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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ
COORDINACIÓN ACADÉMICA REGIÓN ALTIPLANO
OESTE
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE
INGENIERO AGROINDUSTRIAL
Efecto antimicrobiano de chilcuague (Heliopsis longipes) sobre
Staphylococcus aureus, Escheriquia coli, Staphylococcus faecalis y
Klebsiella pneumonae
PRESENTA:
GLENN ESAÚ LEGASPI RAMOS
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. JUAN ANTONIO RENDÓN HUERTA
ASESORES:
Dr. GREGORIO ÁLVAREZ FUENTES
Dr. JUAN ÁNGEL MORALES RUEDA
NOVIEMBRE 2018
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ
COORDINACIÓN ACADÉMICA REGIÓN ALTIPLANO
OESTE
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE
INGENIERO AGROINDUSTRIAL
Efecto antimicrobiano de chilcuague (Heliopsis longipes) sobre
Staphylococcus aureus, Escheriquia coli, Staphylococcus faecalis y
Klebsiella pneumonae
PRESENTA:
GLENN ESAÚ LEGASPI RAMOS
SINODALES:
PRESIDENTE: DR. JUAN ANTONIO RENDÓN HUERTA ______________________
SECRETARIO: DR. GREGORIO ÁLVAREZ FUENTES ______________________
VOCAL: DR. JUAN ÁNGEL MORALES RUEDA ______________________
Agradecimientos
A mi padre Oscar Ociel Legaspi Balderas por todo el apoyo, paciencia y
confianza que tuvo hacia mí para lograr terminar mi carrera, así mismo, a mi
madre y hermanos que me dieron su apoyo cuando lo necesite. Al Dr. Juan
Antonio Rendón Huerta por todas las enseñanzas profesionales y personales,
así como la oportunidad y confianza que me dio para realizar mí trabajo de
investigación, al Dr. Juan Ángel Morales Rueda por sus consejos y su confianza.
A mis compañeros de generación de Ing. Agroindustrial por sus consejos y
todos los momentos que compartimos juntos. A mis amigos que siempre
estuvieron presentes, y a todos los profesores que formaron parte de mi
formación profesional.
Dedicatoria
Esta tesis es dedicada a mis padres Oscar Ociel Legaspi Balderas e Hilda Ramos
Sánchez por todo el apoyo y sacrificio que han realizado para poder terminar
mi carrera profesional, así como a mis hermanos Oscar Manuel Legaspi Ramos
y Karen Nohemí Legaspi Ramos que cuando necesite de su apoyo me lo
brindaron.
ÍNDICE
- 1.0 INTRODUCCIÓN 7
- 2.0 ANTECEDENTES
- 2.1 IMPORTANCIA DE LA PRODUCCIÓN LECHERA
- 2.2 SISTEMAS PRODUCTIVOS DE GANADO LECHERO
- 2.2.1 SISTEMA INTENSIVO
- 2.2.2 SISTEMA EXTENSIVO
-2.2.3 DOBLE PROPÓSITO
-2.2.3 FAMILIAR
- 2.3 DEMANDA DE LECHE A NIVEL NACIONAL
- 2.4 INDUSTRIA LACTEA
- 2.5 IMPORTANCIA ECONÓMICA DE LA INDUSTRIA LACTEA
- 2.6 ESTÁNDARES DE CALIDAD DE LECHE CRUDA DE
ACUERDO A LAS NORMAS OFICIALES MEXICANAS
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- 3.0 PRINCIPALES ENFERMEDADES EN GANADO LECHERO
DEBIDO A MICROORGANISMOS PATÓGENOS
- 3.1 MASTITIS
- 3.1.1 MASTITIS SUBCLINICA
- 3.1.2 MASTITIS CLINICA
- 3.2 SINTOMAS
- 3.3 CICLO DE ENFERMEDAD
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- 4.0 ETIOLOGÍA MICROBIANA
- 4.1 CÉLULAS SOMÁTICAS
- 4.2 Staphylococcus aureus
- 4.3 Streptococcus agalactiae
- 4.4 Escherichia coli
- 4.5 Klebsiella pneumoniae
- 4.6 EFECTOS NEGATIVOS EN LA PRODUCCIÓN EN VACAS
INFECTADAS CON MASTITIS
- 4.7 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA MASTITIS BOVINA
- 4.7.1 OBSERVACIÓN Y PALPACIÓN DE LA UBRE
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- 4.7.2 PRUEBAS FÍSICAS
- 4.7.2.1 PRUEBA DEL PAÑO NEGRO
- 4.7.2.2 PRUEBA DE LA TASA PROBADORA
- 4.7.3 PRUEBAS QUÍMICAS
- 4.7.3.1 PRUEBA DE CALIFORNIA PARA MASTITIS (CMT)
- 4.8 CONTROL DE LA MASTITIS
- 4.9 PLANTAS MEDICINALES CON POTENCIAL
ANTIMICROBIANO PARA EL CONTROL DE LA MASTITIS
BOVINA
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- 5.0 DESCRIPCIÓN DE BOTÁNICA DEL CHILCUAGUE (Heliopsis
longipes)
35
- 6.0 JUSTIFICACIÓN 37
- 7.0 OBJETIVO 38
- 8.0 MATERIALES Y MÉTODOS
- 9.0 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 40
- 10.0 RESULTADOS 41
- 11.0 DISCUSIÓN
- 12.0 CONCLUSIONES
- 13.0 REFERENCIAS
45
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7
1.0 INTRODUCCION
La ocurrencia de enfermedades en los bovinos dentro de la industria alimentaria
representa uno de los problemas que impactan negativamente a todos los sistemas
de producción, especialmente a los de nivel intensivo y semi-intensivo. La
enfermedad más común en los hatos lecheros es la mastitis que generalmente se
presenta en la época de lluvias en distintas regiones y es de mayor importancia
económica debido a las pérdidas por disminución en la producción y calidad de la
leche, aunado a esto, los tratamientos son costosos (Keefe, 1997). La mastitis
bovina es una inflamación de la glándula mamaria que se produce en respuesta a
una lesión o infección en la glándula mamaria, Las infecciones se deben a los
siguientes microorganismos que invaden la glándula mamaria en especial bacterias
como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, S.
dysgalactiae, S. uberis, Arcanobacterium pyogenes, Klebsiella pneumonae,
mycoplasmas y levaduras (Early, 2000; Marco-Leal, 2015). Las pérdidas de leche
por mastitis en los hatos lecheros presentan una disminución en la calidad, así como
un descenso en la producción que va del 4% hasta el 30% (Bedolla y Ponce de
León, 2008).
Existen diversos tratamientos para la prevención y control de mastitis que
generalmente son a base de antibióticos y sulfas. La herbolaria tradicional en
México tiene una gama de más de 4,500 especies vegetales consideradas como
medicinales, que son utilizados para tratar algunos padecimientos de diversa índole
(Barragán, 2006). Los metabolitos secundarios de estas plantas es lo que permite
utilizarlas como alternativa a los medicamentos debido al efecto sobre algunos
8
microorganismos, entre las especies más utilizadas encontramos, árnica
(Heterotheca inuloides cass.), cuachalalate (Amphipterygium adstringens), tila (Tilia
mexicana), gordolobo (Gnaphalium sp.), salvia (Salvia officinalis), cola de caballo
(Equisetum robustum) y boldo (Peumus boldus) (Huerta, 1997; García de Alba et
al., 2012). En un trabajo realizado por Márquez et al. (2003) hace mención de una
recopilación de 2 fuentes naturales (plantas y microorganismos) de los cuales se
aislaron metabolitos secundarios, siendo los compuestos bioactivos los que han
demostrado tener un efecto inhibitorio en algunos microorganismos. Por otro lado,
la planta conocida por su nombre común como chilcuague (Heliopsis longipes) es
considerada en la herbolaria tradicional como una planta con efectos medicinales,
es una hierba perenne endémica de la región conformada por porciones de la Sierra
de Álvarez y la Sierra Gorda, donde coinciden parte de los Estados de San Luis
Potosí, Guanajuato y Querétaro (Cilia-López et al., 2008). La planta del chilcuague
presenta una actividad importante como insecticida (Fisher, 1957). Esta planta tiene
un compuesto activo llamado afinina el cual se ha probado su efecto analgésico
sobre el sistema nervioso, así como el efecto antifúngico y antibacteriano (Ramírez
et al., 2000, Cilia-López et al., 2010). El objetivo de este ensayo fue estudiar el efecto
inhibitorio del extracto acuoso y etanólico de chilcuague sobre cuatro bacterias
(Staphylococcus aureus, Staphylococcus faecalis, Klebsiella pneumonae y
Escheriquia coli) que están asociadas a la enfermedad de mastitis en mamíferos
rumiantes de interés pecuario como bovinos, caprinos y ovinos.
9
2.0 ANTECEDENTES
2.1 Importancia de la producción lechera
La introducción de la ganadería en México y en específico la del ganado lechero,
comenzó en el siglo XVI con la llegada de los españoles durante el periodo de la
conquista, cuando se construyeron las primeras haciendas destinadas para la
producción de carne y leche pare el consumo interno (SAGARPA, 1990).
Desde esa época y hasta principios de los años noventa se han venido
introduciendo distintas razas de bovinos, caprinos y ovinos productores de leche.
En la década de los 90, México dio un incremento en producción de leche con una
tasa media anual del 1.3%, el cual lo posicionó en el lugar dieciséis en la producción
mundial de lácteo con un 3% del total. Sin embargo, en la producción interna del
país contribuye con el 80% del consumo nacional, por lo que México aún no
satisface la demanda nacional, lo cual lo posiciona como el primer lugar mundial en
importaciones de leche en polvo con un 9% de las importaciones globales (Loera y
Banda, 2017).
En el año 2017, la leche de vaca fue considerada como el tercer producto pecuario
en importancia económica, con el 17.22% del valor nacional, sólo por detrás de la
carne de bovino (30%) y la carne de ave (23%); esta actividad genera más de 200
mil empleos directos, permanentes y remunerados (INFORURAL, 2018). De
acuerdo con la información recopilada por SIAP-SAGARPA (2018a) durante el
periodo de 2008-2017 se han registrado incrementos constantes en la producción
de leche de bovino del 11.5% mientras que la leche de cabra tuvo un decremento
10
en la producción de 2008 al 2013, posteriormente en ese año se volvió a
incrementar, tal como se muestra en la figura 1.
Figura 1. Producción nacional de leche de bovino y caprino entre 2008 y 2017(SIAP
2018a).
No obstante, la producción de leche en México aún se encuentra por debajo de la
demanda nacional, por lo que a corto plazo no se visualiza la autosuficiencia de
leche en el país (Mellado-Bosque, 2010).
Los sistemas de producción que son utilizados para las explotaciones lecheras
varían según su tecnificación. Por un lado, se tienen explotaciones intensivas con
instalaciones, manejo y producciones similares a las encontradas en países
desarrollados. Y, por otro lado, se encuentran las explotaciones pequeñas y rusticas
con bajos niveles de producción de leche debido a la carencia de infraestructura
(Mellado-Bosque, 2010).
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2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017
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o
Años
Leche Bovino
Leche Caprino
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2.2 Sistemas de producción de leche en México
Los sistemas de producción de leche bovina se definen como un conjunto de
manejos y prácticas agropecuarias interrelacionadas entre sí, tales como el manejo
de los animales en pastoreo, los programas de sanidad de las vacas, además de
otros factores y variables como lo es el tipo de suelo, la producción de alimentos
para la formulación de las dietas, la tecnificación, mano de obra, la pureza de la raza
que conforma el hato, maquinaria, inclusión de concentrados en la dieta que,
ordenados de una manera organizada en un proceso productivo pueden determinar
la producción y eficacia del establo lechero (Smith., 1999). Los sistemas productivos
se dividen en intensivo, semi-intensivo, doble propósito y familiar. Los que más
aportan a la producción nacional son el intensivo con el 50.6% y el semi-intensivo
con el 21.3%, mientras que el doble propósito y el familiar aportan el 18.3% y 9.8%
respectivamente (SIAP, 2011; Loera y Banda, 2017).
2.2.1 Sistema intensivo
Los sistemas intensivos actuales se crearon con base en una copia del modelo
Holstein Americano, que se enfoca principalmente en aumentar la productividad de
todos los recursos que han invertido, es por esto y por los altos costos unitarios que
requieren grandes volúmenes de producción y tener altos precios para generar
utilidades. Principalmente se utiliza ganado muy productivo como la raza Holstein
que tiene una producción promedio 7-9 mil litros/vaca/año, las vacas se mantienen
con instalaciones especializadas y procesos mecanizados sobre todo en la ordeña
(Ortíz-Salazar et al, 2005). La alimentación es basada en forraje de alta calidad
como son el ensilaje de maíz y sorgo, heno de alfalfa, avena y cebada, así como
12
grandes cantidades de concentrados. En la mayor parte de estos sistemas se utiliza
la inseminación artificial y se tienen programas de sanidad y vacunación. La leche
que se produce se destina sobre todo a plantas pasteurizadoras o transformadoras,
la mitad de la leche producida en el país proviene de estos sistemas, además de
toda leche que se pasteuriza, este sistema contribuye con el 80% (Loera y Banda,
2017). Cabe señalar que los estados donde se concentran estos sistemas son:
Durango, Coahuila, Guanajuato, Jalisco, Aguascalientes, Chihuahua, México, San
Luis Potosí, Hidalgo, Querétaro y Baja California (Mellado-Bosque, 2010).
2.2.2 Sistema extensivo
Los sistemas extensivos se basan principalmente en la utilización de especies
ganaderas capaces de aprovechar los recursos naturales para su alimentación por
medio de pastoreo en agostaderos extensos (Martin-Bellido, 2001).
De acuerdo con Boyazoglu (1998) estos sistemas comparten tradicionalmente
varias características comunes como lo son: número limitado de animales por
unidad de producción, deficientes avances tecnológicos, baja productividad por
animal, alimentación basada principalmente por pastoreo natural, entre otras.
Este sistema tiene como característica que los animales los tiene en condiciones de
semiestabulación que se desarrollan en pequeñas extensiones de terreno, la ordeña
puede ser manual o mecanizada, así como mantienen un nivel medio de tecnología
y en ocasiones cuentan con algunos sistemas de enfriamiento (INFORURAL, 2012).
13
2.2.3 Doble propósito
Son aquellos dedicados a la producción simultánea de leche y carne. Son
caracterizados por la predominación del tipo de ganado que suele ser una cruza de
Suizo con Cebú o Criollo; es alimentado en forma extensiva con base en plantas
nativas o pastos cultivados, suministrándole ocasionalmente suplementos
alimenticios y la mayoría de los productores realizan la ordeña manual, así como
también carecen de sistemas de refrigeración, recursos sanitarios y tecnológicos
(Pech-Martínez et al., 2007).
2.2.4 Familiar
Este tipo de sistema se caracteriza por ser explotaciones pequeñas, en el fluctúan
animales entre 3 y 40 vacas que se encuentran dentro de terrenos familiares y su
manejo es realizado por la familia. La alimentación de las vacas se basa
principalmente en esquilmos de la agricultura (rastrojo de maíz, avena, sorgo y
trigo), residuos de hortalizas y, en las zonas áridas el nopal. Los animales de este
sistema son normalmente vacas Holstein de bajo potencial genético, las cuales
presentan producciones de 2500 litros de leche por lactancia, además de no contar
con tecnificación. En general la leche que se produce bajo este sistema se vende
como leche “bronca” o se destina para la producción de queso fresco. Los
principales estados donde se desarrollan estos sistemas de producción son Jalisco,
Michoacán, Distrito Federal, Hidalgo, Durango, Zacatecas, Aguascalientes,
Chihuahua, Coahuila y Nuevo León (Mellado-Bosque, 2010).
14
2.3 Demanda de leche a nivel nacional
En México, la producción lechera se desarrolla en todo su territorio, pero durante el
periodo de 2008 a 2017 se concentró en cuatro estados, los que contribuyeron
juntamente con el 48 hasta 50% de la producción nacional. En este período se
destacan Jalisco, Coahuila, Durango y Chihuahua, en orden de mayor a menor
(SIAP, 2018b). Si bien existen desde los ranchos más grandes y tecnificados y
modernos (la laguna, y algunas granjas de gran tecnificación que se encuentran en
los estados de Baja California, Querétaro e Hidalgo, algunos con más de 2 mil 500
vacas en producción) hasta ranchos con menor tecnificación como los que se
encuentran en el estado de Jalisco cuyas ganancias se basan en el número de
animales que tienen y no en términos de producción. Existen muchas razas de
bovino con destino a producción de leche en el mundo. En México las de mayor
arraigo son: Holstein Freisian, Jersey y algunas otras razas como lo son: Pardo
Suiza Americana, Airshire, Guernsey, entre otras.
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Figura 2. Comparación de la producción de leche contrastando los estados más
productivos (Jalisco, Coahuila, Durango y Chihuahua) con la producción Nacional
(SIAP, 2018b).
Sin embargo, las importaciones de otros países se han incrementado en un 43.6%.
Por otro lado, las exportaciones tuvieron una tendencia de disminuir entre 2013 y
2014, en el 2015 se volvieron a incrementar (cuadro 1), en cuanto al consumo
aparente y per cápita sus valores tienen una tendencia a subir siendo los datos más
altos, los registrados en el año 2015 (SIAP, 2016).
No obstante, al primer trimestre del año 2018 la producción de leche bovina alcanzó
2 mil 807 millones de litro de leche lo cual indica un crecimiento de 1.8% en
comparación con el año 2017, de los estados que presentaron un incremento en su
producción se encuentran Puebla (6.7%), Jalisco (6.6%), Chihuahua (3.9%) y
Chiapas (3.9%), en contraste, con una disminución con su producción se
encuentran los estados de México (3.5%), Coahuila (0.8%) y Durango (0.4%). Para
0
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Años
Suma Estados Productores
Total Nacional
48.7% 48.0% 48.1% 48.4% 48.8% 49.2% 49.3% 50.1% 50.2% 50.5%
16
el cierre del año se tiene una expectativa de producción de leche de 12 mil 26
millones de litros, lo que significaría un incremento de 1.9% con respecto al año
2017. Desde el año 2010 se ha visto un incremento de producción de leche y para
el año 2018 se estima siga la tendencia de incremento (SIAP, 2018c).
Cuadro 1. Consumo aparente y per cápita de leche en México entre 2011 y 2015
Componente 2011 2012 2013 2014 2015 Promedio
2011-2015
Producción 10,724,288 10,880,870 10,955,632 11,129,622 11,394,663 11,019,015
Importaciones 2,067,224 2,196,573 2,400,000 2,426,000 2,970,000 2,411,959
Exportaciones 128,204 138,761 119,752 90,000 120,000 119,343
Consumo
aparente 12,663,309 12,938,682 13,245,880 13,465,622 14,244,663 13,311,631
Consumo per
cápita **/ 109.5 110.5 106.9 112.6 114.0 110.7
**/ La estimación del año de referencia, se calcula con base en la población a mitad de año.
2.4 Industria láctea
Los productos lácteos fueron uno de los consumos clave en el desarrollo de la
transición nutricional que pautó el cambio alimentario en occidente durante los siglos
XIX y XX. Una combinación de factores biológicos, tecnológicos, económicos y
culturales impidió que la leche fuera un componente importante de las dietas antes
de finales del siglo XIX, pero a partir de entonces tendió a convertirse en un bien de
consumo masivo (Collantes, 2013). El aumento en el consumo de productos lácteos
como son los quesos y los yogurts, así como las leches industrializadas:
pasteurizada, ultrapasteurizada y en polvo, ocupan los primeros lugares de
comercialización manifestando una tendencia hacia el abastecimiento de las zonas
17
urbanas, ya que estas poseen vías de comunicación accesibles y concentran grupos
con niveles de ingreso más altos (SE, 2012)
El complejo lácteo, es uno de los subsistemas agroalimentarios de mayor
complejidad productiva y tecnológica, a lo largo de todas las etapas que lo
conforman. En el procesamiento industrial, tanto en la producción de los diversos
tipos de leche fluida y en polvo, como en la de productos frescos y quesos son
importantes las tecnologías de proceso, de productos, de envases,
almacenamientos, logísticas, de distribución y de comercialización (Bisang et al.,
2000).
2.5 Importancia económica de la industria láctea
La productividad de la ganadería lechera como una de las principales actividades
primarias para la economía mexicana y su estrecha relación con la industrialización
y el comercio hacen de éste un tema de relevancia para la economía. Así mismo, la
industria láctea toma una importancia relevante en la producción de alimentos a
nivel mundial siendo el queso el producto más representativo. Durante el año 2007
se llegó a una producción de 14.5 millones de toneladas, sin embargo, ese mismo
año hizo una distinción de los principales productores. Los que destacan son la
Unión Europea con 6.9 millones de toneladas, seguido de Estados Unidos con una
producción de 4.4 millones de toneladas, en contraste México aporta 0.15 millones
de toneladas (Cervantes et al., 2010).
En el año 2016 se cerró con una población de 2.48 millones de cabezas de ganado
lechero (FAOSTAT, 2017). En el 2016 se produjeron 11,608 millones de litros de
18
leche, lo cual supone un récord en la historia lechera de México. Como se mencionó
anteriormente, esta producción principalmente se divide en seis regiones del país
que concentran el 63.3% del total producido: Jalisco (19.2%), Coahuila (12.2%),
Durango (9.8%), Chihuahua (9.1%), Guanajuato (7.1%) y 6.1% en el estado de
Veracruz (Cesín et al, 2007). De acuerdo con cifras obtenidas por el SIAP hasta el
año del 2017, se tuvo un registro de 11.8 millones de litros de leche (SIAP, 2018a).
Sin embargo, existe una problemática debido a la pérdida económica ocasionada
por enfermedades principalmente la mastitis que es considerada la enfermedad
infecciosa más costosa de las vacas lecheras ya que ocasiona una baja de
producción de 4 a 30% de leche, así como la calidad de la leche disminuye, además
de tener un alto costo en el cuidado del hato lechero y su prevención (Bedolla y
Ponce de León, 2008). Este impacto económico varía dependiendo del país, la
estabilidad económica de cada empresa, médico veterinario, los tratamientos que
se les aplique, y la leche que es desechada por la contaminación por antibióticos,
entre otros factores (Kleinschroth, 1991).
2.6 Estándares de calidad de leche cruda de acuerdo a las Normas Oficiales
Mexicanas
Los sistemas de producción de leche y de derivados lácteos deben cumplir con
especificaciones de las Normas Oficiales Mexicanas en cuanto a calidad de leche,
especificaciones sanitarias y conteo de células somáticas (cuadro 2) esto con la
finalidad de garantizar el contenido de nutrientes, la baja o ausencia de
microorganismos patógenos, así como la baja conteo de células somáticas que
indican que la leche no proviene de animales enfermos ().
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Cuadro 2. Límites máximos permitidos del contenido de microorganismos
patógenos y células somáticas.
Microorganismo Límite Máximo
permitido
Producto
*Staphylococcus
aureus
<10 UFC/g por
siembra directa
Leche, fórmula láctea y producto
lácteo combinado pasteurizado
*Escherichia coli < 3 NMP/g o mL Leche utilizada como materia prima
para la elaboración de quesos
**Células somáticas,
CCS/mL
Máx. 400,000 Leche cruda
* NOM-243-SSA1-2010
** NMX-F-706-COFOCALEC-2012
3.0 Principales enfermedades en ganado lechero debido a microorganismos
patógenos
3.1 Mastitis
Uno de los mayores problemas económicos y de sanidad a nivel industrial es la
presencia de enfermedades como la mastitis. La mastitis bovina es una inflamación
de la glándula mamaria que se produce en respuesta a una lesión o infección en el
tejido. Las lesiones suelen ser físicas, pero generalmente la infección se debe al
accionar de microorganismos que han invadido la glándula mamaria, en especial
bacterias Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae (Early, 2000).
Mientras que Marco-Leal (2015) define la mastitis como la inflamación de la glándula
mamaria que puede deberse a diversas etiologías, entre las que se encuentran
bacterias como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus
dysgalactiae, S. uberis, Arcanobacterium pyogenes, Klebsiella pneumonae,
20
mycoplasmas y levaduras. Esta enfermedad se caracteriza por la entrada de células
somáticas, principalmente neutrófilos polimorfonucleares (PMN) a la glándula
mamaria y por un aumento en el contenido de proteasa en la leche producida (Kerr
y Wellnitz, 2003).
3.1.1 Mastitis subclínica
La mastitis subclínica es difícil de corregir ya que la vaca parece saludable, así como
la ubre no muestra signos de inflamación (Figura 3), además la leche parece normal
sin tener cambios organolépticos (Valera et al., 2005). En el mismo sentido, Gallegos
y Moncada (2011) también mencionan que no se presentan cambios en la ubre y
leche, sin embargo, se presenta una reducción en el rendimiento de la leche siendo
afectada por componentes inflamatorios y bacterias. Pastor López et al. (2010)
señalan que en la región de la comarca lagunera la presencia de mastitis subclínica
es de 39.06 %, sin embargo, no hacen referencia a la época del año en que
realizaron el estudio. En otro estudio realizado por Wilson et al. (1997) menciona
una prevalencia de mastitis subclínica del 48.5% en Nueva York y Pennsilvania. Las
visitas a los hatos lecheros se realizaron en el periodo de enero y junio.
21
Figura 3. Anomalías en la ubre causada por la mastitis subclínica. (Imagen
tomada de https://saludpublicavet.wikispaces.com/La+mastitis+en+bovinos).
3.1.2 Mastitis clínica
Tollersrud et al. (2000) define la mastitis clínica como una anomalía en la ubre
mamaria o en la leche que puede ser fácilmente observable. Además de tener
características por presentarse de manera súbita. Se presenta enrojecimiento de la
ubre, inflamación, dolor, disminución de la producción y alteraciones en los cuartos
afectados. Por otro lado, Chebel et al. (2004) dice que la mastitis clínica es la
enfermedad más importante debido a que ocasiona grandes pérdidas económicas
debido a varios factores entre los que destacan la pérdida de producción y baja
calidad de leche, en algunos casos, el sacrificio de animales afectados.
3.2 Síntomas
La infección puede ser reconocida mediante el enrojecimiento de la ubre, dolor e
hinchazón (figura 4), además de anormalidades físicas en la leche, en algunos
22
casos se presentan síntomas con mayor complicación como dolores rectales,
anorexia, e incluso la muerte Heringstad et al., (2000). La mastitis clínica se puede
presentar de manera aguda y crónica. La forma aguda se caracteriza por presentar
anormalidades en la leche, dolores en la ubre y enrojecimiento (Djabri et al., 2002).
Mientras que la forma crónica se presentan cambios en el tejido al realizar la
palpación del tejido, así como una infección de larga duración con cambios
anormales en la leche (Schrick et al., 2001).
Figura 4. Identificación de mastitis por hinchazón de los cuartos (Imagen tomada
de https://www.icbf.com/wp/?page_id=2274)
3.3 Ciclo de enfermedad
Por lo regular esta enfermedad se contagia entre los ordeños, así como cuando el
animal se encuentra en estado de transición (3 semanas antes de parto a 4
semanas post-parto) siendo más difícil el control de esta misma (Corbellini., 2002).
De acuerdo con Azócar (2001) en estudios realizados en Santiago de Chile, Chile,
la incidencia de mastitis clínica es de 48.70 casos/100 animales/año, mostrando una
variación mensual de 0.75% a 10.61%, tendiendo a mostrar valores más elevados
23
en junio y julio. Los niveles más altos de incidencia se mostraron en invierno
(22.22%) primavera (14,41%) y finalmente en verano y otoño con un 6% de
incidencia. Uno de los microorganismos más infecciosos causantes de esta
enfermedad es Staphylococcus aureus, su relevancia radica en que no es un
patógeno obligado de la ubre por lo que se puede encontrar en lesiones de la ubre,
en las camas, en las manos de los ordeñadores, así como en los equipos de ordeño.
Debido a esto las prácticas de manejo en los hatos lecheros puede hacer que este
agente etiológico alcance el conducto del pezón y por lo tanto desencadenar una
reacción inflamatoria (Calderón y Rodríguez, 2008).
4.0 Etiología microbiana
Se han encontrado hasta 140 especies, subespecies y serovariedades microbianas
dentro de la glándula mamaria que son el factor causante de la infección. Estos
microorganismos se han dividido en patógenos contagiosos y ambientales. Dentro
de los patógenos contagiosos de mayor importancia se destaca el Staphylococcus
aureus, Streptococcus agalactiae, Corynobacterium spp, y Mycoplasma spp.
Mientras que los patógenos ambientales (destacan por su facilidad de transmisión
durante el proceso de ordeño) son bacilos entéricos gram-negativos (Escherichia
coli, Klebsiella spp), Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis y
Enterococcus spp (Bedolla, 2017). Mientras que Corbellini (2002) menciona que los
organismos causantes son diferentes tipos de bacterias, micoplasmas, hongos,
levaduras, y hasta algunos virus, sin embargo, los géneros Staphylococcus,
Streptococcus, Corynebacterium, y algunos gérmenes Gram negativo, son
24
responsables del 90% de casos clínicos y subclínicos. Osteras et al., (2006) afirman
que los casos clínicos son producidos por bacterias que solo se encuentran por un
corto periodo de tiempo desencadenando claros signos (Eschericha coli). Por el
contrario, en la mastitis subclínica es causada por bacterias patógenas que pueden
estar presentes por largos periodos causando signos leves, entre ellas se encuentra
la bacteria Staphylococcus aureus. Considerando la etiología, la mastitis contagiosa
es producida por bacterias que su principal hábitat se encuentra en el canal de
pezón, así como en la pared de la ubre lo que ocasiona el contagio por medio del
ordeño.
4.1 Células somáticas
El hablar de calidad engloba diferentes parámetros dentro del sector lechero, uno
de los más concurridos y de mayor importancia es el conteo de células somáticas
(CCS) el cual se utiliza para saber la condición y viabilidad de la leche y por ende el
estado de salud del bovino. Las células somáticas están constituidas por una
asociación de leucocitos y células epiteliales. Los leucocitos se introducen en la
leche en respuesta a la inflamación que puede aparecer debido a una enfermedad
o, a veces, a una lesión. Las células epiteliales se desprenden del revestimiento del
tejido de la ubre (Blowey y Edmondson, 1995). De igual manera, Bradley y Green
(2005) definen el CCS como el número de células presentes en un mililitro de leche,
siendo este un buen indicador para saber la concentración del número de leucocitos
presentes y así mismo verificar la salud de la glándula mamaria. Además, Wolter y
Kloppert (2004) hacen mención que para realizar la evaluación de un hato lechero
utilizando el conteo de células somáticas con relación a la leche del tanque no es
25
representativa, ya que cuando un hato está libre de S. aureus o de S. agalactiae y
tienen un bajo nivel de células (<150,000 células/ml).
4.2 Staphylococcus aureus
Esta especie está formada por cocos Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5
μm, agrupados como células únicas, pares, tétradas, cadenas cortas o formando un
racimo de uvas (Cervantes-García et al., 2014). S. aureus ha sido aislado de la
mastitis bovina (Watts, 1988) y puede ser transferida directamente por leche
infectada, productos lácteos o indirectamente a través de la contaminación
ambiental en el manejo y procesamiento (Jorgensen et al., 2005). Durante su
crecimiento en la leche, las cepas de S. aureus son capaces de producir
enterotoxinas que si se ingieren pueden causar, vomito, nausea y diarrea (Jablonsky
y Bohach, 1997). Dicha especie tiene una gran capacidad de adaptación por lo cual
afecta a todas las especies conocidas de mamíferos, por ese motivo tiene una
facilidad de transmisión (Zandejas-Manzo, 2014). Debido a la peligrosidad de los
patógenos mamarios, se informó a nivel internacional de un aumento de resistencia
bacteriana a los antimicrobianos que son utilizados habitualmente para la mastitis.
En un estudio realizado en rebaños lecheros en Finlandia donde aislaron las cepas
de S. aureus se visualizó un incremento de resistencia de 36.9% a un 63.6% entre
los años 1985 y 1995 (Myllys et al., 1998). Todas las cepas de S. aureus tienen la
capacidad de coagular el plasma sanguíneo, sin embrago, solo el 30% se relaciona
con la producción de enterotoxinas implicadas en la toxiinfección alimentaria
(Forsythe y Hayes., 2012).
26
4.3 Streptococcus agalactiae
La bacteria Streptococcus agalactiae pertenece al grupo B de Streptococcus, es un
microorganismo gram-positivo, frecuentemente crece en medios líquidos y en leche.
Es una especie considerada como una de las principales bacterias causantes de las
infecciones intramamarias bovinas que desarrollan enfermedades como la mastitis
subclínica (figura 5) (Keefe, 1997). Es un patógeno altamente contagioso de la
glándula mamaria, siendo este el que más periodos de larga duración sobrevive
(Martínez et al., 2000). En la región de América del norte es considerada una de las
mayores causantes de infecciones intramamarias bovina (Poyart et al., 2001).
Figura 5. Colonias de Streptococcus agalactiae en medio Granada (Tomado de
https://es.wikipedia.org/wiki/Agar_granada#/media/File:Streptococcus_agalactiae_
on_Granada_medium.jpg).
4.4 Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) forma parte de la flora normal del intestino del hombre.
Entre sus principales características se encuentra que es un bacilo gram-negativo,
anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, tribu Escherichia. Sin
embargo, existen cepas que son patógenas y pueden causar daño como diarrea
27
(Rodríguez-Ángeles., 2002). La cepa de E.coli O157:H7 es uno de los
microorganismos más importantes debido a los daños que puede ocasionar a la
salud que van desde una ligera diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico
hemolítico. Los casos de intoxicación se relacionan con el consumo de carne,
productos lácteos, así como la leche, subprocesados con calor (Roberts et al.,
2000). En un trabajo realizado por Soujala et al. (2018) menciona que la mastitis
bovina causada por Escherichia Coli, puede ir desde una infección subclínica de la
glándula mamaria, hasta una enfermedad sistémica grave. Los únicos tratamientos
con evidencia científica son las fluoroquinolonas y las cefalosporinas, sin embargo,
debido a que la evidencia de la eficacia del tratamiento antimicrobiano para la
mastitis por E. coli es muy limitada y no se puede recomendar.
Figura 6. Colonias de E. coli en agar MacConkey (izquierda) y en agar Eosina y
Azul de Metileno (derecha) https://www.microbiologyinpictures.com/bacteria-
photos/escherichia-coli-photos/e.-coli.html, http://www.labprobio.com/2014/08/el-
control-de-e-coli-una-prioridad.html
28
4.5 Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pseumoniae es un agente común de la mastitis clínica y subclínica en
establos lecheros, es un bacilo gram negativo, no móvil, de la familia
Enterobacteriaceae (figura 7). Usualmente desarrolla una cápsula que es un factor
importante en la virulencia de la bacteria (López y Echeverri., 2010). La importancia
de esta bacteria radica en ser la causante del al menos el 4% de la mastitis clínica,
cifra que va en aumento a medida que va disminuyendo el conteo de células
somáticas, siendo más frecuente en conteos bajos de 150,000 cel/mL de leche. Sin
embargo, tal como menciona Langoni et al. (2015) la mastitis ocasionada por K.
pneumoniae se vuelve más severa debido a la nula reacción de los tratamientos con
antibióticos, así como a la rápida evolución de distancias sustancias tóxicas que
pueden ocasionar la muerte del animal.
Figura 7. Colonias de Klebsiella pneumoniae en agar sangre de carnero (Sharma
et al., 2015).
29
4.6 Efectos negativos en la producción en vacas infectadas con mastitis
Diversos estudios evidencian que las vacas que contraen la enfermedad de mastitis
pueden presentar pérdidas en la producción de leche en el primer mes de la
lactancia, que van desde 0.5, 0.8 y 1.1 kg/d en el primer, segundo y tercer parto,
respectivamente (Detilleux, 2018). Mientras que en un estudio realizado por Pinzón
et al. (2009) hace mención de que aproximadamente el 93% de las pérdidas
económicas son causadas por la mastitis subclínica en la cuenca lechera del Alto
Chicamocha en Colombia.
4.7 Métodos de detección de la mastitis bovina
Debido a la sospecha de indicios de enfermedad en los hatos lecheros, se realizan
pruebas y técnicas a nivel de campo y nivel laboratorio para la detección de la
mastitis, entre estas pruebas se encuentran la observación y palpación de la ubre.
Dentro de las técnicas a nivel de laboratorio se encuentran: pruebas bacteriológicas,
conteo de células somáticas, determinación de enzimas entre otras. Según Pérez
et al., (2005) las pruebas físicas solo son útiles cuando la mastitis ya se encuentra
en una etapa avanzada y no detectan mastitis subclínica, o se utilizan aparatos para
el conteo de células somáticas. Dentro de las pruebas físicas se encuentran:la
prueba del paño negro y la taza probadora. Dentro de las pruebas químicas se
encuentran: Conductividad térmica de la leche, papel indicador de mastitis y la
prueba de Whitheside, el cual, dentro de esta última prueba Pérez et al (2005)
menciona que el procedimiento químico es muy variable por lo cual no es
recomendable sea prueba única. Por otro lado, Ashraf e Imran (2018) mencionan
que los métodos que aún son muy utilizados son: el recuento de células somáticas
30
y el cultivo microbiano, sin embargo en algunos países, estas técnicas han estado
siendo reemplazados parcialmente con reacción bioquímica como la prueba de
polimerasa y pruebas basadas en secuenciación, además de que la nanotecnología
y pruebas basadas en proteínas han estado ganando mucha atención y algunas de
estas pruebas podrían ser futuros candidatos para el diagnóstico de la mastitis
bovina.
4.7.1 Observación y palpación de la ubre
En la mastitis subclínica es difícil determinar si algún cuarto de la glándula se
encuentra infectada, esto debido a que durante esta etapa de la enfermedad los
principales signos de infección son visualmente indetectables. Sin embargo, la
infección puede provocar la inflamación de los cuartos además de incremento de
temperatura, enrojecimiento y dolor (Pérez et al., 2005).
4.7.2 Pruebas físicas
4.7.2.1 Prueba del paño negro
Esta prueba se realiza durante la preparación de la vaca para la ordeña, en la cual
consiste en la detección de grumos en la leche pasándola a través de una malla
oscura o bien en una cubeta especialmente diseñada para esto. Esta prueba es
recomendada utilizarla en todos los ordeños ya que además de detectar una leche
anormal, se pueden eliminar bacterias que son encontradas principalmente en los
primeros chorros (Pérez, 1986).
31
Figura 8. Prueba del paño negro
4.7.2.2 Prueba de la tasa probadora
Esta prueba consiste en examinar los primeros chorros de leche sobre un recipiente
(figura 9) en busca de anormalidades como: coágulos, hilos, materia fibrosa, color
anormal, entre otras; estas anormalidades son indicadores de un problema en la
leche. Cabe mencionar que en la mastitis crónica la leche no tiene anormalidades
visibles (Carrión, 2001).
Figura 9. Prueba de la taza probadora
32
4.7.3 Pruebas químicas
4.7.3.1 Prueba de california para mastitis (CMT)
La prueba de California se utiliza para la detección visual de mastitis bovina en
ganado lechero a nivel de campo (Morresey, 1999; Radostits, 2000; Cepero et al.,
2005; Erskine, 2001; Bedolla et al., 2007). Esta prueba se desarrolló en la
Universidad de California (EUA), el reactivo de California (Sodio dodecyl sulfato, 2
g, o también llamado alquilauril sulfonato de sodio), consiste en el agregado de un
“detergente” a la leche, el cual causa la liberación de los leucocitos presentes en la
ubre que en combinación con agentes proteicos de la leche forma una gelatina
(Smith 1990; Saran y Chaffer, 2000; Cepero et al., 2005).
Los resultados obtenidos se interpretan en 5 clases, desde el resultado negativo
donde hay ausencia de reacción entre la leche y el reactivo encontrándose en
estado acuoso, hasta la coagulación de las dos sustancias indicando la presencia
de la mastitis (Figura 10) (Pérez, 1986; Blowey y Edmonson, 1995; Bedolla, 2007).
Negativo Trazas Uno (+)
Dos (++) Tres (+++) Mastitis clínica
33
Figura 10. Interpretación de los resultados de la prueba California (Bedolla et al.,
2007).
Los valores determinados para la interpretación de resultados de mastitis con la
prueba de California se muestran en el cuadro 3.
Cuadro 3. Relación de escala CMT con nivel de células somáticas e interpretación
y registro de resultados se realiza bajo criterio
Escala de
CMT
Amplitud relativa del nivel
de células somáticas
(cs/ml)
Interpretación
Negativo:
0
< 200.000 El estado de la solución permanece
inalterado. La mezcla sigue en estado
líquido. El 25% de las células son
leucocitos polimorfonucleares.
Trazas 150.000 – 500.000 Se forma un precipitado en el piso de
la paleta que desaparece pronto. De 1
a 30% son leucocitos
polimorfonucleares.
1 (+) 400.000 – 1.500.000 Hay mayor precipitado, pero no se
forma gel. De un 30 a 40% son
leucocitos polimorfonucleares.
2 (++) 800.000 – 5.000.000 El precipitado se torna denso y se
concentra en el centro. De un 40 a 70%
son leucocitos poliformonucleares.
3 (+++) > 5.000.000 Se forma un gel muy denso que se
adhiere a la paleta. De un 70 a 80%
son leucocitos poliformonucleares.
Fuente: DVG, 2002; Saran y Chaffer, 2000.
34
4.8 Control de la mastitis
Actualmente existen varios medicamentos para el control de mastitis bovina en el
que se encuentran agentes químicos como el Trimetropim (TMP) y sulfadiazina
(SDZ) los cuales son muy eficientes contra los gérmenes causantes de la gran
mayoría de las mastitis en periodo de lactación (especialmente Staphylococcus spp
y Streptococcus spp). La combinación de estos tiene un efecto bactericida mucho
mayor que el efecto de alguno de estos compuestos por separado por lo que esta
combinación es efectiva contra patógenos comunes Gram positivos y Gram
negativos de la mastitis (Econovet, Registro SAGARPA Q-8006-050). Sin embargo,
se ha demostrado que ciertos microorganismos como Staphylococcus aureus
pueden desarrollar resistencia a los antibióticos derivados de la penicilina en
establos lecheros de traspatio (Ochoa-Zarzosa et al., 2008)
4.9 Plantas medicinales con potencial antimicrobiano para el control de la
mastitis bovina
En todas las regiones del mundo, por muchos años los humanos han desarrollado
un conocimiento sobre las plantas de su entorno y su uso medicinal. Desde la
llegada de los españoles y la incursión de los bovinos a América, los ganaderos se
encargaban del cuidado con el uso de estas plantas. La llegada de medicinas
modernas, así como la síntesis química de nuevos compuestos ha provocado la
disminución de las plantas medicinales. No obstante, existe evidencia del uso de
uso de plantas medicinales (aceites esenciales y extractos de algunas plantas
como: Origanum vulgare y Origanun aplii (orégano), y Cymbopogon citratus (DC.)
Stapf (chinchillo, hierba-cidro y limoncillo) implementadas como antibiótico para el
35
tratamiento de mastitis en bovinos (Acosta Moreno et al., 2017). En algunos estudios
se ha documentado la actividad antimicrobiana sobre microorganismos patógenos
causantes de la mastitis, tales como E. coli, S. Aureus, B. subtilis, Klebsiella
Pneumonae, con extractos de plantas como Acacia modesta, Thymus serphylum,
Syzygium comuni L., Laportea ovalifolia entre otras tienen un efecto inhibidor (Bashir
et al., 2012; Avello Lorca et al., 2012; Srinivasan et al., 2001).
5.0 Descripción de botánica del chilcuague (Heliopsis longipes)
Heliopsis longipes es una hierba perenne endémica de la región conformada por
porciones de la Sierra de Álvarez y la Sierra Gorda, donde coinciden parte de los
Estados de San Luis Potosí, Guanajuato y Querétaro. Los nombres comunes de
esta planta son chilcuague, pelitre, raíz de oro y raíz azteca (Ramírez, 1902;
Martínez, 1967).
En un estudio realizado por Cilia-López et al. (2014), describen a la planta de
chilcuague como una herbacea perenne de 19.6 a 38.9 cm de alto; con raíces
fibrosas; tallos herbáceos, decumbente a subdecumbente, de color rojizo-púrpura,
leñosa en la base, hojas opuestas, pecíolo ovado a oblongo en ocasiones
lanceolado, margen serrado a ligeramente dentado o casi entero cerca del ápice;
una a tres cabezuelas terminales solitarias, sobre pedúnculos largos y estriados;
receptáculo cónico; 5 a 11 flores de rayos amarillos, hermafroditas con hojas
lineares a oblongo-elípticas, ápice tridentado, flores del disco de 40-176,
hermafroditas, castaño-amarillo glabras; aquenios triangulares o cuadrangulares,
estriados, castaños a negruzcos, vilano ausente o raramente de dos a cuatro aristas
pequeñas y membranosas (figura 11).
36
Figura 11. Ejemplar de H. longipes (Cilia-López et al., 2013).
Su distribución comprende la región compuesta por porciones de la Sierra Álvarez
y la Sierra Gorda, donde coinciden parte de los territorios los estados de San Luis
Potosí, Guanajuato y Querétaro (Figura 12)
Figura 12. Distribución de H. longipes en la región de la Sierra de Álvarez (Cilia-
López et al., 2008).
37
La planta del chilcuague presenta una actividad importante como insecticida (Fisher,
1957). De acuerdo con Ramírez et al. (2000) esta planta tiene un compuesto
llamado afinina (Figura 13) el cual es el activo que presenta efecto de inhibición
contra hongos y bacterias. Una de las ventajas de obtener sustancias como la
afinina, producidas por la biosíntesis de plantas es que no tiene efectos adversos
en el ecosistema.
Figura 13. Estructura química de afinina, principal compuesto activo de la raíz de
chilcuague (Ramírez et al., 2000).
6. JUSTIFICACIÓN
La leche y sus derivados son de los alimentos con mayor demanda, además de ser
una de las industrias que mayor aportan a la economía en el sector pecuario y en
pequeña escala al autoconsumo, también representan el sustento económico de
muchas familias mexicanas, por lo que la calidad e inocuidad de la leche y sus
derivados son muy importantes, para cuidar la salud de los consumidores.. Por otro
38
lado el uso los antibióticos para el control de la mastitis, puede provocar problemas
de salud en la población y resistencia de algunos de los microorganismos
causantes de la enfermedad. Una alternativa a éste problema es la gran variedad
de plantas medicinales que han evidenciado tener efectos antifúngicos y
bactericidas que pudieran tener efecto en la inhibición de microorganismos
patógenos, una de ellas es la planta de chilcuague (Heliopsis longipes) la cual no
ha sido probado para la prevención y control de este tipo de enfermedades.
7.0 OBJETIVO
Evaluar la actividad antibacteriana in vitro de dos extractos, acuoso y etanólico de
Heliopsis longipes sobre cuatro bacterias causantes de la enfermedad de mastitis
en ganado lechero, tales como Escheriquia coli, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus faecalis y Klebsiella pneumonae.
7.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener un extracto acuoso y etanólico de la raíz de chilcuague (Heliopsis longipes)
para evaluar el efecto de inhibición en sensidiscos sobre cuatro principales bacterias
causantes de la mastitis.
Realizar pruebas de inhibición de crecimiento de bacterias que provocan la mastitis.
39
8.0 MATERIALES Y MÉTODOS
8.1 Preparación del material vegetal
El material vegetal utilizado fue raíz de la planta de chilcuague (Heliopsis longipes),
la cual se adquirió en el mercado local de San Luis de la Paz, Guanajuato. Con ella
se elaboró un extracto acuoso y uno etanólico. Para ello, se pesaron 200 g de raíz
de chilcuague (H. longipes) la cual fue sometida a triturado en una licuadora casera
(Oster) para disminuir su tamaño de partícula y proceder a una maceración durante
dos semanas en oscuridad en un litro de agua y etanol respectivamente.
Posteriormente, los extractos fueron filtrados usando papel filtro de tamaño de poro
de 2.5 µm (Whatman # 5). En seguida, los extractos se concentraron con un
rotavapor. Posteriormente, se tomó una muestra de cada extracto seco y se diluyó
en agua o etanol a una concentración de 0.05 g/mL, respectivamente.
Las cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 259238), Staphylococcus faecalis
(ATCC 29212) y Escheriquia coli (ATCC 25922), fueron obtenidos en el laboratorio
de microbiología de alimentos de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Mientras que la cepa Klebsiella
pneumonae (ATCC 31488) nos fue otorgada por el laboratorio estatal de salubridad
pública de San Luis Potosí. Dichos microrganismos se suspendieron por separado
en tubos con agua peptonada al 0.1% a una concentración de 6.0 x 108 UFC/mL
que corresponde al 0.5 basada en la escala de McFarland de turbidez (MacFaddin,
2005).
40
La prueba de inhibición se realizó en placas Petri con agares específicos para cada
microorganismo para lo cual se utilizó agar Baird Parker (BD Bioxon) inoculado con
1.0 mL (mediante la técnica por extensión en placa) de la suspensión por separado
de S. aureus, y S. faecalis. La inoculación de E. coli se realizó en agar EMB (BD
Bioxon) con 1.0 mL de la suspensión. Para el crecimiento de Klebsiella pneumonae
se prepararon cajas de Petri con agar McConkey (BD Bioxon).
Las placas se dividieron en cuatro cuadrantes y en cada cuadrante se colocó un
disco de papel filtro de 0.5 cm de diámetro previamente esterilizado e impregnado
con la solución correspondiente al tratamiento. Los tratamientos probados fueron;
agua destilada, etanol 96%, extracto acuoso y extracto etanólico de H. longipes y
fármaco comercial Antimastitis intramamario para bovinos, caprinos y ovinos
(Econovet, Registro SAGARPA Q-8006-050), el cual contiene sulfato de kanamicina
1 g/100 mL, sulfato de neomicina 1 g/100 mL y sulfato de gentamicina 1 g/100 mL.
El proceso de inoculación se realizó en una campana de flujo laminar (Thermo
scientific, grado II 1300 SERIES A2), posteriormente las placas se colocaron en una
incubadora (Yamato IN 804) a 35° C durante 24 horas. El parámetro medido fue el
diámetro (en mm) del halo de inhibición con vernier (marca TRUPER).
9.0 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados de diámetro de inhibición se analizaron por medio de un diseño
estadístico por bloques al azar, donde los bloques corresponde a las cuatro
bacterias (S. aureus, S. faecalis, E. coli y Klebsiella pneumonae) y los tratamientos
41
fueron los extractos, (agua destilada, etanol 96%, extracto acuoso y extracto
etanólico de H. longipes y fármaco comercial) y los bloques corresponden a cuatro
tipos de bacterias y la variable de respuesta fue el halo de inhibición en sensidiscos
con una n=12 por placa. Además, se realizó una prueba de medias de Tukey
(p<0.05) con el paquete estadístico R Studio (R Core Team, 2016).
10.0 RESULTADOS
Los resultados se presentan en la figura 14 y 15, donde la variable medida fue el
diámetro de halo de inhibición, se encontraron diferencias altamente significativas
debido a los tratamientos mostrados en la figura 14 (p<0.0001), donde se encontró
que el tratamiento de medicamento, tal como se muestra en la figura 16, fue el que
obtuvo el mayor diámetro de inhibición (19.65 mm) en todas las cepas de
microorganismos, sin embargo, en menor proporción el tratamiento etanólico de H.
longipes también mostró efecto inhibidor (6.96 mm), el extracto acuso no mostró
efectividad, y finalmente, como era de esperarse en el tratamiento con agua, todas
las bacterias crecieron sin ninguna restricción.
42
Figura 14. Resultados de la prueba inhibición in vitro sobre cuatro bacterias
patógenas con cinco sustancias (tratamientos). Valores medios y las barras de error
corresponde al error estándar de la media.
Por otro lado, en la figura 15 se muestran los resultados del halo de inhibición por
tipo de bacteria (bloque), el cual muestra diferencias significativas (p>0.0001),
donde Klebsiella es el microorganismo más sensible a los tratamientos, se registró
una inhibición de 9.37 mm, en contraste las dos especies de Staphylococcus fueron
las más resistentes y que registraron menor halo (6.36 y 4.53 mm). Para estudios
futuros, se podría incrementar la dosis del extracto etanólico para ver mayor
reacción.
-1
4
9
14
19
24
Agua Ext. Acuoso Etanol Ext. Etanolico Medicamento
Dia
met
ro d
e hal
o d
e in
hib
icio
, m
m
Tratamientos
e
a
b
c
d
43
Figura 15. Resultados de halo de inhibición por bacteria patógena (bloque). Valores
medios y las barras de error corresponde al error estándar de la media.
En el mismo sentido, en la figura 16 cuando se realizó el análisis por interacción
tratamiento-bacteria, se observó que K. pneumonae fue la especie que mayor halo
de inhibición presentó debido al tratamiento de medicamento y al extracto de H.
longipes, mientras que el menor efecto de inhibición lo presentaron S. aeurus y S.
faecalis.
0
2
4
6
8
10
12
S. faecalis S. auerus E. coli K. pneumonae
Dia
met
ro d
e hal
o d
e in
hib
icio
, m
m
Bacteria
a
b
c
d
44
Figura 16. Halos de inhibición (mm) en cada una de las bacterias, por cada uno de
los tratamientos.
Finalmente, en la figura 17 a modo de ejemplo se muestran dos ejemplos de los
halos de inhibición uniforme de S. faecalis y E. coli con el tratamiento del
medicamento.
Figura 17. Resultados de halo de inhibición con medicamento comercial sobre a)
S. faecalis sobre agar estafilococos 110 y b) E. coli en agar EMB.
-5
0
5
10
15
20
25
30
E. coli S. aureus S. faecalis klebsiella
halo
de in
hib
ició
n, m
m
Bacterias
Agua Alcohol Extracto Medicamento
a) b)
45
11.0 DISCUSIÓN
La finalidad de este trabajo fue estudiar la reacción de extractos de raíz de
chilcuague como una alternativa ambientalmente amigable, para el control de
microrganismos patógenos comúnmente relacionados con la mastitis subclínica en
bovinos estabulados, usados para la producción de leche y derivados lácteos entre
los que destacan vacas, borregos y cabras.
Existen diversos trabajos donde se han estudiado las cualidades del principio activo
de la raíz de chilcuague, algunos de ellos destacan el efecto antimicrobiano,
analgésico y tóxico. Martínez-Loredo et al. (2016) mencionan que el extracto
alcohólico de H. longipes en contacto con esperma de ratones, puede tener efecto
espermaticida del 100% a una concentración de 2,000 mg/mL en un tiempo de 30
min.
En un estudio realizado por Molina-Torres et al. (1999) se evaluó el efecto
antimicrobiano del extracto alcohólico de H. longipes, sobre el crecimiento de
Escherichia coli, Pseudomonas solanacearum, Bacilus subtilis y Sacaromyces
cerevisiae, donde se observó que el extracto inhibió el crecimiento de E. coli y S.
cerevisiae a concentraciones de 25 µg/mL, el mismo autor comenta que se tuvo que
incrementar la dosis a 75 µg/mL para inhibir el crecimiento de P. solanacearum y B.
subtilis. Sin embargo, a pesar de que encontraron efecto inhibidor, el tiempo de
experimentación fue más corto (8 horas) en comparación con el presente
experimento (48 horas) y, además, en sus resultados se observa una tendencia a
incrementarse la carga microbiana, que posiblemente en 24 horas las cargas
microbianas sean parecidas a las del tratamiento testigo.
46
De igual manera, Ramírez et al. (2000) realizaron un trabajo in vitro para el control
de Sclerotium cepivorum y S. rolfsii en agar papa dextrosa, para esto se analizó el
efecto del extracto purificado y del extracto crudo de raíces de H. longipes en
acetato de etilo como disolvente a concentraciones de 5 a 25 µg/mL. Según los
autores, los resultados mostraron que con una concentración de 25 μg/mL de afinina
purificada, o del extracto crudo, el desarrollo micelial de las dos especies de
Sclerotium se inhiben completamente. Al respecto, las diferencias marcadas con
respecto al presente estudio se pueden deber al disolvente que utilizaron para
extraer la afinina y otros compuestos, que, en presente caso no se utilizó acetato de
etilo.
González et al. (2011) analizaron el efecto in vitro de H. longipes sobre el
crecimiento del hongo Fusarium oxysporm F. sp lycopersici. Se realizó un extracto
etanólico a una proporción de 1:10, es decir, 1 gramo de extracto con 9 mL de etanol
al 98%, y lo dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 días, donde la dosis
letal media estimada fue de 164.2 μg/mL de afinina, y la dosis letal90 fue de 348.6
μg/mL para el control del hongo. Por otro lado, en el presente trabajo, la maceración
se realizó en un lapso de 15 días, lo cual pudiera ser un factor que considerar en la
extracción de la afinina.
En un ensayo realizado por Hernández Morales et al. (2012), se estudió la actividad
de la afinina contra un díptero (A. albimanus) el cual se le atribuye la capacidad de
transmisión del paludismo. Se evaluaron varias dosis del extracto 0, 2.5, 5, 7.5 y 10
ppm. Los autores mencionan que, a partir de una concentración de 5 ppm, el 100%
de las larvas se encontraron sin movilidad. La dosis letal media se encontró con la
47
concentración de 2.85 ppm. Los autores sugieren que el efecto insecticida de H.
longipes Gray Black se le atribuye a la insaturación de las posiciones 2E, 6Z y 8E
de la afinina. Además, mencionan que existe la posibilidad de que dicho efecto sea
debido a la acción sinérgica de la afinina y alcamidas encontradas en el extracto, y
no solo de la afinina como se tenía contemplado.
En un trabajo realizado por Cilia-López et al. (2010) se evaluó la actividad
analgésica de la afinina (1 mg/kg) y el extracto etanólico de la raíz de H. longipes
(10 mg/kg) y su efecto sobre el sistema nervioso de ratones albinos, los autores
concluyen que tanto la afinina purificada como el extracto alcohólico muestran una
acción analgésica similar a la del ketorolaco, y que, además, el efecto estimulante
sobre el sistema nervioso es comparable al de la cafeína.
Otros trabajos donde se estudió el efecto inhibidor de otros extractos vegetales
sobre el crecimiento de microrganismos usados en este trabajo se describen a
continuación.
Pereira et al. (2013), realizaron un experimento in vitro para evaluar la actividad
antimicrobiana de la corteza del fuste cedro (Cederla adorata), donde se evaluaron
distintos extractos químicos a 400 μg de extracto/disco; con n-hexano, cloroformo,
acetato de etilo y agua para el control de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
y Staphylococcus aureus, el estudio mostró que el extracto con hexano presentaba
un mayor halo de inhibición de 12 mm sobre S. aureus. Los autores mencionan que
los responsables de la inhibición fueron los alcaloides, triterpenos o esteroles y
quinonas presentes en el extracto.
48
En un trabajo realizado por Castillo et al. (2016) se evaluó el efecto de inhibición de
extractos acetónicos de las especies vegetales Peumus boldus, Cucurbita pepo,
Piper auritum, Plantago major, Artemisia absinthum, Foeniculum vulgare,
Parmentiera aculeata y Croton guatemalensis contra las bacterias Escherichia coli
spp y Bacillus cereus. Sus resultados mostraron que los extractos de P. major y P.
boldus presentaron un efecto inhibidor con halos de inhibición de hasta 1.0 cm en
ambos extractos contra B. cereus, mientras que para E. coli, solo los extractos de
P. boldus, P. major y C. pepo mostraron inhibición con un máximo de 0.9 cm. Los
autores señalan, que el resto de los extractos no mostraron efecto pese a que hay
evidencia de inhibición en otros patógenos.
Salazar-Aranda et al. (2009) evaluaron extractos hidroalcohólicos de diferentes
especies vegetales que son comercializados en mercados convencionales de
Monterrey, el estudio consistió en la evaluación antimicrobiana contra Escherichia
coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Los autores mencionan que las
especies de Allium sativum, Peumus boldus, Eucalyptus globulus, Mentha piperita,
o Salvia officinalis, no mostraron ningún efecto de inhibición contra E. coli, sin
embargo, los productos que contenían P. boldus, E. globulus, o S. officinalis fueron
los más activos contra S. aureus con una concentración de 62.5 µg/mL. Y
finalmente, solo los extractos de P. boldus, E. globulus y S. officinalis mostraron
actividad contra Candida albicans con la misma concentración.
Por otro lado, Miranda et al. (2012) realizaron la evaluación antimicrobiana de
extractos etanólicos y hexánicos de hojas y cortezas de Guayaba agria (Psidium
friedrichsthalianum L.), palo de sangre (Pterocarpus hayesii L.), chichimecate
49
(Tynanthus guatemalensis L.) y ciruela (Spondias purpurea L.) reportadas como
plantas medicinales en el estado de Tabasco. El estudio consistió en ver el efecto
inhibidor sobre Staphylococcus aureus, Salmonella typhymuirium y Bacillus cereus.
Los resultados de los autores mostraron que el extracto hexánico de las hojas de
cada una de las plantas evaluadas, mostraron inhibición en al menos uno de los
microorganismos evaluados, mientras que los extractos de la corteza no
presentaron actividad en ninguno de los tres microorganismos evaluados. Los
extractos hexánicos de las hojas de las cuatro especies vegetales mostraron
actividad antimicrobiana, el mayor halo de inhibición los mostró S. purpurea con un
diámetro de 15.63 ± 0.96 mm contra B. cereus, mientras que el menor fue con T.
guatemalensis con 10.20 ± 0.10 mm. Los extractos hexánicos de hoja de P.
friedrichsthalianum y S. purpurea presentaron actividad contra S. typhimurium con
halos de inhibición de 9.53 ± 1.02 y 11.11 ± 1.06 mm, respectivamente. Finalmente,
los extractos hexánicos de P. friedrichsthalianum, P. hayessii y S. purpurea
presentaron halos de inhibición de 13.38 ± 2.98, 10.45 ± 0.70 y 10.68 ± 1.33 mm,
respectivamente, contra S. aureus. Realizando una comparación con respecto a
nuestro trabajo, nos encontramos que el extracto etanólico de Heliopsis longipes si
mostraron efecto de inhibición sobre S. aureus, sin embargo, el efecto lo pudo
ocasionar el alcohol y no el principio activo de la planta como se esperaría.
En un trabajo realizado por Vega Menchaca et al., (2013) donde realizó un extracto
metanólico y acuoso de las hojas de Leucophyllum frutescens que ha sido utilizada
como remedio para enfermedades respiratorias, los extractos fueron evaluados
contra cepas de Staphylococcus aureus de un aislado clínico y uno de referencia.
50
De los extractos evaluados, solo el metanólico fue el que presentó actividad
antimicrobiana, mientras que el acuoso no mostró efecto alguno. El efecto de
inhibición del aislado clínico de S. aureus fue de 12 mm a las concentraciones de
1000 y 500 µg/mL y 10 mm a la concentración de 250 µg/mL, mientras que la cepa
de referencia mostró un halo de inhibición de 15 mm en las concentraciones de 1000
y 500 µl/mL, en cambio a la concentración de 250 µg/mL no presentó actividad
antimicrobiana. Sin embargo, el tratamiento considerado como control negativo para
ver un posible efecto sesgado del solvente extractor, no fue el mismo con el que
realizaron el extracto de la planta, no se hace mención de si el efecto de inhibición
se debe a los principios activos de la planta o al metanol.
Castro-Franco et al. (2001) evaluaron la actividad antibacterial de siete extractos de
plantas de zonas áridas, para así poder darles un uso alternativo a algunas especies
con bajo o nulo potencial forrajero como es el caso de Larrea tridentata, contra
bacterias de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes,
Bacillus cereus, y Shigella dysenteriae a distintas concentraciones. Los autores
mencionan que todos los extractos evaluados mostraron actividad antimicrobial al
menos en uno de los microorganismos probados. El extracto más efectivo fue Agave
lechuguilla, mientras que el que mostró menor eficacia de los siete fitoextractos fue
Larrea tridentata. La bacteria Shigella dysenteriae fue afectada por el 100% de los
fitoextractos; el crecimiento de Escherichia coli solo fue inhibido por Larrea
tridentata. Con respecto a la concentración mínima inhibitoria, la tendencia indicó
un efecto de inhibición en bacterias Grampositivas conforme se incrementó la
51
concentración del fitoextracto. El mayor efecto de inhibición bacterias Gram
negativas fue observado a la concentración de 28.5 mg mL-1.
12.0 CONCLUSIONES
El medicamento comercial mostró la mayor efectividad de inhibición de las cuatro
cepas patógenas, sin embargo, el tratamiento de extracto etanólico de H. longipes
también mostró efecto inhibidor de las cuatro cepas de microorganismos patógenos.
Por otro lado, la cepa que más sensibilidad presento ante los tratamientos fue la de
Klebsiella penumonae, en contraste con la cepa de Staphylococcus faecalis quien
fue la que menor inhibición presentó.
Se requiere realizar más estudios en los que se purifique el extracto y en los que se
incremente la dosis del mismo. Estudios de este tipo podrían servir para diseñar
experimentos in vivo para el control de mastitis en pequeños establos.
52
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