010).

As enterobactérias podem ser agrupadas em três categorias: patógenos oportunistas,

patógenos principais e não patogênicas. Esta família compreende muitos gêneros de

patógenos oportunistas, tais como: Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Serratia.

As categorias de patógenos principais podem ser citadas as espécies Escherichia coli, espécies

de Shigella, Yersinia e Salmonella, que são destaque para a medicina veterinária e humana

onde no qual essas bactérias são responsáveis por uma gama de distúrbios intestinais, assim

como de associações com infecções septicêmicas (FARMER et al., 2007; FORBES et al.,

2007; PUERTA-GARCIA e MATEOS-RODRÍGUEZ, 2010; KONEMAN et al., 2012;

BROOKS et al., 2012; MURRAY et al., 2015). Estes micro-organismos são sensíveis à luz

solar, pasteurização, desinfetantes comuns e dessecação. Entretanto, em ambientes úmidos e

sombreados, como esterco, pastos e cama de palha, podem sobreviver por vários meses

(HIRSH, 2009).

As enterobactérias contém estruturas celulares que podem estar relacionadas com sua

patogenicidade, como por exemplo, as fimbrias, cápsulas, flagelos e sideróforos

(KONEMAN et al., 2012). Essas estruturas tem relação ainda com a patogenicidade das

cepas, o antígeno O compreende a porção mais externa ao lipopolissacarídeos da parede

celular da célula bacteriana, sendo em muitos casos empregados como base para as provas

sorológicas de reconhecimento bacilar, o antígeno K apresenta constituição natural que pode

variar de um polissacarídeo a uma proteína dentre as bactérias, e o antígeno H, no qual é

encontrado nos flagelos bacterianos das espécies móveis (LEVINSON, 2010).

Nesta família são relatados aproximadamente 42 gêneros e 142 espécies bacterianas.

Os gêneros e espécies desta família apresentam distinções bioquímicas, o que permite a

identificação dos isolados clínicos (QUINN et al., 2005; JANDA & ABBOT, 2008). As

enterobactérias podem apresentar as seguintes características: fermentam glicose em vez de

oxidá-la, normalmente com produção de gás; são bacilos Gram-negativos, móveis com

flagelos peritriquiais ou imóveis; são anaeróbicos facultativos; são catalase-positivos,

oxidase-negativos e reduzem nitrato a nitrito; apresentando um ótimo crescimento a uma

26

temperatura de 37 °C e crescem adequadamente em ágar de MacConkey (BROOKS et al.,

2012).

2.4.1 Salmonella spp.

As espécies do gênero Salmonella spp e Escherichia descendem de um ancestral

comum que viveu há 160 a 180 milhões de anos atrás, no decorrer com o período terciário, em

paralelo com os invertebrados. Ao longo da evolução, E. coli e grande parte das cepas de

Salmonella difásica se adaptaram aos mamíferos e, de modo semelhante em paralelo, os

sorovares monofásicos permaneceram adaptados aos répteis (LÁZARO et al., 2008; BRASIL,

2011).

As Salmonellae possui um único gênero, Salmonella, cujo nome foi dado em

homenagem ao microbiologista americano Daniel Elmer Salmon (23 de julho de 1850 – 30 de

agosto de 1914), que isolou o micro-organismo atualmente conhecido como Salmonella ser.

Choleraesuis. Esse gênero atualmente está dividido em duas espécies: S. bongori, com cerca

de 23 sorotipos conhecidos e que está associada a animais de sangue frio, tais como; répteis e

anfíbios, e S. entérica, que possui seis subespécies: S enterica subsp. salamae (513 sorotipos),

S enterica subsp. arizonae (100 sorotipos), S enterica subsp. indica (13 sorotipos), S enterica

subsp. enterica (1547 sorotipos), S enterica subsp. diarizonae (341 sorotipos) e S enterica

subsp. houtenae (73 sorotipos). Este gênero é o mais complexo de todas as

enterobacteriaceae, possui mais de 2.600 descritos no atual esquema de Kauffmann-White.

Esses micro-organismos possuem antígenos flagelares (H), que são proteínas, possuem

antígenos somáticos (O), que são lipopolissacarídeos, possuem também um antígeno capsular

ou de virulência (Vi), como a S ser. Typhi (GUIBOURDENCHE et al., 2010; SÁNCHEZ-

VARGAS et al., 2011; AGBAJE et al., 2011; KONEMAN et al., 2012).

Morfologicamente, são bacilos com hastes retas com cerca de 0,7-1,5 μm a 2-5 μm de

comprimento. Similarmente as demais bactérias da família, são Gram-negativas e anaeróbias

facultativas, passiveis de mobilidade através de flagelos peritriquiais, com exceção dos

sorotipos S. Pullorum e S. Gallinarum que são imóveis (BERGEY & HOLT, 1994).

Bioquimicamente, produzem gás sulfídrico a partir da redução do enxofre por ação da enzima

cisteína-desulfidrase. Apresentam como características metabólicas a capacidade de

descarboxilação dos aminoácidos ornitina e lisina, redução de nitrato a nitrito e utiliza o

citrato como uma única fonte de carbono, podendo ocorrer variações em função do sorovar

27

e/ou da subespécie. São catalase positivas, oxidase, vermelho de metila, indol, voges

proskauer, ureia e malonato negativas. São capazes de fermentarem arabinose, glicose,

galactose, manitol, manose, ramnose maltose, sorbitol, treolose e xilose. Em contrapartida,

não fermenta adonitol, dulcitol, inositol, lactose, rafinose, sacarose, salicina, e amido

(BERCHIERI, 2000; KONEMAN et al., 2012; BRASIL, 2011).

Com base na especificidade do hospedeiro e padrão clínico, o habitat natural das

salmonelas pode ser dividido em 3 categorias: primeiro são aquelas altamente adaptadas ao

homem, que inclui a Salmonella ser. Typhi e Salmonella ser. Paratyphi A, B e C, agentes esse

que pode causar febre entérica (febres tifoides e paratifoide); Segunda são as altamente

adaptadas aos animais que são representadas por Salmonella ser. Choleraesuis e Salmonella

ser. Typhisuis (suínos), Salmonella ser. Dublin (bovinos) e Salmonella ser. Pullorum e

Salmonella ser. Gallinarum (aves), responsáveis por causar a pulorose e tifo aviário

respectivamente, a terceira categoria inclui a grande maioria dos sorotipos que afetam

indiretamente os animais e os homens, denominadas de salmonelas zoonóticas, que são

responsáveis por quadro de gastrenterite (enterocolite) ou doença de transmissão alimentar.

São distribuídos mundialmente, sendo os alimentos as principais vias de transmissão (BAÚ et

al., 2001 ; LÁZARO et al., 2008).

Essencialmente, os sorotipos de Salmonella apresentam distribuição no mundo inteiro,

infectando diversos répteis, mamíferos, aves e o ser humano, além de serem passíveis de

contaminarem o solo, vegetação, água e componentes de ração animal (HIRSH, 2009).

O primeiro registro na literatura de isolamento de Salmonella em canários belgas (S.

canaria) ocorreu na década de 70 quando Harrington (1975) isolou Salmonella ser.

Typhimurium de amostras teciduais de 63 canários que vieram a óbito de uma estação de

quarentena de importação localizada nos Estados Unidos. Estas aves haviam sido exportada

da Holanda.

Raidal (1998) isolou Salmonella ser. Typhimurium de canários de pet shops na

Austrália, enquanto que Sanchez-Cordón et al. (2007) em Berlim na Alemanha isolou de

amostras de intestinos de canários do tipo Timbrado Espanhol Salmonella spp. De acordo

com Madadgar (2009), foram observadas altas taxas de mortalidades de 17 plantéis de

diferentes regiões de Teerã, no Irã, e foi detectado em 34 amostras coletadas de vísceras de

canários mortos ou de fezes das aves doentes a presença de Salmonella ser. Typhimurium.

28

Mais recentemente Giacopello et al. (2015) em uma pesquisa realizada com 50

criadores amadores de canário, na província de Messina (Sicília, sul da Itália), realizou o

isolamento de Salmonella ser. Typhimurium a partir de amostras de fezes.

De acordo com Cardoso & Tessari (2015) a salmonelose é uma das enfermidades

consideradas mais problemáticas para a saúde pública e para a avicultura pela grande

endemicidade, alta mortalidade e dificuldade no controle. O controle de Samonella spp. nos

sistemas de criação de canário depende do conhecimento das sua patogenicidade,

epidemiologia e das características destes micro-organismos principalmente aqueles

relacionados a virulência. Segundo Sant’Ana et al. (2008), os estudos voltados a sanidade dos

animais silvestres e exóticos devem ser implementados para ampliar o conhecimento acerca

da dispersão de micro-organismos no meio ambiente, prevenir surtos em propriedades e em

animais domésticos.

2.4.2 Escherichia coli

O cientista Theodor Von Escherich, foi quem descreveu a bactéria Escherichia coli em

1885 e que inicialmente foi denominada Bacterium coli commune. Ele considerou que esse

micro-organismo faz parte da flora bacteriana do trato intestinal dos animais e não causa

patogenia no hospedeiro. Com o decorrer dos anos, os estudos foram se aprofundando e a

atribuição da E. coli como membro normal da microbiota intestinal foi sendo substituído a um

micro-organismo capaz de gerar uma gama de variedades de patologias nos animais e no

homem (FERREIRA & KNÖBL, 2009; TORTORA et al., 2012).

Existe uma diversidade de espécies no gênero Escherichia, porém a espécie E. coli é

uma das bactérias Gram-negativas mais frequentemente isoladas em laboratórios clínicos, é

de importância para animais e tem sido identificada provocando doenças infecciosas que

acometem praticamente todos os tecidos e sistemas orgânicos dos seres humanos. É um dos

micro-organismos comumente envolvidos na sepse, infecções do trato urinário, pneumonia

em pacientes hospitalizados imunossuprimidos, meningite em recém-nascidos, no choque

causado por endotoxinas dentre outras patologias. A sua transmissão ocorre por meio da via

fecal-oral (HIRSH, 2009; LEVINSON, 2010; KONEMAN et al., 2012).

Em âmbito laboratorial são empregadas técnicas de isolamento microbiológico para

identificação desta bactéria, utilizam-se meios de plaqueamento, tais como: ágar Eosina Azul

de Metileno (EMB), ágar MacConkey (MC) e ágar entérico Hektoen (HE), seguidos de testes

29

bioquímicos para identificação bacteriana (EVANS et al., 2014). As cepas do gênero

Escherichia podem ser circundadas por cápsulas ou microcápsulas, sendo anaeróbias

facultativas. É uma bactéria bacilar, com comprimento de 1,1 – 1,5 μm (BERGEY & HOLT,

1994).

Bioquimicamente, possuem a capacidade de fermentar os carboidratos ramnose,

glicose, manose, maltose, xilose, manitol, arabinose e sorbitol. Sobretudo, são variáveis

quanto a utilização de sacarose, rafinose, adonitol, salicina, dulcitol, ornitina e arginina

(KONEMAN et al., 2012). Os resultados das provas bioquímicas para E. coli que se

apresentam negativos são os testes de Citrato de Simmons, Voges-Proskaues, urease,

produção de sulfeto de hidrogênio, malonato e fenilalanina-desaminase. Em contrapartida, são

positivos para os testes de lisina descarboxilase, indol, vermelho de metila, produção de gás,

motilidade e lactose, existem ainda amostras que apresentam fermentação tardia à lactose,

sendo essas consideradas cepas inativas de E. coli (ANDREATTI FILHO, 2007; KONEMAN

et al., 2012). Esta bactéria apresenta ótimo crescimento em temperaturas variantes de 18 a

44°C (FERREIRA & KNÖBL, 2009).

Para a identificação das cepas, comumente são utilizados kits comerciais para detecção

rápida de E. coli com base em seus princípios bioquímicos. Quando associado ao

processamento microbiológico, a coloração de Gram é considerada uma boa técnica para

auxílio à detecção desta espécie bacteriana (EVANS et al., 2014).

Diante de uma variedade de mecanismos de patogenia, associados com fatores de

virulência diversos, E. coli foi classificada em patotipos que são divididos em duas categorias:

cepas que causam infecções extra-intestinais (ExPEC), e os patotipos relacionados a infecções

intestinais, chamadas de E. coli diarreogênica (DEC) (MARTINEZ & TRABULSI, 2008).

As cepas de E. coli diarreogênicas têm a capacidade de causar gastroenterites ou

enterites por meio de seis mecanismos diferentes causando síndromes clinicamente distintas.

São elas: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli difusamente

aderente (DAEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E.

coli enteroagregativa (EAEC). Além dessas classes, existem outras duas classes potenciais

que ainda não foram totalmente caracterizadas, são as E. coli produtora de toxina distensora

citoletal (CDT) e E. coli de desprendimento das células (CDEC) (KONEMAN et al., 2012).

Os patotipos relacionados às infecções que possuem atuação as regiões extra-intestinais, são

divididos em E. coli associada a meningite neonatal (MNEC), E. coli uropatogênica (UPEC) e

30

E. coli patogênica aviária (APEC) (SANTOS et al., 2009; FERREIRA & KNÖBl et al., 2009;

GYLES & FAIRBROTHER, 2010).

Os fatores de virulência de E.coli conhecidos incluem a capacidade da bactéria em

expressar adesinas, hemolisinas e aerobactina, produção de enterotoxinas e citotoxinas, a

produção de colicinas, presença de cápsula, capacidade de invadir tecidos e resistir aos fatores

séricos inibitórios do hospedeiro (SUSSMAN, 1997). Alguns genes localizados nos

cromossomos ou nos plasmídeos são responsáveis pela codificação de fatores de virulência.

Nos cromossomos, estes determinantes estão organizados em grandes fragmentos de DNA,

denominados ilhas de patogenicidade (PAI) (HACKER et al., 1997). A presença destes

fatores de virulência favorece que a bactéria seja resistente aos mecanismos de defesa do

hospedeiro (inespecíficos e específicos), provocando o processo de doença (FERREIRA;

KNÖBL, 2009).

Em humanos, cepas de E. coli enteropatogênica (EPEC) é a principal causa de diarreia

em crianças com menos de um ano de idade principalmente em países subdesenvolvidos

(DONNENBERG & KAPER, 1992; MINAGAWA, 2007; PUERTA-GARCIA & MATEOS-

RODRÍGUEZ, 2010). O gene eaeA, localizado no loci de desaparecimento dos enterócitos

(LEE) em uma ilha de patogenicidade, tem sido utilizado para identificação de EPEC. A

presença desse gene determina um padrão de aderência de bactérias ao epitélio intestinal em

enterócitos com lesão em forma de pedestal conhecida por attaching and effacing (A/E), que é

o mecanismo principal da patogênese da EPEC (A/E) (SYDOW, 2005). As cepas de EPEC

ainda são classificadas em típicas quando abrigam o plasmídeo para o fator de aderência de

EPEC (EAF), que codifica o gene bfp (bundle forming pili), enquanto as cepas atípicas são

negativas para o fator EAF e o gene bfp (TRABUISI et al., 2002). A transmissão de EPEC é

através da via fecal-oral, e diversos estudos demonstram que este patotipo causa grande parte

das infecções de origem alimentar (SOOMRO et al., 2002).

Em humanos e animais cepas de E. coli enteroinvasiva (EIEC) possuem um grande

plasmídeo (ipaH) que contém genes que permitem a invasão de células provocando distúrbios

no intestino grosso, febre e diarreias profusas contendo muco e sangue similar a da Shiguella

spp. (SUSSMANN, 1997; BERCHIERI JUNIOR et al., 2009). As cepas do patotipo EIEC

invadem ativamente as células do cólon e se proliferam lateralmente para as células

adjacentes, virtualmente idênticas às espécies de Shigella. No entanto, as EIEC não produzem

shigatoxinas. Quando a infecção é severa, pode levar a uma forte reação inflamatória com

grande ulceração (MINAGAWA, 2007).

31

Em humanos as cepas de E. coli entero-hemorrágica (EHEC) causam patologias no

intestino grosso, com diarréia sanguinolenta (desinteria), colite hemorrágica, síndrome

urêmica hemolítica e púrpura trombótica trombocitopênica. Em suínos causam a Doença do

Edema (ROCHA, 2008; BERCHIERI JUNIOR et al., 2009; KONEMAN et al., 2012). Este

grupo tem a capacidade de destruir células epiteliais e produz uma citotoxina potente, a toxina

Shiga (E. coli verotoxigênica VETEC, também conhecida como E. coli produtora de

shigatoxina, ou STEC), que provoca diarreia com ou sem a presença de sangue, síndrome

urêmico-hemolítica, e é fatal para crianças. Existem dois grupos de Toxina Shiga,

denominados stx1 e stx2. O gene stx1 é muito semelhante com a principal citoxina produzida

pela Shigella dysenteriae sorotipo 1. Entre os membros do stx2, há algumas diferenças. Este

grupo inclui também os sorotipos O157, O26 e O111. Pela presença do gene eae - lesão em

pedestal (attaching and effacing) ligam-se fortemente às células dos mamíferos e produzem o

mesmo fenômeno de ligação e desaparecimento que as linhagens de EPEC. Abrigam

plasmídios de vários tamanhos. São bactérias pertencentes a diversos sorogrupos. O sorotipo

O157:H7 é o mais importante no Reino Unido e nos Estados Unidos (ROCHA, 2008;

CROXEN & FINLAY, 2010; SILVA et al., 2011; KONEMAN et al., 2012).

Gholami-Ahangaran & Zian-Jahromi (2014), analisando o papel de canários belgas

como reservatório de stx (stx1 e stx2) e do gene da intimuna (eae), encontraram 6% (3/50) das

amostras positivas para o gene stx2, do qual a cepa foi caracterizada como E. coli produtoras

de Shiga-Toxina (STEC).

Em humanos e animais cepas de E. coli enterotoxigênica (ETEC), colonizam as

proximidades do intestino delgado causam diarréia aquosa e produzem hipotermia. Este

patótipo se parece com o Vibrio cholerae no fato de aderirem-se à mucosa do intestino

delgado e causarem diarréia sem invadir a mucosa, porém produzindo toxinas que agem nas

células da mucosa. Possui fatores de colonização específicos (CFA/ I a IV) (ROCHA, 2008;

CROXEN & FINLAY, 2010)

As cepas do patotipo de E. coli enteroagregativa (EAEC) podem colonizar e causar

doença em ambos os intestinos de humanos e animais, causam diarreia aquosa persistente,

durando mais de 14 dias. O padrão de aderência é em forma de agregados de cultura em

célula de cólon humano. Esta bactéria estimula a secreção mucóide e se liga a ela, formando

um biofilme, causando assim uma colonização persistente e diarréia (MINAGAWA, 2007).

Produzem uma toxina termolábil relacionada antigenicamente a hemolisina, mas que não é

hemolítica, e uma toxina (citotoxina) termoestável enteroagregativa codificada por um

32

plasmídeo (EAST1). Produzem uma toxina do tipo ST e uma do tipo hemolisina. Algumas

cepas são conhecidas por produzirem uma toxina do tipo shigatoxina (verotoxina) (CAMPOS

& TRABULSI, 2002; SYDOW, 2005).

O patotipo E. coli difusamente aderente (DAEC) está associado em alguns estudos

com diarreia porém, sua patogenia não é definida com consistência. O termo E. coli

difusamente aderente foi inicialmente utilizado para se referir a qualquer E. coli que se adere

as células HEp-2 e He-Laque não formam microcolônias típicas de EPEC. Com a descoberta

da EAggEC, autores reconhecem a DAEC como uma categoria independente, potencialmente

causadora de diarréia. Como se trata de uma categoria de E. coli ainda não muito estudada,

pouco se sabe sobre sua patogênese (MINAGAWA, 2007).

Cepas E. coli associada a meningite neonatal (MNEC) causam meningite em crianças

recém nascidas. Este tipo se caracteriza por atravessar a barreira hematoencefálica e colonizar

o sistema nervoso central causando meningite. A proteína IbeA presente na NMEC possui a

habilidade de invadir células endoteliais da microvasculatura cerebral, causando meningite

neonatal em humanos (SAVIOLLI, 2010).

Cepas de E. coli uropatogênica (UPEC) é responsável por infecções urinárias em

humanos e animais (cistite e pielonefrite). A bactéria penetra o trato urinário e invade o

epitélio da bexiga, causando cistite, e quando não é tratada corretamente, pode ascender aos

rins causar pielonefrite, lesão renal irreversível, insuficiência renal e septicemia. O

reservatório para esta linhagem de E. coli acredita-se que seja o próprio trato gastrointestinal

(SYDOW, 2005; BERCHIERI JUNIOR, et al., 2009).

O termo colibacilose aviária refere-se a qualquer infecção, localizada ou sistêmica,

causada pelo patotipo E. coli patogênica aviária (APEC). A maior parte das APEC isoladas de

aves é patogênica apenas para as mesmas e apresentam um baixo risco de doença para

humanos ou outros animais (BARNES et al., 2003; BARCELOS, 2005). Porem Johnson e

colaboradores (2007) demonstraram grande proximidade entre ExPEC humanas e aviárias,

observando a ocorrência de sorogrupos de APEC e de UPEC que apresentavam 95,5% de

similaridade no genoma. Dessa maneira, cepas humanas e aviárias têm potencial de causar

infecções cruzadas, reforçando seu potencial zoonótico (RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005;

MOULIN-SCHOULER et al., 2007; EWERS et al., 2007; CHANTELOUP et al., 2011;

TIVENDALE et al., 2010; CUNHA et al., 2013 ).

33

A Escherichia coli está entre as primeiras bactérias a compor a microbiota intestinal

das aves. Este evento ocorre através de penetração pela casca do ovo e, logo após o

nascimento, contato com a mãe e meio ambiente (ANDREATTI FILHO, 2007; CARVALHO,

2006; FERREIRA & KNOBL, 2009). Essas cepas podem estar presentes na microbiota

intestinal de aves sadias, podendo permanecer em um ambiente por um longo período,

contaminando alimentos e a água, que servirão de via de disseminação da bactéria para as

aves (EWERS et al., 2004). Ainda, cepas de APEC distintas geneticamente podem produzir a

mesma infecção, pois podem apresentarem fatores de virulência que, apesar de diferentes,

possuem a mesma função e atuam no mesmo sítio do hospedeiro (BARBIERI, 2010).

A virulência bacteriana é um fenômeno multifatorial e a aquisição de fatores de

virulência pode tornar uma cepa de E. coli comensal em patogênica (IKUNO et al., 2008).

São cinco os genes que codificam fatores de virulência relacionados a cepas APEC de alta

patogenicidade (JOHNSON et al., 2008). Os genes iroN e iutA são responsáveis pela

codificação dos sideróforos salmochelina e aerobactina, respectivamente, facilitando a

aquisição de ferro em condições adversas, fator essencial para o crescimento bacteriano

(JOHNSON et al., 2008). O gene ompT codifica uma evasina que auxilia a bactéria a resistir à

ação do complemento (NOLAN et al., 2003). O gene hlyF é responsável pela produção de

uma hemolisina aviária (JOHNSON et al., 2008; NOLAN et al., 2003); e por fim, o gene iss

confere à bactéria resistência às propriedades líticas do soro, sendo fundamental na patogenia

das infecções causadas por APEC e outras ExPEC (JOHNSON et al., 2008; NOLAN et al.,

2003; EWERS et al., 2007; BERCHIERI JUNIOR et al., 2009).

Existem poucos trabalhos relacionando a presença de E. coli em canário belga,

sobretudo, Giacopello et al. (2015) em um estudo feito com 50 criadores amadores de canário,

na província de Messina (Sicília, sul da Itália), relatou E. coli na grande maioria dos isolados

a partir de amostras de fezes. Horn et al. (2015) verificaram a presença de E. coli a partir de

suabes cloacais de canários belgas proveniente de criadores da região metropolitana de

Fortaleza, Ceará.

De acordo com Mattes et al. (2005) a prevenção e o controle em criadouros tem como

principio a manutenção e planejamento das medidas de biossegurança, que assegurem as

práticas básicas higiênico-sanitárias. Recomenda-se práticas de desinfecção das gaiolas, o

controle de pragas, o manejo alimentar bem apropriado, bem como, a realização diária do

monitoramento sanitário e microbiológico do ambiente e dos animais, garantindo a sanidade

animal (MARIETTO-GONÇALVES et al., 2010).

34

2.4.3 Pantoea sp

Este gênero tem como representante principal a espécie Pantoea agglomerans,

anteriormente pertencente ao gênero Enterobacter (apresentando nomenclatura mais antiga de

Erwinia herbicola) é primariamente caracterizada como um patógeno oportunistas de animais,

de plantas e humanos, passível de ser encontrado em inúmeros ambientes como no solo,

esgoto, sementes, material feculento, água e associado a vegetais (DELÉTOILE et al., 2009,

SHARMA et al., 2012).

Em animais, P. agglomerans foi isolada por Hansen et al. (1990) a partir de um

Dourado do mar (Coryphaena hippurus) e identificada como a causa de uma doença

hemorrágica nesta espécies. Loch & Faisal (2007) Relatam sobre o isolamento de P.

agglomerans de rim de uma infectada truta marrom feral (Salmo trutta) em Michigan, EUA.

Gibson et al. (1982) relataram a presença de P. agglomerans isolada a partir de 17 casos de

aborto equina. Verdier-Metz et al. (2012) isolaram P. agglomerans da pele da teta das vacas

saudáveis, sem quaisquer alterações patológicas. Lawniczek-Walczyk et al. (2013) isolaram

Pantoea spp. do ar dos aviários altamente contaminadas com bactérias.

Esta espécie bacteriana em humanos, é considerada um patógeno oportunista, sendo

relatada causando infecções sépticas em recém-nascidos em unidades itensivas neonatais

(UTI) (SEGADO-ARENAS et al., 2012; MAHAPATRA et al., 2014; SENGUPTA et al.,

2016), bacteremia (CHENG et al., 2013), peritonite (SASTRE et al., 2017), endoftalmites

(VENINCASA et al., 2015), espondilodiscite cervical (MARAIS et al., 2015), e osteomielite

(LABIANCA et al., 2013).

Kirzinguer et al. (2015) relataram que várias cepas de Pantoea, incluindo uma de

ambiente clínico, realizam intercâmbio genético de mecanismos metabólicos importantes na

colonização de hospedeiros vegetais e animais com outros membros da família

Enterobacteriaceae, incluindo espécies patógenas para humanos.

2.4.4 Klebsiella sp

O gênero Klebsiella, possui uma diversidade de espécies, sendo a principal espécie do

gênero a K. pneumoniae, atuam como patógenos oportunistas em humanos, podem ser

encontradas nas fezes e nas vias respiratórias de cerca de 5% de homens normais. É

responsável por causar pneumonias bacterianas, podendo provocar uma extensa consolidação

35

necrosante hemorrágica dos pulmões. Provoca também infecções das vias urinárias e

bacteremia com lesões focais em pacientes debilitados. Espécies desse gênero podem

provocar diversas outras enfermidades, e essas espécies estão classificadas entre os dez

principais micro-organismos causadores de infecções hospitalares, sendo encontrados no

ambiente e muitas vezes causando infecções nosocomiais (BERGEY et al., 1994; BROOKS

et al., 2012).

Algumas espécies desse gênero podem agir como patógenos primários ou podendo

está relacionados às enfermidades oportunistas em aves imunossuprimidas. A cápsula

mucóide presente nestes micro-organismos promove uma barreira contra desinfetantes,

intempéries ambientais e até mesmo a resposta imunológica celular no hospedeiro, todavia é

também altamente imunogênica, estimulando resposta humoral. A bacteremia causada pelas

bactérias deste gênero resulta em colonização e consequente falha renal, sendo em muitas

aves, a infecção detectada tardiamente apenas quando há comprometimento respiratório

(GERLACH, 1994; GODOY, 2007).

A espécie Klebsiella pneumoniae já foi descrita causando mortalidade embrionária e

perdas em excesso de galinhas e perus jovens (Orajaka e Mohan, 1985). Dashe et al. (2008)

descreveram esta bactéria atuando como agente secundário favorecendo o agravamento do

surto de gripe aviária altamente patogénica (H5N1) na Nigéria. Piñeiro et al. (2012) relataram

infecção sinusial causada por K. pneumoniae relacionada com atresia cohonal em Papagaio do

Congo (Erithacus psittacus). Razmyar & Zamani (2016) descreveram um surto em canários

de cativeiro, K. pneumoniae causando infecção do saco vitelino e da gema de ovo. As aves

foram encontradas deprimidas, incapaz de se mover e comer tinha distensão abdominal e

foram encontradas mortas nos primeiros dias após sua eclosão do ovo.

2.4.5 Outras enterobactérias

Puerta-Garcia & Mateos-Rodríguez (2010) relataram sobre o gênero Serratia, citando

que esses micro-organismos são seres oportunistas, portanto agem como agentes secundários,

pois fazem parte da microbiota intestinal. Entretanto, quando em outros tecidos e em órgãos

extraintestinais podem causar diversas patogenias tais como, bacteremia, pneumonia,

infecções do trato respiratório inferior, infecções do trato urinário, infecções de feridas

cirúrgicas, dente outras. Esses bacilos podem ser encontrados na água, solo, vegetais e

animais (RAÚL, 2007). De acordo com Quinn et al. (2002), esse patógeno age como

36

oportunista para os animais, podendo provocar infecções em diferentes regiões anatômicas,

dependendo de alguns fatores como o estado imune do hospedeiro, a presença de infecções

primárias, a virulência da bactéria e integridade dos tecidos-alvos.

O gênero Enterobacter é composto por micro-organismos que fazem parte da

microbiota entérica comensal, sendo associadas a uma variedade de infecções secundária tais

como pneumonia, osteomielite, infecção do trato respiratório e das vias urinarias

(KONEMAN et al., 2012; BROOKS et al., 2012). O gênero possui 16 espécies, todavia as

espécies E. aerogenes e E. cloacae são as mais comumente isoladas de amostras clínicas.

Encontram-se distribuídas amplamente na água, solo, vegetais e esgoto (KONEMAN et al.,

2012). Esses micro-organismos são considerados patógenos oportunistas em animais, ou seja,

ocasionalmente podem provocar infecções quando algumas condições são propícias (QUINN

et al., 2002).

Outro gênero de bactéria o Proteus, Brooks et al. (2012) relataram que é um micro-

organismo causador de infecções secundárias, que está relacionado com infecções das vias

urinárias e que causa pneumonia, bacteremia e lesões em pacientes que receberam infusões

intravenosas. Murray et al. (2015) cita a espécie P. mirabilis como produtora de grandes

quantidades de urease, no qual reage com a ureia, separando a molécula em dióxido de

carbono e amônia. Processo no qual aumenta o pH urinário e facilita a formação de pedras nos

rins. Carter et al. (1995) relatam que P. mirabilis é uma espécie relacionada a uma diversidade

de infecções esporádicas em cães, gatos, gados, aves e outros animais.

Todas essas enterobactérias citadas acima já foram previamente isoladas em estudos

realizados com canários belgas (S. canaria)(GIACOPELLO et al., 2015; HORN et al., 2015).

2.5 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA

O aparecimento da quimioterapia moderna se dá devido aos esforços de Paul Ehrlich,

na Alemanha, no decorrer da primeira parte do século XX. Enquanto tentava corar bactérias

sem corar os tecidos circundantes, ele especulava sobre alguma “bala mágica” que encontraria

e destruiria com os patógenos de forma seletiva, porém sem afetar o hospedeiro. Esta é a ideia

central da quimioterapia, termo que ele próprio cunhou (TORTORA et al., 2012).

Em 1928, Alexander Fleming foi o primeiro a observar que o crescimento da bactéria

Staphylococcus aureus estava sendo inibido por uma área que circundava a colônia de um

37

fungo que havia contaminado a placa de Petri e foi isolado e identificado como Penicillium

notatum. Assim foi notado que havia ali atividade antibacteriana e o produto desse fungo foi

chamado de penicilina. Essas reações inibitórias são encontradas em meios sólidos, sendo

observado na microbiologia, e esse mecanismo de inibição é chamado de antibiose. Foi dessa

palavra que surgiu o temo antibiótico, uma substância produzida por um micro-organismo,

que dependendo das quantidades, pode inibir o crescimento de outros micro-organismos

(MURRAY et al., 2015).

O ano de 1935 foi importante para a quimioterapia das infecções sistêmicas causadas

por bactérias. Apesar dos antissépticos serem aplicados topicamente para evitar o crescimento

de micro-organismos, os antissépticos existentes eram ineficazes contra infecções bacterianas

sistêmicas. Um composto denominado Vermelho de Prontosil demostrou-se eficaz em

proteger ratos contra infecções sistêmicas causadas por estreptococos e que permitia a cura de

pacientes que sofriam de tal infecção. Em seguida, descobriu-se mais tarde que o princípio

ativo do composto era o componente sulfanilamida, que demonstrou ter atividade

antibacteriana durante a Segunda Guerra Mundial e que foi utilizada por pessoas neste

período (TORTORA et al., 2012).

A primeira droga denominada “sulfa” iniciou a nova era na medicina. Compostos

produzidos por micro-organismos (antibióticos) foram eventualmente descobertos como

inibidores de crescimento de outros micro-organismos. Tetraciclinas e estreptomicinas foram

desenvolvidas nas décadas de 1940 a 1950, seguidas rapidamente pelo desenvolvimento de

aminoglicosídeos, penicilinas semissintéticas, cefalosporina, quinolonas e outros agentes

antimicrobianos. Todos esses agentes antibacterianos aumentaram consideravelmente em

relação às doenças infecciosas que puderam ser prevenidas ou tratadas (MURRAY et al.,

2015).

Existe uma diversidade de antimicrobianos que agem contra as Enterobactereaceae,

dentre os quais estão os beta-lactâmicos (Penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e

monobactâmicos), sulfonamidas, quinolonas e aminoglicosídeos. As penicilinas sintéticas de

amplo especto, ampicilina ou amoxicilina, são drogas de baixo custo e com atividade

bactericida, mas as taxas de resistências podem exceder 30% para 50% em enterobactérias,

portanto, a associação desses agentes antimicrobianos com inibidores beta-lactamase (ácido

clavulânico ou sulbactam) pode recuperar a sensibilidade de grande parte das enterobactérias.

A associação de uma cefalosporina de terceira geração, tais como cefotaxima ou ceftriaxona e

um aminoglicosídeo não só pode expandir o aspecto antimicrobiano, mas conseguir um efeito

38

sinérgico e aumentar a ação bactericida, embora seja possível que o tratamento com um único

antibiótico (carbapenemos, amoxicilina-clavulanato, piperracilina-tazobactam) também pode

ser eficaz (NACARRO, 2010).

Segundo Wellington et al. (2013) umas das importantes ameaças emergentes de saúde

pública é a disseminação de patógenos com multirresistência em ambiente hospitalar, e no

meio ambiente em geral. Mudanças demográficas, ambientais e agrícolas estão contribuindo

para uma crise de bactérias com multirresistência, que se não for interrompido, irá emergir

como uma das principais causas de morte nos próximos séculos. Estratégias de prevenção são

possíveis e necessárias para resolver este problema. No entanto, ao longo do tempo, o número

de micro-organismos com vários mecanismos de resistência aumentou, enquanto que o

número de novas moléculas antimicrobianas e investimentos económicos em terapias

alternativas têm diminuído significativamente (CORTÉS, 2011).

A fauna silvestre tem sido afetada por três fatores, são eles: políticos, socioeconômicos

e ambientais. Isto levou os seres humanos e os animais por eles domesticados, invadir

sistemas ambientais nativos. O efeito dessa convivência entre animais selvagens, animais

domésticos e seres humanos, tem sido associado à resistência antimicrobiana e suas

consequências têm sido muito pouca estudada (VARGAS et al., 2010). Sobretudo, o controle

das infecções tem sido um produto de uma corrida armamentista evolucionária. Os estudos

indica que a investigação permanece focada na descoberta e desenvolvimento de novos

medicamentos (BROOKS & BROOKS, 2014).

39

3 JUSTIFICATIVA

O aumento do número de criatórios de canários belgas (Serinus canaria) criados para

exposição no Brasil implica em um maior contato da ave com o homem, possibilitando assim

um risco na transmissão de micro-organismos potencialmente patogênicos para diversos

animais e incluindo o homem.

Surge, portanto, a necessidade de conhecer a ocorrência, a resistência

antimicrobiana desses patógenos, bem como a presença de fatores de virulência em cepas de

Escherichia coli isoladas de fezes dessa ave, para ser possível conhecer a microbiota dos

canários belgas pertencentes a criadores de diversas regiões do Nordeste brasileiro. E caso

necessário, adotar medidas preventivas específicas por parte dos criadores para que se evitem

maiores problemas relacionados às enterobactérias.

40

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

Os canários belgas são reservatórios de espécies da família enterobactérias causadoras

de problemas infecciosos em animais e seres humanos, dessa forma é possível isolar e

tipificar esses micro-organismos.

Os canários belgas são passíveis de apresentarem taxas elevadas de enterobactérias

multirresistentes, bem como apresentam cepas de Escherichia coli com genes de virulência

relacionados a patotipos que podem causar doenças em humanos e em animais.

41

5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Realizar o levantamento, tipificação, perfil de sensibilidade de enterobactérias em

Canários belgas (Serinus Canaria) da região Nordeste.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1- Relatar a presença de Salmonella spp e outras enterobactérias em fezes de canários belgas

de exposição criados em cativeiro da região Nordeste.

2- Avaliar os níveis de enterobactérias multirresistentes isoladas de canários belgas da região

Nordeste

3 Identificar genes de E. coli diarreiogênicas (DEC) e de E. coli patogênica aviária (APEC)

presentes nas cepas de Escherichia coli isoladas das aves;

42

6 CAPÍTULO 1

Detecção de enterobactérias, sensibilidade antimicrobiana e genes de virulência de

Escherichia coli em canários belgas (Serinus canaria) da região Nordeste do Brasil.

Detection of Enterobacteriaceae, antimicrobial susceptibility and virulence genes of

Escherichia coli in canaries (Serinus canaria) in Northeastern Brazil.

Antonio Jackson Forte Beleza, William Cardoso Maciel, Mariana Duarte Bona, Windleyanne

Gonçalves Amorim Bezerra, Suzan Vitória Girão Lima, Alexandre Havt Binda, Fernanda

Conceição Gaio, Régis Siqueira de Castro Teixeira

Periódico submetido: Pesquisa Veterinária Brasileira

(Submetido em Junho 2017 – QUALIS A2)

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Detecção de enterobactérias, sensibilidade antimicrobiana e genes de virulência de Escherichia coli em canários belgas (Serinus

canaria) da região Nordeste do Brasil1

Antonio Jackson Forte Beleza2*, William Cardoso Maciel2, Mariana Duarte Bona3, Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra2, Suzan Vitória Girão Lima2, Alexandre Havt Binda3, Fernanda Conceição Gaio2, Régis

Siqueira de Castro Teixeira2

ABSTRACT.- Beleza A.J.F., Cardoso W.M., Bona M.N., Bezerra W.G.A., Lima S.V.G., Havt A., Gaio F.C. & Teixeira R.S.C.[Detection of Enterobacteriaceae, antimicrobial susceptibility and virulence genes of Escherichia coli in canaries (Serinus canaria) in Northeastern Brazil.] Detecção de enterobactérias, sensibilidade antimicrobiana e genes de virulência de Escherichia coli em canários belgas (Serinus canaria) da região Nordeste do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Setor de Estudos Ornitológicos, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana, 1700, Fortaleza, CE 60.740-903, Brazil. E-mail: jacksonxand@gmail.com

This study aimed to verify the presence of members from the Enterobacteriaceae family and

determine antimicrobial susceptibility profiles of the isolates in canaries bred in Northeastern Brazil. In

addition, the presence of diarrheagenic Escherichia coli (DEC) and Avian Pathogenic Escherichia coli

(APEC) was verified as well. Samples were collected during an exhibition organized by the Brazilian

Ornithological Federal during July 2015 in Fortaleza, Brazil. A total of 88 feces samples were collected and

submitted to pre-enrichment step using buffered peptone water, followed by enrichment with the

following broths brain-heart-infusion, Rappaport-Vassiliadis and Selenite-Cystine. Then, aliquots were

streaked in MacConkey, brilliant green and salmonella-shigella agar plates. Colonies were selected

according to morphological characteristics and submitted to biochemical identification and antimicrobial

susceptibility test with disk-diffusion technique. E. coli strains were evaluated for the presence of eight

DEC genes and five APEC genes with conventional polymerase chain reaction. Most frequent species were

Pantoea agglomerans (25%), Serratia liquefaciens (12.5%) and Enterobacter aerogenes (9.1%). A single

rough strain of Salmonella enterica subsp. enterica was identified in one sample (1,1%). Elevated

resistance rates were identified to amoxicillin (78.7%) and ampicillin (75.4%). Polymyxin B (9.8%),

gentamycin (6.5%) and enrofloxacin (6.5%) were the most efficient antibiotics, to which isolates

presented low resistance rates. A total of 33 (54.1%) multidrug resistant strains was identified. Four E.

coli strains were tested for the virulence genes, and two were positive for APEC virulence genes. One

strain was positive for iutA and the other for hlyF. In conclusion, canaries in Northeastern Brazil from

exhibition may present Salmonella spp., Escherichia coli and other enterobacteria in the intestinal

microbiota with antimicrobial resistance. In addition, these results suggest that E. coli isolated from

canaries may present APEC virulence genes.

INDEX TERMS: Enterobacteria, antibiogram, Escherichia coli diarrheogenic, APEC, belgian canary, Serinus canaria ____________________________________________________ 1 Recebido em ......................... Aceito para publicação em .......................... 2 Laboratório de Estudos Ornitológicos, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Paranjana, 1700, Fortaleza, CE 60.740-903, Brasil. *Autor para correspondência: jacksonxand@gmail.com 3 Laboratório de Toxinologia Molecular, Universidade Federal do Ceará (UFC), Rua Alexandre Baraúna, 994, Rodolfo Teófilo, Fortaleza, CE 60430-160, Brasil.

RESUMO. - O objetivo deste trabalho foi verificar a presença de enterobactérias e determinar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados oriundos de canários belgas criados em cativeiro do Nordeste do Brasil, adicionalmente verificou-se a presença de Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) e E.

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coli patogênica aviária (APEC) nesses animais. A colheita das amostras ocorreu durante uma exposição de canários belgas organizada pela Federação Ornitológica do Brasil (FOB), em julho de 2015, na cidade de Fortaleza, Ceará, Brasil. Um total de 88 amostras de fezes foram coletadas e submetidas a pré-enriquecimento utilizando água peptonada, caldo de enriquecimento Brain Heart Infusion, Rappaport-Vassiliadis e Selenito-Cistina. Fez-se triagem em placas de ágar MacConkey, Verde Brilhante e ágar Salmonella Shigella. As colônias foram selecionadas e submetidas à identificação bioquímica e susceptibilidade antimicrobiana. Cepas de Escherichia coli foram avaliadas quanto a presença de 8 genes de virulência de DEC e cinco de APEC por reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional. As enterobactérias encontradas com maior frequência foram Pantoea agglomerans (25%), Serratia liquefaciens (12,5%) e Enterobacter aerogenes (9,1%). Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa) esteve presente em um dos isolados (1,1%). Dois antibióticos apresentaram alta resistência, ou seja amoxicilina (78,7%) e ampicilina (75,4%). Gentamicina (6,5%), Polimixina B (9,8%) e Enrofloxacina (6,5%) foram os antibióticos com melhor eficiência. O total de bactérias multirresistentes foi de 33 (54,1%). Este estudo relata o primeiro isolamento de Salmonella enterica subsp. Enterica (rugosa) em fezes de canários de exposição criados em cativeiro no Brasil. Das quatro cepas de E. coli isoladas, duas foram positivas para os genes de APEC, sendo uma cepa para o gene iss e outra para os genes iutA e hlyF. Portanto, canários belgas criados em cativeiro no Brasil que participam de exposições podem apresentar Salmonella spp, Escherichia coli e outras enterobactérias em sua microbiota intestinal com resistência antimicrobiana, bem como estes resultados sugerem que amostras de E. coli isoladas de canário belga apresentam alguns fatores de virulência das amostras do patotipo de E. coli patogênica para aves (APEC). TERMOS DE INDEXAÇÃO: Enterobactérias, antibiograma, Escherichia coli diarreiogênica, APEC, Canário belga, Serinus canaria.

INTRODUÇÃO O canário belga (Serinus canaria) pertencente a ordem Passeriforme, família Fringilidae. Atualmente é uma das aves mais procuradas pelos criadores do mundo, estimado pelo seu canto suave e harmonioso, a beleza de suas cores, além de ser muito dócil, facil de cuidar e de manutenção de baixo custo (Mantel, 2005; Arnaiz-Villena et al. 2012). Infecções causadas pelas bactérias da família Enterobacteriaceae são comuns em aves da familia Fringilidae, sobretudo, são consideradas secundárias, sendo necessária, a presença de fatores predisponentes para a transmissão da bactéria para ave. Diversos gêneros desta família já foram relatados causando diferentes doenças em aves da família Fringilidea (Canários, Tentilhões, Pintarroxos, Pintassilgos, Verdilhões, Lugres-cruza-bicos), principalmente: Escherichia coli, Salmonella spp., Citrobacter sp., Yersinia pseudotuberculosis e Klebsiella spp. (Macwhister, 1994; Dorrestein, 1997; Guimarães, 2007; Dorrestein, 2009).

E. coli é considerada uma bactéria comensal comum na microbiota intestinal dos animais homeotérmicos. No entanto, cepas patogênicas são capazes de causar doenças intestinais e extraintestinais em seres humanos, mamíferos e aves, resultando em sérios prejuízos econômicos aos criadores (Koneman et al. 2001; Kaper et al. 2004; Croxen e Finlay, 2010; Bélanger et al. 2011). Estudos com cepas causadoras de septicemia em humanos e aves demonstraram que o genoma pode apresentar grande variedade devido à presença de plasmídeos, fagos e elementos transponíveis, sendo comum a ocorrência destes tanto em E.coli quanto em Salmonella spp. (Mokady e Uri-Gophna Ron, 2005). Além disso, fatores de virulência semelhantes em cepas isoladas de humanos e de cepas de E.coli patogênica aviária (APEC) são comumente descritos, demonstrando seu potêncial zoonótico (Bélanger et al. 2011; Smith et al. 2007; Ewers et al. 2007; Moulin-Schouler et al. 2007; Tivendale et. al. 2010).

A salmonelose, causada por bactérias do gênero Salmonella, é uma doença aviária de grande importância devido a sua alta letalidade e potencial zoonótico (Kanashiro et al. 2002; Soncini, 2002). Esta bactéria habita o trato gastrointestinal de uma grande variedade de animais vertebrados, ocorrendo frequentemente em aves. Podem ser adquiridas através do contato direto com outros animais (especialmente roedores e outras aves), vertical (ovos) e horizontal (contato entre aves e ambiente) (McCLUGGAE, 1996; Gast, 2008; Tizard, 2004).

Existe uma escassez de informações disponíveis sobre o papel epidemiológico dos canários mantidos como animais de estimação, na epidemiologia de E. coli, Salmonella spp e outras enterobactérias e seus perfis de sensibilidade/resistência aos antibacterianos. Diante disto o presente estudo tem como objetivo verificar a presença de enterobactérias, determinar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados oriundos de canários belgas (Serinus canaria) criados em cativeiro do Nordeste do Brasil e analisar a presença de cepas de E. coli diarreiogênicas (DEC) e E. coli patogênica aviária (APEC).

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MATERIAIS E MÉTODOS Amostragem. O estudo foi realizado a partir de amostras de fezes de fundo de gaiolas obtidas de

canários belgas (Serinus canaria) criados com a finalidade de exposição de porte ou de cor. Os pássaros pertenciam a quarenta e quatro criadores de diversos estados da região Nordeste do Brasil (Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Piauí, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Sergipe) que participavam de um campeonato de exposição de pássaros. O evento contou com a presença de 1448 pássaros (1255 canários de cor e 193 canários de porte) que foram alojados individualmente em gaiolas que mediam 32 centímetro de comprimento, 22 de largura e 21 de altura. As gaiolas eram feitas com aço inoxidável, equipados com poleiros adequados e de fácil limpeza. Os canários eram alimentados com uma mistura de sementes (Alpiste, painço, nabão) e a água ad libitum. Material fecal e comida que ficavam no fundo das gaiolas foram removidos diariamente, assim como a comida e a água eram trocadas diariamente e limpas.

Um total de 440 amostras de fezes foram embaladas em sacos plásticos estéreis e transportadas até o Laboratório de Estudos Ornitológico da Faculdade de Medicina Veterinária (LABEO - FAVET) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) em caixas isotérmicas com gelo reciclável para posterior processamento. Cada amostra representou um pool de material biológico (fezes) provenientes do fundo de 5 gaiolas de um mesmo criador. Dessa forma, um total de 88 amostras foi submetido para análise microbiológica.

Processamento microbiológico das enterobactérias. Para o isolamento de enteropatógenos foi utilizada a metodologia de acordo com o trabalho de Sousa et al. (2010). Ao chegar no laboratório, as fezes foram acondicionadas em 10 mL de água peptonada 1% que foram incubadas. Subsequentemente foram transferidas alíquotas de 1mL para caldos de enriquecimento Brain Heart Infusion (BHI), Selenito-Cistina (SC) e 0,1 mL para Rappaport-Vassiliadis (RP) respectivamente. Estas soluções foram incubadas. Após incubação, os caldos foram semeados em placas contendo ágar Verde Brilhante (VB), ágar Salmonella Shigella (SS) e/ou ágar MacConkey (MC), e então novamente, incubados.

Foram coletadas colônias distintas das placas e as mesmas foram inoculadas em tubos contendo ágar Triple sugas iron (TSI), ágar lisina ferro (LIA) e ágar SIM (Sulfato/Indol/Motilidade Agar). Após o periódo de incubação, para a confirmação das enterobacterias, foi utilizada bateria bioquímica com os seguinte meios: lisina-descarboxilase, ornitina-descarboxilase, vermelho de metila, ureia, Citrato de simmons, arginina-descarboxilase, malonato, Voges-Proskauer, fermentação de glicose (com produção de gás), lactose, sacarose, manitol, arabinose, rafinose, dulcitol, adonitol, inositol e sorbitol (Holt et al. 1994; Konemam, 2012). Vale ressaltar que para todas as etapas a temperatura e tempo de incubação foram padronizados em 37°C/24h. As amostras suspeitas para Salmonella spp. foram submetidas ao teste de soroaglutinação rápida em lâmina, utilizando antissoro polivalente, somático O. Para confirmação das amostras suspeitas, estas foram armazenadas em ágar nutriente e enviadas para o laboratório de referência FIOCRUZ para a sorotipagem.

Perfil de sensibilidade das enterobactérias (Antibiograma). Os isolados de enterobactérias foram submetidos à técnica de disco de difusão de Kirby-Bauer, e a leitura dos halos de inibição foi realizada de acordo com os padrões do Clinical and Laboratory Standars Institute CLSI (2014). Na superfície do Ágar Müller-Hinton, após a semeadura da solução (amostra), foram dispensados discos com antimicrobianos, sendo a aferição dos halos de inibição realizada após incubação a 37ºC/24h. Foram testados os seguintes antimicrobianos: neomicina (30 μg), sulfonamida (300 μg), ácido nalidixico (30 μg), amoxicilina(3 μg), estreptomicina (10 μg), polimixina B (300 μg), ampicilina (10 μg), enrofloxacina (5 μg), cloranfenicol (30 μg), tetraciclina (30 μg), gentamicina (10 μg) e sulfazotrim (sulfametoxazol + trimetoprim) (25 μg).

Detecção de Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) e de Escherichia coli patogênica aviária (APEC). Para análise molecular as cepas de E. coli mantidas em ágar nutriente foram reativadas em BHI, plaqueadas em MacConkey para detectar a pureza da cepa e incubadas durante 37ºC/24h. A partir de cada placa foram recolhidas duas a três colônias e colocadas em tubos contendo 1 mL de Triton X-100 a 0,5%, que foram agitados em vórtex durante 15s e fervidos durante 20min a 94ºC. Os tubos foram então centrifugados a 10.000 rpm durante 10 min a tempreratura de 4°C. O sobrenadante contendo DNA foi quantificado por espectrofotometria usando NanoDrop Spectrophotometer 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, EUA). Para diagnóstico molecular de DEC as amostras de DNA foram submetidas a reações em cadeia da polimerase (PCR). A presença de oito genes de virulência de cinco patotipos foram avaliados como se segue: genes stx1 (348pb) e stx2 (584pb) para a identificação de E. coli produtoras de Shiga-Toxina (STEC); eltB (508 pb) e estA (147 pb) para E. coli enterotoxigênica (ETEC); eaeA (881 pb) para E. coli enteropatogênica (EPEC); ipaH (483 pb) para E. coli enteroinvasiva (EIEC); aatA (630 pb) e aaiC (215 pb) para a E. coli enteroagregativa (EAEC) (Taniuchi et al. 2012). As cepas EAEC 042, EHEC O157: H7, EIEC O124, EPEC 2348/69 e ETEC H10407 foram utilizadas como controles positivos para as reações. As cepas também foram submetidas para detecção dos cincos genes preditores mínimos de virulência de E. coli

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patogênica aviária (APEC), de acordo com Johnson et al. (2008). Sendo: iroN (receptor de Salmochelina), iss (resistência sérica), hlyF (codificam toxinas), ompT (protease de membrana externa epissomal) e iutA (Aerobactina – receptor). A cepa 212A foi utilizada como controle positivo das reações. A extração de DNA foi realizada pelo método de ebulição (Lima et al. 2013). A PCR foi realizada utilizando GoTaqGreen kit (Promega) e iniciadores a 0,2 uM em MyCycler Thermal Cycler (Biorad, CA, EUA), com o seguinte protocolo: 95°C durante 15 min; 40 ciclos de 95°C durante 30 s, 57°C durante 30 s e 72°C durante 110 min; seguido de 72°C durante 10 min. Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etídio a 2% e fotografados pelo sistema transiluminador ChemicDoc XRS 112 (Biorad, CA, EUA).

RESULTADOS

Bactérias isoladas. A bactéria mais isolada foi Pantoea agglomerans (22/61), apresentando uma taxa de 25%, seguida de Serratia liquefaciens (11/61) com 12,5% e Enterobacter aerogenes (8/61) com 9,1%. Os patógenos isolados com menores frequências foram Enterobacter cloacae (5/61) com 5,7%, Encherichia coli (4/61) com 4,5%, Hafnia alvei (3/61) com 3,4%, Cronobacter sakazakii (3/61) com 3,4%, Serraria rubidae (2/61) com 2,3%, Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa) (1/61) com 1,1%, Shigella sonnei (1/61) com 1,1%, e Klebsiella pneumoniae (1/61) com 1,1% (Quadro 1).

Resistência antimicrobiana. Os resultados do teste de sensibilidade antimicrobiana estão demonstrados no quadro 2. O antibiótico aos quais as cepas apresentaram maior resistência foi amoxicilina (78,7%), seguida de ampicilina (75,4%), estreptomicina (45,9%) e sulfonamida (42,6%). Mais de 50% das cepas de Pantoea agglomerans apresentaram resistência a amoxicilina (81,8%), ampicilina (72,7%) e sulfonamida (40,9%). Entre as outras três espécies bacterianas que mais ocorreram (Serratia liquefaciens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, respectivamente) também foi observado que a resistência a amoxicilina e ampicilina foram as que apresentaram maiores taxas, com valores que variavam de 80 à 100%. Em relação à taxa de resistência de Escherichia coli, pode-se observar que a maior frequência foi observada em relação a Estreptomicina (75%), para os outros antibióticos a taxa de resistência foi inferior a 25%. A cepa de Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa) foi resistente somente a amoxicilina e estreptomicina. Entre as 61 cepas isoladas neste estudo, 54 (88,5%) apresentaram resistência a pelo menos um dos antibióticos, e o total de bactérias multirresistentes foi de 33 (54,1%). O máximo de antimicrobianos para a qual uma cepa foi resistente foi de doze antibióticos testados, seguido de quatro isolados resistentes a nove antibiótico. O quadro 3 demonstra a quantidade de isolados aos quais foi observada resistência.

Detecção de Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) e de Escherichia coli patogênica aviária (APEC). As 4 cepas de Escherichia coli isoladas submetidas a PCR para detecção de genes de virulência foram negativas para os patotipos diarreiogênicos (DEC) pesquisados. Para a pesquisa dos genes de APEC, apenas 1 (25%) foi positiva para o gene iss, e 1 (25%) positiva para os genes iutA e hlyF.

DISCUSSÃO

De acordo com os resultados, os canários pesquisados albergavam diferentes espécies bacterianas da família Enterobacteriaceae. Esses dados são consistentes com os achados de Conzo et al. (1998), que isolou e identificou Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Enterobacter cloacae, dentre outras espécies, em um levantamento de enterobacterias em canários belgas criados em viveiros no distrito de Nápoles, sul da Itália. Bem como os achados de Horn et al. (2015), que isolaram Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Pantoea agglomerans e Serratia spp de suabes cloacais de canários belgas de criadores da região de Fortaleza, Ceará, Brasil. Giacopello et al. (2015) relataram a prevalência de bactérias gram-negativas tais como: Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Cronobacter sakazakii, Pantoea agglomerans, dentre outras espécies, em fezes de canários com sinais de doença oriundos de aviários de criadores amadores da Sicília, sul da Itália. Pantoea agglomerans foi a enterobactéria mais prevalente no presente estudo. É considerada um patógeno oportunista em humanos, sendo relatada causando infecções sépticas em recém-nascidos em unidades itensivas neonatais (UTI) (Segado-Arenas et al. 2012; Mahapatra et al. 2014; Sengupta et al. 2016), osteomielite (Labianca et al. 2013), bacteremia (Cheng et al. 2013), endoftalmites (Venincasa et al. 2015), espondilodiscite cervical (Marais et al. 2015) e peritonite (Sastre et al. 2017). Essa bactéria também tem sido relatada em outras espécies de aves saudáveis mantidas em cativeiro. Santos et al. (2010) isolou P. agglomerans de aves da família Cracídae (mutuns, jacus, jacutingas e araquãs) de cativeiro no Rio Grande do Sul. Apesar de ser considerado um micro-organismo não nocivo à saúde das aves, em algumas circunstâncias a sua presença pode ser prejudicial. Gerlach (1994) esclareceu que as aves são passíveis de se infectarem com essa bactéria por meio do consumo de sementes, sendo considerado tóxico um alimento que contenha uma alta concentração desse micro-organismo. Conzo et al.

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(1998) relacionaram este patógeno como sendo uma, entre outras enterobactérias isoladas, responsável pela mortalidade de filhotes e embriões de canários belga. Outro ponto que vale destaque em relação a essa espécie bacteriana é que de acordo com Kirzinguer et al. (2015), P. agglomerans realiza intercambio genético de mecanismos metabólicos importantes na colonização do hospedeiro animal com outros membros da família enterobacteriaceae, incluindo espécies patógenas para humanos. Isto pode favorecer a proliferação de genes que codificam fatores de virulência entre bactérias comensais e bactérias com potenciais patogênicos elevados, que podem permanecer por mais tempo na microbiota entérica dos canários, podendo favorecer assim sua transmissão para as aves, ao homem e ao meio ambiente. O segundo micro-organismo bacteriano mais isolado neste estudo foi Serratia liquefaciens. Na ordem Passeriformes, essa espécie bacteriana já foi isolada de suabes cloacais de canários-da-terra (Sicalis flaveola) apreendidos do comércio ilegal em São Paulo (Davis et al. 2016). Em um estudo de pesquisa de enterobactérias em cardeais (Paroaria dominicana e Paroaria coronata) apreendidos do comércio ilegal em São Paulo, Cunha et al. (2016) isolaram de suabe cloacal esta espécie bacteriana. Nos dois estudos os autores não descrevem se as aves estavam doentes. Fudge (2001) relata que não é comum este gênero causar doença, mas que pode afetar aves imunocomprometidas. Ao homem, este micro-organismo tem sido relatado causando infecção do aneurisma de artéria poplítea anteriormente excluídos em pacientes (Coelho et al. 2017) e infecções urinária (Menezes et al. 2004). Enterobacter aerogenes e Enterobacter cloacae são espécies bacterianas comumente isoladas de aves clinicamente saudáveis, contudo, também podem causar infecções primárias ou secundárias em aves imunocomprometidas, podendo atuar concomitantemente com parasitas, vírus ou fungos (Fudge, 2001; Joseph, 2003). Magda et al. (2013), pesquisando bactérias em aves selvagens de diversas localidades no Egito, isolaram E. aerogenes e E. cloacae. Em seres humanos, E. aerogenes e E. cloacae tem sido relatadas em hospitais como importantes patógenos oportunistas causando sepse em neonatais (Akindolire et al. 2016; Köse et al. 2016; Boulos et al. 2016), infecção nosocomial (Oliva-Menacho et al. 2016) e septicemia em profissionais da saúde (Jah et al. 2016). Sobretudo, as aves analisadas no nosso estudo estavam aparentemente saudável, porém estavam expostas ao contato com diversas pessoas que estavam prestigiando o evento ocorrido, fato que poderia contribuir com diversas situações onde poderia provocar imunocomprometimento dessas aves e favorecer infecções oportunistas.

No presente estudo, cepas de E. coli representou 4,5% (4/61) das amostras isoladas. Resultados semelhantes foram encontrados por Horn et al. (2015) quando detectaram 3,62% de positividade em amostras de canários belgas, entretanto, provenientes de suabes cloacais. Giacopello et al. (2015), em um estudo feito com 88 aves de 50 criadores amadores de canários belgas na Itália, detectaram uma frequencia superior (35,2%) em amostras de fezes. A literatura relata em outras espécies de aves esta bactéria causando celulite em frangos de corte (Vieira et al. 2006), colisepticemia em papagaio verdadeiro (Amazonas aestiva) (Marieto-Gonçalves, 2007), peritonite em galinhas (Trampel et al. 2007), colibacilose em papagaios (Knobl et al. 2008) e enterite em arara (Ara ararauna) (Golçalves, 2008). Em humanos, E. coli é um dos micro-organismos comumente envolvidos em sepse, infecção do trato urinário, pneumonia em pacientes hospitalizados imunocomprometido, meningite em recém nascidos, dentre outras patologias (Hirsh, 2009; Levison, 2010; Koneman et al. 2012).

No presente estudo, das 4 cepas analisadas para os genes de E. coli diarreiogênicas (DEC), todas foram negativas para os genes testados (stx1, stx2, eltB, estA, eaeA, bfpA, ipaH, aatA e aaiC). Os genes relacionados ao patotipo aviário (APEC) foram encontrados em duas cepas, onde em apenas uma cepa (25%) foi positiva para o gene iss e uma outra (25%) positiva para os genes iutA e hlyF. Alguns estudos sugerem que mesmo cepas de E.coli comensais podem conter um ou mais genes de virulência com potencial de causar doenças em animais imunocomprometido (Kariyawasam et al. 2006). De acordo com Johnson et al. (2008), somente a detecção do plasmídeo contendo o gene iss não é o suficiente para caracterizar uma cepa de E. coli como patogênica, entretanto este gene é considerado um marcador de virulência, tendo em vista sua alta prevalência em cepas isoladas de aves doentes (Ozawa et al. 2008; Knbol et al. 2011; Saindenberg, 2012). Segundo Lynne et al. (2006) o gene iss está fortemente relacionado com APEC e não é detectado em E. coli comensais, o que torna este gene e a proteína que ele codifica (iss) um candidato aos procedimentos de controle da colibacilose aviária. Entretanto, este gene também tem sido relatado em aves de cativeiro e vida livre sadias, ou seja, sem nenhum sinal de sintomatologia (Saidenberg et al. 2013; Prioste et al. 2013; Almeida, 2014; Borges, 2015).

O gene iutA encontrado no presente estudo, de acordo com Chouikha et al. (2008) está envolvido na aquisição de ferro e é conhecido por sua expressão ser induzida durante a infecção das aves. Na literatura cientifica ainda não foi relatado a presença do gene iutA em canarios belgas (S. canaria), entretanto em aves industriais diversas pesquisas estão disponíveis. Delicato et al. (2003) encontrou o gene iutA em 63% dos isolados de galinhas com colibacilose. Trampel et al. (2007) descreveram a

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presença deste gene em galinhas com lesões de peritonite. Yaguchi et al. (2007) avaliaram 125 amostras de E. coli de frangos de corte com lesões de colisepticemia, encontraram a presença do gene iutA em 74,4% destes isolados. O terceiro gene mais detectado foi o hlyF, o qual segundo Johnson et al. (2008) é responsável pela produção de uma hemolisina aviária, mas que sua função na patogênese da colibacilose permanece desconhecida. Pontes (2015), pesquisando genes de virulência em E. coli isoladas de calopsita (Nymphicus holandicus), detectou em apenas 8% das aves a presença do gene hlyF. Considerando a presença destes genes, os resultados sugerem que as amostras de E. coli isoladas de canários (S. canaria) no presente estudo, apresentam alguns fatores de virulência das amostras do patotipo de E. coli patogênica para aves (APEC).

Este trabalho apresenta o primeiro relato no Brasil de Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa) na espécie Serinus canaria. Algumas pesquisas em amostras oriundas de canários belgas de criadores de outros países já apresentaram isolamento desse gênero bacteriano, sendo o sorotipo Typhimurium o mais relatado (Harrington et al. 1975; Raidal, 1998; Sanchez-Cordón et al. 2007; Madadgar et al. 2009; Giacopello et al. 2015) e da mesma forma que os nossos resultados apresentaram baixa frequência de isolamento. Segundo Dorrestein (2003) bactéria desse gênero pode provocar alta mortalidade em canários. Entretanto, os canários pesquisados no presente estudo não apresentavam nenhuma sintomatologia para salmonelose, apesar de ocorrer seu isolamento em uma das amostras. Embora as aves deste estudo apresentarem-se aparentemente assintomáticas, esta bactéria não deve ser depreciada devido à possibilidade da ocorrência de infecções oportunistas em eventual condição de imunocomprometido (Krieg e Holt, 1984). Mesmo com um baixo percentual de detecção apresentados na maioria dos estudos, e especificamente neste em questão, verifica-se a importância da realização de exames microbiológicos que possibilitem a observação do status sanitário de canários belgas de cativeiro em relação a esse patógeno, pois mesmo sendo baixo a ocorrência, sempre existe um risco de transmissão para humanos e outras aves.

No presente estudo, uma alta porcentagem de isolados Gram-negativos multirresistentes foram identificadas. O antibiótico para qual as cepas apresentaram maior resistência foi amoxicilina (78,7%), seguida de ampicilina (75,4%), estreptomicina (45,9%) e sulfonamida (42,6%). Giacopello et al. (2015) também observaram que as maiores resistências nas enterobactérias analisadas em canários na Itália ocorreram em relação à amoxicilina (100%), ampicilina (92,2%) e estreptomicina (61,2%), sendo estas taxas detectadas apresentando percentuais superiores ao encontrado em nossa pesquisa. O autor também relata neste estudo uma alta porcentagem de isolados multirresistente obtido à partir de canários que mostravam sinais de doenças. Horn et al. (2015) relataram resistência a sulfonamida (55,7%), seguido de ampicilina com (54,1%) e tetraciclina (39,3) em canários criados em cativeiro em Fortaleza, Ceará. Além disso, 55,7% das bactérias apresentaram multirresistência, e o máximo de antimicrobianos para o qual um único isolado foi resistente foi de oito, seguidos por três isolados resistentes a sete antimicrobianos, o que corrobora com os achados neste estudo ao qual uma única cepa foi resistente a onze antibióticos seguido por quatro isolados resistentes a nove antibióticos.

A resistência bacteriana atualmente é um problema de saúde pública. A utilização excessiva e inadequada de antibióticos tem propiciado o surgimento de cepas multirresistentes. Dessa forma, apesar da probabilidade da manifestação natural da resistência aos antibióticos (Nascimento et al. 2003), as fontes mais prováveis da origem desse fenômeno relacionam-se tanto ao contato direto com os tratadores, responsáveis pelo manejo dos animais do criadouro, o qual possibilitaria uma troca de micro-organismos possuidores de genes de resistência (Santos et al., 2010).

CONCLUSÕES Diferentes enterobactérias foram isoladas no presente estudo, e este é o primeiro relato de

isolamento de S. enterica subespécie enterica (rugosa), isoladas de fezes de canário belga no Brasil. É fundamental o monitoramento de enterobactérias em eventos de exposições de canários, devido

ao risco de disseminação destas bactérias que ocorre geralmente pela presença de aves portadoras assintomáticas, e elevada taxa de mortalidade que possa vir a ocorrer em decorrência da patogenicidade destas bactérias para as aves.

Sendo assim, os profissionais veterinários devem estar preparados para diagnosticar, tratar e prevenir as infecções nessas aves por enterobactérias. Ao criador dessas aves, cabe o desafio de melhorar o manejo, a higiene das instalações e implantar normas de biossegurança para diminuir os prejuízos econômicos e os riscos de doenças aviária.

AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório de Estudos Ornitológico da Faculdade de Medicina Veterinária (LABEO - FAVET) da Universidade Estadual do Ceará (UECE), ao Laboratório de Toxinológia Molecular (LTM) da Universidade Federal do Ceará e gradecer a Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) por favorecer o financiamente desta pesquisa.

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53

Quadro 1. Frequências absolutas e relativas de enterobactérias isoladas de canários belgas (Serinus canaria)

Bactéria n %

Pantoea agglomerans 22 25

Serratia liquefaciens 11 12,5

Enterobacter aerogenes 8 9,1

Enterobacter cloacae 5 5,7

Escherichia coli 4 4,5

Hafnia alvei 3 3,4

Cronobacter sakazakii 3 3,4

Serratia rubidaea 2 2,3

Salmonella enterica subsp enterica (rugosa) 1 1,1

Shiguella sonnei 1 1,1

Klebsiella pneumoniae 1 1,1

Amostras positivas para enterobactérias 48 54,5

Amostras negativas para enterobactérias 40 45,5

Total de amostras coletadas 88 100,0

54

Quadro 2. Frequencia absoluta (n) e relativa (%) de enterobactérias isoladas de canários belgas (Serinus canaria) resistentes a antibióticos Bactéria (n) AMO AMP NAL TET CLO GEN SUL POL NEO ENR SUT STR

n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)

Pantoea agglomerans (22) 18 (81,9) 16 (72,7) 4 (18,2) 1 (4,5) 1 (4,5) 2 (9,1) 9 (40,9) 1 (4,5) 5 (22,7) 1 (4,5) 1 (4,5) 8 (36,4) Serratia liquefaciens (11) 10 (90,8) 10 (90,9) 5 (45,4) 3 (27,3) 2 (18,2) - 5 (45,4) 3 (27,3) 5 (45,4) - 2 (18,2) 5 (45,4) Enterobacter aerogenes (8) 8 (100,0) 8 (100,0) 5 (62,5) 3 (37,5) 3 (37,5) 1 (12,5) 4 (50,0) 1 (12,5) 3 (37,5) 1 (12,5) 4 (50,0) 3 (37,5) Enterobacter cloacae (5) 5 (100,0) 4 (80,0) - - - - 3 (60,0) - - - - 4 (80,0) Escherichia coli (4) 1 (25,0) 1 (25,0) 1 (25,0) 1 (25,0) - - 1 (25,0) - - 1 (25,0) 1 (25,0) 3 (75,0) Hafnia alvei (3) 1 (33,3) 1 (33,3) - - - 1 (33,3) 1 (33,3) - 1 (33,3) - - 1 (33,3) Cronobacter sakazakii (3) 2 (66,6) 3 (100,0) 2 (66,6) 1 (33,3) 1 (33,3) - 2 (66,6) - 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,3) 2 (66,6) Serraria rubidaea (2) 2 (100,0) 2 (100,0) - - 1 (50,0) - 1 (50,0) 1 (50,0) - - 1 (50,0) 1 (50,0) Salmonella enterica* (1) 1 (100,0) - - - - - - - - - - 1 (100,0) Shigella sonnei (1) - - - - - - - - - - - - Klebsiella pneumoniae (1) 1 (100,0) 1 (100,0) - - - - - - - - - -

Total de Enterobacterias n=61 49 (80,3) 46 (75,4) 17 (27,9) 9 (14,7) 8 (13,1) 4 (6,5) 26 (42,6) 6 (9,8) 15 (24,6) 4 (6,5) 10 (16,4) 28 (45,9) * Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa), AMO= Amoxicilina, AMP= Ampicilina, NAL= Ácido Nalidixico, TET= Tetraciclina, CLO= Cloranfenicol, GEN= Gentamicina, SUL= Sulfonamida, POL= Polimixina B, NEO, Neomicina, ENR= Enrofloxacina, SUT= Sulfazotrim (Sulfametoxazol+trimetoprim), STR= Streptomicina.

55

Quadro 3. Multirresistência de enterobactérias isoladas de Canários belgas (Serinus canaria)

Nº de antibióticos Nº de enterobactérias resistentes (%)

Pelo menos 1 54 (88,5)

>1 49 (80,3)

>2 33 (54,1)

>3 24 (39,3)

>4 15 (24,6)

>5 14 (22,9)

>6 12 (19,7)

>7 8 (13,1)

>8 6 (9,8)

>9 4 (6,5)

>10 1 (1,6)

56

8 CONCLUSÕES

Esses resultados demonstram que canários belgas criadas em cativeiro podem alberga

bactérias Gram-negativas da família Enterobactereaceae prejudiciais para a saúde animal e

humano, tais como Salmonella enterica subsp enterica (rugosa) e Escherichia coli.

Também se constatou um alto índice de cepas resistentes, apresentando cepas

multirresistente, o que pode gerar um possível risco para a saúde dos criadores e demais

pessoas que participavam do evento.

Além disso, a pesquisa dos genes de virulência de E. coli revelou a presença de cepa

com potencial de se tornar patogênicas para aves APEC. A investigação destas questões é

importante para avaliar a patogenicidade, o potencial zoonótico e os fatores de riscos

envolvidos tanto para a saúde humana, quanto para a saúde animal.

57

9. PERSPECTIVAS

A tendência para os próximos anos é que aumente cada vez mais o interesse pela

criação de canários belgas em diversas partes do mundo, e isso favorecerá um maior contato

com o homem. A presença de bactérias do gênero Salmonella spp. em canários evidenciados

nas últimas publicações científicas mostra que esse micro-organismo pode vir a ser um

problema para os criadores e com isso preocupação com questões de ordem sanitárias deverá

ter mais destaque. Escherichia coli também deve ser outro patógeno a qual as atenções

poderão ocorrer entre pesquisadores e criadores, visto a possibilidade de carrearem

importantes genes de virulências que as tornam patogênicas para a ave e também para

humanos. Sendo assim, pesquisas deverão ocorrer com mais intensidade para que se observe o

status sanitário dessas aves diante da presença desses patógenos.

58

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71

APÊNDICE

72

APÊNDICE A - Momentos expopássaro 2016. A – Local que pessoas transitavam onde no

qual foram alojadas as aves; B – Galeria de exposição das aves; C; momentos com o

presidente da União Cearense de Ornitologia (UNICO), William Cardoso Maciel.

73

APÊNDICE B - Momento em que ocorreu processamento das amostras.

APÊNDICE C - Momentos do processamento das amostras. A – Placa de MacConkey com

crescimento de Escherichia coli; B – Placas de teste de sensibilidade antimicrobiana

(antibiograma) C; Bactérias em TSI; D Agar nutriente contendo a espécie Salmonella enterica

subsp enterica (rugosa) isolada no presente estudo.

74

ANEXO

75

ANEXO A – CERTIFICADO CEUA

Comitê de Ética para o Uso de Animais

Av. Paranjana, 1700 – Itaperi

CEP 60740-903 – fone 3101-9890

ceua_uece@uece.com.br – www.uece.br/ceua

CERTIFICADO

Certificamos que o Projeto de Pesquisa intitulado “LEVANTAMENTO,

TIPIFICAÇÃO E PERFIL DE SENSIBILIDADE E PATOGÊNESECIDADE

DE ENTEROBACTÉRIAS EM CANÁRIOS BELGAS (Serinus canaria) DA

REGIÃO NORDESTE” registrado sob o 0515351/2016, tendo como

pesquisadora principal WILLIAM CARDOSO MACIEL, está de acordo

com os Princípios Éticos de Experimentação Animal, adotados pelo

Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do

Ceará (CEUA – UECE), tendo sido aprovado em 04 de março de 2016.

Este certificado expira-se em 04 de março de 2020.

Fortaleza, 16 de março de 2016.

Maria Erivalda Farias de Aragão

Presidente CEUA-UECE

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ANEXO B – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO PRIMEIRO ARTIGO.

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