Métodos de estudio de las células y sus componentes

MÓDULO OPTATIVO:

“INTRODUCCIÓN A LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA EN EL ÁREA BIOMÉDICA”

MICROSCOPÍA

- Procesamiento de materiales biológicos

Microscopía óptica1- Fijación: Formol 4%2- Deshidratación: Series de etanol de concentración creciente3- Aclaramiento: xilol4- Inclusión en parafina5- Preparación del taco6- Corte7- Desparafinización 8- Coloración: Hematoxilina/Eosina9- Deshidratación10- Aclaramiento11- Colocación de cubreobjeto

Microscopía electrónica de transmisión1- Fijación: Karnovsky 1,5%2- Deshidratación: Series de acetonas 3- Inclusión en resinas: araldita4- Preparación del taco5- Corte6- Montaje en grillas de níquel7- Coloración: Sales de metales pesados: citrato de plomo y acetato de uranilo

Utilidades de la Microscopía Electrónica de Transmisión en la patología médica:

Patología renalPatología neuromuscularPatología tumoral

Probable contribución de la Microscopía Electrónica al diagnóstico diferencial de:

-Carcinoma, melanoma y sarcoma.- Adenocarcinoma y mesotelioma.- Tumores de mediastino anterior: timoma, carcinoide tímico, linfoma y seminoma.- Tumores de células pequeñas y redondas: sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma embrionario, linfoma, tumores neuroectodérmicos.- Tumores de células fusadas de partes blandas.

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- Tumores endocrinos y no-endocrinos.

INMUNOCITOQUÍMICA

Permite localizar componentes celulares específicos, mediante una reacción antígeno- anticuerpo.

Componentes esenciales

Antígeno: sustancia de cualquier constitución química, que introducida a un organismo por cualquier vía, no es reconocida como propia e induce una respuesta con formación de anticuerpos.

Anticuerpo (Inmunoglobulina): molécula proteica producida por las células plasmáticas en respuesta a un antígeno.

Cada anticuerpo tiene una porción que se une específicamente a un antígeno.

Para llevar a cabo esta técnica los anticuerpos están unidos a moléculas trazadoras, que permiten visualizar el lugar de la reacción antígeno-anticuerpo.Las moléculas trazadoras pueden ser:

- Fluorocromos (microscopía de fluorescencia)- Enzimas (microscopía fotónica)- Metales, como el oro coloidal (microscopía electrónica)

La inmunocitoquímica se puede realizar tanto para microscopía óptica como para microscopía electrónica de transmisión.A continuación se mencionan dos de las técnicas de immunohistoquímica más utilizadas en microscopía fotónica:

Metales

Ag

Inmunoglobulina

Marcador

enzimas

fluorocromos

Ag

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1- Técnica de immunoperoxidasa. El trazador enzimático es la enzima peroxidasa. Puede emplearse en técnica con anticuerpos marcados (técnica directa o indirecta) o con anticuerpos sin marcar (técnica peroxidasa/anti-peroxidasa: PAP).

2- Método de avidina-biotina.

Entre las aplicaciones de la inmunocitoquímica se encuentra:- Identificación celular.- Inmunotipificación tumoral y pronóstico.- Morfometría.

CITOMETRÍA DE FLUJO (CMF)

FUNDAMENTOS

Técnica de análisis celular multiparamétrico basada en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado

Los citómetros de flujo analizan células en suspensión que interfieren de forma individual con una fuente de luz. La intersección de cada célula con la luz láser provoca la emisión de una serie de señales luminosas que permite diferenciar poblaciones celulares dentro de la muestra analizada, por su tamaño relativo, por sus granulaciones o bien por su reactividad con fluorocromos. Es un método de lectura rápido, que permite analizar un elevado número de células y proporciona un registro computarizado de los resultados. La citometría de flujo permite la determinación de antígenos celulares de superficie, y por tanto, tiene utilidad en la determinacón de inmunotipos de leucemias agudas y sindromes linfoproliferativos crónicos. Así mismo, permite la cuantificación del ADN y la determinación de la actividad proliferativa de la población celular. La cuantificación de ARN celular se aplica al recuento de reticulocitos. La citometría de flujo se ha beneficiado de los avances ocurridos en los últimos años en informática, electrónica, óptica y tecnología laser. Así mismo, la producción de nuevos anticuerpos monoclonales con diferentes fluorocromos y los nuevos procedimientos de tinción en citoquímica han permitido ampliar las áreas de estudio en diagnóstico clínico e investigación biomédica. Actualmente, esta tecnología ha pasado de ser una herramienta útil en investigación básica a ser empleada en la práctica habitual de muchos laboratorios de hematología y anatomía patológica.

¿CUANDO EMPLEAR LA CDF?

La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de células o partículas en suspensión.

Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología y medicina Permite la identificación de antígenos celulares mediante técnicas de

inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.

¿QUÉ ES UN CITÓMETRO DE FLUJO?

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Es un aparato que es capaz de medir componentes y propiedades celulares (partículas biológicas) que fluyen en suspensión. Es esencial disponer de una suspensión de células o partículas individuales.Las células o partículas son marcadas por colorantes fluorescentes que son capaces de excitarse con una fuente luminosa de alta energía

EMPLEOS DE LA CDF EN BIOMEDICINA:

Recuento celular, Fórmula leucocitaria, Recuento reticulocitario, Análisis de médula ósea, Estudios de cinética celular, Estudio de subpoblaciones linfocitarias, Tipología tisular, Estimulación linfocitaria, Diagnóstico/pronóstico de procesos neoplásicos, Monitorear tratamiento en oncología, Diagnóstico bacteriano y vírico, Sensibilidad a antibióticos, Cariotipo, Diagnóstico de portador, Diagnóstico prenatal. 

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE APOPTOSIS

MECANISMOS DE MUERTE CELULAR (Clásicos)Necrosis Apoptosis

Mecanismo pasivo consecuencia de una lesión severa (hipertermia, hipoxia, toxinas, etc…)Conduce a la lisis celular Afecta grupos celulares contiguosGeneralmente acompañada de reacción inflamatoria

Proceso activo y organizado determinado genéticamenteCulmina con la fragmentación celular y fagocitosis de restos celularesAfecta células aisladasNo se acompaña de reacción inflamatoria

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APOPTOSISEventos morfológicos y bioquímicos Técnicas de detecciónDisminución del tamaño celularCondensación del citoplasmaFragmentación nuclearFormación de cuerpos apoptóticosFagocitosis

Microscopía ElectrónicaMicroscopía Fotónica

Externalización de la fosfatidilserina Citometría de FlujoDivisión intranucleosomal Técnica de TUNELDivisión del ADN en 50-300 kb Electroforesis del ADN en gel de

agarosaDetección de Proteínas que participan en el proceso apoptótico

InmunohistoquímicaWestern blot

Detección de actividad Enzimática ELISA

TÉCNICA DE TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling)

TUNEL Es uno de los métodos más utilizados. Consiste en la incorporación de nucleótidos marcados a extremos OH 3` de las cadenas simples del ADN mediante una transferasa terminal (desoxynucleotidil transferasa Dichos polímeros se ponen de manifiesto mediante microscopía de fluorescencia o se pueden detectar por técnicas inmunohistoquímicas.

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Ventajas Permite determinar presencia de fragmentación del ADN en células individuales (cuantitativa)

Se han desarrollado kits que facilitan su utilización

Desventajas En algunos procesos de necrosis puede haber degradación del ADN dejando extremos 3´ libres

ELECTROFORESIS DEL ADNSe basa en la extracción y purificación de las moléculas de ADN, las cuales son separadas por su tamaño, en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico

Extracción del ADNLisis y homogeneización de la muestraDigestión con Proteinasa KDigestión del ARN con ARNasaRemoción de proteínas residuales por precipitación y centrifugaciónRecuperación del ADN del sobrenadante por precipitación con isoproterenolLavado del ADN con etanol

Siembra del ADN Corrida Electroforética (Buffer que contiene Bromuro de Etidio)Transiluminación

Cortes histológicosCultivos celulares

Desparafinar Hidratar Fijar

Digerir enzimáticamente con Proteinasa K

Permeabilizar

Incubar con nucleótidos marcados y enzima Transferasa Terminal

Incubar con anticuerpo conjugado con peroxidasa

Analizar las muestras

Adicionar el substrato (DAB)

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Ventajas La degradación del ADN en patrón de escalera ocurre en forma específicaMétodo confiable

Desventajas Aparece en un proceso tardíoAlgunas estirpes celulares no presentan este tipo de degradación (epiteliales) Es posible perder fragmentos pequeños de ADN

CITOMETRÍA DE FLUJO

Método que permite medir componentes y propiedades de células que fluyen en una suspensión celular.

Detección de moléculas involucradas en apoptosis: ( Fas, Bcl-2, citocromo c, caspasa 3 ) se utilizan anticuerpos acoplados a algún fluorocromo.Degradación del ADN: las células apoptóticas presentan menos contenido de ADN, debido a la degradación por endonucleasas ( se utilizan fluorocromos que se intercalan en la molécula de ADN) Cambios en la simetría de la membrana plasmática: mediante la incorporación de anexina (molécula con gran afinidad por la fosfatidilserina y que no difunde) . Con yoduro de propidio puede verse la integridad de la membrana plasmática.

Ventajas Detección de apoptosis temprana y tardía

Desventajas Requiere células íntegras

CuantitativoConocer la integridad de las membranas

CULTIVOS CELULARES

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células "in vitro", manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Aplicaciones del cultivo de tejidoLa técnica de cultivo celular permite el estudio de múltiples fenómenos celulares:

a. Actividad intracelularb. Flujo intracelular c. Ecología celulard. Interacciones celulares

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Las técnicas de cultivo celular permiten la producción de vacunas antivirales, investigación del cáncer, producción de proteínas como interferón, insulina, hormona de crecimiento para usos terapéuticos, mantenimiento y producción de tejidos para transplante.

Ventajas y desventajas de los cultivos celulares

VENTAJAS DESVENTAJAS

Control preciso y fino del medio ambiente Sensibilidad de la técnicaHomogeneidad de la muestra Alto costoMotivaciones éticas. Inestabilidad

Validez del modelo "in vitro"

Tipos de cultivos de tejidosDependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: celulares, organotípicos y explantes.I) Cultivos celulares. Se cultivan células aisladas, por lo que es necesario realizar una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos, para romper las uniones intercelulares y con la matriz extracelular.

Los cultivos celulares pueden ser

Primarios Líneas celulares

Forma de crecimiento de los cultivos celularesUna suspensión celular se puede cultivar como

monocapa en suspensión. adherida a una superficie en el medio de cultivo

II) Cultivo de órganos (Organotípicos)Implica que la arquitectura característica (con estructura tridimensional) del tejido 'in vivo' se conserva al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos.

III) Explantes Se cultivan fragmentos de tejidos o de órganos adheridos a una superficie.

Equipo necesario para un cultivo celular

1. Sistemas de esterilizaciónLa necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios líquidos

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o sólidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su manipulación - Equipos de filtración.- Autoclave- Estufa

2. Cabina de Flujo LaminarSu función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, hongos) que puedan acceder al cultivo.

3. IncubadorUn incubador dispone de: 1. dispositivos de control de temperatura. 2. dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2 en la proporción deseada. 3. dispositivo de control de la humedad ambiente. 4. dispositivo de recircularización de aire. Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2 son característicos de cada tipo celular.

4. Baño termostatizado

5. Microscopio invertido de contraste de faseEl control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio de contraste de fase. La fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional. Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.

6. Otros instrumentos: centrífugas, equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro.

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ELISA y WESTERN BLOT: métodos de inmunodetección de antígenos sin preservación de la estructura del tejido

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MATERIAL BIOLÓGICO

TEJIDO CÉLULAS

HOMOGENATO

PROTEÍNAS

TOTALES ESPECÍFICAS

Centrifugación (eliminación de núcleos, algunas organelas, restos celulares)

- Absorbancia UV (280 y 205 nm)

- Métodos colorimétricos (VIS)

Western BlotELISA

1- Separación de proteínas en la muestra por electroforesis.2- Transferencia a un soporte sólido3- Detección de proteína específica con anticuerpo específico.

MétodoSemicuantitativo

Detección de la proteína en la muestra con anticuerpo

específico, sin necesidad de

separación previa.

MétodoCuantitativo

ESPECTROFOTÓMETRO

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Definición

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método in vitro en el cual se produce la síntesis enzimática de un fragmento de ADN específico, en pocas horas.

Etapas de la reacción

Las etapas de la reacción son 4: DESNATURALIZACION INICIAL: Esta etapa consiste de un calentamiento de la muestra a

95 C, para que se produzca la desnaturalización de todas las cadenas de ADN. CICLADO: Esta etapa es la reacción propiamente dicha. Consiste de 3 subetapas:

Desnaturalización (95 C) separación de las cadenas de ADN

Annealling (56-70 C) unión de los primers a la molécula de ADN 1 ciclo

Extensión (72 C) se produce mediante el agregado de dNTPs

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EXTENSION FINAL: Esta etapa consiste de una extensión final a 72 C para que la reacción se complete.

Reactivos

Muestra (Template DNA): Esta contiene la región del fragmento a ser amplificado Buffer (Tris, NH4+ y/o K+): le brinda a la polimerasa un ambiente químico conveniente Cloruro de Magnesio (Cl2Mg): Ayuda a la polimerasa en su función Par de primers (oligonucleótidos): determinan el comienzo y el final de la región a ser

amplificada dNTP´s (deoxinucleótidos trifosfato): a partir de los cuales la polimerasa construye el nuevo

fragmento de ADN DNA Polimerasa (Usualmente Taq)

Aplicaciones

Detección de mutaciones Screening de enfermedades hereditarias (desordenes genéticos heredados) Diagnostico de enfermedades infecciosas Clonación de genes Perfil genético utilizando microsatélites

Medicina forense Estudio de especies salvajes Test de paternidad

Producción de gran cantidad de ADN para secuenciación o de secuencias especificas de ADN para utilizar como sonda

Tipos de PCR

SSCP-PCR (single strand conformational polymorphims PCR): Se utiliza para detectar mutaciones

Touchdown PCR: Evita, parcialmente, el annealling no especifico de los primers y por ende la amplificación inespecífica

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR): Permite ver expresión de genes Real Time-PCR (PCR en tiempo real): Permite ver en tiempo real la acumulación de

producto

MICROARRAY ( BIOCHIPS )

FUNDAMENTOLa tecnología microarray permite el análisis comparativo y simultáneo de cómo se expresan cientos de genes en un solo experimento

GENERALIDADES

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Son micromatrices (soporte de silicona, vidrio, plástico o membrana de nylon) donde

existen miles de sondas de material genético las cuales tienen una secuencia conocida.Se fabrican a partir de:

- Cadenas de oligonucleótidos- Una colección purificada de DNA´s- Proteínas- Tejidos

SECUENCIA DE EVENTOS EN UN ESTUDIO COMPARATIVO DE EXPRESIÓN GÉNICA

1- Elección de la población celular a estudiar. Objetivos:

A- Estudios comparativos de genes específicos de tejidosB- Estudios de defectos genes reguladores en el cáncerC- Respuestas celulares al ambienteD- Variaciones del ciclo celular

2- Extracción del mRNA y Transcripción Reversa- Objetivo: Comparar la cantidad de diferentes mRNA presentes en 2 poblaciones celulares seleccionadas.- Se realiza una trascripción reversa de mRNA a cDNA que es una forma más estable.

3- Marcación de los cDNA.Empleo de moléculas fluorescentes: Rojo: RodaminaVerde: Fuoresceína

4- Hibridación al DNA del Biochip o Microarray.

5- Escaneo del array hibridado. Revelado mediante: 1- Escáner óptico2- Microscopio láser confocal

6- Interpretación de la imagen escaneada.Mediante el empleo de software comerciales y gratuitos

APLICACIONES

en biomedicina

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en la clínica

en la industria farmacéutica

en biotecnologíaVENTAJASVENTAJAS

- Permite generar un volumen importante de datos que luego se analizan, interpretan y reúnen en una base informática.- Acelerar descubrimientos biológicos- Encontrar genes con objetivos terapéuticos- Clasificar enfermedades basándose en genes

PERSPECTIVAS DE DESARROLLO EN INDUSTRIAS FARMACÉUTICAS

Desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico micromatriciales en las áreas siguientes: - genotipado del VIH-1 para detectar mutaciones de resistencia,- resecuenciación del gen p53 en el cáncer,- predicción del riesgo de cáncer colorrectal,- fibrosis cística,- genotipado del virus del papiloma humano (HPV). (La infección por el HPV es la

primera causa de cáncer cervical.)

Estas micromatrices aportarán información sobre la dotación genética de una persona o revelarán características distintivas de la enfermedad o el agente infeccioso, cuyo conocimiento influirá en la elección y la duración del tratamiento.

HIBRIDIZACION IN SITU

Es un técnica mediante la cual se estudia la distribución y densidad de un gen o molécula de ARNm en una célula o un tejido, utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena.

Hibridización: Es un proceso en el cual dos cadenas complementarias de ácidonucleico forman una doble hélice durante un período de tiempo.

En general, la hibridación puede hacerse sobre soportes sólidos (filtros de nylon o nitrocelulosa), en solución (in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ). Se pueden utilizar sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como se necesita protección y manipulación especiales , no son de elección para su uso rutinario. Las técnicas no-isotópicas o colorimétricas son más rápidas y permiten una localización más precisa de la reacción. Las sondas marcadas sin elementos radioactivos son más estables y más baratas. La sensibilidad es igual o levemente inferior a la de los métodos isotópicos. Se han utilizado sondas marcadas con biotina y digoxigenina.

Tipos de técnicas de hibridación:

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• Técnica isotópica ó radioactiva (sondas marcadas con: 32P, 35S, 3H).

• Técnica no isotópica o no radioactiva. (sondas marcadas con: digoxigenina, peroxidasa, biotina etc).

Tipos de sondas

• ADN de simple cadena: Son más largas de 200-500 pb.• ADN de doble cadena: Necesitan ser desnaturalizados antes de la

hibridización.

• Probes de ARN: Son más estables.

La hibridación in situ se utiliza primordialmente en la detección de bajo número de copias de virus, en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como agentes carcinógenos (HPV, HBV, EBV).

Hibridación in situ Fluorescente (FISH : Fluorescent In Situ Hybridization)

La FISH es una nueva tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas con fluorescencia para detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá del poder de resolución de la citogenética de rutina. Primero, la muestra de DNA (cromosomas metafásicos o núcleos en interfase) se desnaturaliza, proceso que separa las hebras complementarias de la estructura en doble hélice del DNA. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés, marcada con fluorescencia, que se hibridará al DNA de la muestra en el sitio diana, en el proceso denominado templado, donde se vuelve a formar una doble hélice. La señal de la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y la muestra de DNA se clasifica según la presencia o ausencia de la señal.

FISH de Metafase

La FISH puede usarse sobre células en metafase para detectar microdeleciones específicas más allá de la resolución de la citogenética de rutina o para identificar material extra de origen desconocido. Puede también ser de ayuda en casos donde es difícil determinar mediante la citogenética de rutina si un cromosoma tiene una deleción simple o está implicado en una reorganización sutil o compleja. Además, la FISH de metafase puede detectar algunos de los reordenamientos específicos que se observan en ciertos cánceres. El número de síndromes de microdeleción diagnosticados por FISH está aumentando con rapidez. La sensibilidad de estos ensayos es en todos los casos mejor que la de la citogenética de rutina, pero depende del síndrome en concreto. En algunos, la sonda es específica para el gen defectuoso, como en el Síndrome de Williams, donde se ha encontrado una deleción en el gen de la elastina en el 96% de los pacientes con diagnóstico confirmado. En otros síndromes como el de Prader-Willi/Angelman, la etiología es heterogénea y las microdeleciones sólo forman una parte de los casos (60%).

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Síndromes de Microdeleción Actualmente Diagnosticables mediante FISH

 

Síndrome del maullido (cri-du-chat)  

Síndrome de Kallman   

Síndrome de Miller-Dieker  

Síndrome de Williams   

Síndrome de Smith-Magenis  

Síndrome de Wolf-Hirschhorn   

Deficiencia de esteroide-sulfatasa  

Síndrome de Prader-Willi/Angelman   

Síndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen 

FISH de Interfase

La FISH se puede usar sobre células en interfase para determinar el número de copias de uno o varios cromosomas, así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son características de ciertos cánceres. La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede realizar muy rápidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento de las células. Un buen ejemplo es el ensayo de Prueba de Aneuploidía, que se realiza sobre células del fluido amniótico cuando hay una fuerte indicación clínica de una de las trisomías más comunes. Se desnaturalizan los núcleos de la muestra, se hibridan con sondas específicas para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y los resultados se obtienen comúnmente en 24 horas. La prueba de aneuploidía suele incluir también una citogenética de rutina para confirmar los resultados o detectar cualquier anomalía no detectada por la FISH de interfase.

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

La tecnología del DNA recombinante o ingeniería genética es un término general que engloba todos aquellos protocolos experimentales que conducen a la transferencia de información genética (DNA) desde un organismo a otro.

Un experimento de DNA recombinante generalmente sigue el siguiente formato:

1.- El DNA (DNA clonado, DNA insertado, DNA diana, DNA extraño) de un organismo donador se extrae, se rompe enzimáticamente (corta, digiere) y se junta (liga, une) a otro DNA (vector de clonación) para formar una nueva molécula de DNA recombinado

2.- Esta construcción vector de clonación-DNA insertado se transfiere y mantiene dentro de una célula hospedadora. La introducción del DNA en la célula hospedadora se denomina transformación (bacterias) o tranfección (células eucariotas).

3.- Aquellas células que han tomado la construcción de DNA (células transformadas o transfectadas) se identifican y seleccionan (separan) de aquellas que no contienen la construcción.

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ANIMALES TRANSGÉNICOS

Un animal transgénico es el resultado de insertar un gen foráneo (transgen) en su genoma, con el fin de modificar alguna característica del animal.

Son utilizados para:

• Estudiar enfermedades y contribuir al desarrollo de tratamientos más efectivos.

• Producir productos biológicos útiles.

• Conseguir órganos que puedan utilizarse en transplantes.

Primer paso:

Identificar y aislar el gen que se desea insertar en el genoma del animal con el fin que manifieste un carácter determinado o que produzca la síntesis de una proteína.

Segundo paso:

Introducir el gen , para ello existen diferentes métodos:

• Microinyección de ADN en el pronúcleo de un zigoto.

• Transferencia del gen empleando retrovirus como vectores.

• Transformación de células madre embrionarias.

Aplicación clinica:

- Esta técnica es utilizada para crear modelos de enfermedades humanas con el fin de investigar nuevos tratamientos. Existen modelos transgénicos para el cancer, fibrosis quística, artritis reumatoide y Alzheimer.

- Producir órganos para trasplantes , con el fin que no exista rechazo por el sistema inmunológico del paciente. Para ello se inserta un gen que expresa una proteína humana en la superficie de las células del animal de modo que dichas células no sean reconocidas por el sistema inmune humano.

- Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto valor (proteínas terapéuticas): Las "granjas farmacéuticas" o "granjas moleculares“.

Desventajas:

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- Bajo porcentaje de animales que incorporan el transgen en el lugar correcto.

- Preocupación que los transplantes de animales a humanos permitan a unvirus animal infectar al hombre.

ANIMALES KNOCKOUT

Animales "knockout" son aquellos en los que un gen normal es reemplazado por uno que produce una proteína no funcional. La herramienta esencial para la aplicación de esta técnica deriva del empleo de las células embrionarias troncales (células ES) o multipotentes

El primer paso del proceso de generación de un ratón knockout consiste en la eliminación de uno de las dos copias del gen seleccionado en las células ES.

Aplicación clinica:

- Fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica de Knockout, el gen de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.

- Se han desarrollado modelos animales (ratones) knockout deficientes en una determinada proteasa de potencial relevancia en el cáncer.

Desventajas :

- Bajo porcentaje de animales que incorporan el transgen en el lugar correcto.

- La deficiencia en un gen puede llegar a generar anomalías importantes provocando retraso en el crecimiento, envejecimiento acelerado y muerteprematura.

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