Technische Hinweise: Wieslab Funktionelle Komplement-Tests Technische Hinweise... · Technische...
Transcript of Technische Hinweise: Wieslab Funktionelle Komplement-Tests Technische Hinweise... · Technische...
Technische Hinweise: Wieslab© Funktionelle Komplement-Tests
• Testspezifikationen • Kurzanleitung • Ergebnis-Interpretation • Präanalytik • Fallstricke, Hinweise • Forschungsmodifikationen • Support
I 1 Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests 2016-06-16
• Komplexes System aus einer sequentiellen Kaskade von über 35 Proteinen, Teil des unspezifischen Immunsystems
• Schrittweise Aktivierung durch proteolytische Spaltung von Proenzymen; endet immer in der Bildung des Membran-Angriffskomplexes MAC (C5b-9)
• Unterscheidung von drei Aktivierungswegen:
Klassisch
Lektin (MBL)
Alternativ
• Basis-Aktivierung erfolgt über unterschiedliche Auslöser, extern oder intern
• Zentrale Punkte sind:
Spaltung von C3, Opsonisierung
Bildung der Anaphylatoxine C3a, C5a (Entzündung)
Endpunkt ist Bildung von MAC und Lyse des Erregers
• Regulation auf unterschiedlichen Ebenen mittels löslicher und zell-gebundener Proteine (z.B. C1INH, Faktor H, DAF/CD55)
• Enge Verzahnung mit dem adaptiven Immunsystem und der Hämostase!
Das Komplementsystem Überblick
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 2
• Euro Diagnostica hat 2005 zusammen mit führenden Komplementologen funktionelle Globaltests im ELISA-Format entwickelt; das Projekt wurde von der EU gefördert.
• Über Weg-spezifische Aktivatoren können alle drei Wege
im gleichen Testformat separat untersucht werden: • IgM: Klassischer Weg • LPS: Alternativer Weg • Mannan: Lektin-Weg (MBL)
• Az. BSA: Ficolin-3 Weg (Subtyp Lektin-Weg, nur für Forschungszwecke)
• Funktionalität im Reagenzglas:
Prinzipiell wird aufgrund spezifischer Aktivatoren nur die Neu-Enstehung des Membrane-Attack-Complex (MAC/ C5b-9) gemessen; dieser liegt gebunden an die Aktivatoren auf der Plattenoberfläche im Well vor.
• Korreliert mit klassischen, Erythrozyten-basierten hämolytischen Tests CH50, APH50 (≈ Lyse durch MAC)
• Patentschutz besteht für unseren funktionellen Test für den MBL/Lektin- und Ficolin-3/Lektin-Weg
Das Komplementsystem Wie bekommt man das Gesamtbild?
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 3
www.eurodiagnostica.com
Euro Diagnostica ELISA-Portfolio Komplement
Messung der funktionellen Aktivität
Produkte Bestellnummer Zur in-vitro-Diagnostik* Wieslab® Complement system Screen COMPL 300 Wieslab® Complement system CP COMPL CP310 Wieslab® Complement system MBL COMPL MP320 Wieslab® Complement system AP COMPL AP330 Nur für Forschungszwecke* Wieslab® Complement system Ficolin-3 COMPL F3 RUO *Verfügbarkeit länderabhängig, bitte lokalen Ansprechpartner kontaktieren
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 4
Technische Spezifikationen Komplement Classical Pathway
Produktname Wieslab® Complement Classical Pathway
Bestell-Nr. COMPL CP310*
Format ELISA, brechbare 96-well Platte (blau markiert)
Aktivator-Beschichtung IgM (human)
Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-/Aktivitäts-Kontrolle)
Auswertung Qualitativ: Ratio (Probe - NC)/(PC - NC) x100 % oder quantitativ: 0 – 100% (6 Standards)
Kontrollen 2 (NC, PC; plus Leerwert)
Normbereich 69 – 129 % (2s-Bereich von 120 Blutspendern)
Probenmaterial, Menge Serum, 5 µl
Vorverdünnung 1:101
Probenmenge 100 µl
Substrat, Wellenlänge pNPP, 405 nm
Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden
Intraassay-Varianz 3%
Automation Validiert (Dynex)
Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion
Ref: E-23-0162 – Bedienungsanleitung WIESLAB® Complement system, Classical Pathway *auch als RUO-Version für Forschungszwecke erhältlich: COMPL CP310 RUO
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 5
Kurzanleitung Komplement Classical Pathway
Schritte Lösung Verdünnte
Probe
Leerwert / Standards,
verdünnte Kontrollen
In die Wells pipettieren 100 µL 100 µL
60 min bei 37°C inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Enzym-Konjugat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Substrat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Bei 405 nm messen (nach beendeter Inkubation innerhalb von 60 min)
Ausführliche Anweisungen in der Bedienungsanleitung
E-23-0162, WIESLAB® Complement system, Classical Pathway
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 6
Verdünnungsreihe der rekonstituierten Positivkontrolle: Verwendung als Master-Standard für quant. Auswertung
100 % = Verdünnung 1/101
75% 50% 25% 12,5% 0%
10 µl PC
1000 µl Verdünnungs-puffer
225 µl 100%
75 µl Verdünnungs-puffer
150 µl 100%
150 µl Verdünnungs-puffer
75 µl 100%
225 µl Verdünnungs-puffer
40 µl 100%
280 µl Verdünnungs-puffer
300 µl Verdünnungs-puffer
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 7
Technische Spezifikationen Komplement Alternative Pathway
Produktname Wieslab® Complement Alternative Pathway
Bestell-Nr. COMPL AP330*
Format ELISA, brechbare 96-well Platte (rot markiert)
Aktivator-Beschichtung Lipopolysaccharid (LPS)
Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-Kontrolle)
Auswertung Qualitativ: (Probe - NC)/(PC - NC) x100 % (Ratio)
Kontrollen 2 (NC, PC; plus Leerwert)
Normbereich 30 – 113 % (2s-Bereich von 120 Blutspendern)
Probenmaterial, Menge Serum, 20 µl
Vorverdünnung 1:18
Probenmenge 100 µl
Substrat, Wellenlänge pNPP, 405 nm
Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden
Intraassay-Varianz 7%
Automation Validiert (Dynex)
Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion
Ref: E-23-0164 – Bedienungsanleitung WIESLAB® Complement system, Alternative Pathway *auch als RUO-Version für Forschungszwecke erhältlich: COMPL CP330 RUO
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 8
Kurzanleitung Komplement Alternative Pathway
Schritte Lösung Verdünnte
Probe Leerwert /
verdünnte Kontrollen
In die Wells pipettieren 100 µL 100 µL
60 min bei 37°C inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Enzym-Konjugat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Substrat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Bei 405 nm messen (nach beendeter Inkubation innerhalb von 60 min)
Ausführliche Anweisungen in der Bedienungsanleitung E-23-0164
- WIESLAB® Complement system, Alternative Pathway
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 9
Technische Spezifikationen Komplement MBL Pathway
Produktname Wieslab® Complement MBL Pathway
Bestell-Nr. COMPL MP320*
Format ELISA, brechbare 96-well Platte (grün markiert)
Aktivator-Beschichtung Mannan
Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-Kontrolle)
Auswertung Qualitativ: (Probe - NC)/(PC - NC) x100 % (Ratio)
Kontrollen 2 (NC, PC; plus Leerwert)
Normbereich 0 – 125 % (2s-Bereich von 120 Blutspendern); ND-Defekthäufigkeit 20-30%
Probenmaterial, Menge Serum, 5 µl
Vorverdünnung 1:101
Probenmenge 100 µl
Substrat, Wellenlänge pNPP, 405 nm
Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden 15 Minuten
Intraassay-Varianz 5%
Automation Validiert (Dynex)
Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion
Ref: E-23-0163 – Bedienungsanleitung WIESLAB® Complement system, MBL Pathway *auch als RUO-Version für Forschungszwecke erhältlich: COMPL CP320 RUO
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 10
Kurzanleitung Komplement MBL Pathway
Schritte Lösung Verdünnte
Probe Leerwert /
verdünnte Kontrollen
Verdünnte Proben 15 min (maximal 60 min) bei Raumtemperatur stehen lassen
In die Wells pipettieren 100 µL 100 µL
60 min bei 37°C inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Enzym-Konjugat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Substrat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Bei 405 nm messen (nach beendeter Inkubation innerhalb von 60 min)
Ausführliche Anweisungen in der Bedienungsanleitung E-23-0163
- WIESLAB® Complement system, MBL Pathway
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 11
Technische Spezifikationen Komplement-System Screen (3 Wege)
Produktname Wieslab® Complement System screen
Bestell-Nr. COMPL 300*
Format ELISA, brechbare 4x8x3-well Platte CP blau, MP grün, AP rot
Aktivator-Beschichtung Separat mit IgM, Mannan, LPS
Reagenzien Ready-to-use (außer Waschpuffer, Positiv-Kontrolle)
Auswertung Qualitativ: (Probe - NC)/(PC - NC) x100 % (Ratio)
Kontrollen 2 (NC, PC; plus Leerwert)
Normbereiche CP 69–129 %, MP 0-125 %, AP 30-113 % (2s-Bereich von 120 Blutspendern)
Probenmaterial, Menge Serum, 5 / 5 / 20 µl
Vorverdünnung 1:101 / 1:101 / 1:18
Probenmenge 100 µl
Substrat, Wellenlänge pNPP, 405 nm
Zeit bis zum Ergebnis 2 Stunden 15 Minuten
Intraassay-Varianz 3 / 5 / 7%
Automation Validiert (Dynex)
Haltbarkeit des Kits 15 Monate ab Produktion
Classical Pathway MBL Pathway Alternative Pathway
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Dil CP P2 Dil MP P2 Dil AP P2 B Dil CP P2 Dil MP P2 Dil AP P2 C PC etc PC etc PC etc D PC PC PC E NC NC NC F NC NC NC G P1 P1 P1 H P1 P1 P1
Ref: E-23-0161 - WIESLAB® Complement system, Screen *auch als RUO-Version für Forschungszwecke erhältlich: COMPL CP300 RUO
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 12
Kurzanleitung Complement Screen (3 Wege)
Schritte Lösung Alle drei
verdünnten Proben
Leerwert / alle drei verdünnten
Kontrollen Nur die verdünnten Proben des MP 15 min (maximal 60 min) bei Raumtemperatur stehen lassen (mit der Weiterbearbeitung von CP und AP warten!)
In die Wells pipettieren 100 µL 100 µL
60 min bei 37°C inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Enzym-Konjugat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Die Wells dreimal mit 300 µL Waschpuffer waschen
Zugeben Substrat 100 µL 100 µL
30 min bei Raumtemperatur (20-25°C) inkubieren
Bei 405 nm messen (nach beendeter Inkubation innerhalb von 60 min)
Ausführliche Anweisungen in der Bedienungsanleitung E-23-0161
- WIESLAB® Complement system, Screen
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 13
Berechnung der Komplement-Funktion
• Bezugspunkt ist die standardisierte Positiv-Kontrolle. Dies ist ein Serumpool aus definierten Blutspendern mit normaler Komplementfunktion (= 100%)
• Nach Blank-Abzug das Ergebnis der Komplement-Funktion in % wie folgt berechnen:
(Probe - Negativkontrolle)/(Positivkontrolle - Negativkontrolle) x100
In Bezug auf die Normalsituation enthält die Probe also alle zur Funktion notwendigen Komponenten oder nicht
Die Auswertung mittels Zwei-Punkt-Kalibration kann prinzipiell eine Verlaufsbeurteilung (Anstieg, Abfall) der in % angegebenen funktionellen Werte ermöglichen (Grafik: Beispiel klassischer Weg)
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 14
Normbereiche (Interne Studie, Erwachsene)
40 54 68 82 96 110 124 138 152
CP
0
10
20
30
40
n Mittelwert (%)
±2 SD (%) Median (%)
Klassischer Weg (CP) 120 99 69-129 100 Alternativer Weg (AP) 120 71 30-113 73 Lektin-Weg (MP) 120 49 0-125 56
CP AP MP
0 14 28 42 56 70 84 98 112 126
AP
0
10
20
30
0 2 4 6 8 10
AP
Empfehlung: Jedes Labor sollte seine eigenen Referenzwerte ermitteln!
Ref: IFU E-23-0162 WIESLAB® Complement system, Classical Pathway
IFU E-23-0164 - WIESLAB® Complement system, Alternative Pathway
IFU E-23-0163 - WIESLAB® Complement system, MBL Pathway
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 15
Interpretation der Testergebnisse
A. Werte im Normbereich: Normale Komplement-Funktion Kein signifikanter Hinweis auf eine Störung der Gesamt-Funktion
Generell Anamnese und weitere Laborparameter beachten!
B. Werte unterhalb des Normbereichs: Verminderte Komplement-Funktion Gründe für eine verminderte Funktion: - Verbrauch nötiger Komponenten (Auslöser ist Aktivierung des Komplementsystems) - Erbliche oder erworbene Komplement-Defekte (insbesondere bei Werten ≤ 5%) - Unsachgemäße Handhabung der Probe (falsch-niedrig durch Abbau-Prozesse!)
C. Werte oberhalb des Normbereichs: Hinweis auf eher unspezifische Entzündungsaktivität (Akute-Phase)
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 16
Beispiel: Interpretation der Ergebnisse für den klasssischen Weg (CP)
Aktivität (%) Genetischer Defekt oder sehr starker Verbrauch/Aktivierung
Verminderte Funktion: Fehlende oder verbrauchte Komponenten
Normale Funktion Unspezifische Entzündung
< 5% Ref: E-23-0162 – Bedienungsanleitung WIESLAB® Complement system, Classical Pathway
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 17
Test follow-up - Stufendiagnostik
• IMMER abnormale/verminderte Funktionsergebnisse mit einer neuen Probe gegentesten (Sicherstellung der korrekten Präanalytik)
• Wenn ein erneuter Test mit einer frischen Probe weiterhin eine verminderte Funktion zeigt:
-> Verbrauch/Aktivierung oder genetischer Defekt?
oder neu: Blockade durch Medikamente
• Weitere Untersuchungen müssen zeigen:
Welche individuellen Komponenten fehlen?
(Hinzufügen von vermuteten Einzelkomponenten und Test wiederholen)
Autoantikörper gegen Komplement?
Genetische Defizienz?
Mittleres Ergebnis –> Aktivierungsmarker!? Verlaufskontrolle
Anamnese, weitere relevante Laborparameter
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 18
Empfehlung für die Stufendiagnostik des Komplementsystems
Tudoran/Kirschfink, J Lab Med 2012
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 19
Screening-Test für alle drei Wege: Zusätzliche Hinweise auf Defekte beteiligter Komplement-Komponenten
= normale Funktion verminderte Funktion
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests 20
Fallbeispiel: Diagnose von kompletter C2-Defizienz Lennart Truedsson MD/PhD, Section of Microbiology, Immunology and Glycobiology, Dept of Laboratory Medicine, Lund University, Lund, Schweden
Vorstellung des Falls Ein 8-jähriges Mädchen wurde mit einer plötzlichen fiebrigen Erkrankung mit Kopfschmerz ins Krankenhaus eingeliefert. Dort wurde sie mit Verdacht auf Meningitis oder Sepsis mit Antibiotika behandelt. Eine Kultur der Rückenmarksflüssigkeit zeigte ein Wachstum von Meningokokken. Sie hatte schon einmal im Alter von 2 Jahren an von Pneumokokken verursachter Lungenentzündung und Sepsis gelitten. In der Familie gibt es keine erhöhte Infektionsanfälligkeit. Bewertung und Diagnose Eine Analyse des Immunsystems inklusive Immunglobuline und Komplement wurde durchgeführt. Die IgG-Konzentrationen mit allen Subklassen sowie IgM waren normal. Die IgA Konzentration lag unterhalb der Norm, war aber nicht so niedrig wie bei einer selektiven IgA-Defizienz. Eine Analyse der Komplementfunktion mit dem Wieslab® Complement system screen Test ergab keine Aktivität des klassischen und des Lektin-Wegs, aber eine normale Aktivität des alternativen Wegs. Weitere Untersuchungen mit Messungen der individuellen Komponenten des klassischen Wegs (C1q, C2 und C4) ergaben eine vollständige C2-Defizienz. Diskussion und Schlussfolgerung Eine vollständige C2-Defizienz geht mit einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen mit verkapselten Bakterien wie Pneumokokken und einem erhöhten Risiko für SLE einher. Aus der Ergebnissen der funktionellen Analyse kann nicht erkannt werden, ob auch eine MBL-Defizienz vorliegt, da C2 im klassischen und im Lektin Weg vorkommt. Dann ist eine MBL-Messung erforderlich. Es gibt einige Hinweise darauf, dass eine Defizienz-Kombination wie z.B. von C2 und MBL die Anfälligkeit für Infektionen erhöht.
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 21
• Komponenten des Komplement-Systems sind instabiler als andere Standard-Laborparameter; Präanalytik ist somit wichtig für korrekte Ergebnisse
• Stabilität bei Beachtung einiger Spielregeln gar nicht so problematisch
• Probenmaterial: Für Funktionalität nur Serum (Gerinnung komplett abgelaufen!)
• Probentransport und kurzfristige Lagerung:
– Optimal -20°C; kaum Risiken: Bei Raumtemperatur mehrere Stunden, gekühlt bis 24 Stunden
– Empfehlung: Etablierung eines praktikablen, standardisierten Vorgehens (wichtig für Verläufe)
• Verwendung eingefrorener Patienten-Proben:
– Im 37°C Wasserbad schnell auftauen und dann zügig verarbeiten; im Probenpuffer verdünnt bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur stabil; wiederholtes Auftauen (1-2x) kein Problem
• Lagerung der Kit-Bestandteile:
– Positiv-Kontrolle (+ Aktivitätskontrolle CP): lyophilisiert bei -20°C; aufgelöst, dann portioniert bei -70°C
– Restliche Bestandteile des Kits (frisch oder geöffnet) bei 2-8°C
• Interpretation der Ergebnisse:
– Normale oder erniedrigte funktionelle Aktivität des Komplement-Systems
– Im Falle einer verminderten Funktion, Bestätigung mit einer frischen Probe (Ausschluss falsch-niedriger Ergebnisse durch fehlerhafte Präanalytik; falsch-normale Funktion aufgrund Testdesign nicht möglich)
– Ergänzung klinisches Bild, Aktivierungsmarker wie z.B. C3d, sTCC (Plasma), weitere Laborparameter
• Instand Ringversuche (Nr. 246) verfügbar für funktionelle Komplementsystem-Tests (Euro Diagnostica nimmt teil, ebenso an lokalen Ringversuchen in Schweden und Holland)
Qualitätssicherung
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 22
Automatisierte Abarbeitung: Validierte Protokolle für Dynex-Geräte
• Protokolle für alle drei Komplement-Wege vorhanden
• Alle Euro Diagnostica Komplement-Kits werden international auf DSX- und DS2-Geräten (sowie anderen ELISA-Prozessoren) abgearbeitet
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 23
Komplement: Probengewinnung/Präanalytik
• Kein Plasma für die funktionelle Komplement-Testung verwenden!
• Normales Serum sollte aus Vollblut ohne Antikoagulantien gewonnen werden; 60 – 65 Min. gerinnen lassen
• Serum kann maximal 24h bei Raumtemperatur gelagert werden, 48h gekühlt bei 4°C
• Zur längeren Lagerung Aliquots einfrieren (empfohlen bei -70°C); wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden
• Plasma sollte nicht verwendet werden
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 24
Komplement: Interne Erfahrungen mit Plasma
0
20
40
60
80
100
120
CP MP AP
Serum
Heparin
EDTA
Citrate
Mittelwert von 6 Proben (in %)
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 25
Komplement: Proben-Stabilität/Lagerung (interne Daten)
• Bei Raumtemperatur (RT) gelagert
– 24 Stunden: Ok
– 48 Stunden: Aktivitätsverlust von 15-20%
– 72 Stunden: Problematisch, da 40-80% Aktivitätsverlust
• Bei +4 0C gelagert
– 48 Stunden: Ok
– 72 Stunden: Aktivitätsverlust von 10-20%
• Bei -20 0C gelagert
– 1 Monat: Ok
– 2 Monate: Ok, Lektin-Weg beginnt an Aktivität zu verlieren
– 4 Monate: Probleme beginnen generell
• Bei -70 0C gelagert
– Generell ok für längere Lagerung
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 26
Externe Daten aus Lausanne*: Bestätigung der Probenstabilität
Tabelle 1
Dauer S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4
3 Tage 101 98 96 98 92 88 84 85
1 Tag 100 97 99 99 93 98 99 97
4 Stunden 98 95 96 97 99 68 68 100
2 Stunden 99 97 100 99 90 96 96 98
1 Stunde 6 74 89 99 100 97 99 99
0 Stunden/
Messung 90 98 92 104 90 98 92 104
Lagerung bei 4°C Lagerung bei 25°C
Tabelle 2
Gefrier und Auftau-Zyklen S1 S2 S3 S4
0x, Messung 100 81 101 97
1x 98 79 101 96
2x 98 81 101 96
3x 98 79 101 96
* Mit freundlicher Genehmigung: Dr. Vincent Aubert, Institut für Immunologie, Universität Lausanne, 2015
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 27
Komplement-ELISAs: Fallstricke, Hinweise
• Präanalytik beachten: Falsche Lagerung (Abbau der Komplement-Komponenten) führt zu falsch-niedrigen Ergebnis-Interpretationen (= Komplement-Störung/Defekt)
• Lyophilisierte Positivkontrolle sorgfältig und vollständig auflösen. Danach sofort verwenden oder portioniert wegfrieren (-70°C)
• 1. Inkubationsschritt bei 37°C
- Wichtig für korrekte Komplement-Aktivierung (Neu-Enstehung von MAC/C5b-9)
- Falls nur Brutschrank vorhanden, ohne CO2 verwenden! (sonst falsch-niedrige Ergebnisse für Lektin, Ficolin-3)
- 60 Minuten Inkubation insbesondere für den alternativen Weg einhalten! (exponentielle, enzymatische Kinetik bei AP, linear bei CP und MP)
• Nur den jeweiligen Weg-spezifischen Probenverdünnungspuffer verwenden (Inhibition der anderen Wege); 15 min Vorinkubation Lektin-Weg beachten (Blockade CP)
• Achtung: Beim Alternativen Weg ist eine andere Verdünnung nötig (1:18 statt 1:101); strikt einhalten!
• Weitere Probenverdünnungen in der Regel nicht nötig, bzw. können die Ergebnisse (AP) verfälschen
• Nur die jeweilige Weg-spezifische Positiv-Kontrolle verwenden, siehe Beschriftung Fläschchen-Etikett. Prinzipiell existieren zwei Versionen PC CPMPAP = PC MP und PC CP = PC AP
• Waschpuffer und Substrat sind in allen Komplement-Kits identisch, Konjugat bedingt (lot-spezifisch)
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 28
Hinweise zur Lagerung der Positiv- und Aktivitäts-Kontrolle (CP)
• Achtung: Beim Versand befinden sich Kit-Box und eine separate Schachtel für die Kontrollen gemeinsam in einer Plastiktüte. Alles wird vom Zentrallager in Malmö ungekühlt verschickt. Nach Erhalt, die Kit-Box bei 2-8°C lagern und nur die lyophilisierten Kontrollen (zweite Schachtel) bei -20°C sofort einfrieren.
• Die Lagerung der lyophilisierten Positiv-Kontrollen (PC, AC) bei Raumtemperatur ist bis zu einer Woche ok. Ein versehentliches Einfrieren des gesamten Kits bei -20°C oder sogar bei -80°C führt zu keiner Beeinträchtigung der Ergebnisse.
• Positivkontrollen nicht mehrmals auftauen und wieder einfrieren; nach dem Auflösen portioniert wegfrieren!
• Nach dem Auflösen des Lyophilisats ist die Positivkontrolle bei -20°C ca. 12 Wochen, bei -70°C mind. 52 Wochen stabil.
• Die Positiv-Kontrolle ist nicht Kit-Lot-spezifisch; das standardisierte Material aus einem Pool von definierten Normalspendern kann separat bestellt werden.
• Die Negativkontrolle kann im Kühlschrank gelagert werden (hitze-inaktivierter Serumpool).
• Positiv-, Negativ- und Aktivitätskontrolle werden wie die Patientenproben in der jeweiligen Weg-spezifischen Verdünnung im Test eingesetzt.
• Zusätzliche Aktivitätskontrolle (klassischer Weg): Für die quantitative Auswertung des klassischen Wegs (CP), wird die Positivkontrolle als Masterstandard für die Herstellung der Standarkurve verwendet. Für jeden Testlauf muß die Standardkurve immer frisch aus weggefrorenen Portionen des Masterstandards hergestellt werden. Als unabhängige, neue Positivkontrolle dient dann die sogenannte „Aktivitätskontrolle“ im CP-Kit.
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 29
Robustes Testsystem: Optionen zu Modifikationen bei Forschungsanwendungen
• Geeignet für die Testung von Inhibitoren der Komplement-Funktion:
– Die Positiv-Kontrolle kann z.B. als standardisiertes Normalspender Kontroll-Material verwendet werden
– Hinweis: Bei Titrationen von Substanzen den potentiellen Stör-Einfluss von Ionen oder pH in Relation auf den Standardansatz des Wieslab© ELISA-Systems (Serum!) kontrollieren
• Bei vermuteter Defizienz einer Komplement-Komponente kann durch Zugabe der selbigen die Annahme geprüft werden:
– Mögliches Testdesign: Das funktionelle Protein in der für Normalspender üblichen Konzentration zugeben (z.B. in drei verschiedenen Konzentrationen wie: niedriger, gleich, höher), ein paar Stunden bei 4°C inkubieren, dann das Serum mit und ohne vermutetem Defekt-Protein im entsprechenden Wieslab© Kit messen
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 30
Ergebnisse von Forschungsuntersuchungen der Pädiatrischen Nephrologie, Universität Freiburg: Einflüsse von Pufferbedingungen auf den Alternativen Weg
Mit freundlicher Genehmigung von St. Michelfelder, 2015
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 31
www.eurodiagnostica.com/complement – Informative Website
• Übersicht
• Diagnostik
• Therapie
• Support:
– Technische Informationen
– Videos
– Fallbeispiele
– Literatur
– Webinar
– Kongress-Teilnahmen
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 32
• Die ELISA-Systeme von ED bieten eine einfache und standardisierte Untersuchung der Funktionalität aller drei Wege:
– Untersuchung der Einzelwege separat möglich oder alle drei Wege auf einer Platte gleichzeitig
– Sehr ähnliche Testdurchführung für alle drei Wege, kein Spezialwissen nötig
– Laborausstatttung: 37°C Inkubator + Wasserbad, ELISA-Reader (405 nm), -20°C (-80°C) Gefrierschrank
– Ergebnisse innerhalb von 3 Stunden, niedrige VK´s
– Geringe Probenmengen (5, 20 µl Serum je nach Weg)
– Ergebnis:
• Normale oder verminderte Gesamtfunktion des Komplementsystems
• Auswertung aller drei Wege gleichzeitig: Hinweis auf betroffene Einzelkomponenten
• Optimiert für Kleinserien:
– Brechbare Streifen; Notfall-Untersuchung für einen Patienten mit nur zwei Kontrollen ansetzbar
– Stabile Reagenzien auch nach dem Öffnen (bis zu 15 Monate)
• Automation möglich, validierte Protokolle (Dynex) verfügbar
• Etablierte Labormethode:
– CE-markierte Kits, validiert mittels internationaler Multicenter-Studie (2005), Publikationen verfügbar
– Zuverlässige Alternative für aufwendige, hämolytische Tests (CH50, APH50)
Basis-Anforderung der Kliniker kann zeitnah, einfach und kosteneffizient bedient werden
Zusammenfassung: Routinetauglichkeit
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 33
Öresund-Brücke (Malmö-Kopenhagen)
Bei Fragen, können Sie uns gerne über [email protected] kontaktieren
Dok.-Nr. E-142-DE01 – Technische Informationen Funktionelle Komplement-Tests I 34