Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko
-
Upload
samantha-horton -
Category
Documents
-
view
31 -
download
4
description
Transcript of Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko
Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja
kokonais-PSA:lle käyttäen terbium(III)-kelaattia donorina
Tuomo LiljenbäckOhjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko
MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA
Nuoret tutkijat 2008 / 11.3.2008 Arcanum
Johdanto
• Työn tarkoitus
• PSA
• FRET
• Määrityksen periaate
Työn tarkoitus
• Tarkoitus on kehittää homogeeninen, multiparametrinen immunomääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle– Hyödynnetään homogeenisille määrityksille hyvin
soveltuvaa fluoresenssiresonanssienergiansiirtoa (FRET)
– Määrityksessä käytetään vasta-aineita, jotka tunnistavat joko vapaan ja/tai kompleksoituneen PSA:n
PSA
• Prostata-spesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine
• Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja
• PSA:ta esiintyy verenkierrossa– vapaana
– kompleksoituneena
(yleensä α1-antikymotrypsiinin kanssa)
PSA
• Seerumin korkea kokonais-PSA -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta
• PSA:ta käytetään tässä työssä mallianalyyttina– kaksi eri muotoa – soveltuu hyvin multiparametriseen
määritykseen
FRET
• FRET vaatii lähekkäin (<10 nm) olevan luovuttaja- ja vastaanottajavärin, joiden emissio- ja viritysspektrit ovat osittain päällekkäin
• FRET-parin viritysaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat kaukana toisistaan, joten määrityksen epäspesifinen tausta jää matalaksi
• Mittausaallonpituudet valittiin siten, että Tb(III)-kelaatin emissio olisi mahdollisimman matala
Määrityksen periaate
Määrityksen periaate
Spektrit
Materiaalit ja menetelmät
• Käytetyt vasta-aineet
• Leimaukset
• Määritykset
Käytetyt vasta-aineet
• Kaikki monoklonaalisia
• 5E4– Sitoutuu vapaaseen ja
kompleksoituneeseen PSA:han
• H50– Sitoutuu vapaaseen ja
kompleksoituneeseen PSA:han
• 5A10– Sitoutuu vain vapaaseen PSA:han
Leimaukset
• Luovuttaja 5E4 Mab leimattiin terbium(III)-kelaatilla
• Vastaanottaja H50 ja 5A10 Mabit leimattiin Alexa Fluor 680:lla
• Myöhemmin H50 leimattiin myös Alexa Fluor 488:lla
Määritykset
• Varsinaiset mittaukset– BSA-pinnoitetuissa kaivoissa 100
µl tilavuudessa• 50 ng kutakin vasta-ainetta
– 2 x 45 min / 1 x 1h inkubointi huoneen lämmössä
– Mittaukset tehtiin Victor 1240 monileimalaskimella (Perkin Elmer MA, USA), johon oli lisätty punaherkkä valomonistinputki (Hamamatsu PMT R4632).
Tulokset
• Leima-asteet
• Standardisuora
• Kinetiikkatarkastelu
• Multiparametrimääritys
Leima-asteet
• Tb – 5E4 Mab (luovuttaja)– leima-aste 12,4
• AF 680 – 5A10 Mab (vastaanottaja)– leima-aste 4,6
• AF 680 – H50 Mab (vastaanottaja)– leima-aste 5,4
• AF 488 – H50 Mab (vastaanottaja)– leima-aste 5
Standardisuora
• AF 680 leimatut 5A10 ja H50 vastaanottaja-Mabit
• Signaalin määrä kasvaa PSA-pitoisuuden noustessa
y = 601,15x0,8378
R2 = 0,9976
y = 266,89x0,8662
R2 = 0,998
Kinetiikka
• Kahden tunnin inkubointi ei muuta signaalin määrää
Multiparametrinen määritys
Päätelmät
• Työssä on todistettu fluoresenssiresonanssienergiansiirron toimivan määrityksessä vapaalla PSA:lla– Vastaanottajavärin signaali kasvaa kummankin vasta-
aineen kohdalla PSA:n määrän noustessa
• Energiaa siirtyy myös, kun molemmat leimatut vasta-aineet ovat läsnä Mittaukset voidaan tehdä multiparametrisesti
• Alun perin määritys oli tarkoitus pystyttää käyttämällä Fabeja
Mab
Fab
Jatkossa
• Optimoidaan vasta-aineiden määriä• Optimoidaan kinetiikkaa• Potilaspaneeli, jos aikaa jää
Kiitokset
• Ohjaajat Ulla ja Tiina• Erikoistyöntekijät ja muu biotekniikan väki• Turun Yliopiston Kemistit TYK ry:n aktiivit