Tes Ca 19-9 (ELFA)2

TES CA 19-9 DENGAN METODE ENZYME LINKED FLUORESCENT ASSAY

(ELFA)

Haerani Harun, Tenri Esa, Uleng Bahrun

Bagian Ilmu Patologi Klinik FK UNHAS RSUP DR Wahidin Sudirohusodo

I. PENDAHULUAN

Tumor Marker adalah substansi yang dihasilkan oleh sel kanker atau sel lain

dalam tubuh sebagai respon terhadap kanker atau keadaan non-kanker tertentu.

Umumnya tumor marker dihasilkan oleh sel normal seperti halnya sel kanker,

tapi kadarnya jauh lebih tinggi pada kanker. Tumor marker dapat ditemukan

pada darah, urine, feses, jaringan tumor atau jaringan lain juga pada cairan tubuh

pasien. Tumor marker lebih banyak merupakan protein, namun belakangan ini

pola ekspresi gen atau perubahan DNA juga mulai digunakan sebagai tumor

marker. Ada bermacam-macam tumor marker, beberapa tumor marker hanya

berhubungan dengan satu jenis kanker dan yang lain dapat ditemukan pada

banyak jenis kanker.1,2

Cancer antigen 19-9 (Ca 19-9) merupakan suatu antigen karbohidrat,

ditemukan sebagai suatu antibodi monoklonal IgG tikus yang muncul sebagai

reaksi terhadap sel karsinoma kolon manusia oleh Koprowsky dan kolega pada

tahun 1979. Cancer antigen 19-9 dideteksi awalnya pada jaringan kolorektal

tetapi ditemukan lebih banyak terdistribusi pada pankreas normal, lambung, dan

epitel biliar, dan juga pada serum pasien dengan karsinoma pankreas. 2-5

Antigen CA 19-9 (Sialyl Lewis a) mempunyai determinan normal yaitu

disialyl Lewis a yang dominan diekspresikan pada sel epitel normal organ

digestif sementara sialyl Lewis a diekspresikan pada sel kanker. Disialyl Lewis a

pada sel epitelial normal berperan sebagai ligand untuk reseptor immunosupresif

dan menjaga homeostasis imunologis dengan menekan aktivasi berlebihan

monosit dan makrofag pada membran mukosa organ digestif. Pada

karsinogenesis pembentukan disialyl Lewis a oleh α2,6 sialyltransferase yang

berikatan dengan dua residu asam sialyl tidak berlangsung sempurna dan hanya

membentuk membentuk monosialyl Lewis a oleh α2,3 sialyltransferase atau

Tutorial Imunologi 1

Tutorial Imunologi

sialyl Lewis a yang hanya memiliki satu ikatan residu asam sialyl sehingga

terjadi akumulasi sialyl Lewis a pada sel kanker.6

Pembentukan disialyl Lewis a dapat digambarkan sebagai berikut:

Lewis a α2,3 ST Sialyl Lewis a α2,6 ST Disialyl Lewis a

Pasien dengan Lewis negatif (Lea-b-) tidak dapat mengekspresikan antigen

CA 19-9 meskipun mengalami kanker saluran cerna karena tidak mempunyai

oligosakarida antigen Lewis yaitu asam sialyl yang diperlukan untuk membentuk

epitop CA 19-9. Kekurangan lain antigen CA 19-9 yaitu dapat meningkat pada

kelainan non-malignansi. Adanya antigen CA 19-9 dalam serum tidak spesifik

untuk kelainan malignansi dan dapat meningkat pada pasien dengan kelainan

non-malignansi. Karena itu hasil positif palsu dapat terjadi pada pasien kanker

yang disertai dengan kelainan benigna atau non-malignansi.6,7

Kondisi malignan yang dapat menyebabkan peningkatan kadar CA 19-9

antara lain Ca. Colorektal, Ca. Pankreas, Ca. Hepar, Ca. Paru dan Ca. Ovarium.

Peningkatan kadar CA 19-9 lebih dari 500 U/ml terjadi pada 50% pasien dengan

malignansi. Interval kadar CA 19-9 pada malignansi yaitu 40 – 10.000 U/ml.

Pada kaadaan benigna kadar CA 19-9 jarang meningkat lebih dari 200 U/ml.

Pada 69,7% keadaan benigna ditemukan kadar CA 19-9 meningkat kurang dari

100 U/ml. Interval kadar CA 19-9 pada keadaan benigna yaitu 40 - 331 U/ml.8

Gambar 1. Kadar CA 19-9 pada keadaan malignansi dan benigna(Sumber: http://www.searchgate.com )


http://www.searchgate.com/

Tes CA 19-9 mempunyai sensitifitas 79 - 81 % dan spesifitas 82 - 90 % untuk

diagnosis kanker pankreas asimptomatik, tetapi tidak digunakan sebagai tes

skrining karena sensifitas dan spesifisitas tidak cukup akurat. Pengukuran kadar

CA 19-9 sebagai suatu faktor prognostik memberikan informasi berharga untuk

membantu membuat keputusan terapi terutama untuk ahli bedah. Tes CA 19-9

digunakan sebagai pemeriksaan tambahan untuk prognosis dan memonitor terapi

pada pasien yang didiagnosis dengan keganasan. Penurunan kadar CA 19-9

mengindikasikan suatu respon positif terhadap terapi dan prognosis yang baik.

Peningkatan kadar CA 19-9 yang konstan menggambarkan respon yang kurang

baik terhadap terapi. Pada evaluasi pasien dengan intervensi bedah, kadar

CA 19-9 preoperatif dan postoperatif telah digunakan untuk memperkirakan

hasil terapi pasien. 3,5,9,10

Cancer antigen 19-9 dapat ditemukan pada darah, urine, cairan peritoneal,

cairan kista, dan cairan amnion. Kadar CA 19-9 pada urine dapat diperiksa

dengan metode Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA), untuk cairan

tubuh dapat diperiksa dengan metode Electrochemiluminescent immunoassay

(ECLIA). Kadar CA 19-9 pada darah dapat diperiksa dengan metode Enzyme

Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) dan Enzyme

Linked Fluorescent Assay (ELFA). Enzyme Linked Fluorescent Assay

merupakan kombinasi metode ELISA dengan deteksi akhir fluoresen. Ada

beberapa fluorofor yang dewasa ini sering dipakai sebagai label dalam uji

imunoflouresen yaitu Fluorescein isothiocyanate, Rhodamine isothiocyanate,

Umbelliferone, Lanthanide Chelates.5,10-13 Pada tutorial ini akan dibahas

pemeriksaan CA 19-9 metode ELFA menggunakan Immunoanalyser automatik

Mini Vidas (BioMѐrieux)

II. TUJUAN

Mendeteksi kadar CA 19-9 secara kuantitatif dengan metode ELFA


III. METODE

A. PRA ANALITIK10

1. Persiapan Pasien

Tidak ada persiapan khusus

2. Persiapan Sampel

Sampel serum atau plasma (heparin atau EDTA). Sampel dapat

disimpan pada suhu 2°C sampai 8 °C selama 48 jam, jika dibutuhkan

penyimpanan lebih lama sampel dapat dibekukan pada suhu -31°C

sampai -19°C hingga 2 bulan. Hindari penggunaan sampel hemolitik,

lipemik dan ikterik.

3. Alat dan Bahan

a. Alat Immunoanalyser Automatik Mini Vidas

b. Mikropipet dan tip

c. Vortex-type mixer

d. Kit Vidas CA 19-9


Tabel 1. Isi kit Vidas CA 19-9

30 CA 19-9 strips STR Siap pakai

30 CA 19-9 SPRs

1x30

SPR Siap pakai

Interior SPR telah dilapisi dengan antibodi

mouse monoclonal 116-NS-19-9.

CA 19-9 Control

1x2 ml (liquid)

C1 Siap pakai

Bovine albumin + antigen reaktif 1116-

NS-19-9 (dari manusia) + 0,9 g/l sodium

azide

Confidence interval dalam U/ml terlihat

pada kartu MLE setelah muncul “Control

C1 Dose Value Range” pada layar

CA 19-9 Calibrator

1x2,5 ml (liquid)

S1 Siap pakai

Bovine albumin + antigen reaktif 1116-

NS-19-9 (dari manusia) + 0,9 g/l sodium

azide

Konsentrasi dalam U/ml terlihat pada kartu

MLE setelah disebutkan “Calibrator (S1)

Dose Value). Confidence interval pada

“Relative Fluorescence Value” terlihat

pada kartu MLE setelah muncul

“Calibrator (S1) RFV Range” pada layar

CA 19-9 Diluent

1x5 ml (liquid)

R1 Siap pakai

Serum manusia + 1 g/l sodium azide

1 kartu MLE Kartu spesifikasi yang mengandung data

kalibrasi master dari pabrik yang

dibutuhkan untuk kalibrasi

1 package insert

(Sumber : Biomerieux, packege insert Kit Vidas CA 19-9. Perancis. 2004)

1) Strip Reagen (STR)


Gambar 2. Strip reagen dengan foil berlabel.(Sumber : Biomerieux, Prosedur manual Vidas CA 19-9. Perancis.

2008)Keterangan:

1. Barcode : Pada kondisi pengoperasian manual, pembaca

barcode internal membaca kode pada strip reagen.

2. Alfanumerik barcode : Jika sistem tidak dapat membaca

barcode, maka alfanumerik barcode digunakan untuk

memasukkan barcode.

3. Nama Pemeriksaan : Kode pemeriksaan berdasarkan karakter

atau huruf yang menggambarkan nama pemeriksaan.

4. ID : Tempat untuk menuliskan identitas sampel jika

dibutuhkan.

5. Kode Batch : Kode batch digunakan untuk mengkode tanggal

kadaluarsa lot reagen.

6. Tanggal kadaluarsa : Bila pembaca barcode membaca

tanggal ini, alat mini Vidas membandingkan dengan data

pada memori untuk memastikan lot reagen tidak melewati

tanggal kadaluarsa.

7. Nomor sequence : Pada tiap batch, tiap reagen strip memiliki

nomor yang berbeda sehubungan dengan tanggal

pembuatan.14

Setiap strip terdiri atas 10 sumur yang ditutupi foil

berlabel berisi barcode kode tes, nomor lot kit, dan tanggal

kadaluarsa. Foil pada sumur pertama dilubangi untuk

memasukkan sampel. Sumur pada bagian tengah mengandung


berbagai reagen yang dibutuhkan untuk pemeriksaan. Sumur

yang terakhir merupakan kuvet yang memungkinkan terjadinya

pembacaan fluorometrik. Tab kecil pada bagian belakang

memastikan strip berada pada posisi yang benar.10,14

Tabel 2. Deskripsi reagen strip Ca 19-9.

Sumur Reagen

1 Sumur sampel

2-3-4 Sumur kosong

5 Konjugat : Antibodi 1116-NS-19-9 berlabel alkali fosfatase

(mouse) + 0,9 g/l sodium azide (400 µl)

6-7 Buffer pembilas : Tris (0.05 mol/l, pH 7,4) + 0,9 g/l sodium

azide (600 µl)

8 Diluent : Kalium fosfat (0,05 mol/l + horse serum (5%) + 0,9

g.l sodium azide (400 µl)

9 Buffer pembilas : Tris (0.05 mol/l, pH 7,4) + 0,9 g/l sodium

azide (600 µl)

10 Kuvet dengan substrat : 4-methyl-umbelliferyl phosphate

(0.6 mol/l) + diethanolamine (DEA) (0.62 mol/l atau

6.6%, pH 9.2) + 1 g/l sodium azide (300 µl)

(Sumber : Biomerieux, packege insert Kit Vidas CA 19-9. Perancis.

2004)

2) Solid Phase Receptacle (SPR)

Solid Phase Receptacle (SPR) berfungsi sebagai pipet pada

pemeriksaan ini. Bagian dalam SPR pada dilapisi dengan

antibodi mouse monoclonal 116-NS-19-9. Setiap SPR diberi

kode “199” dan dikeluarkan hanya sejumlah yang dibutuhkan

dari kemasan dan segera ditutup kembali dengan baik.10


Immunoanalyser Mini Vidas Mikropipet dan tip Vortex-type Mixer

Kit Vidas Ca 19-9 Strip reagen SPR

Gambar 3. Alat dan bahan tes CA 19-9 dengan immunoanalyser Automatik Mini Vidas

(Sumber : http://www.londeran.com )

B. ANALITIK10

1. Prinsip Tes

Prinsip pemeriksaan ini merupakan kombinasi metode immunoassay

enzimatik sandwich dua langkah dengan deteksi akhir fluorosen

(ELFA) dengan langkah sebagai berikut (gambar 3):


http://www.londeran.com/

Gambar 4. Reaksi imunologis pada tes CA 19-9 metode ELFA(Sumber: modifikasi dari http://www.procalcitonin.com)

a. Antibodi 1116-NS-19-9 yang terfiksasi pada dinding SPR

menangkap antigen reaktif yang terdapat pada sampel.

b. Komponen yang tidak terikat akan dikeluarkan selama fase

pembilasan.

c. Antibodi 1116-NS-19-9 berlabel alkali fosfatase (konjugat)

kemudian akan diinkubasi dalam SPR dan akan berikatan dengan

antigen reaktif 1116-NS-19-9.

d. Komponen yang tidak terikat akan dikeluarkan pada fase

pembilasan.

e. Substrat (4-methyl-umbelliferyl phosphate) dipipet keluar masuk

SPR. Enzim konjugat akan mengkatalisis proses hidrolisis substrat

ini menjadi produk fluoresen (4-methyl-umbeiliferone) dimana

fluoresen tersebut akan diukur pada panjang gelombang 450 nm.


http://www.procalcitonin.com/

Intensitas fluorosen setara dengan konsentrasi antigen reaktif 1116-

NS-19-9 pada sampel

2. Cara Kerja10

a. Master lot data entry (MLE)

Master lot data entry (MLE) yang terdapat dalam tiap kit

dimasukkan sebelum reagen dengan lot baru digunakan. Master lot

data Entry (MLE) berisi spesifikasi data kurva kalibrasi. Jika

langkah ini tidak dilakukan sebelum memulai tes, maka alat tidak

dapat mencetak hasil.

Gambar 5. Master lot data entry(Sumber: http://www.biomerieux-usa.com )

b. Kalibrasi

Melakukan kalibrasi dengan kalibrator (S1) yang terdapat pada kit

harus dilakukan setiap menggunakan reagen dengan lot baru dan

setelah memasukkan master lot data. Kalibrasi seharusnya dilakukan

setiap 14 hari dan harus selalu dicek hasilnya dengan kontrol.

c. Kontrol

Kontrol kualitas harus dilakukan segera setelah kit baru dibuka untuk

meyakinkan kualitas reagen tidak berubah. Kontrol tidak dapat

divalidasi jika nilainya keluar dari nilai yang diharapkan.

d. Langkah kerja

Secara skematis tes Ca 19-9 berlangsung sebagai berikut (gambar 6):


http://www.biomerieux-usa.com/

Gambar 6. Proses pada tes Ca 19-9 metode ELFA(Sumber: modifikasi dari http://www.procalcitonin.com)

1) Strip reagen dan SPR yang dibutuhkan dikeluarkan dari lemari es

dan didiamkan pada suhu ruangan minimal 30 menit.

2) Satu strip dan SPR CA 19-9 digunakan untuk tiap satu sampel,

kontrol dan kalibrator dari tes yang akan diperiksa. Pastikan

kemasan kembali ditutup setelah SPR yang dibutuhkan

dikeluarkan. Memilih “199” pada alat untuk masuk pada kode tes.

Kalibrator harus ditandai sebagai “S1” dan dites dengan cara

duplikat. Jika kontrol akan dites, maka ditandai dengan “C1”

3) Sampel dapat disentrifus jika perlu

4) Kalibrator dan kontrol dihomogenkan menggunakan vortex-type

mixer.

5) Sampel, kalibrator atau kontrol dipipet sebanyak 200 µl ke sumur

sampel.

6) SPR dan strip CA 19-9 dimasukkan ke alat. Warna label dan kode

pemeriksaan strip dan SPR dipastikan sesuai.

7) Data pasien dan pemeriksaan yang akan dilakukan dimasukkan

sesuai posisi sampel pada monitor.

8) “Start” ditekan dan pemeriksaan akan dilakukan secara ototmatis

oleh alat. Pemeriksaan selesai dalam waktu kurang lebih 60 menit.

Proses kerja automatis digambarkan sebagai berikut:



Gambar 7. Proses kerja automatis pada SPR dan strip reagen Mini Vidas(Sumber: modifikasi dari http://www.procalcitonin.com)

9) Hasil akan keluar dalam bentuk print out

10) Setelah pemeriksaan selesai, SPR dan strip dikeluarkan dari alat

dan dibuang pada tempat yang telah disediakan.

11) Sampel dengan kadar CA 19-9 lebih dari 500 U/ml harus diperiksa

kembali dan diencerkan dengan diluent (R1). Faktor pengenceran

dimasukkan pada worklist sebelum memulai tes. Jika faktor

pengenceran tidak dimasukkan pada worklist maka hasil tes

dikalikan dengan faktor pengenceran untuk memperoleh

konsentrasi CA 19-9 pada sampel.

Langkah kerja digambarkan pada gambar 8.



1 2 3

4 5 6

7 8 9

10

Gambar 8. Langkah kerja tes CA 19-9 dengan alat Mini Vidas

C. PASCA ANALITIK

Nilai rujukan: < 37 U/ml

Interpretasi:

CA 19-9 dapat meningkat pada Ca. kolorektal, Ca. Pankreas, dan

kanker lain pada traktus digestivus seperti duktus biliaris dan lambung.


Dapat juga meningkat pada keadaan non-malignansi seperti penyakit tiroid,

artritis reumatoid, infeksi kandung kemih dan pankreatitis.1,9

Kadar CA 19-9 pada keganasan pankreas dapat memberikan

informasi prognostik. Kadar CA 19-9 pada serum < 37 U/ml mempunyai

perpanjangan masa hidup 32 - 36 bulan dan pasien dengan kadar CA 19-9 >

37 U/ml mempunyai perpanjangan masa hidup 12-15 bulan.4

Pemeriksaan CA 19-9 digunakan sebagai pemeriksaan tambahan

untuk prognosis dan memonitor terapi pada pasien yang didiagnosis dengan

keganasan. Penurunan kadar CA 19-9 mengindikasikan suatu respon positif

terhadap terapi dan prognosis yang baik. Peningkatan kadar CA 19-9 yang

konstan menggambarkan respon yang kurang terhadap terapi. 10

D. Keterbatasan Pemeriksaan CA 19-9

Cancer antigen 19-9 tidak dianjurkan untuk skrining dan diagnosis

penyakit karena sensivitas dan spesifitas yang tidak cukup adekuat. Sekitar

5-10% populasi dengan fenotipe darah Lewis negatif tidak dapat

membentuk antigen CA 19-9 walaupun menderita Ca Pankreas sehingga

didapatkan hasil negatif palsu. Hasil positif palsu dapat ditemukan pada

pasien Ca Pankreas yang disertai kelainan non-malignansi.4,5

Keterbatasan pemeriksaan CA 19-9 dengan metode ELFA (Mini

Vidas) yaitu dapat terjadi peningkatan atau penurunan palsu kadar CA 19-9

karena adanya human anti-mouse antibodies (HAMA) saat diperiksa dengan

menggunakan kit yang mengandung mouse antibodies. Serum yang

mengandung antibodi terhadap komponen reagen juga dapat mempengaruhi

hasil pemeriksaan. Metode lain yang menggunakan antibodi selain 1116-

NS-19-9 dapat memberikan hasil yang berbeda.10

DAFTAR PUSTAKA

1. American Cancer Society. Tumor Markers. 2012. Available at

http://www.cancer.gov. Accessed on December 15th 2012.


http://www.cancer.gov/

2. National Cancer Institute. Tumor markers. Available at

http://www.cancer.gov. Accessed on March 20th 2013

3. Rückert F, Pilarsky C, Grützmann R. Serum Tumor Markers in Pancreatic

Cancer – Recent Discoveries. 2010. Cancers 2010, 2, 1107-24

4. Ballehaninna UK, Chamberlain RS. The Clinical Utility of serum CA 19-9

gin the diagnosis, prognosis and management of Pancreatic Adenocarcinoma:

J Gastrointest Oncol 2012; 3(2):105-19.

5. Locker G Y, Hamilton S, et al. ASCO 2006 Update of recomendation for The

Usa of Tumor Markers in Gastrointestinal Cancer. JCO 2006; 24: 5313-27

6. Kannagi Reiji, Carbohydrate Antigen Sialyl Lewis a – Its Pathophysiologycal

Significance and Induction in Cancer prograssion. Chang Gung Med J 2007;

3: 189-207.

7. Tian F, Appert H E, et al. Prognostic value of serum Ca 19-9 Levels in

Pancreacitic Adenocarcinoma. Ann. Surg. 1992; 215: 350-5.

8. Pavai S, Yap SF, FRCPath. The Clinical Significance of Elevated levels of

serum CA 19-9. Med J Malaysia. 2003; 58: 667-71.

9. Hardjoeno H, dkk. Tumor Marker. Interpretasi Hasil tes Laboratorium

Diagnostik, bagian dari standar pelayanan medik. Makassar: Lephas. 2012:

422

10. Biomerieux, packege insert Kit Vidas Ca 19-9. Perancis. 2004

11. Inaudi P, Pasqui L, Torre GC, et al. CA 125 and CA 19-9 in Peritoneal, cyst

and amniotic fluids. Med Oncol Tumor Pharmacother, 1988; 5(4): 233-8.

12. Pal K, Roy S, Mondal SA. Et al. Urinary level of CA 19-9 as Tumor Marker

in Urothelial Carcinoma of the Bladder. Urology Journal. 2011; 8((3): 203-7.

13. Hardojo I. Pengantar Imunoasai Dasar. Surabaya: Pusat Penerbitan dan

Percetakan Unair (AUP). 2003: 47.

14. Biomerieux, Prosedur manual Vidas Ca 19-9. Perancis. 2008.


http://www.cancer.gov/

Tes Ca 19-9 (ELFA)2

Documents

Transcript of Tes Ca 19-9 (ELFA)2