Elaboración de mezcla para PCR€¦ · Trabajar con control negativo. GELES DE AGAROSA. Métodos...
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ELABORACIELABORACIÓÓN DE MEZCLA N DE MEZCLA PARA PCRPARA PCR
Raquel Asunción Lima Cordón
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PCR
Polymerase Chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa)Sintetizar muchas veces un fragmento de ADNPCR: simulación de lo que sucede en la célula cuando se sintetiza el ADN
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PCR
Ingredientes necesarios:PolimerasaADNOligonucleotidos dNTPs (dinucleotidos)
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PCR: ingredientes
Oligonucleótidos:
Uno debe tener la misma secuencia del ADN Segundo debe ser complementario a esa secuencia. Forward y reverse
De no ser así, no podría amplificarse el fragmento deseado.
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PCR: aplicaciones
Genética de poblaciones
Evolución molecular
Genómica
Medicina forense
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PCR: ¿Cómo funciona?
Después de haber preparado la mezcla maestraSe coloca en un termociclador
Calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas (ciclos de reacción)
95° (desnaturalización)40° - 60° (alineamiento)72° (extensión)
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PCR: desnaturalización
Dobles cadenas de ADN se abren.
Se forman y se rompen constantemente los puentes de H entre los oligonucleótidos y el ADN
Uniones más estables durarán mas tiempoPolimerasa se une al fragmento de ADN de doble
cadena : 5´→ 3´
PCR: alineamiento
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PCR: extensión
Polimerasa alcanza su máxima actividadContinúa la sintesis de los fragmentos de ADN
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TIPOS DE TECNICAS
RAPDs, AFLPs, RFLPsTener claro el tipo de información que necesitamos Las técnicas se pueden dividir en dos categorías
PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genomaPCRs en los que no es necesario conocer la región que se está amplificando.
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•
PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genomaRequieren conocer la secuencia que se trabajaCon este tipo es posible hacer filogeniasLos datos pueden obtenerse de:
Geles que detectan cambios hasta de una sola base SSCPUtilizando enzimas de restricción
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•
PCRs en los que no es necesario conocer la región que se está
amplificando.
Se desconoce el tamaño del fragmento (s)Se utilizan para determinar polimorfismo genómicoUtiliza un solo oligonucleotido con 2 características
Pequeño a mediano (6 -18 pb)Secuencia esté presente muchas veces en el ADN
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¿Qué
se necesita para hacer un PCR?
Polimerasa comercial (acompañada de un buffer o amortiguador)MgCl2 (cloruro de magnesio) Oligonucleótidos Agua (debe tener pocas sales, bidestilada)Tubos (0.2 – 0.5 ml) y puntas (libres de ARNasas y ADNasas)Termociclador
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HACIENDO PCR
ANTES DE EMPEZARPreparar todos los reactivos en alícuotas congeladas (-20° C)
CONDICIONES DEL PCREmpezar con las mismas condiciones que se hayan reportado para el oligonucleótido que se estáutilizando.Realizar pruebas con pocas muestras antes de utilizar todas las muestras de estudio.
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Concentración inicial
Concentración final en la reacción
Cantidad para un tubo
Cantidad para 10 tubos
dNTPs 10 mM 200μM varía de acuerdo al magnesio
1 μl 10 μl
Magnesio 25mM 1.5mM puede probarse de 1 a 4 mM
3 μl 30 μl
Oligo forward
10 μM 1μM puede probarse de 0.1 a 1 μM
5 μl 50 μl
Oligo reverse
10 μM 1μM puede probarse de 0.1 a 1 μM
5 μl 50 μl
Enzima 5U/μl 1U 0.2 μl 2 μl
Buffer 10X 1X 5 μl 50 μl
Agua - - 29.8 μl 298 μl
ADN 0.1mg/ml 0.1 mg genómico 11 μl -
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TEMPERATURAS Y CICLOS
Buscar artículos que hayan trabajado con el organismo de interés. Si no hay o bien no funciona se puede probar lo siguiente
Desnaturalización inicial: 95°C por 5 – 10 mins30 ciclos con desnaturalización a 95 °C (30 s), alineamiento a 50 °C (30 s) y extensión a 72 °C por tiempo variable. Extension final 72 °C 10 mins4 °C
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LA TEMPERATURA DE ALINEAMIENTOPuede modificarse si el PCR aun no funciona. Se puede calcular la Tm (melting temperature) de cada oligo
Varia de la cantidad de dobles o triples enlaces de H
http://insilico.ehu.es/tm.php
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¿Qué
hacer cuando todo empieza a fallar?
¿Cuál es la calidad del ADN que tenemos?
ADN contaminado con proteínas que inhiben la reacción de PCRADN esté degradado: correr una pequeña muestra de ADN en un gel.
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En la extracción ocurre lo siguiente
Rompe tejido: detergente (SDS o CTAB), si quedan restos de SDS la reacción se inhibe. Puede neutralizarse utilizando 0.5% de Tween 20 o 40
Después es necesario deshacerse de todos los componenetes celulares: se usan sales que precipitan proteínas pero no el ADN.
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Hacer curvas de cloruro de magnesioRevisar la concentración y el manejo de los dNTPs. Revisar el buffer
Algunos ya incluyen el MgCl2 e inhiben la reacción
Revisar los oligonucleótidosPodrían estar degradados, defectuosos, mal diseñados.
Contaminación Trabajar con control negativo
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GELES DE AGAROSAMétodos para visualizar el PCR
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Principios básicos de la electroforesis
Geles de agarosa o acrilamida (permiten separar fragmentos de acuerdo al tamaño de cada uno)Especie de red con agujeros de tamaños diferentesEl ADN es “corrido” por corriente eléctrica hacia el polo positivo (ADN negativo)
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Fragmentos de un mismo tamaño se agruparan todos juntos formando bandas en el gel
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¿Agarosa o acrilamida?
AcrilamidaRedes con tamaños de poros uniformesPequeñosÚtil si los tamaños de los fragmentos son pequeñosSeparación fina Una sola base de diferencia
Son muy laboriosasLa tinción con plata
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AgarosaNo forma redes tan uniformesPermite separar moléculas de ADN en un intervalo muy grandeSencillo
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METODOS PARA GELES DE AGAROSA
EQUIPOCámara de electroforesisFuente de poderTransiluminador de luz UVEquipo de fotografía
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Para empezar:
Preparar buffer de corrida Con pH requeridoTBE (Tris Boratos EDTA): estable y reusable.TAE (Tris Acetatos EDTA): menos estable pero permite obtener mejor separación de bandas
La concentración de agarosa dependerá de los tamaños de fragmentos
Si se desconoce el tamaño, se puede iniciar con agarosa al 1%
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Rango efectivo de separacion (Kb) Agarosa (%)
30 -
1 0.5
12 -
0.8 0.7
10 –
0.5 1.0
7 –
0.4 1.2
3 –
0.2 1.5
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La agarosa se disuelve en el mismo buffer que se utiliza para la corridaSe calienta hasta ebullición (evitar derramar)Dejar enfriar aprox. 60°CAñadir bromuro de etidio
Se intercala en las bases del ADNBrilla con luz UVEs mutágeno y altamente tóxico
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Verter en el contenedor de gelesColocar peines para formar pozosDejar enfríar y solidificarAgregar el buffer necesario hasta cubrir el gel
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CARGANDO EL GEL
Colorante de corrida: llevan sustancia espesa (glicerol o sacarosa) que permite que la muestra caiga hacia el fondo del pozoColorantes: nos dan una idea de cómo van migrando los fragmentos
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Cuando el gel esté listo, se conectan los cablesCable rojo: polo positivo.Cable negro: polo negativo.
El ADN migrará hacia el polo +Se recomienda utilizar 5 volts por cada cm que exista entre los dos electrodos (fragmentos grandes)Fragmentos pequeños se recomienda 90-100 V.
Una cámara de 30 cm se correrá a 150 V
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GRACIAS POR SU ATENCIÓN