TECNICAS PARA ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS. ELECTROFORESIS La electroforesis de ácidos nucleicos en...
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TECNICAS PARA ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS
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ELECTROFORESIS
La electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa, permite separar fragmentos de DNA de diferente tamaño.
Sin embargo, no se puede saber en cuál de los fragmentos se encuentra el gen o la secuencia de DNA que se busca.
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HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS
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El DNA puede sufrir un proceso reversible de separación y reasociación de hebras
DNA en estado nativo Denaturado Renaturado
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Sonda marcada
Acido nucleico inmovilizado
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Paso 1: Separación de fragmentos de RNA por electroforesis.
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Paso 2: Transferencia del RNA al filtro o membrana
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Sonda marcada
Acido nucleico inmovilizado
Paso 3: Hibridación con la sonda específica complementaria
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Paso 4: Lavado y detección de la sonda marcada
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La hibridación con sondas específicas permite determinar la identidad de un
fragmento de DNA o RNA
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La hibridación en condiciones de mayor estringencia garantiza una mayor especificidad en la interacción.
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TIPOS DE HIBRIDACION
1. Tipo de interaccion: DNA – DNA / DNA – RNA/ RNA – RNA
2. Hibridación en filtro: Southern
Northern
Colony Hibridization
Dot-blot
3. Hibridacion en solución : substractiva + columna de hidroxiapatita
4. Hibridacion in situ
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Colony hibridization
Por hibridación en colonia, se puede identificar cuáles de las colonias recombinantes obtenidas, tiene clonado un fragmento de DNA en particular.
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SECUENCIAMIENTO
• Uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs)• 4 reacciones por separado, en paralelo.• Separación de fragmentos producidos por
electroforesis en gel de secuenciamiento
• Animación (Lodish)
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Figure 7-29a
Se realizan 4 reacciones por separado
Oligonucleótido o PrimerTemplado