UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

LAÍS QUINTEIRO TOBALDINI

CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DO FATOR TECIDUAL EM PACIENTES

COM SÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDE E TROMBOSE

CHARACTERIZATION OF THE EXPRESSION OF TISSUE FACTOR IN PATIENTS WITH

ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME AND TROMBOSIS

CAMPINAS

2018

LAIS QUINTEIRO TOBALDINI

CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DO FATOR TECIDUAL EM PACIENTES

COM SÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDE E TROMBOSE

CHARACTERIZATION OF THE EXPRESSION OF TISSUE FACTOR IN PATIENTS WITH ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME AND TROMBOSIS

Dissertação apresentada à Faculdade de

Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do

título de Mestra em Ciências, na área de Concentração Patologia Clínica.

Dissertation presented to the Faculty of

Medical Sciencis Institute of the University of Campinas in partial

fulfillment of the requirements for the degree of Master of Sciencis, in the area

of Clinical Pathology

ORIENTADORA: Prof.ª Drª Fernanda Loureiro de Andrade Orsi

COORIENTADORA: Drª Bruna de Moraes Mazetto Fonseca

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LAÍS QUINTEIRO TOBALDINI, E ORIENTADO PELA PROFª. DRª FERNANDA LOUREIRO DE ANDRADE ORSI

CAMPINAS

2018

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES, 01-P-4353/2015; CAPES,

01-P-1743/2016

Ficha catalográfica Universidade

Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Ciências

Médicas Maristella Soares dos Santos -

CRB 8/8402

Tobaldini, Laís Quinteiro, 1987-

T551c Caracterização da expressão do fator tecidual em pacientes com

síndrome antifosfolípide e trombose / Laís Quinteiro Tobaldini. –

Campinas, SP : [s.n.], 2018.

Orientador: Fernanda Loureiro de Andrade

Orsi. Coorientador: Bruna de Moraes Mazetto

Fonseca.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas,

Faculdade de Ciências Médicas.

1. Síndrome antifosfolipídica. 2. Tromboplastina. 3. Trombose. 4.

Doenças autoimunes. I. Orsi, Fernanda Loureiro de Andrade, 1975-. II.

Fonseca, Bruna de Moraes Mazetto, 1987-. III. Universidade Estadual de

Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Characterization of the tissue factor expression in

patientes with antiphospholipid syndrome and thrombosis

Palavras-chave em inglês:

Antiphospholipid syndrome

Thromboplastin

Thrombosis

Autoimmune

diseases Área de concentração: Patologia Clínica

Titulação: Mestra em Ciências

Banca examinadora:

Fernanda Loureiro de Andrade Orsi

[Orientador] Luis Fernando Bittar Sckayer Danyelle Romana Rios Data de defesa: 19-12-2018

Programa de Pós-Graduação: Ciências Médicas

ORIENTADOR: PROFª DRª FERNANDA LOUREIRO DE ANDRADE ORSI

COORIENTADOR: DRª BRUNA DE MORAES MAZETTO FONSECA

MEMBROS:

1. PROF. DR. FERNANDA LOUREIRO DE ANDRADE ORSI

2. PROF. DR. DANYELLE ROMANA ALVES RIOS

3. PROF. DR. LUIS FERNANDO BITTAR SCKAYER

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no SIGA/Sistemas de Fluxo de

Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO

LAÍS QUINTEIRO TOBALDINI

Data: DATA DA DEFESA 19/12/2018

AGRADECIMENTOS

A Deus, aos meus pais pelo seu amor incondicional.

À minha orientadora Profa. Dra. Fernanda Orsi, agradeço pela oportunidade,

por todo o aprendizado e paciência ao longo desses anos.

À Dra. Bruna Mazetto, minha coorientadora e amiga, que me ajudou em

todos os momentos dessa jornada.

Às amigas do laboratório, Fernanda, Cleyse e Dra. Sabrina, pelo

companheirismo, insentivo e ajuda nos momentos mais difíceis.

À Profa Dra Joyce Annichino-Bizzacchi e a todos do laboratório de

Hemostasia

Aos funcionários do Hemocentro e do Hospital de clínicas (HC) por ajudarem

na realização dessa pesquisa.

Aos pacientes, pois sem eles, a realização deste trabalho não seria possível.

À agência financiadora, CAPES.

A todos os meus familiares e amigos, pelo apoio e por torcerem pela

realização desse projeto.

A todos os professores que fizeram parte da minha formação, e que, direta

ou indiretamente me ajudaram a chegar até aqui.

RESUMO

A síndrome antifosfolípide (SAF) é uma doença caracterizada pela ocorrência

de trombose ou complicações gestacionais. A formação de trombos pode ocorrer

indistintamente em qualquer veia, artéria ou capilar do organismo, atingindo

diferentes órgãos ou tecidos. A SAF é uma das raras condições clínicas em que os

pacientes podem apresentar trombose venosa, trombose arterial ou da

microcirculação. Entretanto, os mecanismos por trás do estado de

hipercoagulabilidade na SAF ainda não foram totalmente elucidados.

Desta forma, o objetivo do presente estudo é avaliar a associação dos níveis

de marcadores da coagulação e de marcadores inflamatórios com a trombose

provocada pela SAF. Para tal, realizamos um estudo de caso-controle em que foram

comparados os níveis de fator tecidual circulante (TF), fator de Von Willebrand

(FVW), ADAMTS13, fator de necrose tumoral (TNF)-, interleucinas (IL)- 6, -8, e

proteína C reativa de alta sensibilidade (hs-PCR) de pacientes com SAF trombótica

ou tromboembolismo venoso não provocado (TEV) com controles sem histórico de

trombose. Além disso, também avaliamos a expressão do FT em micropartículas de

monócitos (CD 14+), de células endoteliais (CD 34+ e CD 144+) e de plaquetas (CD

41+) nos pacientes de SAF comparando-os com controles saudáveis. Os níveis de

FT circulante estavam aumentados em pacientes com SAF primária e na SAF

secundária, em relação a TEV e controles. Os níveis dos marcadores inflamatórios

TNF-, IL-6 e hs-PCR estavam aumentados na SAF e também no TEV, em

comparação com os controles. A correlação entre níveis circulantes de FT e os

marcadores inflamatórios TNF-, IL-6 foi fraca. Pacientes com SAF apresentaram

também maior quantidade de micropartículas de células endoteliais (CD 34+) e

monócitos (CD 14+) com expressão de FT em comparação com os controles, porém

a diferença não foi estatisticamente significante.

Observamos que níveis elevados de FT e de marcadores inflamatórios estão

associados às tromboses provocadas pela SAF. Em pacientes com TEV, também

observamos aumento dos marcadores da atividade inflamatória, embora sem

associação com aumento dos níveis de FT. Os achados desse estudo nos permitem

associar o aumento da expressão do FT com a ocorrência de tromboses na SAF, em

contraste com a não associação do FT com as tromboses espontâneas.

Palavras chaves: antifosfolípide, fator tecidual, trombose, imuno trombose.

ABSTRACT

Antiphospholipid syndrome (APS) is characterized by the occurrence of

thrombosis or gestational complications. The formation of thrombi can occur

indistinctly in any vein, artery or capillary of the body, reaching different organs or

tissues. APS is one of the rare disorders in which patients may present with venous

thrombosis, arterial thrombosis or thrombosis of the microcirculation. The

mechanisms behind the hypercoagulability state in APS have not yet been fully

elucidated. Knowledge of the etiology of thrombosis in APS is necessary to improve

treatment.

Thus, the aim of the present study is to determine the association between

levels of coagulation markers and inflammatory markers with thrombosis caused by

APS. A case-control study was conducted to evaluate the association of circulating

tissue factor (TF), von Willebrand factor (FVW), ADAMTS-13, TNF-, interleukin (IL)

-6, -8, C- reactive protein (CRP) with thrombotic APS and unprovoked venous

thromboembolism (VTE), when compared to controls with no history of thrombosis.

Circulating TF levels were increased in patients with primary APS and secondary

APS, compared to VTE and controls. The levels of the inflammatory markers TNF-,

IL-6 and CRP were increased in APS and also in VTE patients, as compared to

controls. In addition, we also evaluated the expression of FT in monocytes (CD14 +),

endothelial cells (CD34 + and CD144 +) and platelet (CD41 +) microparticles in SAF

patients compared with healthy controls. The correlation between circulating FT

levels and the inflammatory markers of TNF-, IL-6 was poor. Patients with APS also

had a greater amount of endothelial cell microparticles (CD34 +) and monocytes

(CD14 +) with TF expression when compared to controls. However, the statistical

difference was not significant.

We observed that high levels of TF and inflammatory markers are associated

with thrombosis caused by APS. This result suggests that TF has an effect on the

occurrence of thrombosis in APS. It is possible that the hypercoagulability in APS is

related to the inflammatory activity of the disease, but the levels of inflammatory

cytokines were similar among the groups of thrombosis. The findings of this study

may support clinical studies for TF modulation with the aim of preventing or treating

APS-related thrombosis.

Keywords: antiphospholipid, tissue factor, thrombosis, immune-thrombosis

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Mecanismo sugerido do anticorpo antifosfolípide como causa da

trombose.....................................................................................................................

15

Figura 2- A interação do anticorpoantifosfolípide com a anti-β2-GPI................. 16

Figura 3- Formas celulares e não celulares do FT. ... ............................................. 17

Figura 4- Composição dos tubos de citometria ...................................................... 24

Figura 5- Representação da identificação quantificação das Micropartículas.............. 25

Figura 6- Fluxograma da seleção dos participantes e motivos da exclusão.............. 27

Figura 7- Marcadores da coagulação e os marcadores inflamatórios avaliados nos

pacientes e controles...................................................................................................

62

Figura 8- Correlação do FT com outros marcadores de coagulação e marcadores

inflamatórios avaliados nos controles..........................................................................

64

Figura 9- Resultados das análises de citometria para Micropartículas de células

endoteliais (CD34+)...................................................................................................

69

Figura 10- Resultados das análises de citometria de fluxo para micropartículas

de células endoteliais (CD34+) e FT ..............................................................

69


de monócitos (CD14+).........................................................................................

69


de monócitos (CD14+) e FT...............................................................................

69


de plaquetas (CD41+).........................................................................................

70


de células endoteliais (CD 144+).......................................................................

70

Figura 15- Resultados das análises de citometria de fluxo de positividade de

micropartículas e FT...............................................................................................

70

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Dados demográficos dos pacientes com trombose (TEV, SAF primária,

SAF secundária) e controles. ............................................................................. 28

Tabela 2- Prevalência de fatores de risco cardiovascular nos paciente com TEV,

SAF primária , SAF secundária e controles........................................................ 29

Tabela 3- Dados laboratoriais dos pacientes com trombose (TEV, SAF primária,

SAF secundária) e controles .............................................................................. 60

Tabela 4- Comparação dos pacientes de SAF com ocorrência de trombose

venosa e trombose arterial ................................................................................. 65

Tabela 5- Comparação entre pacientes com SAF conforme a ocorrência, ou

não, de múltiplos eventos trombóticos ............................................................... 66

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Critérios clínicos e laboratoriais necessários para o diagnóstico de

SAF. .................................................................................................................... 13

.

SUMÁRIO

1. Introdução .................................................................................................................. 12

1.1. Síndrome Antifosfolípide .....................................................................................12

1.1.1. Aspectos clínicos da trombose na SAF. ............................................................ 13

1.2. Hemostasia e Trombose ..................................................................................... .14

1.2.1. O anticorpo antifosfolípide como causa da trombose ....................................... .15

2. Justificativa............................................................................................................... .18

3. Objetivos. .................................................................................................................. .19

4. Materiais e métodos .................................................................................................. .20

4.1. Seleção dos pacientes e controles .................................................................... .20

4.2. Avaliação clínica dos pacientes e controle .......................................................... .20

4.3. Avaliação dos marcadores de coagulação e inflamação......................................21

4.3.1. Coleta e armazenamento das amostras ............................................................ .21

4.3.2. Quantificação dos níveis plasmáticos do FT ..................................................... .21

4.3.3. Quantificação dos níveis plasmáticos do FVW ..................................................... ..22

4.3.4. Mensuração da atividade da ADAMTS 13 ..................................................... ....22

4.3.5. Quantificação dos níveis séricos de IL-6 ....................................................... ....22

4.3.6. Quantificação dos níveis séricos de TNF-α ..................................................... ...23

4.3.7. Quantificação dos níveis séricos de IL-8.............................................................23

4.3.8. Quantificação dos níveis séricos de hs-PCR .................................................. ...23

4.4. Avaliação da presença do fator tecidual em micropartículas de células

endoteliais, plaquetas e monócitos................................................................................

4.4. Análise estatística.............................................................................................. ....26

5. Resultados .............................................................................................................. ....27

5.1. Características demográficas e clínicas dos pacientes e controles ................... ....27

5.2. Avaliação do FT circulante no plasma ............................................................... ....30

23

5.3. Correlação dos níveis de FT circulate com os níveis de citocinas inflamatórias,

FVW e ADAMTS 13 ......................................................................................... .59

5.3.1 Avaliação de interleucinas conforme a manifestação clínica da

SAF. ..........................................................................................................................64

5.4. Quantificação das micropartículas circulantes................................................... 67

6. Discussão ................................................................................................................71

7. Referências. ............................................................................................................ 77

8. Anexos. ................................................................................................................... 82

Anexo I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido....................82

Anexo II- Questionários para controles saudáveis............................86

Anexo III- Avaliação dos pacientes com SAF e trombose..................88

Anexo IV- Autorização para inclusão do artigo..................................90

Anexo V- Parecer do comitê de ética..............................................92

12

1. INTRODUÇÃO

1.1. Síndrome Antifosfolípide

A síndrome antifosfolípide (SAF) é uma condição pró-trombótica, adquirida,

que se caracteriza pela ocorrência de trombose ou complicações gestacionais (1).

Ocorre devido à produção de autoanticorpos, chamados anticorpos antifosfolípides,

que atuam contra proteínas que se ligam aos fosfolípides de membranas celulares,

como de plaquetas e células endoteliais (2). A proteína alvo principal desses

anticorpos é a beta2-glicoproteína I (β2GPI) (3).

A formação de trombos pode ocorrer indistintamente em qualquer veia, artéria

ou capilar do organismo, atingindo diferentes órgãos e tecidos (4). A fisiopatogenia

da formação dos trombos não está bem elucidada, mas possivelmente há ativação

de plaquetas e células endoteliais, e, consequentemente, hiperestímulo à

coagulação (5).

A apresentação clínica da SAF é heterogênea, com diversas complicações

trombóticas, obstétricas ou mistas. Alguns casos apresentam, ainda, manifestações

pouco usuais, como anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica imune, livedo

reticular, alterações renais, cardíacas e neurológicas (6).

O diagnóstico da SAF baseia-se na detecção de pelo menos um critério clínico e

um critério laboratorial (7,8) descritos no quadro 1. A doença é classificada em SAF

primária, quando não há doença desencadeante, e SAF secundária, quando é

causada por doença autoimune sistêmica, como o lúpus eritematoso sistêmico

(LES), principalmente.

13

Quadro 1 : Esta tabela descreve os critérios clínicos e laboratoriais necessários para

o diagnóstico de SAF

1.1.1. Aspectos clínicos da trombose na SAF

SAF é uma das poucas condições clínicas em que os pacientes podem

apresentar tanto trombose venosa como trombose arterial, sendo que a trombose

venosa profunda (TVP) dos membros inferiores e o AVCi são as manifestações

trombóticas mais comuns (4). Até 20% dos jovens com tromboembolismo venoso

(TEV), e até 10% dos com acidente vascular cerebral isquêmico (AVCi), são

diagnosticados com SAF (4). O risco de recidiva dos eventos trombóticos é alto,

acima de 40%, nos casos não tratados (4).

Estudos clínicos sugerem que pacientes com SAF e trombose arterial,

principalmente AVCi, teriam pior prognóstico e poderiam se beneficiar com o uso de

terapia mais agressiva que a anticoagulação oral convencional (9, 10, 11, 12)

Critério Clínico (pelo menos 1) Critério Laboratorial (pelo menos 1)

Trombose vascular

Tromboembolismo venosa (TEV)

Trombose arterial

Trombose da microcirculação

Positividade de pelo menos 1 dos 3

testes; em 2 ocasiões distintas, com

12 semanas de intervalo entre os testes.

Morbidade obstétrica

Óbito fetal ≥ 10 semanas, feto

morfologicamente normal

Parto prematuro antes de 34 semanas de

gestação por causa de pré-eclampsia,

eclampsia ou insuficiência placentária

Abortos de repetição (≥3 abortos antes de

10 semanas de gestação), sem outra

causa identificada

Anticoagulante lúpico

Anticardiolipina IgM ou IgG, em título

médio ou alto (i.é. > 40 GPL ou MPL)

Anticorpo anti-beta2 glicoproteína (IgM ou

IgG > percentil 99)

14

O tratamento da trombose na SAF é realizado com terapia anticoagulante definitiva,

sendo que alguns casos se beneficiam da associação de anticoagulantes com

antiagregantes. Além disso, o controle de fatores cardiovascular, como hipertensão,

obesidade e dislipidemia, também pode contribuir para a prevenção de eventos

trombóticos (11, 13). Entretanto, mesmo com tratamento adequado, as taxas de

recidiva da trombose mantêm-se altas, em torno de 15% (14).

1.2. Hemostasia e Trombose

Hemostasia é o conjunto de mecanismos fisiológicos responsáveis pela

manutenção da fluidez do sangue dentro dos vasos. Dentre esses mecanismos,

destacam-se as cascatas de coagulação e fibrinólise, que agem para prevenir a

formação excessiva de coágulos ou sua remoção inapropriada. Os processos de

coagulação e fibrinólise iniciam-se concomitantemente, a partir do estímulo

endotelial. Quando ocorre lesão ou ação de mediadores inflamatórios sobre as

células endoteliais, há expressão do fator tecidual (FT) e ativação concomitante de

plaquetas e do ativador do plasminogênio tecidual (tPA) (15).

O FT é responsável pelo início da cascata da coagulação. Quando exposto

pelas células subendoteliais, o FT se liga ao fator (F) VII circulante e o ativa. O

complexo FT-FVIIa será responsável pela ativação dos FIX e FX, e este último

levará à geração de pequenas quantidades de trombina (16). A trombina gerada é

capaz de ativar, na superfície das plaquetas, os fatores XI, VIII e V, que por sua vez

irão levar à ativação do FX e de quantidades maiores de trombina. A trombina, em

quantidades maiores, converte o fibrinogênio em fibrina. A trombina também dá

início à ativação de inibidores da coagulação: TFPI (tissue factor pathway inhibitor) e

proteína C (PC). Nas células do endotélio, a trombina liga- se à trombomodulina

(TM) e receptor endotelial da proteína C (EPCR), e esse complexo promove a

conversão da PC em PC ativada (PCA). A PCA, em conjunto com a proteína S,

inativa os fatores Va e VIII (17). O desequilíbrio dos processos de hemostasia

podem levar a hipercoagulabilidade e a trombose.

15

1.2.1. O anticorpo antifosfolípide como causa da trombose

O mecanismo que desencadeia a ocorrência de trombose na SAF não é

conhecido, porém alguns mecanismos patológicos são sugeridos. As células

endoteliais, monócitos e plaquetas possivelmente tem papel central na indução da

trombose na SAF. Anticorpos antifosfolípides, ou o complexo formado entre os

anticorpos e a β2GPI, podem levar a ativação de plaquetas e células endoteliais,

induzindo, desta forma, a expressão de proteínas de adesão, como a e-selectina (5),

e do FT (18). Anticorpos antifosfolípides também são capazes de ativar plaquetas,

aumentando a expressão da glicoproteína 2b-3a e a síntese de tromboxane (5).

Esses mecanismos são capazes de promover um estado pró-trombótico. A

ocorrência de trombose dependeria então de outros fatores, como a ativação do

sistema complemento, condições inflamatórias, uso de estrógenos e a interação com

proteínas da coagulação, como a proteína C, a protrombina e plasmina (5). A Figura

1 ilustra os potenciais mecanismos fisiopatológicos da hipercoagulabilidade na SAF,

e a Figura 2 ilustra a interação do anticorpo antifosfolípide com a β2-GPI.

Adaptado de Ruiz-Irastorza et al.. Lancet 2010; 376: 1498–1509

Figura 1: Mecanismo sugerido de interação do anticorpo antifosfolipide com células

endoteliais, monócitos e plaquetas.

Legenda: Células endoteliais e monócitos expressariam moléculas de adesão, o que levaria à

16

regulação positiva na produção do FT, e consequentemente a um estado pró-trombótico;

consequentemente, as plaquetas expressariam glicoproteína 2b-3a, que levaria a ativação do sistema

complemento, induzindo ao estado pró-trombótico. A interação do anticorpo antifosfolípide com as

proteínas da coagulação, a ativação do sistema complemento e outras condições pró-coagulantes,

como uso de estrógenos, levariam a trombose efetivamente.

Figura 2: A interação do anticorpo antifosfolípide com a β2-GPI

Legenda: A figura mostra a provável fisiopatologia inicial da ativação celular pelo anticorpo anti-

β2GPI. Anti- β2GPI se ligaria a β2GPI, que por sua vez, está ligada às membranas célulares. O

complexo formado por elas estimularia o endotelio, levando a um deslocamento da fosfatidilserina e

consequente exposição das cargas negativas.. Esse evento levaria a ativação plaquetária, ativação

endotelial e ativação dos monócitos. A cascata do FT ocorreria após o deslocamento da

fosfatidilserina na membrana, e consequente estímulo no endotélio. O FT, que primeiramente estava

em estado críptico (inativo), ativa-se, mudando sua forma, ligando-se ao FVIIa e ao FX, dando inicio a

cascata da coagulação.

Além dos mecanismos descritos acima, a ativação celular pela ação do

anticorpo antifosfolípide poderia provocar também a liberação de micropartículas de

células endoteliais e de monócitos na circulação. Micropartículas são vesículas

provenientes das membranas de células ativadas que mantém a expressão de

antígenos de superfície das células de origem. A geração de micropartículas na SAF

poderia levar a circulação do FT no sangue (19).

Segundo Breitensein (20), o FT está presente na circulação sanguínea em

formas celulares e não celulares. Nas formas celulares, o FT é expresso na

Célula em repouso

17

superfície das células endoteliais ou monócitos, principalmente. O FT é pouco

expresso em condições basais, mas sua expressão poderia ser estimulada pela

proteína C reativa e LDL oxidado. As formas não celulares do FT ocorreriam pela

liberação de micropartículas. O FT não celular pode ser mensurado pela

quantificação de FT circulante ou através da avaliação das micropartículas. A

liberação de micropartículas que expressam FT está ilustrada na Figura 2.

Ainda segundo Breitensein (20), existem dúvidas quanto a expressão do FT em

plaquetas, alguns autores não detectaram antígenos ou atividade de FT em

plaquetas, outros descreveram um FT funcional em plaquetas, ou seja, o FT existiria

a partir da absorção de outras fontes, como as micropartículas

Adaptado de Breitenstein, A. et al., Circulation Jornal, vol. 74, 2010

Figura 3: Formas celulares e não celulares do FT

Legenda: Figura 2 mostra o FT presente em sua forma não celular, na circulação sanguínea em

forma de micropartículas; e em suas formas celulares, nos neutrófilos, monócitos, eosinófilos e

plaqueta

18

2. JUSTIFICATIVA

Um dos principais mecanismos fisiopatológicos descritos na SAF é a ativação

da cascata do FT pelos anticorpos antifosfolípides, com consequente gatilho para

coagulação. Entretanto, do ponto de vista clínico, a associação entre níveis de FT e

trombose provocada pela SAF não está bem caracterizada. Desta forma, a avaliação

dos níveis circulantes de FT na SAF auxilia no entendimento das causas de

trombose relacionadas a doença e na distinção fisiopatológica entre a SAF e outras

trombofilia.

19

3. OBJETIVOS

O objetivo principal é determinar a associação entre FT e complicações

trombóticas da SAF em um estudo caso-controle. Pacientes com complicações

trombóticas da SAF, indivíduos com trombose venosa (TEV) espontânea e

indivíduos sem histórico de trombose foram comparados conforme os seguintes

parâmetros:

a- Níveis plasmáticos do antígeno do FT, e sua relação com diversas

manifestações clínicas da SAF como: doença primária ou secundária,

trombose venosa ou arterial, episódio trombótico único ou múltiplas

tromboses.

b- Marcadores de inflamação (IL6, IL8, TNF-α e hs-PCR), e suas correlações

com níveis de FT circulante.

c- Outros marcadores de coagulação (FVW e ADAMTS13), e suas correlações

com níveis de FT circulante.

d- Presença de micropartículas circulantes que expressam FT

20

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Seleção dos pacientes e controles

Os pacientes do estudo foram recrutados dentre os pacientes com diagnóstico

confirmado de SAF, do ambulatório de Hemostasia do Hemocentro da UNICAMP, no

período de novembro de 2014 a fevereiro de 2016.

Os critérios de inclusão para os pacientes com SAF primária foram:

diagnóstico confirmado de SAF com histórico de pelo menos um evento trombótico

prévio, sem doença autoimune subjacente. Foram excluídos pacientes com

diagnóstico de neoplasia ativa, gravidez ou SAF com complicações obstétricas

isoladas. Posteriormente, pacientes com doença autoimune subjacente foram

classificados como portadores de SAF secundária e os demais como portadores de

SAF primária.

Os pacientes com TEV espontânea foram recrutados dentre os pacientes do

ambulatório de Hemostasia do Hemocentro da UNICAMP durante estudo prévio,

entre março de 2009 e junho de 2011. Os pacientes selecionados desse estudo

foram pareados por sexo e idade com os pacientes com SAF. Os critérios de

inclusão foram trombose venosa sem fator desencadeante (trombose não

provocada) e os critérios de exclusão foram doença autoimune, inflamatória ou

neoplásica e gestação. Esses pacientes foram utilizados como controles de

trombose não mediada por mecanismo imune, ou controles doentes.

Os controles saudáveis foram recrutados entre pessoas da mesma região

geográfica dos pacientes e pareados por sexo e idade, no mesmo período em que

os pacientes foram recrutados. Foram excluídos do grupo controle indivíduos com

histórico de trombose, AVCi ou doença cardiovascular, neoplasia, doença

inflamatória ou autoimune e gestantes.

4.2. Avaliação clínica dos pacientes e controle

Os pacientes e controles que aceitaram participar do estudo preencheram o

termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), anexo I. Após a assinatura do

termo, os pacientes foram encaminhados para coleta de amostras e avaliação

21

clínica. Os pacientes e controles foram avaliados clinicamente através de

autorrelato, utilizando-se formulário padronizado (anexo II), contendo os dados da

anamnese (nome, sexo, data de nascimento, descrição do evento trombótico,

recidiva da trombose e comorbidades) e os dados do exame físico (medidas

hematimétricas como peso, altura, índice de massa corpórea e circunferência

abdominal).

4.3. Avaliação dos marcadores de coagulação e inflamação

4.3.1. Coleta e armazenamento das amostras

A coleta de amostras foi feita por punção venosa periférica, e o sangue

distribuído em 4 tubos (1 tubo seco, 1 tubo com EDTA e 2 tubos com citrato de sódio

3,2 %). O tubo de EDTA foi destinado para a análise de hemograma, que foi

realizada pelo Laboratório de Hematologia do Hemocentro. Após a coleta, os tubos

com citrato permaneceram em posição vertical e foram transportados até o

laboratório de Hemostasia do Hemocentro dentro de racks para tubos. A separação

do plasma foi realizada usando dupla centrifugação do material a 2465g por 15

minutos a 22 °C. Imediatamente após a centrifugação, as amostras de plasma foram

separadas em alíquotas de 250μl e armazenados em freezer a -80oC. As amostras

de soro (tubo seco) foram centrifugadas a 1258g durante 10 minutos a 22 °C e logo

em seguida, foram separadas em alíquotas de 250μl e armazenadas em freezer a -

80oC. Todas as amostras foram submetidas ao mesmo processamento, respeitando

o tempo máximo de 2 horas entre a coleta e o início da centrifugação. Os

experimentos foram realizados no laboratório de Hemostasia do Hemocentro.

4.3.2. Quantificação dos níveis plasmáticos do FT

A avaliação dos níveis circulantes de FT foi realizada usando técnica de ELISA

(enzyme-linked immunosorbent assay) (21) com reagentes comerciais (Sekisui

Diagnostics- IMUBIND® Tissue Factor ELISA). As amostras de plasma dos

pacientes e controles foram previamente diluídas a 1:4 e colocadas numa placa de

96 poços previamente recoberta com anticorpo monoclonal contra o FT. O FT do

plasma e o anticorpo contido na placa formam um complexo que é evidenciado pela

adição de um segundo anticorpo (anti-FT peroxidase- conjugado) e do substrato

22

colorimétrico TMB (3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina). A reação foi lida por absorbância no

comprimento de onda de 450nm. Os resultados foram expressos em pg/mL em

espectrofotômetro.

4.3.3. Quantificação dos níveis plasmáticos do FWV

Os níveis de antígeno de FWV (FVWAg) no plasma foram mensurados

utilizando-se a técnica de ELISA. Placas de ELISA de alta aderência (MaxiSorbR,

Nunc, Rochester, NY, USA) foram cobertas com anti-FVW humano (A0082;

DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) e as amostras de plasma diluído foram

transferidas para a placa. Após incubação, o anticorpo anti-FVW peroxidase

conjugado (P0226; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA) e o

substratocromogênico foram adicionados. A absorbância foi lida em

espectrofotômetro, no comprimento de onda de 492/620nm e expressa em U/dl.

4.3.4. Mensuração da atividade da ADAMTS13

A atividade da ADAMTS13 no plasma foi avaliada pelo kit comercial

Technozym ADAMTS13 Activity (ADAMTS13 GST-VWF73 activity) (Technoclone

GmbH, Viena, Austria). O método utiliza o peptídeo sintético FVW73 marcado com

glutationa S-transferase (GST). A utilização do kit foi realizada de acordo com as

instruções do fabricante. A absorbância foi lida em espectrofotômetro, no

comprimento de onda de 450nm na leitora SpectraMax 190 ELISA Reader

(Molecular Devices, Union City, CA, USA). Os resultados foram expressos em % de

atividade.

4.3.5. Quantificação dos níveis séricos de IL-6

A avaliação dos níveis circulantes de IL-6 foi realizada com o soro dos

pacientes através de kit comercial (ELISA Human IL-6 Quantikine HS ELISA Kit R&D

Systems Quantikine®) do tipo ELISA. A IL-6 presente no soro se liga ao anticorpo

monoclonal contido na placa do kit, a reação é evidenciada pela adição do segundo

anticorpo peroxidade e do substrato colorimétrico. A absorbância foi medida no

espectrofotômetro, no comprimento de onda de 490nm. Os resultados foram

23

expressos em pg/mL.

4.3.6. Quantificação dos níveis séricos de TNF-α

A quantificação dos níveis séricos de TNF-α foi realizada no soro dos pacientes

através de kit comercial ELISA (Human TNF-α, R&D Systems Quantikine® HS

ELISA High Sensitivity). A reação antígeno-anticorpo na placa é evidenciada pela

adição do segundo anticorpo peroxidade e do substrato colorimétrico TMB. A

absorbância medida no espectrofotômetro, no comprimento de onda de 490nm. Os

resultados foram expressos em pg/mL.

4.3.7. Quantificação dos níveis séricos de IL-8

A avaliação dos níveis séricos de IL-8 foi realizada através de kit comercial

ELISA (BD OptEIA™). A reação antígeno-anticorpo na placa é evidenciada pela

adição do segundo anticorpo peroxidade e do substrato colorimétrico TMB. A

absorbância foi medida no espectrofotômetro, no comprimento de onda de 450 nm.

Os resultados foram expressos em pg/mL.

4.3.8. Quantificação dos níveis séricos de hs-PCR

A análise de hs-PCR foi realizada no laboratório de Imunologia do Hospital de

Clínicas da Unicamp, por nefelometria, utilizando Kit ultra-sensível (C-Reactive

Protein Test System para aparelho BN ProSpec® Siemens Healthcare). Os

resultados foram expressos em mg/dL.

4.4. Avaliação da presença do fator tecidual em micropartículas de células

endoteliais, plaquetas e monócitos.

A identificação da presença de micropartículas (MP) circulantes, sua origem

celular e a quantificação da expressão do FT nas MP foram realizadas através de

citometria de fluxo associada a captação de imagem, como previamente descrito

(22, 23, 24).

Para esse experimento, foram utilizadas amostras de plasma previamente

24

armazenadas como descrito acima. A preparação das micropartículas para o

experimento consistiu em descongelar duas alíquotas de plasma (250 µl) em banho

de gelo, centrifugá-las a 20.500 g a 4°C durante 45 minutos e separar 400 µl do

sobrenadante para a realização do experimento. Para a quantificação das MP, as

amostras de plasma foram incubadas com anticorpos conjugados anti-anexina V,

com anticorpos marcadores específicos de membrana para indicação da origem

celular das MP, como anti-CD41 (plaquetas), anti-CD14 (monócitos), anti-CD144

(células endoteliais) e anti-CD34 (células endoteliais), e com anticorpo anti - FT

(CD142). A Figura 4 ilustra a composição dos tubos para citometria.

Figura 4: Composição dos tubos de citometria.

Legenda: Em cada tubo foi adicionado anti-CD142-FITC (anti-FT), anti-anexina V (APC) e buffer (PBS

+ CaCl). O tubo 1 foi marcado com anti-CD144-PE (células endotelias), o tubo 2 com anti- CD14-PE

(monócitos), o tubo 3 com anti-CD41-PE (plaquetas), o tubo 4 com anti-CD34-PE (células endotelias),

e o tubo 5 continha somente buffer (PBS + CaCl2).

As micropartículas foram identificadas primeiramente pela caracterização de

tamanho (entre 50nm e 1000nm) e localização (gate R1), como visto na Figura 5-a.

Depois, pela marcação do anticorpo anti-anexina V, utilizado como marcador de

MPs (Figura 5-b). Em seguida, consideramos a marcação do anticorpo contra

antígenos específicos

CD 142

+ CD 144

+

anti-anexin

a V

CD142 +

CD 14 +

anti-

anexina V

CD 142 +

CD 41 +

anti

anexina V

CD 142 +

CD 34

+ anti-

anexina

V

Branco

1 2 3 4 5

25

das membranas celulares (CD14, CD41, CD144 ou CD34), Figura 5-c. Por fim,

consideramos a marcação do anticorpo anti-FT CD142, Figura 5-d. A identificação e

quantificação das MPs foi realizada através do citômetro de fluxo Amnis

ImageStream® (EMD Millipore, EUA), utilizando o software específico do

equipamento (IDEAS®, EMD Millipore, EUA).

a. b.

Figura 5: Representação da identificação quantificação das Micropartículas

Legenda: a. Demonstra, na área destacada em azul, o gate R1 que corresponde à localização de

micropartículas. b. Na área destacada em verde, a Figura indica a positividade das micropartículas

[continuação] localizadas no gate R1 para a anexina V. c.Essa Figura mostra a positividade do

marcador de micropartículas (anexina V) em conjunto com a positividade do marcador de membrana

CD34 (células endoteliais) no gate correspondente a localização das micropartículas. d. Na área

c. d.

26

4.5. Análise estatística

Foram feitas análises descritivas através de tabelas de frequências para

variáveis categóricas e medidas de posição e dispersão para variáveis numéricas.

Para comparação de proporções foi utilizado o teste qui-quadrado ou teste exato de

Fisher. Para comparação dos parâmetros entre dois grupos foi utilizado o teste não

paramétrico de Mann-Whitney. Para comparação dos parâmetros entre três ou mais

grupos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste não paramétrico de

Dunn para múltiplas comparações. Para verificar a associação linear entre os níveis

de FT e os diferentes parâmetros da coagulação (FVW e ADAMTS13) e inflamação

(TNF-α, IL-6, IL-8, hs-PCR) realizamos o teste de correlação de Spearman, com

valores que variaram de -1 a 1. Valores próximos dos extremos indicaram correlação

negativa ou positiva, respectivamente, e valores próximos de zero não indicaram

correlação. A associação entre FT e TEV ou SAF foi determinada através de

modelos de regressão logística, conforme detalhado no ítem 5.2 desta dissertação.

O nível de significância adotado para os testes estatísticos foi 5% (P<0.05).

destacada em laranja, a Figura indica a positividade da anexina V, do marcador de membrana CD34

(células endoteliais) e do FT, localizados no gate R1.

27

5. RESULTADOS

5.1 Características demográficas e clínicas dos pacientes e controles

Nesse estudo foram incluídos 68 patientes com diagnóstico de SAF primária,

43 pacientes com SAF secundária (todos secundários a LES), 51 pacientes com

TEV. Todos os pacientes ja tinham diagnostico prévio.

Figura 6: Fluxograma da seleção dos participantes e motivos da exclusão.

Legenda: A figura mostra o fluxograma da seleção dos pacientes e controles e os motivos de

exclusão. TEV= tromboembolismo venoso; SAF= síndrome antifosfolípide; FT = fator tecidual

A mediana de idade foi 42 anos (IQR=28-51anos) nos pacientes com SAF

primária, 38 anos (IQR=26-48) na SAF secundária, 43 anos (IQR: 32-54) nos

pacientes com TEV e 42 anos (IQR=30-53) nos controles saudáveis. Os demais

dados demográficos dos pacientes e controles estão detalhados na tabela 1.

Pacientes com SAF, selecionados

consecutivamente

n=117

Pacientes com TEV não provocada foram incluídos

no estudo

n=51

11 pacientes

excluídos: 7 com

TEV provocada, 2

com neoplasia e 2

sem resultados de

FT (problemas

técnicos)

Pacientes com trombose não

provocada, selecionados

consecutivamente

n=62

4 pacientes

excluídos: 1 com

neoplasia, 2 sem

trombose e 3 por

falta de dados

clínicos

Controles saudáveis incluídos no estudo

n= 118

21 controles

excluídos por falta

de dados

Controles recrutados para o

estudo ent

re Novembro de

2013 e Fevereiro de 2016

n=139

Pacientes com histórico de trombose tratados durante o

recrutamento entre Novembro

de 2013 e Fevereiro de 2016

n=455

Pacientes com SAF trombótica foram

incluídos no estudo

n=111

28

SAF- Síndrome antifosfolípide TEV-Tromboembolismo venoso IQR- Interquartile range n= Número de indivíduos

Dentre os pacientes com SAF primária ou secundária (n=111), 79 pacientes

(72%) tiveram trombose venosa e 45 (41%) tiveram trombose arterial. Todos os

indivíduos com TEV tiveram apenas eventos venosos.

A prevalência de hipertensão, diabetes, dislipidemia e obesidade, que são

fatores de risco para doenças cardiovasculares, foi significativamente maior nos

Tabela 1: Dados demográficos e clínicos dos pacientes com trombose (TEV, SAF

primária, SAF secundária) e controles.

Controles (n=118)

TEV (n=51) SAF primária (n=68)

SAF secundária (n=43)

Feminino (%): Masculino 88:30 (74%)

32:19 (63%)

45:23 (66%)

36:7 (8%)

Idade da 1ª trombose, anos mediana (IQR)

37,0 (27,0- 51,1)

31 (22,3- 41,0)

26 (19-38)

1º evento trombótico, anos mediana ( IQR )

3,0 (2,0 – 4,0)

4,8 (2,1- 8,9)

5,0 (2,0-9,0)

Trombose única, n (%) 41 (81) 44 (65) 22 (51)

Trombose venosa no primeiro evento, n (%)

51 (100)

48 (71)

31 (72)

LAC (+), n (%)

58 (85)

31 (72)

aCL IgG (+), n (%)

18 (26,5)

18 (41,9)

aCL IgM (+), n (%)

1 (1,5)

6 (14)

aB2GP1, n (%)

32 (47)

29 (67)

29

pacientes com TEV e SAF em relação aos controles. Exceção apenas para

obesidade, que foi menos prevalente nos pacientes com SAF secundária,

possivelmente pelo fato da doença de base poder causar redução do peso corporal.

Tabela 2 demostram os dados clínicos dos pacientes e controles.

Tabela 2: Prevalência de fatores de risco cardiovascular nos paciente com TEV, SAF

primária , SAF secundária e controles.

Controles

(n=118)

TEV (n=51) SAF

primária

(n=68)

SAF

secundária

(n=43)

Valor de P*

Hipertensão(1) 3 (2.5%) 20 (71%) 18 (42%) 18 (42%) <0.0001

Diabetes(2) 4 (3%) 1 (2%) 7 (10%) 3 (7%) 0,15

Dislipidemia(3) 10 (8.5%) 9 (18%) 26 (38%) 21 (49%) <0,0001

Obesidade(4) 16 (14%) 16 (31%) 24 (35%) 4 (9%) 0,02

*Valor de P calculado utilizando teste Qui-quadrado SAF- Síndrome do anticorpo antifosfolípide TEV-Tromboembolismo venoso IQR-Interquartile range n= Número de indivíduos (1) Diferenças estatísticas entre controles vs TEV, SAF primária e SAF secundária. (2) Não houve diferenças estatísticas entre os grupos . (3) Diferenças estatísticas entre controles vs SAF primária e SAF secundária ; TEV vs SAF primária; TEV vs SAF secundária. (4) Diferenças estatísticas entre controles vs TEV; TEV vs SAF primária .

30

5.2. Avaliação do FT circulante no plasma

Esse trabalho foi publicado em setembro de 2018 no período Thrombosis

Research. Segue abaixo o manuscrito publicado. (Submetido)

Circulating levels of tissue factor and the risk of thrombosis associated

with antiphospholipid syndrome

Authors: Laís Quinteiro Tobaldini (1), Fernanda Talge Arantes (1), Sabrina da

Silva Saraiva (1), Bruna de Moraes Mazetto (1), Marina Pereira Colella (1), Erich

Vinícius de Paula (2), Joyce Annichino-Bizzachi (2), Fernanda Andrade Orsi* (1,3)

Affiliations: 1) Hematology and Hemotherapy Center, University of Campinas.

2)Department of Clinical Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of

Campinas. 3)Department of Clinical Pathology, Faculty of Medical Sciences,

University of Campinas, Campinas, Brazil

Corresponding author: Fernanda Andrade Orsi. Department of Clinical

Pathology, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas, Campinas R.

Tessália Vieira de Camargo, 126. Cidade Universitária, Campinas, Brazil. Zip Code

13083-887. Phone:

+55 19 35217064. E-mail address: [email protected]

Running title: Circulating tissue factor and antiphospholipid syndrome Word

count abstract: 250 (max. 250)

Word count manuscript: 3762 (max. 7500)

Keywords: Thrombosis; Antiphospholipid; Tissue factor; Coagulation; Risk Factor

mailto:[email protected]

31

ABSTRACT

The mechanisms behind the severe hypercoagulable state in antiphospholipid

syndrome (APS) have not yet been fully elucidated. Knowledge on the etiology of

thrombosis in APS is needed to improve treatment. We performed a case control

study to evaluate the association of the levels of circulating tissue factor (TF) with

thrombotic APS and unprovoked venous thromboembolism (VTE), as compared with

controls without a history of thrombosis. Study participants were selected in the same

geographic area. Linear regression was used to evaluate possible determinants of

TF levels among controls and logistic regression was used to evaluate the

association between TF, unprovoked VTE and t-APS. TF levels were grouped into

three categories based on: below 50th percentile [reference], between 50-75th

percentiles [second category] and 75th percentile [third category]. Two hundred and

eighty participants were included in the study; 51 patients with unprovoked VTE, 111

patients with t-APS and 118 control individuals. The levels of TF were not associated

with an increased risk of unprovoked VTE, as compared with controls. The adjusted

odds ratio for t-APS was 2.62 (95%CI 1.03 to 6.62) with TF levels between 50-75th

percentiles and 8.62 (95%CI 3.76 to 19.80) with TF levels above the 75th percentile,

as compared with the reference category (below the 50th percentile). In the subgroup

analysis, higher levels of TF were associated with both arterial and venous

thrombosis in APS and with both primary and secondary APS. Circulating TF is

associated with thrombotic complications related to APS, but not with the risk of

unprovoked VTE.

32

INTRODUCTION

Antiphospholipid syndrome (APS) is an rare disorder characterized by the

occurrence of thrombosis or gestational complications associated with the presence

of at least one antiphospholipid antibody (aPL): lupus anticoagulant (LAC),

anticardiolipin (aCL) or anti-beta2glycoprotein I (aβ2GP1).[1,2] APS can lead to a

wide spectrum of thrombotic complications, such as venous thromboembolism (VTE),

venous thrombosis in unusual sites, arterial and capillary thrombosis, which are

highly susceptible to recurrence.[3,4] The mechanisms that are at the basis of the

severe hypercoagulable state and thrombosis in APS have not yet been fully

elucidated, but seem to differ from those observed in unprovoked VTE.[5]

A mechanism that could explain the occurrence of thrombosis in APS is the

overexpression of tissue factor (TF).[6] TF is a coagulation factor encountered in

endothelial cells, monocytes and in blood circulation.[7,8] Circulating TF comprise

either soluble forms of TF or TF-bearing microparticles released from TF-producing

cells.[7,8] These forms of TF encountered in blood can participate in thrombus

growth and extension.[9,10] High levels of circulating TF have been associated with

the risk of thrombosis in several diseases, as sepsis, diabetes, cardiovascular

disease, sickle cell disease, stroke and cancer.[11–14] Despite basic research

studies having demonstrated that aPL may increase TF expression in endothelial

cells and monocytes,[15–18] clinical evidence on the association between circulating

TF and APS-related thrombosis (t-APS) are scarce.[19,20]

The evaluation of circulating TF can provide clinical information on risk factors

associated with thrombotic complications in APS. Identifying these risk factors is a

critical step towards the identification of potential alternative treatments for the

prevention of t-APS. Therefore, the aim of this study was to investigate the

association of the levels of circulating TF with t-APS and unprovoked VTE.

MATERIALS AND METHODS

Participant selection

This study enrolled patients with t-APS or unprovoked VTE treated at the

Hematology and Hemostasis Center at the University of Campinas, Brazil, between

33

November 2013 and February 2016. During the same period, individuals with no

history of thrombosis and who tested negative for aPL antibodies were enrolled as

healthy controls. Inclusion criteria for the APS group comprised a confirmed

diagnosis of APS with a history of at least one thrombotic event. Inclusion criteria for

the group of unprovoked VTE comprised a history of deep venous thrombosis or

pulmonary embolism with no clear transient risk factor (immobilization, air flight,

surgery, contraceptives, pregnancy). Active neoplasia, pregnancy and lack of clinical

information were reasons for exclusion. Clinical information was obtained at the day

of the enrollment for the study by reviewing the medical records or interviewing

patients. All patients with t-APS received prolonged anticoagulant treatment with

warfarin; patients with arterial thrombosis also received antiplatelet agents. Patients

with VTE were enrolled after the end of the anticoagulant treatment.

The total period of enrollment for the study was 28 months, in which 455

patients with a history of thrombotic disease were treated at the outpatient unit in the

Hematology and Hemostasis Center at the University of Campinas, Brazil.

Consecutive patients with unprovoked VTE or APS were enrolled for the study.

Healthy individuals from the same geographic area were selected among individuals.

who were accompanying a patient to the medical appointment, employees at the

hospital or their relatives or friends. Figure 1 illustrates the study enrollment, selection

and reasons for exclusion. The study was conducted in compliance with the Helsinki

Declaration. The local Ethical Committee on Human Research approved this study

and written informed consent was obtained from patients or their attending relatives.

Outcomes

The information regarding the diagnosis of VTE and the presence of risk

factors for VTE, such as immobilization, air flight, surgery, oral contraceptives or

pregnancy was obtained from medical records. The diagnosis of deep vein

thrombosis was confirmed by Doppler ultrasonography and the diagnosis of

pulmonary embolism was confirmed by ventilation-perfusion lung scan or computer

tomography of the chest. All VTE patients tested negative for aPL antibodies.

Information on APS diagnosis and classification were assessed in the medical

records.

APS was diagnosed in patients with persistent positive aPL antibody plus a

34

history of thrombosis (confirmed by imaging examinations) or obstetric complications.

Persistent positive aPL was defined as persistent positive LAC; persistent positive

IgG or IgM aCL at moderate to high titers (>40 GPL or MPL) or persistent positive (>

the 99th percentile) IgG/IgM anti-beta2 glycoprotein 1, at two distinct times, with an

interval of at least 12 weeks.[2]

The detection of aPL was performed at diagnosis following the international

guidelines from the International Society of Thrombosis and Haemostasis (ISTH) and

Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Blood was collected in 0.109 M

sodium citrate at a proportion of 9:1 and in serum separating tubes, prior to the

initiation of any anticoagulant drug regimen or after a sufficient period of drug

discontinuation.

For LAC, plasma samples were used and two assays based on different principles

were applied: Dilute Russell's viper venom time (dRVVT) and Silica Clotting Time

(SCT). Results of screening tests were potentially suggestive of LAC when their

clotting times were longer than the local cut-off value (percentile 99th) and the results

were confirmed for LAC at correction percentage of above the local cut-off value

(99th percentile). The antiphospholipid antibodies with solid phase were tested in

patient serum by “in house” ELISA immunological assays, with cardiolipin or β2GP1

as antigen (Sigma-Aldrich, USA), as previously described [21,22] A calibration curve

and commercial controls were used, positive patient samples were also used as

positive controls, and samples were tested in duplicate. The local cut-off value for

aβ2GP1 was determined by the 99th percentile.

APS was classified into primary (PAPS) or secondary (SAPS) depending on the

diagnosis of an underlying autoimmune disease, such as systemic lupus

erythematosus (SLE). All patients with APS were screened for SLE and the diagnosis

of SLE was confirmed according to established criteria.[23]

Laboratory procedures

Blood samples were obtained from the participants (cases and controls) at the

time of their enrollment for the study. After overnight fasting, two citrate and one

EDTA-containing tubes were collected and samples were immediately centrifuged.

Serum and platelet-poor plasma (PPP) obtained were separated and immediately

35

stored at −80°C.

Serum levels of C-reactive protein (hs-CRP) were measured using the reagent

C-Reactive Protein Test System for BN device (ProSpec®, Siemens Healthcare,

USA) by means of by nephelometry. Plasma levels of TF were measured using a

commercially available ELISA kit (IMUBIND® Tissue Factor ELISA, Sekisui

Diagnosis, USA). The assay was performed according to the manufacturers’

instructions. For this assay, blood was collected in 0.109 M sodium citrate containing

-tube in a proportion of 9:1 and centrifuged twice at 3,000 rpm for 10 minutes to

obtain platelet-poor plasma. Plasma was stored frozen at −80°C. Frozen plasma

was thawed at 37°C for 15 minutes and diluted with the assay buffer as

recommended by the manufacturer. Tissue Factor standard and diluted samples

were added to a 96-wells pre-coated plate, next the detection antibody and the assay

substrate were added to reveal the reaction. TF levels were determined by

measuring solution absorbance at 450 nm and comparing the values with those of

the standard curve.

Statistical analysis

Baseline characteristics were evaluated as counts and percentage when they

were categorical variables or mean +/- standard deviation (SD) when they were

continuous variables.

First we evaluated possible clinical variables associated with the TF levels

among control subjects, reflecting the general population. For that, we compared the

mean levels of TF between genders (male and female), different age groups (≤ 30,

30 – 50 and ≥ 50 years), presence of cardiovascular risk factors (hypertension,

dyslipidemia, diabetes or obesity/overweight defined as BMI≥ 25kg/m2), and different

levels of hs-CRP (<1mg/L and >1mg/L). Additionally, the mean difference (and 95%

confidence interval) in the levels of TF was calculated using linear regression.

We assessed the association between the TF levels of individuals with

unprovoked VTE and t-APS. To determine whether a dose-response relation

between the levels of TF and VTE or t-APS was present, we stratified the subjects

into three categories, according to the percentiles of TF levels in the control group:

36

below 50th percentile [reference], between 50-75th percentiles [second category] and

75th percentile [third category]. Per unit increase in TF values was also evaluated.

Odds ratios (OR) and the 95% confidence intervals (CI) were calculated using logistic

regression analysis. Three adjusted logistic regression models were used: age and

gender; age, gender, hypertension, diabetes, dyslipidemia and BMI≥25kg/m2; and

finally age, gender, hypertension, diabetes, dyslipidemia, BMI≥25kg/m2 and CRP

levels.

Next, we performed a pos-hoc analysis to compare the levels of circulating TF

between VTE patients and t-APS patients, the analysis was adjusted for age, gender

and time elapsed since the last thrombotic event.

The levels of TF in patients with thrombosis associated with PAPS (t-PAPS) and

SAPS (t-SAPS), and with arterial and venous thrombosis related to APS, were

studied in a subgroup analysis. For that, age and gender-adjusted logistic regression

models were applied to estimate the odds ratio 95% confidence intervals according to

the three pre-specified categories of TF levels.

All statistical analyses were performed with SPSS version 23.0 for Windows

(SPSS Inc, Chicago,IL, USA). Graphs were plotted using GraphPad Prism version

6.0 (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA, USA).

RESULTS

Clinical characteristics

A total of 280 participants were included in the study; 51 patients with

unprovoked VTE, 111 patients with t-APS and 118 individuals with no prior history of

thrombosis (control subjects). Figure 1 illustrates the flow chart of the participants’

selection for the study. Baseline clinical characteristics of the participants are shown

in Table 1. The median time since diagnosis was 33 months (IQR=21 - 41) in VTE

and 59 months (IQR=26 - 113) in t-APS patients. Women comprised 62.7% of VTE

patients, 72.9% of t-APS patients and 62.7% of controls. The frequency of

cardiovascular risk factors, such as hypertension, diabetes, obesity and dyslipidemia,

was higher in patients with VTE (49%) and t-APS (60%) when compared with control

37

subjects (22%). Levels of hs-CRP were within the normal values in 89% of the study

participants, and there were no substantial differences in these levels between

patients and controls.

Determinants of tissue factor levels

Among control subjects, the mean level of TF was 134.3 pg/mL (SD 73.6). As

shown in Table 2, no difference was found in TF levels between genders and age

groups. The levels of TF were slightly higher among control subjects with

cardiovascular risk factors than in subjects without these risk factors, however the

difference was not statistically significant (mean difference: 26.7 pg/dL, 95%CI: -5.8

to 59.0). TF levels were not associated with those of hs-CRP (regression coefficient

with TF level as dependent variable, CRP: -0.108, CI: -12.379 to 12.163).

Association between tissue factor levels, venous thromboembolism and

thrombotic antiphospholipid syndrome

The results of the association of TF circulating levels with unprovoked VTE

and t-APS are shown in Table 3.

The mean level of TF was 146.1 pg/mL (SD 105) in patients with unprovoked

VTE. As shown in Table 3, the levels of TF were not associated with the risk of

unprovoked VTE, as compared with controls. Adjustments for cardiovascular risk

factors, such as hypertension, diabetes, dyslipidemia, obesity, and for levels of hs-

CRP did not affect the results.

In patients with t-APS, the mean level of TF was 273.9 pg/mL (SD 273.0).

Increasing levels of circulating TF were dose-dependently associated with t-APS,

with age and gender-adjusted odds ratios of 2.08 (95%CI 0.97 to 4.46) for the

second category (TF levels between 50-75th percentiles) and 7.16 (95%CI 3.67 to

13.97) for the third category (TF levels above the 75th percentile) versus the

reference category (below the 50th percentile), respectively. Further adjustments for

cardiovascular risk factors and for hs-CRP did not affect the results.

Pos-hoc analyses revealed that patients with t-APS had higher levels of

circulating TF than patients with unprovoked VTE. When compared with unprovoked

VTE, the adjusted odds ratio of t-APS was 4.76 (95%CI 1.4 to 16.17) for TF levels

38

between 50-75th percentiles and 9.32 (95%CI 3.16 to 27.53) for TF levels above the

75th percentile, versus the reference category (below the 50th percentile).

Subgroup analysis

Data on the subgroup analysis are shown in table 4. The mean levels of TF

were 277.3 pg/mL (SD 202.9) in patients with t-APS related arterial thrombosis and

301.0 pg/mL (SD 382.2) in t-APS related venous thrombosis. Higher levels of

circulating TF were dose-dependently associated with both arterial and venous

thrombosis in APS patients.

Figure 2 illustrates the odds ratio for unprovoked VTE, t-PAPS and t-SAPS

according to the categories of circulating TF levels (below 50th percentile, 50-75th

percentile and above 75th percentile), the analysis were adjusted for age and gender.

The mean levels of TF were 215.6 pg/mL (SD 256.3) in patients with t-PAPS and

366.2 pg/mL (SD 273.2) in patients with t-SAPS. Increases in the levels of circulating

TF were dose-dependently associated with both t-PAPS and t-SAPS, as compared

with controls. However, a higher odds ratio was observed in t-SAPS (OR 20.75;

95%CI 5.83 to 73.92) than in t-PAPS (OR 4.92; 95%CI 2.37 to 10.25).

To evaluate whether aPL antibodies profile played a role in the levels of

circulating TF, we grouped t-APS patients into five groups, (1) single positivity for

aβ2GP1 or aCL, (2) single positivity for LAC, (3) double positivity for aCL and

aβ2GP1, (4) double positivity for LAC plus aβ2GP1 (or aCL) and (5) triple positivity.

The levels of TF in each group were calculated. The results are shown in table 5.

Levels of circulating TF were higher in patients with positive LAC when compared to

LAC negative patients. However the differences were not statistically significant.

DISCUSSION

In the present study we have shown that high levels of circulating TF are

associated with thrombosis related to APS though not with unprovoked VTE.

Particularly, TF levels between the 50-75th percentile were associated with a 2-fold

increased risk and levels above the 75th percentile were associated with a 8-fold

increased risk of t-APS, in comparison with TF levels below the 50th percentile. In the

39

subgroup analysis we observed that circulating TF was associated with both t-PAPS

and t-SAPS, and with both arterial and venous APS-related thrombosis. These

findings suggest that circulating TF plays a role in t-APS regardless of the

classification of the disease or the site of the thrombosis.

A relation between circulating TF, hypercoagulability and thrombosis has been

described in clinical studies. A recent meta-analysis has shown that circulating TF-

bearing microparticles are associated with a 76% increase in the risk of venous

thrombosis (OR: 1.76; 95% CI: 1.21–2.56) in patients with cancer.[11] In a

prospective cohort of cancer patients, a 3-fold increased risk of recurrent VTE

(relative risk: 3.3; 95% CI: 2.1 - 5.1) was observed with levels of circulating TF above

the 75th percentile at the time of the acute event of venous thrombosis.[14] Higher

TF levels (above the 75th percentile) have also been associated with a 2-fold

increased risk of ischemic stroke (OR: 2.01; 95% CI: 1.25-3.23) in a large case-

cohort study.[13]

Despite TF having been associated with thrombosis related to many chronic

diseases, the role of TF in unprovoked VTE has not been confirmed. A recent clinical

trial showed that patients with unprovoked VTE presented similar levels of circulating

TF as healthy controls.[24] Our results point to the same direction of a lack of

association between circulating TF and unprovoked VTE, suggesting that the profile

of hypercoagulability in APS-related thrombosis is different from that observed in

unprovoked VTE, which could ultimately explain the clinical differences between

these thrombotic diseases.

With regard to APS, Forastiero et al[19] demonstrated that levels of TF were

higher in patients with the disease, when compared with patients with infections.

Willemze et al[20] showed that TF activity was 1.5 times higher in APS patients in

comparison with aPL-positive, asymptomatic individuals. However, these studies

have not evaluated levels of TF either in thrombosis related APS or in different

settings of t-APS. Despite previous studies having shown an increase in TF levels

among APS patients,[19,20] the association of circulating TF with different

thrombotic manifestations of APS has not been demonstrated before.

Moreover, our results revealed a dose-response association between

circulating TF and t-APS, in which the strongest association was found with t-SAPS.

Basic research studies have shown that inflammatory mechanisms, induced by CRP

40

or lipopolysaccharides, can lead to the activation of TF. [25,26] Antiphospholipid

antibodies, when binding to cell membranes, have also been shown to be capable of

activating the expression of TF in monocytes and endothelial cells, in a direct way[17]

or through stimulation of the inflammatory response.[27] Therefore, the dose-

response association between circulating TF and t-APS, along with the absence of

association between circulating TF and unprovoked VTE (a non-immune disease) is

consistent with the hypothesis of an immune-driven stimulus for TF expression and

release. Furthermore, TF levels tended to be higher in patients with positive LAC.

Interestingly, LAC positivity is associated with increased monocyte procoagulant

activity, immune derangement [28,29] and higher risk of thrombosis in APS, when

compared with the other aPLs.[30]

The clinical finding of an association between TF and thrombotic

manifestations of APS can be relevance for future treatment approaches. The

incidence of recurrent thrombosis in APS ranges from 5 - 16%;[4,31,32] along with

significant morbidity and mortality. [33] The rates of recurrent VTE remain high even

among anticoagulated patients.[34–36] The latter underscores the need for an

alternative therapeutic approach towards patients with thrombotic APS. In this

context, medications targeting TF may play a role in preventing thrombosis in APS

and could be evaluated in clinical trials.

There are some aspects of this study that must be highlighted. First, this is a

retrospective observational study and we cannot rule out the possibility of some

clinical data having been misreported in the medical records. Second, circulating TF

can be measured by either ELISA, flow cytometry or functional assays and the

choice of the assay may affect the clinical interpretation of the results.[37,38] Here,

we chose to measure TF antigen by using a commercially available ELISA as we

wanted to use an assay that could be easily reproduced.It is also possible to argue

that since TF was measured after the thrombosis event, a reverse causality was

observed. However, if the increase in TF levels was triggered by thrombosis, we

would observe this phenomenon both in t-APS and VTE patients, not only in patients

with t-APS. Furthermore, previous studies have shown that aPL antibodies can

stimulate the expression of TF in monocytes and endothelial cells.[15–18] Third, the

sample size was small, which can be explained by the relative rarity of thrombotic

41

APS. However, the number of patients included was sufficiently powered to

demonstrate an association between circulating TF and APS-related thrombosis.

Forth, we did not include a group of aPL-positive asymptomatic participants, which

could have provided additional information on the causal association between

circulating TF levels and APS-related thrombosis. However, a previous study

demonstrated that TF levels were similar in aPL-positive individuals and healthy

controls, suggesting that the increase in TF levels is related to APS

complications.[20] Finally, although subgroup analysis revealed that increased levels

of TF were associated with both arterial and venous thrombosis provoked by APS,

and the strongest association was found with t-SAPS, these data must be interpreted

with caution due to the sample size in these subgroups.

Conclusion

In this study, we observed that circulating TF is associated with thrombotic

complications related to APS, but is not associated with the risk of unprovoked VTE.

Although basic research studies have consistently demonstrated that aPL increase

cellular expression of TF, few studies have demonstrated this association from a

clinical perspective. Our results showed clinical evidence on the profile of

hypercoagulability in patients with thrombosis related to APS.

FUNDING

This study was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP grant

#2016/14172-6) and Brazilian National Council for Scientific and Technological

Development (CNPq grant #443564/2014-0). Laís Quinteiro Tobaldini and Fernanda

Talge Arantes received financial support from the Brazilian Federal Agency for the

Support and Evaluation of Graduate Education (CAPES)

DISCLOSURES

None.

42

REFERENCES

[1] C. Gardiner, J. Hills, S.J. MacHin, H. Cohen, Diagnosis of antiphospholipid

syndrome in routine clinical practice, Lupus. 22 (2013) 18–25.

doi:10.1177/0961203312460722.

[2] S. Miyakis, M.D. Lockshin, T. Atsumi, D.W. Branch, R.L. Brey, R. Cervera,

R.H.W.M. Derkesen, P.G. De Groot, T. Koike, P.L. Meroni, G. Reber, Y. Shoenfeld,

A. Tincani, P.G. Vlachoyiannopoulos, S.A. Krilis, International consensus statement

on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome

(APS), J. Thromb. Haemost. 4 (2006) 295–306. doi:10.1111/j.1538-

7836.2006.01753.x.

[3] R.J. Kim, R.C. Becker, Association between factor V Leiden, prothrombin

G20210A, and methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutations and events of

the arterial circulatory system: A meta-analysis of published studies, Am. Heart J.

146 (2003) 948–957. doi:10.1016/S0002-8703(03)00519-2.

[4] R. Cervera, J.C. Piette, J. Font, M.A. Khamashta, Y. Shoenfeld, M.T. Camps, S.

Jacobsen, G. Lakos, A. Tincani, I. Kontopoulou-Griva, M. Galeazzi, P.L. Meroni,

R.H.W.M. Derksen, P.G. De Groot, E. Gromnica-Ihle, M. Baleva, M.Mosca, S.

Bombardieri, F. Houssiau, J.C. Gris, I. Quéré, E. Hachulla, C. Vasconcelos, B. Roch,

A. Fernández-Nebro, M.C. Boffa, G.R.V. Hughes, M. Ingelmo, Antiphospholipid

syndrome: Clinical and immunologic manifestations and patterns of disease

expression in a cohort of 1,000 patients, Arthritis Rheum. 46 (2002) 1019–1027.

doi:10.1002/art.10187.

[5] D. Dizon-Townson, C. Hutchison, R. Silver, D.W. Branch, K. Ward, The factor V

Leiden mutation which predisposes to thrombosis is not common in patients with

antiphospholipid syndrome, Thromb Haemost. 74 (1995) 1029–1031.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8560406.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8560406


43

[6] G. Ruiz-Irastorza, M. Crowther, W. Branch, M.A. Khamashta, Antiphospholipid

syndrome, in: Lancet, 2010: pp. 1498–1509. doi:10.1016/S0140- 6736(10)60709-X.

[7] V.Y. Bogdanov, V. Balasubramanian, J. Hathcock, O. Vele, M. Lieb, Y. Nemerson,

Alternatively spliced human tissue factor: A circulating, soluble, thrombogenic protein,

Nat. Med. 9 (2003) 458–462. doi:10.1038/nm841.

[8] R.J. Berckmans, R. Nieuwland, A.N. Böing, F.P. Romijn, C.E. Hack, A. Sturk,

Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade

thrombin generation., Thromb. Haemost. 85 (2001) 639–46. doi:01040639 [pii].

[9] M. Hoffman, H.C. Whinna, D.M. Monroe, Circulating tissue factor accumulates in

thrombi, but not in hemostatic plugs [10], J. Thromb. Haemost. 4 (2006) 2092–2093.

doi:10.1111/j.1538-7836.2006.02085.x.

[10] V. Balasubramanian, E. Grabowski, A. Bini, Y. Nemerson, Platelets, circulating

tissue factor, and fibrin colocalize in ex vivo thrombi: Real-time fluorescence images

of thrombus formation and propagation under defined flow conditions, Blood. 100

(2002) 2787–2792. doi:10.1182/blood-2002-03-0902.

[11] C.J. Cui, G.J. Wang, S. Yang, S.K. Huang, R. Qiao, W. Cui, Tissue Factor-

bearing MPs and the risk of venous thrombosis in cancer patients: A meta- analysis,

Sci. Rep. 8 (2018). doi:10.1038/s41598-018-19889-8.

[12] S.P. Grover, N. Mackman, Tissue Factor, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.

(2018) ATVBAHA.117.309846. doi:10.1161/ATVBAHA.117.309846.

44

[13] L. Iacoviello, A. Di Castelnuovo, A. De Curtis, C. Agnoli, G. Frasca, A. Mattiello,

G. Matullo, F. Ricceri, C. Sacerdote, S. Grioni, R. Tumino, E. Napoleone, R.

Lorenzet, G. De Gaetano, S. Panico, M.B. Donati, Circulating Tissue Factor Levels

and Risk of Stroke: Findings from the EPICOR Study, Stroke. 46 (2015) 1501–1507.

doi:10.1161/STROKEAHA.115.008678.

[14] A.A. Khorana, P.W. Kamphuisen, G. Meyer, R. Bauersachs, M.S. Janas, M.F.

Jarner, A.Y.Y. Lee, Tissue Factor As a Predictor of Recurrent Venous

Thromboembolism in Malignancy: Biomarker Analyses of the CATCH Trial, J. Clin.

Oncol. 35 (2017) 1078–1085. doi:10.1200/JCO.2016.67.4564.

[15] O. Amengual, T. Atsumi, M.A. Khamashta, G.R. Hughes, The role of the tissue

factor pathway in the hypercoagulable state in patients with the antiphospholipid

syndrome., Thromb. Haemost. 79 (1998) 276–81.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9493575.

[16] P.M. Dobado-Berrios, C. Löpez-Pedrera, F. Velasco, M.A. Aguirre, A. Torres,

M.J. Cuadrado, Increased levels of tissue factor mRNA in mononuclear blood cells of

patients with primary antiphospholipid syndrome, Thromb. Haemost. 82 (1999).

[17] H. Zhou, A.S. Wolberg, R.A.S. Roubey, Characterization of monocyte tissue

factor activity induced by IgG antiphospholipid antibodies and inhibition by dilazep.,

Blood. 104 (2004) 2353–8. doi:10.1182/blood-2004-01-0145.

[18] J.-C. Reverter, D. Tassies, J. Font, J. Monteagudo, G. Escolar, M. Ingelmo, A.

Ordinas, Hypercoagulable State in Patients With Antiphospholipid Syndrome Is

Related to High Induced Tissue Factor Expression on Monocytes and to Low Free

Protein S, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16 (1996) 1319–1326.

doi:10.1161/01.ATV.16.11.1319.



45

[19] R.R. Forastiero, M.E. Martinuzzo, G.F. de Larrañaga, Circulating levels of tissue

factor and proinflammatory cytokines in patients with primary antiphospholipid

syndrome or leprosy related antiphospholipid antibodies, Lupus. 14 (2005) 129–136.

doi:10.1191/0961203305lu2048oa.

[20] R. Willemze, R.L. Bradford, M.J. Mooberry, R.A.S. Roubey, N.S. Key, Plasma

Microparticle Tissue Factor Activity in Patients With Antiphospholipid Antibodies With

and Without Clinical Complications, Thromb. Res. 133 (2014) 187–189.

doi:10.1016/j.thromres.2013.11.027.

[21] A.E. Gharavi, E.N. Harris, R.A. Asherson, G.R. Hughes, Anticardiolipin

antibodies: isotype distribution and phospholipid specificity., Ann. Rheum. Dis. 46

(1987) 1–6. doi:10.1136/ard.46.1.1.

[22] B. de Laat, R.H.W.M. Derksen, R.T. Urbanus, P.G. de Groot, IgG antibodies that

recognize epitope Gly40-Arg43 in domain I of beta 2-glycoprotein I cause LAC, and

their presence correlates strongly with thrombosis., Blood. 105 (2005) 1540–5.

doi:10.1182/blood-2004-09-3387.

[23] E.M. Tan, A.S. Cohen, J.F. Fries, A.T. Masi, D.J. Mcshane, N.F. Rothfield, J.G.

Schaller, N. Talal, R.J. Winchester, The 1982 revised criteria for the classification of

systemic lupus erythematosus, Arthritis Rheum. 25 (1982) 1271–1277.

doi:10.1002/art.1780251101.

[24] J. Thaler, R. Koppensteiner, I. Pabinger, C. Ay, T. Gremmel, Microparticle-

associated tissue factor activity in patients with acute unprovoked deep vein

thrombosis and during the course of one year, Thromb. Res. 134 (2014) 1093– 1096.

doi:10.1016/j.thromres.2014.07.041.

46

[25] Y. Ji, P.M. Fish, T.L. Strawn, A.W. Lohman, J. Wu, A.J. Szalai, W.P. Fay, C-

reactive protein induces expression of tissue factor and plasminogen activator

inhibitor-1 and promotes fibrin accumulation in vein grafts, J. Thromb. Haemost. 12

(2014) 1667–1677. doi:10.1111/jth.12680.

[26] A. Singh, G. Boden, A.K. Rao, Tissue factor and Toll-like receptor (TLR)4 in

hyperglycaemia-hyperinsulinaemia, Thromb. Haemost. 113 (2015) 750–758.

doi:10.1160/TH14-10-0884.

[27] A. Martirosyan, M. Petrek, Z. Navratilova, A. Blbulyan, A. Boyajyan, G.

Manukyan, Differential Regulation of Proinflammatory Mediators following LPS- and

ATP-Induced Activation of Monocytes from Patients with Antiphospholipid Syndrome,

Biomed Res. Int. 2015 (2015) 1–9. doi:10.1155/2015/292851.

[28] K.A. Breen, P. Seed, K. Parmar, G.W. Moore, S.E. Stuart-Smith, B.J. Hunt,

Complement activation in patients with isolated antiphospholipid antibodies or

primary antiphospholipid syndrome., Thromb. Haemost. 107 (2012) 423–9.

doi:10.1160/TH11-08-0554.

[29] S. da Silva Saraiva, B. de Moraes Mazetto, L. Quinteiro Tobaldine, M. Pereira

Colella, E. Vinícius De Paula, J. Annichinno-Bizzachi, F. Andrade Orsi, The impact of

antibody profile in thrombosis associated with primary antiphospholipid syndrome.,

Am. J. Hematol. 92 (2017) 1163–1169. doi:10.1002/ajh.24875.

[30] Q. Reynaud, J.-C. Lega, P. Mismetti, C. Chapelle, D. Wahl, P. Cathébras, S.

Laporte, Risk of venous and arterial thrombosis according to type of antiphospholipid

antibodies in adults without systemic lupus erythematosus: A systematic review and

meta-analysis., Autoimmun. Rev. 13 (2014) 595–608.

doi:10.1016/j.autrev.2013.11.004.

47

[31] M. Bertero, M. Bazzan, R. Carignola, B. Montaruli, E. Silvestro, S. Sciascia, A.

Vaccarino, S. Baldovino, D. Roccatello, Antiphospholipid syndrome in northwest Italy

(APS Piedmont Cohort): demographic features, risk factors, clinical and laboratory

profile, Lupus. 21 (2012) 806–809. doi:10.1177/0961203312446974.

[32] M. Turiel, P. Sarzi-Puttini, R. Peretti, E. Rossi, F. Atzeni, W. Parsons, A. Doria,

Thrombotic Risk Factors In Primary Antiphospholipid Syndrome: A 5-Year

Prospective Study, Stroke. 36 (2005) 1490–1494.

doi:10.1161/01.STR.0000170645.40562.09.

[33] J.A. Gómez-Puerta, H. Martín, M.-C. Amigo, M.A. Aguirre, M.T. Camps, M.J.

Cuadrado, G.R. V. Hughes, M.A. Khamashta, Long-Term Follow-Up in 128 Patients

With Primary Antiphospholipid Syndrome, Medicine (Baltimore). 84 (2005) 225–230.

doi:10.1097/01.md.0000172074.53583.ea.

[34] M.A. Crowther, J.S. Ginsberg, J. Julian, J. Denburg, J. Hirsh, J. Douketis, C.

Laskin, P. Fortin, D. Anderson, C. Kearon, A. Clarke, W. Geerts, M. Forgie, D. Green,

L. Costantini, W. Yacura, S. Wilson, M. Gent, M.J. Kovacs, A Comparison of Two

Intensities of Warfarin for the Prevention of Recurrent Thrombosis in Patients with the

Antiphospholipid Antibody Syndrome, N. Engl. J. Med. 349 (2003) 1133–1138.

doi:10.1056/NEJMoa035241.

[35] G. Finazzi, V. Brancaccio, P. Schinco, F. Wisloff, J. Musial, F. Baudo, M.

Berrettini, S. Testa, A. D’Angelo, G. Tognoni, T. Barbui, R. Marchioli, A randomized

clinical trial of high-intensity warfarin vs. conventional antithrombotic therapy for the

prevention of recurrent thrombosis in patients with the antiphospholipid syndrome

(WAPS), J. Thromb. Haemost. 3 (2005) 848–853. doi:10.1111/j.1538-

7836.2005.01340.x.

48

[36] S.D.S. Saraiva, I.F. Custódio, B.D.M. Mazetto, M.P. Collela, E.V. de Paula, S.

Appenzeller, J. Annichino-Bizzachi, F.A. Orsi, Recurrent thrombosis in

antiphospholipid syndrome may be associated with cardiovascular risk factors and

inflammatory response, Thromb. Res. 136 (2015) 1174–1178.

doi:10.1016/j.thromres.2015.10.029.

[37] M. Brambilla, L. Rossetti, C. Zara, P. Canzano, P.L.A. Giesen, E. Tremoli, M.

Camera, Do methodological differences account for the current controversy on tissue

factor expression in platelets?, Platelets. 29 (2018) 406–414.

doi:10.1080/09537104.2017.1327653.

[38] C. Hernández, J. Orbe, C. Roncal, M. Alvarez-Hernandez, S.M. de Lizarrondo,

M.T. Alves, J.G. Mata, J.A. Páramo, Tissue factor expressed by microparticles is

associated with mortality but not with thrombosis in cancer patients, Thromb.

Haemost. 110 (2013) 598–608. doi:10.1160/TH13-02-0122.

49

LEGENDS TO TABLES AND FIGURES

Table 1 Demographic and clinical characteristics at baseline Table 2 Tissue factor

levels in control subjects

Table 3 Risk of unprovoked VTE or t-APS according to levels of circulating TF Table

4 Odds Ratios for subgroups of antiphospholipid syndrome

Table 5 Levels of TF in different profiles of aPL

Figure 1 Flow chart of participants’ selection and reasons for exclusion. VTE=venous

thromboembolism; APS= antiphospholipid syndrome; TF=tissue factor

Figure 2 Odds ratio and 95% confidence intervals (CI) for unprovoked VTE, t-PAPS

and t-SAPS according to the levels of circulating tissue factor, adjusted for age and

gender. VTE=venous thromboembolism; t-PAPS= thrombotic primary

antiphospholipid syndrome; t-SAPS= thrombotic secondary antiphospholipid

syndrome; TF=tissue factor. P50= below 50th percentile (tissue factor levels

<117.9pg/mL); P50-P75=50th-75th percentile (tissue factor levels 117.9-159.5

pg/mL); P75=above 75th percentile (tissue factor levels >159.5 pg/mL).

50

Figure 1 Flow chart of participants’ selection and reasons for exclusion. VTE=venous

thromboembolism; APS=antiphospholipid syndrome; TF=tissue factor

51

Table 1 Demographic and clinical characteristics at baseline

Patients with thrombosis Controls

without

Unprovoked

VTE n=51

t-PAPS

n=68

t-SAPS

n=43

thrombosis

n=118

Age, mean (SD) 43.9 (13.5) 41.3 (15.4) 37.1 (15.3) 41.0 (13.6)

Women, n (%) 32 (62.7) 45 (66.2) 36 (83.7) 88 (73.9)

Site of the first thrombotic

episode

Venous Thrombosis, n (%) 51 (100) 48 (70.6) 31 (72.1) 0 (0)

DVT, n

47

27

20

-

PE, n

4

9

4

-

Unusual site, n

0

12

7

-

Arterial Thrombosis, n (%) 0 (0) 20 (29.4) 12 (27.9) 0 (0)

Stroke, n

-

14

10

-

Peripheral arterial, n

-

6

2

-

Recurrent thrombosis, n (%) 10 (19.6) 17 (25.0) 19 (44.2) -

Venous Thrombosis, n (%) 10 (100) 10 (58.8) 14 (73.7) -

Arterial Thrombosis, n (%)

- 7 (41.1) 5 (26.3)

-

Antithrombotic treatment

Warfarin, n (%) 0 (0) 68 (100) 43 (100) 0 (0)

Aspirin, n (%) 0 (0) 20 (29.4) 12 (27.9) 4 (3.4)

Months elapsed since the

last thrombotic event,

median (IQR)

33.0

(19.4-

41.5)

46.8

(15.3-

76.8)

31.2

(12-91.2)

-

Obstetric Complications**, n

(%) of pregnancies ending

in abortion, fetal loss or

other APS-related

complications

1

(3.2)

20

(60)

11

(56)

2

(3.8)

52

Hypertension, n (%) 15 (29.4) 18 (26.5) 24 (55.8) 3 (2.5)

Dyslipidemia, n (%) 7 (13.7) 26 (38.2) 21 (48.8) 10 (8.4)

Overweight (BMI≥25kg/m2) 26 (51.0) 17 (25.0) 15 (34.9) 39 (32.8)

Obesity (BMI≥30kg/m2) 16 (31.4) 24 (35.3) 4 (9.3) 16 (13.4)

Diabetes, n (%) 1 (2.0) 7 (10.3) 3 (7.0) 4 (3.4)

CRP levels, n (%)***

< 1 mg/L 48 (93.1) 56 (85.3) 35 (87.8) 112 (94.9)

1- 3 mg/L 3 (5.2) 7 (10.3) 3 (7.3) 6 (5.1)

> 3 mg/L 0 (0) 2 (4.4) 2 (4.9) 0 (0)

Age is expressed in years. BMI body mass index. Missing BMI data (2 controls) t-PAPS thrombotic primary antiphospholipid syndrome t-SAPS thrombotic secondary antiphospholipid syndrome *APAO acute peripheral arterial occlusion** self-reported obstetrical complications, 31 woman with VTE, 34 women with t-PAPS, 20 women with t-SAPS and 53 controls had at least one pregnancy ***high sensitive assay IQR interquartile range

53

Table 2 Tissue factor levels in control subjects

N (118) Tissue Factor levels,

mean (SD)

Gender

Women 88 137.0 (77.8)

Men 30 126.2 (60.2)

Age, y

≤ 30 33 139.9 (100.8)

30 – 50 45 134.6 (70.6)

≥ 50 40 129.2 (47.5)

CV risk factors*

No 90 128.9 (59.9)

Yes 26 155.6 (109.0)

CRP levels**

<1mg/L 112 133.2 (74.6)

1-3mg/L 6 154.5 (53.7)

CV cardiovascular CRP C-reactive protein Two controls were not classified as having or not CV risk factors due to missing data on BMI CRP C reactive protein *hypertension, dyslipidemia, diabetes or BMI≥ 25kg/m2 **high sensitive assay

54

Table 3 Risk of unprovoked VTE or t-APS according to levels of circulating TF

Patients with unprovoked venous thromboembolism

Tissue Factor VTE n(%) Controls

n(%) OR (95% CI)* OR (95% CI)** OR (95% CI)***

Per unit increase 51 118 1.002 (0.998; 1.006) 1.002 (0.998; 1.007) 1.003 (0.998; 1.008)

< 50th percentile

(<117.9pg/mL)

23 (39.7)

59 (49.2)

1 (reference)

1 (reference)

1 (reference)

50th-75th percentile

(117.9-159.5 pg/mL)

13 (22.4)

30 (25.0)

0.99

(0.43;

2.26)

0.96

(0.39;

2.40)

0.93

(0.37;

2.33)

>75th percentile

(>159.5 pg/mL)

15 (25.9)

29 (24.2)

1.33

(0.60;

2.94)

1.49

(0.62;

3.55)

1.51

(0.62;

3.66)

Patients with thrombotic antiphospholipid syndrome

Tissue Factor t-APS

n(%)

Controls

n(%)

OR (95% CI)*

OR (95% CI)**

OR (95% CI)***

Per unit increase 111 118 1.009 (1.005; 1.012) 1.009 (1.005; 1.012) 1.008 (1.004; 1.011)

< 50th percentile

(<117.9pg/mL)

20 (17.4)

59 (49.2)

1 (reference)

1 (reference)

1 (reference)

50th-75th percentile

(117.9-159.5 pg/mL)

21 (18.3)

30 (25.0)

2.08

(0.97;

4.46)

2.43

(1.01;

5.88)

2.62

(1.03;

6.62)

>75th percentile

(>159.5 pg/mL)

70 (60.9)

29 (24.2)

7.16

(3.67;

13.97)

6.85

(3.14;

14.96)

8.62

(3.76;

19.80)

t-APS thrombotic antiphospholipid syndrome * Adjusted for age, gender ** Adjusted for age, gender, hypertension, diabetes, dyslipidemia, BMI≥25kg/m2 *** Adjusted for age, gender, hypertension, diabetes, dyslipidemia, BMI≥25kg/m2 and hs-CRP levels

55

Table 4 Odds Ratios for subgroups of antiphospholipid syndrome

Patients with primary antiphospholipid syndrome

Patients with secondary antiphospholipid syndrome

Tissue Factor Patients with t-

SAPS, n(%)

Controls,

n(%) OR (95% CI)*

Per unit increase 43 118 1.010 (1.007; 1.014)

< 50th percentile (<117.9pg/mL) 3 (7.0) 59 (49.2) 1 (reference)

50th-75th percentile (117.9-159.5

pg/mL)

9 (20.9)

30 (25.0)

6.58

(1.64;

26.45)

>75th percentile (>159.5 pg/mL) 31 (72.1) 29 (24.2) 20.75 (5.83; 73.92)

Patients with antiphospholipid syndrome- related arterial thrombosis

Tissue Factor Patients with

APS-AT n(%)

Controls,

n(%) OR (95% CI)*




pg/mL)

9 (26.5)

30 (25.0)

4.48

(1.32;

15.22)


Tissue Factor Patients with t-

PAPS n(%)

Controls,

n(%) OR (95% CI)*




pg/mL)

12 (17.6)

30 (25.0)

1.32

(0.55;

3.17)


56

PAPS thrombotic primary antiphospholipid syndrome t-SAPS thrombotic secondary antiphospholipid syndrome AV arterial thrombosis VT venous thrombosis * Adjusted for age, gender

Tissue Factor Patients with

APS-VT n(%)

Controls,

n(%) OR (95% CI)*




pg/mL)

11 (14.3)

30 (25.0)

1.78

(0.69;

4.55)


57

Table 5 Levels of TF in different profiles of aPL

aPL antibodies profile

Number of

patients

TF levels*

Median Interquartile

range

Single positivity for aβ2GP1

or aCL 9 164.0 (101.8; 270.9)

Single positivity for LAC 46 189.8 (127.4; 306.5)

Double positivity for aCL

and aβ2GP1

21

153.6

(63.1;

679.4)

Double positivity for LAC

plus aβ2GP1 (or aCL)

8

210.4

(125.3;

365.6)

Triple positivity 22 248.6 (136.2; 421.0)

*P value 0.5, calculated using Kruskal Wallis test LAC lupus anticoagulant aCL anticardiolipin (IgM or IgG) aβ2GP1 anti beta 2 glicoprotein 1 LAC results were missing in 5 patients

58

Figure 2 Odds ratio and 95% confidence intervals (CI) for unprovoked VTE, t- PAPS and t-SAPS according to the levels of circulating tissue factor, adjusted for age and gender. VTE=venous thromboembolism; t-PAPS= thrombotic primary antiphospholipid syndrome; t-SAPS= thrombotic secondary antiphospholipid syndrome; TF=tissue factor. P50= below 50th percentile (tissue factor levels <117.9pg/mL); P50-P75 percentile (tissue factor levels 117.9-159.5 pg/mL); P75= above 75th percentile (tissue factor levels >159.5 pg/mL.)

59

5.3. Correlação dos níveis de FT circulante com os níveis de citocinas

inflamatórias, FVW e ADAMTS13

Os marcadores da coagulação, FVW e ADAMTS13, estavam alterados nos

pacientes com TEV, SAF primária e SAF secundária. Os níveis circulantes de FVW

estavam significativamente aumentados nos pacientes com TEV e SAF secundária,

e discretamente aumentados nos com SAF primária, em relação aos controles.

Inversamente, a atividade da ADAMTS13 estava diminuída nos pacientes em

relação aos controles.

Em relação aos marcadores inflamatórios, observamos que os níveis séricos

de TNF- α, hs-PCR e IL-6 estavam aumentados nos três grupos de pacientes: TEV,

SAF primária e SAF secundária, em relação aos controles. Os níveis de IL-8

estavam semelhantes entre os grupos controle e pacientes.

Tabela 3 demostra os resultados dos dados laboratoriais:

60

Tabela 3: Dados laboratoriais dos pacientes com trombose (TEV, SAF primária, SAF

secundária) e controles.

Controles (n=118)

TEV (n=51) SAF primária (n=68)

SAF secundária (n=43)

P**

ADAMTS 13 (%) Mediana (IQR) (2)

177,10 (118,36- 273,10)

95,93 (86,37- 108,08)*

103,91 (93,27- 128,31)*

111,93 (94,59- 125,13)*

<0,0001

FVW U/dL Mediana (IQR) (3)

87,63 (65,27- 128,38)

147,27 (113,76- 183,77)*

132,28 (84,81- 164,8)*

140,56 (107,29- 166,71)*

<0,0001

TNF-α pg/ml Mediana (IQR) (4)

0,10 (0,08- 0,14)

2,36 (1,53- 4,39)*

1,21 (0,12- 1,95)*

2,04 (1,36- 4,25)*

<0,0001

hs-PCR mg/dL Mediana (IQR) (5)

0,13 (0,07- 0,34)

0,21 (0,07- 0,39)

0,28 (0,09- 0,67)*

0,28 (0,09- 0,85)*

0,02

IL-6 pg/ml Mediana (IQR)(6)

0,28 (0,18- 0,46)

1,21 (0,81- 2,07) *

0,90 (0,55- 2,39) *

1,83 (0,93- 3,33)*

<0,0001

IL-8 pg/ml Mediana (IQR) (7)

17,0 (13,25- 22,75)

19,0 (12,0- 28,0)

19,0 (16,0- 25,75)

22,0 (14,0-32,0) 0,14

*Indica qual grupo é diferente do grupo controle. Calculado pelo teste não paramétrico de comparação de

Dunn. ** Valor de P calculado utilizando teste de Kruskal Wallis SAF- Síndrome do anticorpo antifosfolípide TEV-Tromboembolismo venoso FT- Fator tecidual ADAMTS 13- A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin type 1 repeats FVW- Fator de von Willebrand TNF-α- Fator de necrose tumoral-alfa hs-PCR- Proteína C Reativa IL-6: Interleucina-6 IL-8: Interleucina-8 IQR- Interquartile range n= Número de indivíduos (1) Diferenças estatísticasentre controles vs SAF primária e SAF secundária; TEV vs SAF primária e TEV vs SAF secundária. (2)Diferenças estatísticas entre controles vs TEV, SAF primária e SAF secundária; TEV vs SAF primária. (3) Diferenças estatísticas entre controles vs TEV e SAF secundária (4) Diferenças estatísticasentre controles vs TEV, SAF primária e SAF secundária; TEV vs SAF primária (5) Diferenças estatísticas entre controles vs SAF primária. (6) Diferenças estatísticas entre controles vs TEV, SAF primária e SAF secundária. (7) Não houve diferenças estatísticas entre os grupos.

61

a. b. 2000 1500 1000 500

500

400

400 300

200

200

100

0 SAF SAF

Controles TEV Primária Secundária

0 SAF SAF


c. d

.

100 80 60 40 40

P<0,0001

15 P=0,0011

10

5

2

30

20

10

0

-10

SAF SAF


1

0

SAF SAF

Controles TEV Primária Secundári

P<0,0001

P<0,0001

TN

F-

pg

/mL

A

DA

MT

S 1

3 (

%)

FV

W U

/dL

h

s-P

CR

mg

/dL

d.

62


0

5

10

14

16

18

20

P<0,0001

SAF SAF

IL-6

pg

/mL


0

20

40

60

80

100250

300

350

400P=0,0362

SAF SAFIL

-8 p

g/m

L

Figura 7: Marcadores da coagulação e os marcadores inflamatórios avaliados nos

pacientes e controles.

Legenda: a. níveis séricos de ADAMTS 13, b. níveis séricos de FVW, c. níveis séricos de TNF- α, d.

níveis séricos de hs-PCR, e. níveis séricos de IL-6, f. níveis séricos de IL-8. O valor de P se refere ao

teste de Kruskal Wallis e foi considerado significativo quando < 0,05

Nos controles, houve correlação fraca entre os níveis de FT e IL-6. Não houve

correlação do FT com os outros parâmetros analisados. As Figuras abaixo

demostram esses resultados.

e. f.

63

1

r= 0,17 95% IC -0,03- 0,37 P= 0,0870

FT

pg

/mL

x h

s-P

CR

mg

/dL

a.

1000

b.

1000

100 100

10

0 100 200 300 400

10

0 100 200 300 400

c. d.

10 10

1 1

0.1 0.1

0.01 100 200 300 400

0.01 100 200 300 400

e. 10

100

1

10

0.1

0 100 200 300 400

1 100 200 300 400

r= -0,13 95% IC-0,37- 0,12 P= 0,2948 r= 0,08 95% IC-0,24- 0,25 P= 0,9558

r= -0,01 95% IC -0,22- 0,19 P= 0,8935

r= 0,21 95% IC"0, 01- 0,39 P= 0,0372 r= 0,05 95% IC -0,23- 0,32 P= 0,7341

f. 000

FT

pg

/mL

x IL

-6 p

g/m

L

FT

pg

/mL

x T

NF

- p

g/m

L

FT

pg

/mL

x A

DA

MT

S 1

3%

FT

pg

/mL

x F

vW

U/d

L

FT

pg

/mL

x IL

-8 p

g/m

L

64

Figura 8: Correlação do FT com outros marcadores de coagulação e marcadores

inflamatórios avaliados nos controles.

Legenda: a. correlação do FT com ADAMTS 13, b. correlação do FT com FWV, c. correlação do FT

com TNF-α, d. correlação do FT com hs-PCR, e. correlação FT com IL-6, f. correlação FT com IL-8. O

valor de P se refere ao teste de Sperarman e foi considerado significativo quando < 0,05

5.3.1. Avaliação de interleucinas conforme a manifestação clínica da SAF

Para avaliarmos se os marcadores da coagulação ou inflamatórios poderiam

estar associados a diferentes manifestações clínicas da SAF, como trombose arterial

e tromboses de repetição, subdividimos os pacientes com SAF primária e secundária

entre os que tiveram trombose venosa ou arterial e entre os que haviam tido

tromboses de repetição ou um único evento trombótico.

Não houve diferença dos níveis de FVW, ADAMTS 13, TNF-α, hs-PCR, IL-6

e IL-8, entre pacientes com trombose venosa e trombose arterial. Em relação a

recorrência dos eventos trombóticos, os pacientes com SAF que tiveram múltiplas

tromboses, apresentaram níveis circulantes de FT, FVW, ADAMTS 13, TNF-α, hs-

PCR, IL-6 e IL-8 semelhantes aos dos pacientes que tiveram um único episódio

trombótico. Os dados descritos estão nas tabelas 4 e 5.

65

Tabela 4: Demonstra a comparação dos pacientes de SAF com ocorrência de

trombose venosa e trombose arterial

Trombose Venosa Trombose Arterial P*

ADAMTS 13

(%) Mediana

(IQR)

107,10 (94,21-125,30)

n=49

111,50 (92,85- 123,80)

n=24

0,57

FVW U/dL

Mediana

(IQR)

131,80 (98,17-162,70)

n=48

143,70 (80,01-171,60) n=25 0,63

TNF-α pg/ml

Mediana

(IQR)

1,42 (0,18- 2,68) n= 76 1,40 (0,29- 2,10) n= 37 0,70

hs-PCR mg/dL

Mediana (IQR)

0,27 (0,09- 0,61) n= 72 0,33 (0,08- 1,00) n=36 0,28

IL-6 pg/ml

Mediana (IQR)

1,24 (0,58 -3,03) n=77 1,17 (0,61- 2,75) n= 37 0,90

IL-8 pg/ml

Mediana (IQR)

25,34 (16,54- 62,24) n=

58

19,24 (14,51- 28,69) n=28 0,08

*Valor de P calculado utilizando teste de Man-Whitney SAF- Síndrome do anticorpo antifosfolípide TEV-Tromboembolismo venoso FT- Fator tecidual ADAMTS 13- A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin type 1 repeats FVW- Fator de von Willebrand TNF-α- Fator de necrose tumoral-alfa hs-PCR - Proteína C Reativa IL-6: Interleucina-6 IL-8: Interleucina-8 IQR- Interquartile range n= Número de indivíduos

66

Tabela 5: Comparação entre pacientes com SAF conforme a ocorrência, ou não, de

múltiplos eventos trombóticos.

Evento trombótico único Múltiplas tromboses P*

ADAMTS 13

(%) Mediana

(IQR)

109,03 (98,08- 131,80)

n=35

107,50 (93,11- 117,40) n=38 0,37

FVW U/dL

Mediana (IQR)

132,50 (81,88- 162,40)

n=36

134,00 (89,94- 175,80) n=38 0,41

TNF-α pg/ml

Mediana (IQR)

1,33 (0,15- 2,31) n=72 1,75 (1,10- 2,65) n=41 0,15

hs-PCR mg/dL

Mediana (IQR)

0,26 (0,09- 0,65) n=71 0,32 (0,09- 0,83) n=38 0,42

IL-6 pg/ml

Mediana (IQR)

1,24 (0,58- 3,03) n=73 1,10 (0,64- 2,60) n=42 0,87

IL-8 pg/ml

Mediana (IQR)

24,26 (15,25- 41,93) n=50 20,78 (16,82- 34,73) n=37 0,57

*Valor de P calculado utilizando teste de Man-Whitney SAF- Síndrome do anticorpo antifosfolípide IQR- Interquartile range n= Número de indivíduos TEVTromboembolismo venoso FT- Fator tecidual ADAMTS 13- A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin type 1 repeats FVW - Fator de von Willebrand TNF-α- Fator de necrose tumoral-alfa hs-PCR - Proteína C Reativa IL-6: Interleucina-6 IL-8: Interleucina-8

67

5.4. Quantificação das micropartículas circulantes

As análises de micropartículas foram realizadas em 9 pacientes com SAF

primária, 9 pacientes com SAF secundária e 9 controles, escolhidos

randomicamente dentre os sujeitos participantes deste estudo. Não foram incluídos

pacientes com TEV porque não havia amostras adequadas desses pacientes para a

avaliação das MPs.

O número de micropartículas de células endotelias CD 34+ (MP-CD34+) foi

maior nos pacientes com SAF em relação ao controle, mas a diferença não foi

estatisticamente significativa. A média de eventos MP-CD34+ foi 9.778/mL nos

controles, 20.890 na SAF primária e 21.780/mL na SAF secundária (Figura 9).

Houve, entretanto, uma tendência a maior expressão de FT nas MP- CD34+ dos

pacientes com SAF primária e secundária em relação aos controles. A média de MP-

CD34+FT+ foi 1.333/mL nos controles, 4.444/mL na SAF primária e 8.444/mL na

SAF secundárias (P=0.08) (Figura 10).

O número de micropartículas de monócitos (MP-CD14+) foi semelhante nos

pacientes e controles. A média de eventos MP-CD14+ foi 7.111/mL nos controles

11.110/mL na SAF primária e 20.440/mL na SAF secundária (Figura 11). A

expressão de FT nas MP-CD14 foi maior nos pacientes com SAF, em particular SAF

secundária, porém a diferença não foi estatisticamente significativa. A média de

eventos MP-CD14+-FT+ foi 888,9/mL nos controles, 1.333/mL na SAF primária e

2.667/mL na SAF secundária (Figura 12).

O número de micropartículas de plaquetas (MP-CD 41+) foi semelhante nos

controles e pacientes. A média de eventos de MP-CD41+ foi 16.890 nos controles,

26.670 na SAF primária e 18.670 na SAF secundária (Figura 13). Não observamos

nenhuma MP de plaquetas CD 41+ que expressasse FT.

O número de micropartículas de células endoteliais CD144+ (MP-CD144+) foi

semelhante nos pacientes e controles, a média de eventos foi 25.780/mL nos

controles, 30.200/mL na SAF primária e 43.110 na SAF secundária. (Figura 14). Não

observamos nenhuma MP de células endoteliais CD 144+ com expressão de FT.

Nós avaliamos também o número de MP que expressavam FT, independentemente

de sua origem celular. Observamos que a quantidade de MP-FT+ foi semelhante nos

68

pacientes e controles. A média de eventos MP-FT+ foi 126.700/mL nos controles,

(+/- 101.500), 184.900/mL na SAF primária e 146.200/mL na SAF secundária.

(Figura 15).

69

P=0,4075

P=0,1746

MP

(A

nV

+)

+ (

CD

34

+)

+(F

T+

)

ev

en

tos

/m

L

MP

(A

nV

+)

+ (

CD

14+

) +

(F

T+

)

ev

en

tos /

mL

80000 50000

60000

40000

40000

30000

20000

20000 10000

0

SAF SAF Controles Primária Secundária

0 SAF SAF

Controles Primária Secundária

*Valor de p calculado utilizado o teste de Kruskal Wallis


Figura 9: Resultados das análises de

citometria para Micropartículas de células

endoteliais (CD34+).

Legenda: a Figura demonstra o número de

eventos de MP de CD 34+ nos pacientes de SAF

primária , SAF secundária e controles.


citometria de fluxo para micropartículas

de células endoteliais (CD34+) e FT.

Legenda: a Figura Representa a quantificação de

MPs de células endoteliais (CD34+) que

expressam FT, nos controles e nos pacientes com

SAF primária e SAF secundária.

60000 15000

40000 10000

20000 5000

0 SAF

SAF 0

SAF SAF Controles Primária Secundária






de monócitos (CD14+).

Legenda: a Figura representa os eventos de MP

de CD 14+ nos pacientes de SAF primária e SAF

secundária e controles.



de monócitos (CD14+) e FT.

Legenda: a Figura representa os eventos de CD

14+ /FT+ nos pacientes de SAF primária e SAF

secundária e controle

P=0,0806

P=0,5290

MP

(A

nV

+)+

CD

14

+

ev

en

tos/m

L

MP

(A

nV

+)+

CD

34+

even

tos/m

L

70

P=0,1816

MP

(A

nV

+)+

CD

14

4+

even

tos / m

L

80000 200000

60000 150000

40000 100000

20000 50000

0 SAF SAF


0 SAF SAF


*Valor de p calculado utilizado o teste de Kruskal Wallis *Valor de p calculado utilizado o teste de Kruskal Wallis



de plaquetas (CD41+).

Legenda: a Figura mostra o número de eventos

de CD 41+ nos pacientes de SAF primária e SAF

secu



de células endoteliais (CD 144+).

Legenda: Demonstra o número de eventos de

MP de CD144+ nos pacientes de SAF primária

SAF secundária e controles.

800000.0

600000.0

400000.0

200000.0

0.0

ndária e controles.

SAF SAF




citometria de fluxo de positividade de

micropartículas e FT.

Legenda: a Figura demonstra os eventos de

Anexina V+/ FT+ nos controles, SAF primária, e

SAF secundária.

P=0,9106

P=0,6627

MP

(A

nV

+)

+ (

FT

+)

ev

en

tos/m

L

MP

(A

nV

+)

+

CD

41

+ e

ve

nto

s/m

L

71

6. DISCUSSÃO

No presente estudo, pudemos observar que níveis elevados de FT estão

associados a tromboses relacionadas à SAF, em contraste com a não associação

entre níveis de FT e TEV. Na SAF, os níveis circulantes de FT estavam aumentados

tanto nos casos primários quanto nos secundários a LES, sendo que o aumento foi

mais pronunciado neste último grupo. Entretanto, quando avaliamos complicações

relacionadas à maior gravidade da SAF, como o local da trombose (venosa ou

arterial) ou recorrência das tromboses (tromboses múltiplas), pudemos observar que

os níveis de FT não estavam relacionados com a gravidade da doença.

A associação entre FT e manifestações clínicas da SAF já havia sido

demonstrada anteriormente em um estudo observacional que incluiu principalmente

casos obstétricos de SAF. Nesse estudo, altos níveis de FT estavam associados a

manifestações obstétricas da SAF (25). Portanto, os resultados do nosso estudo são

consistentes com estudos anteriores, e demonstram ainda que o FT está associado

não apenas com as manifestações obstétricas, mas também com as manifestações

trombóticas, arterial ou venosa, da SAF.

A importância do FT para o desenvolvimento da trombose arterial já foi

descrita. Acredita-se que a lesão endotelial sob as placas ateroscleróticas pode levar

a expressão do FT nas placas (26, 27). Nesse contexto, o FT é responsável pelo

início da cascata de coagulação e é fundamental para a indução do trombo sobre a

lesão aterosclerótica. Embora a principal fonte de FT seja a placa aterosclerótica, o

FT circulante presente principalmente em monócitos pode também contribuir para a

formação do trombo no local da ruptura da placa. (28)

Ao contrário do que ocorre nas tromboses arteriais, o papel do FT nas

tromboses venosas é questionável. Dois estudos clínicos recentes avaliaram a

associação entre FT e trombose venosa e não demonstraram relação entre

expressão do FT e a ocorrência de trombose venosa espontânea. (29, 30). Em

concordância com esses estudos, o presente estudo também não encontrou

associação entre os níveis de FT e a ocorrência TEV espontânea, e, portanto,

podemos demonstrar que o estímulo do FT provavelmente não exerce papel

importante na ocorrência dessas tromboses.

72

Pudemos observar, entretanto, que os níveis de FVW estavam significativamente

aumentados nos pacientes com TEV espontâneo e que o aumento do FVW foi

menos pronunciado na SAF. Esse resultado confirma a associação entre FVW e

TEV demonstrada em estudos anteriores (31). Desta forma, os resultados do

presente estudo permitem concluir que os mecanismos que levam a trombose

venosa na SAF são aparentemente distintos dos mecanismos trombóticos da TEV

espontânea. Diferentemente do que ocorre na TEV espontânea, na SAF o estado de

hipercoagulabilidade e a ocorrência de tromboses estão provavelmente relacionados

a ativação do FT.

É possível que a ativação do FT na SAF seja desencadeada por mecanismos

imunes, em particular pela ação de anticorpos antifosfolípides. Os anticorpos

antifosfolípides podem se ligar as membranas celulares e ativar células que

expressam FT, como monócitos e células endoteliais, principalmente. Além disso, o

maior potencial inflamatório da SAF, em relação a outros tipos de trombose, também

poderia estimular células endoteliais e monócitos a expressar FT. No presente

estudo, pudemos observar que as citocinas inflamatórias, TNF-α, IL-6, IL-8 e hs-

PCR estavam aumentadas nos casos de SAF, em particular de SAF secundária,

mas também estavam aumentados nos casos de TEV espontânea. Os níveis das

citocinas inflamatórias estavam aumentados de forma semelhante nos pacientes

com TEV espontânea e SAF, e não houve correlação significativa entre níveis de FT

e níveis de citocinas inflamatórias circulantes. Portanto, não conseguimos

demonstrar a relação entre inflamação e FT nesse estudo.

Esse resultado foi inesperado porque a relação entre ativação do FT e doenças

inflamatórias já foi demonstrada em diversos estudos experimentais e clínicos

prévios, como Ji Y et al (32) que, em um estudo com modelo murino de trombose,

demonstrou que a PCR promove ativação do FT e do antígeno ativador do

plasminogênio (PAI-1). Também há evidências de que a expressão do FT nos

monócitos poderia ser desencadeada pela presença de LDL oxidado, que ativaria

essas células e levaria a secreção de citocinas inflamatórias (5, 33). Em outro estudo

recente (34), mostrou que a hiperglicemia poderia induzir o receptor Toll-like 4

(TLR4), presente em monócitos e células endoteliais, e em consequência, estimular

a atividade procoagulante do FT, evidênciando a relação entre mecanismos

inflamatórios e a atividade do FT. Já em modelos murinos de SAF, Laplante et al.

73

(34) demonstrou que anticorpos antifosfolípides e lipopolissacarídeos (LPS)

mostraram-se capazes de aumentar a expressão do FT em leucócitos através da

indução do TLR4. E ainda nesse sentido, Tehrani et al. (36) realizou um estudo onde

o tratamento com atorvastatina reduziu o FT, possivelmente pela ação anti-

inflamatória da droga.

Além disso, o aumento de expressão do FT foi demonstrado ser causa da

hipercoagulabilidade e tromboses induzidas por neoplasia (37, 38). Estudos clínicos

sugerem que o FT circulante pode ser útil como biomarcador para identificar o risco

trombótico de pacientes com câncer (39, 40).

Apesar das evidências descritas acima, a relação entre inflamação e estímulo

para expressão de FT não foi observada em outros estudos. Recentemente foi

demonstrado que citocinas inflamatórias, como IL-6, IL-8 e IL-1β estimulavam a

coagulação sobre a placa aterosclerótica através principalmente da ativação de

plaquetas, sendo que a expressão do FT e a ativação da cascata da coagulação

seriam eventos secundários (41).

Além disso, o nosso estudo não pode descartar uma possível relação entre

ativação do FT e inflamação, porque as citocinas mensuradas não são marcadores

específicos da SAF ou da atividade autoimune, e seus níveis podem oscilar devido a

diversos fatores, como infecção, obesidade, trauma. Estudos clínicos recentes

mostraram que níveis de TNF-α, embora aumentados, são incapazes de distinguir

casos de SAF primária e secundária (42,43, 44).

Portanto, acreditamos que a mensuração de marcadores de inflamação ou

ativação imune que sejam mais específicos da SAF, como a formação de complexo

antígeno-anticorpo (antiB2GP1- B2GP1) ou quantificação de níveis séricos de

anticorpos por quimiluminescência, poderiam ser úteis para demonstrar a

associação entre a atividade imune da doença e a ativação do FT em estudos

clínicos.

Até o momento, os resultados desse estudo nos permitem afirmar que há uma

associação entre o FT circulante e a ocorrência de trombose relacionada à SAF, e

que é possível que o aumento do FT exerça efeito causal nesse tipo de trombose.

Entretanto, uma vez que o FT é uma proteína presente nas membranas

celulares e que não há formas livres circulantes de FT, o segundo objetivo do

74

estudo, foi avaliar clinicamente qual seria a origem celular do FT observado na

circulação dos pacientes. Sabe-se que células ativadas podem liberar

micropartículas na circulação sanguínea e que contém as mesmas proteínas de

superfície expressas nas células de origem. Em particular, já foi demonstrado “in

vitro”, que células endoteliais, plaquetas ou monócitos, podem liberar micropartículas

que expressam FT após sofrerem estímulo procoagulante. Além disso, a forma

circulante do FT é provavelmente resultado da liberação de micropartículas da

membrana dessas células. Portanto, para avaliar a origem do FT circulante,

quantificamos as micropartículas que expressam FT e sua origem celular. Pudemos

observar que pacientes com SAF apresentavam uma tendência ao aumento de

micropartículas de células endoteliais (CD34+) que expressavam FT, o que sugere

que o FT circulante observado nos pacientes com SAF pode ser originado de células

endoteliais ativadas.

Estudos prévios também exploraram a presença de FT em micropartículas

circulantes. Khaspeka et al.(45) comparou a atividade do FT em micropartículas de

células endoteliais, plaquetas, monócitos e granulócitos em um estudo “in vitro”.

Nesse estudo, foi observado que micropartículas de monócitos e de células

endoteliais expressavam FT. Porém, não houve expressão do FT em micropartículas

de plaquetas e nos granulócitos. Esse estudo também mostrou que o FT em

micropartículas se encontrava numa forma ativa e podia estimular o início da

cascata de coagulação. Shustova, et al. (46), também detectou FT ativo em

monócitos e, em menor quantidade, em células endoteliais, mas não em

micropartículas de plaquetas.

Um estudo anterior detectou a exposição da

fosfatidilserinanas micropartículas, bem como, a origem celular dessas

micropartículas na nefropatia por IgA, uma doença renal autoimune (47). Os

resultados mostraram que há exposição da fosfatidilserina na membrana de

micropartículas de leucócitos, plaquetas, eritrócitos e células endoteliais. A

exposição da fosfatidilserina também aumentou a afinidade do FVIIa e FVa, levando

assim ao aumento de FXa, produção de trombina e fibrina.

Ainda que nesse estudo não tenha sido avaliado se as micropartículas

expressavam FT, os resultados demonstram que as micropartículas estão

envolvidas no processo da coagulação. Portanto, nossos resultados, embora

75

incipientes, apontam para a mesma direção dos estudos prévios, visto que também

observamos positividade do FT em micropartículas de monócitos e células

endoteliais, em particular nos pacientes com SAF.

Esse estudo tem algumas limitações que precisam ser destacadas. Uma das

principais limitações está relacionada à quantificação das micropartículas. Primeiro,

tivemos problemas com a padronização dos experimentos com micropartículas

porque observamos que alguns sinais detectados pelo citômetro na região que

correspondia as micropartículas, correspondiam na verdade a agregados livres de

anticorpos. Parte da anexina V presente nas amostras ligou-se a esses anticorpos, e

não a micropartículas. Observamos, porém, que não havia marcação inespecífica

quando 3 anticorpos eram utilizados, como quando marcávamos micropartículas

(anexina V), antígeno de membrana (CD 34, 14, 144 ou 41) e FT. Portanto, optamos

por concentrar as análises nos dados que continham pelo menos 3 marcadores

fluorescentes, o que reduziu muito o número de eventos observados. Outra limitação

em relação à quantificação de micropartículas foi a escolha do marcador anexina V.

Um estudo recente (48) demonstrou que a anexina V não marca todas as

micropartículas presentes na amostra. É possível que mais de um marcador de

micropartículas seja necessário para que a quantificação seja mais precisa (49).

Portanto, o número de micropartículas detectado nesse estudo pode estar

subestimado por causa do uso apenas da anexina V como marcador. As células

endoteliais foram as que mais expressaram FT, entretanto não há como afirmar que

o FT observado nessas micropartículas é originário da própria célula endotelial, ou

carregado nas membranas de outras células que expressam FT,

célula-célula. Segundo, esse estudo também teve a limitação de ter realizado a

coleta retrospectiva dos dados clínicos dos pacientes, sendo assim, é possível que

alguns dados clínicos tenham sido perdidos ou não tenham sido recuperados na

ocasião do levantamento de dados. Terceiro, o FT circulante pode ser medido por

ELISA ou ensaios funcionais e a escolha do ensaio pode afetar a interpretação

clínica dos resultados. Aqui, escolhemos medir o antígeno de FT usando um teste

ELISA comercialmente disponível porque queríamos usar um ensaio que pudesse

ser facilmente reproduzido. Quarto, o tamanho da amostra foi pequeno, o que pode

ser explicado pela relativa raridade da SAF. No entanto, o estudo teve poder

estatístico para demonstrar uma associação entre TF circulante e trombose

76

relacionada à SAF. Quinto, não incluímos no estudo um grupo de participantes com

antifosfolípides, mas assintomáticos, o que poderiam ter fornecido informações

adicionais sobre a associação entre níveis circulantes de FT e esses anticorpos. No

entanto, um estudo anterior demonstrou que os níveis de FT foram semelhantes em

indivíduos com antifosfolípides positivos e controles saudáveis, sugerindo que o

aumento nos níveis de FT está relacionado principalmente a complicações da SAF.

Apesar das limitações do estudo, pudemos demonstrar que a SAF se diferencia

das outras trombofilias por apresentar eventos trombóticos associados ao aumento

da expressão do FT. É possível que a associação entre FT e trombose na SAF

tenha sido subestimada devido às limitações do estudo, entretanto, apesar das

limitações, essa associação pôde ser demonstrada.

A confirmação da importância do FT nas manifestações trombóticas da SAF

tem relevância clínica diagnóstica e terapêutica. Há grande dificuldade atualmente

em se diagnosticar alguns casos de SAF, primeiro porque os resultados da dosagem

de anticorpos apresentam grande variabilidade inter e intralaboratorial (50).

Segundo, porque muitos pacientes estão em uso de anticoagulação e os

medicamentos anticoagulantes podem interferir com os resultados dos testes de

anticorpos. Finalmente, porque altos níveis de PCR podem influenciar na detecção

do anticoagulante lúpico. Desta forma, a dosagem do FT poderia surgir como um

marcador da doença, a ser utilizado em conjunto com os exames atuais, para

auxiliar no diagnóstico da SAF.

Do ponto de vista terapêutico, a confirmação da importância do FT nas

manifestações trombóticas da SAF poderia embasar a justificativa para o uso futuro,

em estudos clínicos, de medicamentos que possam prevenir a trombose na SAF

através da redução da expressão do FT. Um medicamento em potencial que

atenderia essa questão seria a estatina, uma classe de drogas amplamente

utilizadas para a redução dos lípides séricos e que possui efeitos antitrombóticos

pleiotrópicos. Dentre os efeitos antitrombóticos das estatinas, está a redução da

expressão do FT, tanto em placas ateroscleróticas quanto em monócitos.

77

7. REFERÊNCIAS

(1) Gardiner C, Hills J, Machin SJ, Cohen H. Diagnosis of antiphospholipid syndrome in routine clinical practice. Lupus. 2012;(September 2012):17–25.

(2) Espinosa G, Cervera R. Antiphospholipid syndrome: frequency, main causes and risk factors of mortality. 2010; Nat Rev Rheumatol, v.6, n.5, May, p.296-00.

(3) Meroni PL, Borghi MO, Raschi E, Tedesco F.Pathogenesis of antiphospholipid syndrome: understanding the antibodies. Nat Rev Rheumatol. 2011; v.7, n.6, Jun, p.330-09.

(4) Cervera JC, Piette J, Font MA, Khamashta Y, Shoenfeld MT, Camps S, et al. Antiphospholipid syndrome: Clinical and immunologic manifestations and patterns of disease expression in a cohort of 1,000 patients, Arthritis Rheum. 46.2002; 1019–1027. doi:10.1002/art.10187.

(5) Ruiz-Irastorza G, Crowther M, Branch W, Khamashta MA. Antiphospholipid syndrome. Lancet [Internet]. 2010;376(9751):1498–509. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60709-X

(6) Erkan D, Lockshin MD. Non-criteria manifestations of antiphospholipid syndrome. 2010; Lupus, v.19, n.4, Apr, p.424-7.

(7) Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, Cervera R, et al.

International consensus statement on an update of the classification criteria for

definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost. 2006;4(2):295–

306.

(8) Pengo V, Denas G, Banzato A, Bison E, Bracco A, Facchinetti M.Secondary

prevention in thrombotic antiphospholipid syndrome. Lupus. 2012; v.21, n.7,

Jun, p.734-5.

(9) Cervera R, Khamashta MA, Shoenfeld Y, Camps MT, Jacobsen S, Kiss E, et

al. Morbidity and mortality in the antiphospholipid syndrome during a 5-year

period: a multicentre prospective study of 1000 patients. Ann Rheum Dis

[Internet]. 2009; 68(9):1428–32. Available from:

https://ard.bmj.com/content/68/9/1428

(10) Pengo V, Ruffatti A, Legnani C, Gresele P, Barcellona D, Erba N, et al. Clinical

course of high-risk patients diagnosed with antiphospholipid syndrome. J

Thromb Haemost. 2010; v.8, n.2, Feb, p.237-42.

(11) Ruiz-Irastorza G, Cuadrado M, Ruiz-Arruza I, Brey R, Crowther M, Derksen R,

et al .Evidence-based recommendations for the prevention and long-term

management of thrombosis in antiphospholipid antibody-positive patients:

report of a task force at the 13th International Congress on antiphospholipid

antibodies. Lupus. 2011; v.20, n.2, Feb, p.206-18.

(12) Pengo V, Denas G, Banzato A, Bison E, Bracco A, Facchinetti M, et al.

Secondary prevention in thrombotic antiphospholipid syndrome. Lupus. 2012;

v.21, n.7, Jun, p.734-5.

http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60709-X

https://ard.bmj.com/content/68/9/1428

78

(13) Keeling D, Mackie I, Moore GW, Greer IA, Greaves M. Guidelines on the

investigation and management of antiphospholipid syndrome. Br J Haematol.

2012;157(1):47–58.

(14) Saraiva SDS, Custódio IF, Mazetto BDM, Collela MP, De Paula EV,

Appenzeller S, et al. Recurrent thrombosis in antiphospholipid syndrome may

be associated with cardiovascular risk factors and inflammatory response.

Thromb Res. 2015; v.136,Dec, p.1174–1178.

(15) Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of fibrinolysis. Br J

Haematol. 2005; v.129, n.3, May, p.307-21.

(16) Rapaport SI. Regulation of the tissue factor pathway. Ann N Y Acad Sci. 1991;

v.614, p.51-62.

(17) Brummel KE, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during

tissue factor-induced blood coagulation. Blood. 2002;100(1):148–52.

(18) Lim W. Antiphospholipid antibody syndrome. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009; p.233-9.

(19) Flores-Nascimento MC, Beltrame MP, De Paula EV, Montalvão SL, Pereira FG, Orsi FL, et al. Microparticles in deep venous thrombosis, antiphospholipid syndrome and Factor V Leiden. Platelets. 2009; v.20, n.6, Sep, p.367-75.

(20) Breitenstein A, Tanner FC, Lüscher TF. Tissue Factor and Cardiovascular Disease: Circ J [Internet]. 2010;74(1):3–12. Available from:http://joi.jlc.jst.go.jp/JST.JSTAGE/circj/CJ-09-0818?from=CrossRef

(21) Favaloro EJ, Smith J, Petinos P, Hertzberg M, Koutts J. Laboratory testing for von Willebrand's disease: an assessment of current diagnostic practice and efficacy by means of a multilaboratory survey. RCPA Quality Assurance Program (QAP) in Haematology Haemostasis Scientific Advisory Panel. Thromb Haemost. 1999; v.82, n.4, Oct, p.1276-82.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Flores-Nascimento%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Beltrame%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=De%20Paula%20EV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Montalv%C3%A3o%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pereira%20FG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pereira%20FG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Orsi%20FL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19811220

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Favaloro%20EJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10544913

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Smith%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10544913

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petinos%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10544913

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hertzberg%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10544913

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Koutts%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10544913

79

(22) Nieuwland R, Berckmans RJR, McGregor S, Böing AN, Romijn FP,

Westendorp RGJ, et al. Cellular origin and procoagulant properties of

microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 2000; v.95, n.3, Feb 1, p.930-5.

(23) Sturk-Maquelin KN, Nieuwland R, Romijn FP, Eijsman L, Hack CE, Sturk A.

Pro- and non-coagulant forms of non- cell-bound tissue factor in vivo. J Thromb

Haemost. 2003; v.1, n.9, Sep, p.1920-6.

(24) Tesselaar MET, Romijn FPHTM, Van Der Linden IK, Prins FA, Bertina RM,

Osanto S. Microparticle-associated tissue factor activity: A link between cancer

and thrombosis? J Thromb Haemost. 2007;5(3):520–7.

(25) Tehrani S, Mobarrez F, Antovic A, Santesson P, Lins P, Adamson U, et al.

Atorvastatin has antithrombotic effects in patients with type 1 diabetes and

dyslipidemia, Thrombosis Research. 2010; v.126 , Issue 3 , e225 - e231

(26) Tremoli E. Tissue Factor in Arterial and Venous Thrombosis : From Pathophysiology to Clinical Implications. 2015;1(212).

(27) Palmerini T, Tomasi L, Barozzi C, Della Riva D, Mariani A, Taglieri N, et al. Detection of tissue factor antigen and coagulation activity in coronary artery thrombi isolated from patients with ST-segment elevation acute myocardial infarction. PLoS One. 2013;8(12):1–9.

(28) Tatsumi K, Mackman N. Tissue Factor and Atherothrombosis. J Atheroscler Thromb [Internet]. 2015;22(6):543–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26016513

(29) Thaler J, Koppensteiner R, Pabinger I, Ay C, Gremmel T. Microparticle- associated tissue factor activity in patients with acute unprovoked deep vein thrombosis and during the course of one year, Thromb. Res. 134 (2014) 1093– 1096. doi:10.1016/j.thromres.2014.07.041.

(30) Evangelista FCG, Rios DRA, Ribeiro DD, Carvalho MG, Dusse LMS, Fernandes AP, et al. Lack of association between potential prothrombotic genetic risk factors and arterial and venous thrombosis. Genet Mol Res [Internet]. 2015;14(3):9585–94. Available from:http://www.funpecrp.com.br/gmr/year2015/vol143/pdf/gmr5954.pdf

(31) Mazetto BM, Orsi FL, Barnabe A, De Paula E, Flores-Nascimento MC, et al Increased ADAMTS13 activity in patients with venous thromboembolism. Thrombosis Research. 2012; v.130,Issue 6 , 889 - 893.

(32) Ji Y, Fish PM, Strawn TL, Lohman AW, Wu J, Szalai AJ, et al. C-reactive protein induces expression of tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 and promotes fibrin accumulation in vein grafts. J Thromb Haemost [Internet]. 2014;12(10):1667–77.

(33) Martirosyan A, Petrek M, Navratilova Z, Blbulyan A, Boyajyan A, Manukyan G. Differential regulation of proinflammatory mediators following LPS- and ATP-induced activation of monocytes from patients with antiphospholipid syndrome. Biomed Res Int. 2015;2015.

(34) Koneti NR, Kathare P, Dash TK, Murki S. Surgical correction of obstructed total anomalous pulmonary venous return soon after birth. Annals of Pediatric Cardiology. 2015; 8(3):255-256.

(35) Laplante P, Fuentes R, Salem D, Subang R, Gillis MA, Hachem A, et al. Antiphospholipid antibody-mediated effects in an arterial model of thrombosis are dependent on Toll-like receptor 4. Lupus. 2016; v.25, Issue 2, p. 162 - 76.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sturk-Maquelin%20KN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12941032

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nieuwland%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12941032

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Romijn%20FP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12941032

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eijsman%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12941032

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hack%20CE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12941032

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sturk%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12941032

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0049384810003348#!







https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Koneti%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26556979

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kathare%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26556979

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dash%20TK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26556979

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Murki%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26556979

80

(36) Tehrani S, Mobarrez F, Antovic A, Santesson P, Lins PE, Adamson, U. Atorvastatin has antithrombotic effects in patients with type 1 diabetes and dyslipidemia, Thrombosis Research. 2010; v.126 , Issue 3 , e225 - e231

(37) Geddings JE, Hisada Y, Boulaftali Y, Getz TM, Whelihan M, Fuentes R, et al. Tissue factor-positive tumor microvesicles activate platelets and enhance thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 2016;

(38) Thomas GM, Brill A, Mezouar S, Crescence L, Gallant M, Dubois C, et al. Tissue factor expressed by circulating cancer cell-derived microparticles drastically increases the incidence of deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 2015;

(39) Geddings JE, Mackman N. Tumor-derived tissue factor–positive microparticles and venous thrombosis in cancer patients. Blood. 2013; 122(11):1873-80.

(40) Auwerda JJ, Yuana Y, Osanto S, de Maat MP, Sonneveld P, Bertina RM et al. Microparticle-associated tissue factor activity and venous thrombosis in multiple myeloma. Thromb Haemost.; 2011. 105(1):14–20.

(41) Bester J, Pretorius E. Effects of IL-1β, IL-6 and IL-8 on erythrocytes, platelets and clot viscoelasticity. Scientific Reports. 2016; 6(1), 32188.

(42) Bertolaccini ML, Atsumi T, Lanchbury JS, Caliz AR, Katsumata K, Vaughan RW, et al. Plasma tumor necrosis factor alpha levels and the -282* A promoter polymorphism in patients with antiphospholipid syndrome. Tromb Haemost. 2001; 85:198-203.

(43) Swadzba J, Iwaniec T, Musial J. Increased level of tumor necrosis factor-?? in patients with antiphospholipid syndrome: Marker not only of inflammation but also of the prothrombotic state. Rheumatol Int. 2011;31(3):307–13.

(44) Bećarević M. TNF-alpha and annexin A2: inflammation in thrombotic primary antiphospholipid syndrome. Rheumatol Int. 2016;36(12):1649–56.

(45) Khaspekova SG, Antonova OA, Shustova ON, Yakushkin V V., Golubeva N V., Titaeva E V., et al. Activity of tissue factor in microparticles produced in vitro by endothelial cells, monocytes, granulocytes, and platelets. Biochem [Internet]. 2016;81(2):114–21.

(46) Shustova ON, Antonova OA, Golubeva NV, Khaspekova SG, Yakushkin VV, Aksuk SA, et al. Differential procoagulant activity of microparticles derived from monocytes, granulocytes, platelets and endothelial cells. Blood Coagul Fibrinolysis [Internet]. 2017;28(5):373–82. Available from: http://insights.ovid.com/crossref?an=00001721-201707000-00004

(47) He Z, Zhang Y, Cao M, Ma R, Meng H, Yao Z, et al. Increased phosphatidylserine-exposing microparticles and their originating cells are associated with the coagulation process in patients with IgA nephropathy. Nephrol Dial Transplant. 2016;31(5):747–59.

(48) Chiva-Blanch G, Suades R, Padró T, Vilahur G, Peña E, Ybarra J, et al. Microparticle Shedding by Erythrocytes, Monocytes and Vascular Smooth Muscular Cells Is Reduced by Aspirin in Diabetic Patients. Rev Española Cardiol (English Ed [Internet]. 2016;69(7):672–80. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S188558571630007X

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Auwerda%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21057704

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yuana%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21057704

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Osanto%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21057704

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Maat%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21057704

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sonneveld%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21057704

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bertina%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21057704

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lanchbury%20JS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11246532

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Caliz%20AR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11246532

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Katsumata%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11246532

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vaughan%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11246532

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vaughan%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11246532

http://insights.ovid.com/crossref?an=00001721-201707000-00004

http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S188558571630007X

81

(49) Wisgrill L, Lamm C, Hartmann J, Preißing F, Dragosits K, Bee A, et al. Peripheral blood microvesicles secretion is influenced by storage time, temperature, and anticoagulants. Cytom Part A. 2016;89(7):663–72.

(50) Saraiva SS, Orsi FA, Santos MP, Machado T, Montalvão S, Costa-Lima C, et al Home management of INR in the publichealth system: feasibility of self management of oralanticoagulation and long-term performance of individual POC devices in determining INRJ Thromb Thrombolysis. 2016.

82

8. ANEXOS

a. Anexo I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para pacientes e controles saudáveis

Projeto: “O papel do fator tecidual nas complicações trombóticas da síndrome

antifosfolípide”

Responsáveis pelo projeto:

Laís Quinteiro Tobaldini

Profa. Dra. Fernanda Loureiro de Andrade Orsi

Eu_____________________________________Idade:______RG: ______________

HC/AIH/RH_____________________Residente à Rua/

Av.___________________________ CEP:___________ ,Telefones:__________,

concordo em participar do presente estudo, após estar absolutamente esclarecido

(a) dos propósitos do mesmo.

Em caso de menores/ incapazes, o responsável

legal,_______________________________,RG:_________________, responsável

pelo(a) menor ou incapaz__________________________________,

Idade:____________RG:____________________,Grau de Parentesco:

______________Residente à Rua/

Av.___________________CEP:_________Telefones:_____________concorda que

o menor/incapaz participe do presente estudo, após estar absolutamente esclarecido

(a) dos propósitos do mesmo.

Este estudo pretende quantificar a presença e a atividade de fatores que agem na

coagulação que podem estar envolvidos na ocorrência de trombose em uma doença

grave, chamada síndrome antifosfolípide (SAF). Nestas doenças, o risco de

tromboses e suas complicações hemorrágicas são grandes e pode envolver uma

série de fatores, entre os quais aqueles que pretendemos identificar no sangue das

pessoas acometidas por essa doença. Os resultados da dosagem desses fatores

83

serão comparados com a evolução clínica dos doentes durante o tempo de vigência

deste estudo. Isso poderá ajudar na compreensão da gravidade da trombose nos

pacientes com SAF.

Para tanto, coletaremos 20mL de sangue do(a) senhor(a) em uma única ocasião,

através da punção de veia periférica.

Os riscos a que o senhor(a), ou o(a) menor ou incapaz por quem o(a) senhor(a) é

responsável, estará sujeito ao participar da coleta são hematoma (mancha roxa)

e/ou pequena dor no local da punção venosa. Este estudo não oferecerá a(o)

senhor(a) nenhum outro risco importante.

Sua participação, ou do(a) menor ou incapaz por quem o(a) senhor(a) é

responsável, no estudo contribuirá para o melhor entendimento da trombose na

SAF, e conseqüentemente para a proposta de um tratamento mais eficaz para este

tipo de doença no futuro.

Outras informações:

O (a) senhor (a), como voluntário ou como responsável pelo(a) menor ou incapaz,

estará livre para negar-se a participar do estudo ou desistir do estudo a qualquer

tempo, mesmo que inicialmente tenha concordado em fazê-lo.

Caso o (a) senhor (a) não concorde ou desista, a qualquer momento, de participar

do estudo não haverá nenhum prejuízo ao tratamento da sua doença em curso ou

da doença que afeta o(a) menor ou incapaz por quem o(a) senhor(a) é responsável.

O (a) senhor (a), como voluntário ou responsável pelo(a) menor ou incapaz, poderá

tirar todas as dúvidas que tiver, ou que apareçam durante o estudo, sobre o mesmo,

havendo o compromisso do pesquisador em respondê-las.

O material sanguíneo colhido neste estudo será utilizado para os objetivos propostos

e gostaríamos de saber se o senhor (a) concorda que seu plasma, ou

84

do (a) menor ou incapaz por quem o(a) senhor(a) é responsável, possa ser

armazenado.

Sim Não

Gostaríamos de saber se o senhor (a) concorda que seu sangue, ou do(a) menor ou

incapaz por quem o(a) senhor(a) é responsável, possa ser utilizado em pesquisas

futuras.

Sim Não

Caso o seu sangue, seja armazenado, ficará disponível no biorrepositório de

amostras biológicas do Laboratório de Hemostasia e Biologia Molecular do

Hemocentro de Campinas/ UNICAMP.

Todas as informações obtidas pelo estudo terão um caráter sigiloso e confidencial e

serão usadas apenas com a finalidade de divulgação e publicação científica, e a

identidade dos participantes será sempre preservada.

A sua discordância em participar do estudo não acarretará a(o) senhor(a), ao(a)

menor ou incapaz por quem o(a) senhor(a) é responsável nenhum prejuízo em

qualquer outro tratamento ou procedimento que possa necessitar futuramente em

qualquer serviço de nosso hospital.

Qualquer tipo de queixa ou reclamação relacionada

a esta pesquisa o senhor

(a) poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da FCM-

UNICAMP localizado á rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Campinas –SP, CEP:

13083-887, telefone (19) 3521-8936, email: [email protected]

Campinas __/ _/


85

Assinatura do Voluntário

Assinatura do Responsável legal (Caso

aplicável)

Profa. Dra. Fernanda Loureiro de Andrade

Orsi

Orientadora responsável Fone: (19) 3521-

8601

Laís Quinteiro Tobaldini

Aluna de Pós-graduação Fone: (19) 3521-8617

86

b. Anexo II- Questionários para controles saudáveis

DATA:

Nome do Paciente:

HC: Data de nascimento:

Idade: Sexo: : Feminino Masculino

Endereço:

Email:

Telefone:

Origem étnica: Caucasóide Afro-descendente Obs.:

História Pessoal de trombose venosa profunda (TVP), ou acidente vascular cerebral (AVC),

ou infarto agudo do miocárdio (IAM): Sim Não. Qual?........................................................................................... Fator

de risco: .................................................................................................................................................................... História

Familiar de TVP, ou AVC, ou IAM: Sim Não. Qual?................................................................................

Grau de parentesco e idade:.................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................................................

Sofre de algumas destas doenças: Hipertensão arterial: Sim Não Diabetes: Sim Não Dislipidemia: Sim Não

Síndrome Convulsiva: Sim Não Hipotiroidismo: Sim Não Neoplasia: Sim Não

Doença Renal: Sim Não

Doença hepática: Sim Nã

87

Síndrome do anticorpo antifosfolipídio Sim Não

Outras

Fumo: Sim Não. Quanto tempo? Quantos cigarros?

Faz uso de algum medicamento? Sim Não. Qual?

Faz uso de anticoncepcional? Sim Não. Qual? Quanto tempo? Via:

Faz Terapia de Reposição Hormonal? Sim Não. Qual medicamento? Quanto tempo?

Está grávida? Sim Não. Quantas semanas?

Quantas gestações anteriores? Complicações: Sim Não. Qual?

Abortos: Sim Não. Quantos?

Puerpério: Sim Não Data do parto:

Já passou por alguma cirugia?

Medidas Antropométricas:

Peso: Circunferência abdominal:

Altura: Obesidade: Sim Não

IMC:

88

c. Anexo III – Avaliação dos pacientes com SAF e trombose

90

d. Anexo IV- Autorização para inclusão o artigo na dissertação

1/02/2019 RightsLink Printable License

ELSEVIER ORDER DETAILS

Feb 11, 2019

Order Number 501462989

Order date Feb 11,

2019 Licensed Content Publisher

Elsevier

Licensed Content Publication Thrombosis Research

Licensed Content Title Circulating levels of tissue factor and the risk of thrombosis

associated with antiphospholipid syndrome

Licensed Content Author Laís Quinteiro Tobaldini,Fernanda Talge Arantes,Sabrina da Silva Saraiva,Bruna de Moraes Mazetto,Marina Pereira

Colella,Erich Vinícius de Paula,Joyce Annichino-

Bizzachi,Fernanda Andrade Orsi

Licensed Content Date November

2018 Licensed Content Volume 171

Licensed Content Issue

n/

a Licensed Content Pages 7

Start Page 114

End Page 120

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92

d. Anexo V- Parecer do comitê de ética

96

28/02/2019 Gmail - PLATBR - Citação no Projeto de Pesquisa

Laís Quinteiro <[email protected]>

PLATBR - Citação no Projeto de Pesquisa 1 mensagem

Equipe Plataforma Brasil <[email protected]> 27 de

fevereiro de 2019 14:16 Para: LAIS QUINTEIRO TOBALDINI

<[email protected]>

Prezado (a) Sr. (a) LAIS QUINTEIRO TOBALDINI,

Você foi incluído como Equipe do Projeto no Projeto de Pesquisa

Avaliação da hipercoagulabilidade e do risco cardiovascular nas

complicações trombóticas da síndrome antifosfolípide que tem como

Pesquisador Responsável Isadora Silva Fernandes Custodio em

27/02/2019.

Atenciosamente,

Plataforma Brasil

http://plataformabrasil.

saude.gov.br

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