STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS … · Protein Miktar Tayini 19 3.3.3. Western-blot 20...

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI

STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS

KAVERNOZUM DOKULARINDA RHO-KİNAZ ENZİMİNİN

EKSPRESYONU VE AKTİVİTESİNİN İNCELENMESİ

Halil Mahir KAPLAN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ADANA-2007

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI

STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS

KAVERNOZUM DOKULARINDA RHO-KİNAZ ENZİMİNİN

EKSPRESYONU VE AKTİVİTESİNİN İNCELENMESİ

Halil Mahir KAPLAN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMAN

Yard. Doç. Dr. M. Ata SEÇİLMİŞ

Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından

TF2006YL3 no’lu proje olarak desteklenmiştir.

ADANA-2007

TEŞEKKÜR

Çalışmalarımız için gerekli bilimsel ortamı sağlayan tez yöneticisi hocam Yard.

Doç. Dr. M. Ata SEÇİLMİŞ ve bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Ergin ŞİNGİRİK’e,

araştırmanın tüm aşamalarında maddi, manevi büyük desteği için Prof. Dr. Kansu

BÜYÜKAFŞAR’a, araştırma görevlisi arkadaşlarım Arş.Gör.Dr. Özlem YORULMAZ

ÖZÜ’ye, Arş.Gör.Dr. Nalan TİFTİK’e, Hakan KURT’a, Arş.Gör.Dr. Havva KUBAT’a,

Arş.Gör.Dr. Sencer YURTSEVER’e Arş.Gör. Mehtap PEKTAŞ’a, ayrıca emeği geçmiş

tüm teknik ve idari personele yardımları ve katkılarından dolayı teşekkür ederim.

Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Fonu tarafından, TF2006YL3 no’lu proje olarak

desteklenmiştir.

iii

İÇİNDEKİLER

KABUL ve ONAY ii

TEŞEKKÜR iii

İÇİNDEKİLER iv

ŞEKİLLER DİZİNİ vi

ÇİZELGELER DİZİNİ viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ix

ÖZET xi

ABSTRACT xii

1. GİRİŞ 1

2. GENEL BİLGİ 3

2.1. Statinler 3

2.2. Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı 6

2.2.1. Rho proteinleri 6

2.2.2. Rho-kinaz 8

2.3. Vasküler doku ve Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı ilişkisi 13

2.4. Rho/Rho-kinaz yolağının korpus kavernozum dokusundaki fonksiyonu 15

3. GEREÇ VE YÖNTEM 17

3.1. Kullanılan Kimyasal Ajanlar 17

3.2. Organ Banyosu Deneyleri 18

3.3. Western-blot Deneyleri 19

3.3.1. Homojenizasyon 19

3.3.2. Protein Miktar Tayini 19

3.3.3. Western-blot 20

3.4. Sonuçların Değerlendirilmesi 20

4. BULGULAR 22

iv

4.1. Kontrol ve statin uygulanan farelerin kan lipid seviyeleri 22

4.2. Torasik aorta bulguları 22

4.2.1. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin

torasik aortalarına ait fenilefrin kasılmaları 22

4.2.2. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin torasik

aortalarına ait KCl kasılmaları 23


aortalarına ait Y-27632 gevşemeleri 24

4.2.4. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde

kullanılan çeşitli vazoaktif ajanlara ait pEC50 değerleri 25

4.2.5. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin

torasik aortalarında yapılan Western blot analizleri 26

4.3. Korpus kavernozum bulguları 28

4.3.1. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerin korpus

kavernozum dokularına ait fenilefrin kasılmaları 28


kavernozum dokularına ait KCl kasılmaları 29


kavernozum dokularına ait Y-27632 gevşemeleri 30

4.3.4. Korpus kavernozum ile yapılan organ banyosu deneylerinde

kullanılan çeşitli ajanlara ait pEC50 değerleri 31


kavernozum dokularında yapılan Western blot analizleri 32

5. TARTIŞMA 35

6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER 38

7. KAYNAKLAR 39

ÖZGEÇMİŞ 44

v

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 1. Asetil KoA’dan kolesterole dönüşüm şeması. KoA: koenzim A, PP: pirofosfat. Şekil 2. Rho aktivitesinin düzenlenmesi29. PKN,;protein kinaz N. Şekil 3. Kontraktil stimülasyon ve Ca2+ sensitizasyonu31. PKC; protein kinaz C, PKN;

protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz , CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca2+]i; sitozolik Ca2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol, RhoK; Rho-kinaz, MYPT-1; miyozin hedef alt ünite, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz.

Şekil 4. Rho-kinaz ve düzenlenmesi. PH; plekstrin homoloji bölgesi, RB; Rho bağlayıcı

bölge, AA; araşidonik asit, GTP-Rho; Rho’nun aktif formu.. Şekil 5. Düz kas kasılmasının regülasyonu. ZIPK; zipper-interactig protein kinaz,

DMPK; miyotonik distrofi protein kinaz, PAK; p21-aktivated protein kinaz , PKC; protein kinaz C, PKN; protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca2+]I; sitozolik Ca2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol, GPCRs; G protein-bağlı reseptörler, IP3; inozitol-1,4,5- trisfosfat, MLC20; 20-kDa regülatör miyozin hafif zincir, MLCK; Ca2+-kalmodülin-bağımlı miyozin hafif zincir kinaz, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz, MYPT1; miyozin fosfataz’ hedef alt ünitesi 1, M20; 20-kDa MLCP’nin katalitik olmayan alt ünitesi, PI3K-C2α; sınıf 2 fospfatidilinozitol 3-kinaz’ın α izoformu, PLC; fosfolipaz C, PP1c; katalitik alt ünite 1 protein fosfataz, RhoGEF; GDP-GTP değiştirici faktör, RhoK; Rho-kinaz’ın ROCKI ve ROCK II izoformu 31.

Şekil 6. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden

izole edilen torasik aorta halkalarında fenilefrin (10-8-10-4 M, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmasının %’si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı.


izole edilen torasik aorta halkalarında KCl (10-80 mM, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt bar grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmasının %'si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. ***: P< 0.001.

4 7 8 9 12 23 24

vi

Şekil 8. Kontrol ve statin (30 mg/kg rosuvastatin, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden

izole edilen torasik aorta halkalarında Y-27632 (10-9-10-5 M, n=10)’ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler fenilefrin kasılmasının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05.

Şekil 9. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin torasik aortasında

ROCK2 expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5).

Şekil 10. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin fenilefrinle

kastırılmış torasik aortasında p-MYPT seviyeleri. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5).


izole edilen korpus kavernozum dokularında fenilefrin (10-8-10-4 M, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmalarının %’si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı.


izole edilen korpus kavernozum dokularında KCl (10-80 mM, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt bar grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmalarının %’si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı.

Şekil 13. Statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan ve uygulanmayan

farelerin kavernoz dokularında Y-27632(10-9-10-5 M, n=10)’ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler fenilefrin kasılmasının %’si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05.

Şekil 14. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan ve uygulanmayan (Kontrol)

farelerin korpus kavernozum dokularındaki ROCK2 expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan gurubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5).

Şekil 15. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan ve uygulanmayan (Kontrol)

farelerin fenilefrin ile kastırılımış korpus kavernozum dokularındaki p-MYPT seviyeleri. K: kontrol, S: rosuvastatin alan gurubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5).

25

27

28

29

30 31 33 34

vii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Tablo I. Doğal ve sentetik statinler

Tablo II. Rho kinaz substratları

Tablo III. Kontrol ve rosuvastatin uygulanan farelerin 30. günlerindeki kan lipid düzeyleri

Tablo IV. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli vazoaktif

ajanlara ait pEC50 değerleri

Tablo V. Korpus kavernozum ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli ajanlara

ait pEC50 değerleri

4

10

22

26

32

viii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

HMG-KoA 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A

α Alfa

eNOS Endotelyal nitrik oksid sentaz

iNOS İndüklenebilir nitrik oksid sentaz

nNOS Nöronal nitrik oksid sentaz

ROCK2 Rho-kinaz enzim izofromu

YDL Yüksek dansiteli lipoprotein

DDL Düşük dansiteli lipoprotein

Ç-DDL Çok düşük dansiteli lipoprotein

GTP Guanozin trifosfat

GDP Guanozin difosfat

KCl Potasyum klorür

Ca+2 Kalsiyum

COX Siklooksijenaz

GAPs GTPaz aktive edici proteinler

GDIs GTPaz ayırıcı inhibitörler

GEF Guanin nükleotid değiştirici faktör

ZIPK Zipper-interacting protein kinaz

DMPK Miyotonik distrofi protein kinaz

PAK p21-aktivated protein kinaz

PKC Protein kinaz C

PKN Protein kinaz N

ILK İntegrin-bağlı kinaz

ix

CPI-17 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein of

type 1 of protein fosfataz

[Ca2+]I Sitozolik Ca2+ konsantrasyonu;

DAG Diasilgliserol

GPCRs G protein-kenetli reseptörler

IP3 İnozitol-1,4,5- trisfosfat

MLC20 20-kDa regülatör miyozin hafif zincir

MLCK Miyozin hafif zincir kinaz

MLCP Miyozin hafif zincir fosfataz

MYPT1 Miyozin fosfataz hedef alt ünite

M20 MLCP’nin 20-kDa katalitik olmayan alt ünitesi

PI3K-C2α Sınıf 2 fosfatidilinozitol 3-kinaz’ın α isoformu

PLC Fosfolipaz C

PP1c Tip 1 protein fosfatazın katalitik alt ünitesi

RhoGEF GDP-GTP değiştirici faktör

NO Nitrik oksid

cGMP Siklik guanozinmonofosfat

p-MYPT Fosforillenmiş miyozin fosfataz hedef alt ünite

MBS Miyozin bağlayıcı alt ünite

x

ÖZET

Statin Uygulanan Farelerin Aorta ve Korpus kavernosum Dokularında Rho-kinaz Enziminin Ekspresyonu ve Aktivitesinin İncelenmesi

Bu çalışmada, bir HMG-KoA redüktaz inhibitörü olan rosuvastatinin (30 mg/kg/gün, 30 gün boyunca) kronik olarak uygulamasının fare torasik aorta ve korpus kavernozum (CC) dokularında Rho-kinaz enzim ekspresyonu ve aktivasyonu üzerine olası etkileri hem Western blot analizleri hem de izole organ banyosu deneyleri ile incelendi. 30 günlük uygulama sonrasında rosuvastatin verilen farelerin serum total kolesterol düzeyleri, rosuvastatin verilmeyen farelere göre anlamlı olarak düşüktü.

Rosuvastatin verilen farelerden izole edilen aortta bir α1 adrenoseptör agonisti olan fenilefrine verilen kasılma yanıtları değişmezken, bu grupta KCl yanıtlarının azaldığı görüldü. Bu farelerin CC’larında rosuvastatin uygulaması fenilefrine ait EC50 değerini arttırdı. Rosuvastatin alan gruptan izole edilen hem aorta hem CC dokularında Rho-kinaz enziminin selektif inhibitörü olan Y-27632’ye verilen gevşeme yanıtları kontrole göre anlamlı bir şekilde arttı. Bununla birlikte rosuvastatin alan farelerin torasik aorta ve CC dokularında Rho-kinaz enzim ekspresyonu veya aktivasyon düzeyleri kontrole göre farklı değildi.

Çalışmamızın sonuçları, farelerde rosuvastatin uygulamasıyla HMG-KoA redüktaz enziminin kronik inhibisyonunun bu hayvanlardan izole edilen korpus kavernozum dokusunda, fenilefrine verilen kasılma yanıtlarında bir baskılanmaya ve torasik aortasında KCl’ye verilen kasılma yanıtlarında bir azalmaya neden olduğunu ve bu uygulamanın her iki dokuda Rho-kinaz enziminin selektif inhibitörü olan Y-27632’ye verilen gevşeme yanıtlarını arttırdığını göstermektedir. Anahtar kelimeler: Rosuvastatin, Rho-kinaz, Y-27632, Torasik aorta, Korpus

kavernozum

xi

ABSTRACT

Investigation of Expression and Activity of Rho-kinase Enzyme In The Aorta and Corpus Cavernosum Isolated From Statin-Treated Mice

In this study, we investigated the effects of chronic inhibition of HMG-CoA reductase with rosuvastatin intake (30 mg/kg/day, via gastric gavage, 30 days) on Rho-kinase enzyme expression and activation by Western blot analysis and isolated organ bath experiments on the thoracic aorta and corpus cavernosum(CC) in the mice. In the rosuvastatin-treated mice, serum total cholesterol level was significantly lower than the untreated mice.

Contractile responses of the aorta obtained from rosuvastatin-treated mice to α1-adrenoceptor agonist phenylephrine were not changed while KCl-induced contractions were decreased when compared to those of untreated group. Contractile responses of the CC obtained from rosuvastatin-treated group to phenylephrine were not changed while EC50 for phenylephrine was significantly increased. Relaxant responses to Rho-kinase inhibitor Y-27632 were significantly increased in both thoracic aorta and CC obtained from rosuvastatin-treated mice. In western blot analysis, expression and activation levels in rho-kinase were not different in the aorta and CC from mice treated with rosuvastatin when compared to those of untreated mice. These findings suggest that chronic inhibition of HMG-CoA reductase by rosuvastatin not only leads to decrease in the contractile responses to KCl in the thoracic aorta and to phenylephrine in the CC but also increase in the relaxant responses to Rho-kinase inhibitor Y-27632 in the aorta and CC isolated from mice. Key words: Rosuvastatin, Rho-kinase, Y-27632, Thoracic aorta, Korpus cavernosum

xii

1. GİRİŞ

HMG-KoA (3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A) redüktaz enziminin

inhibitörleri olan statinler güçlü kolesterol düşürücü ilaçlardır ve hiperkolesterolemili

hastalarda en çok tercih edilen gruptur. Son zamanlarda yapılan bazı çalışmalarda, bu

ilaçların vasküler sistem üzerine olumlu tesirlerinde kolesterol düşürücü etkilerinden

başka mekanizmaların da rol oynadığı ileri sürülmektedir. Bu çalışmalarda, statinlerin

kolesterol düşürücü etkilerinden başka, onların eNOS, iNOS ve nNOS enzimlerini

modüle ettikleri, lökosit ve trombositlerin göçünü engelledikleri, damar düz kas

hücrelerinde gevşemeye neden oldukları, antioksidan etki gösterdikleri, anjiyotensin

II’nin neden olduğu kalp hipertrofisini ve fibrozisini engelledikleri, antiinflamatuar

etkiye sahip oldukları ve hücre duvarında sinyal ileti sisteminde rol alan küçük G

proteinlerinin modifikasyonunu önledikleri gösterilmişitir1-8.

Küçük G proteinlerinin modifikasyonunun engellenmesi HMG-KoA redüktaz

enzimi üzerinden L-mevalonatın metabolik yolu ile açıklanabilir. L-mevalonat

katabolizmasının statinler tarafından önlenmesi, farnesilpirofosfat (FPP) ve

geranilgeranilpirofosfat (GGPP) yolu ile oluşan ara ürünleri de engeller. FPP ve GGPP

ile prenilasyon, hücre içi organizasyon ve hücre membranı yapımı için önemlidir9.

Ayrıca küçük, Ras’a benzer Rab, Rac, Rap ve Rho gibi proteinlerin modifikasyonu da

FPP ve GGPP’ye bağlıdır10. Rho ve onun alt efektör molekülü olan Rho-kinaz

enziminin düz kas kasılma mekanizmasında önemli bir rolü vardır. Monomerik

GTP’azların Ras süperfamilyasının Rho subfamilyası üyesi olan küçük GTP’az Rho,

agonist stimülasyonuyla indüklenen Ca2+ sensitizasyonundan sorumludur ve onun alt

efektörü Rho-kinaz, miyozin fosfataz aktivitesini inhibe ederek düz kas hücrelerinde

kasılmanın devamlılığını sağlar11-14.

Yapılan bir çalışmada, serivastatinin küçük bir G proteini olan RhoA’nın

stoplazmadan hücre membranına translokasyonunu engellediği gösterilmiştir15. Diğer

bir çalışmada, Rho proteininin α1 adrenerjik reseptör sinyalizasyon kaskatında gerekli

olduğu gösterilmiştir16. RhoA proteininin aktive edildiği durumlarda bu proteinin

sitozolden mebrana transloke olduğu ve bunun sonucunda Rho-kinaz enziminin aktive

edildiği bilinmektedir12. Sonuç olarak, statin uygulanması Rho/Rho-kinaz aracılı

1

cevapları baskılayabilir ve bu anlamda terapötik bir katkı oluşturabilir. Bu nedenle,

çalışmamızda, bir statin olan rosuvastatinin kronik uygulanmasıyla farelerin aorta ve

korpus kavernozum düz kaslarının reaktivitesinde ortaya çıkabilecek olası değişiklikleri

incelemeyi amaçladık. Bu amaçla, adı geçen dokularda Rho-kinaz enzim ekspresyonu

ve aktivitesi hem izole organ banyosu deneyleriyle fonksiyonel olarak hem de Western

blot analizleriyle doğrudan değerlendirildi.

2

2. GENEL BİLGİ

2.1. Statinler

Statinler, 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A (HMG-KoA) redüktaz enziminin

substratı olan HMG-KoA'ya ve onun yarı indirgenmiş metabolitine yapısal olarak

benzediklerinden; adı geçen enzimi kompetitif bir şekilde inhibe ederler17. Bu olay

sonucu, karaciğer hücrelerindeki kolesterol ve lipoprotein düzeyinin düşmesi, bu

hücrelerin yüzeyindeki DDL (düşük dansiteli lipoprotein) reseptörlerinin dansitesinde

(yoğunluğunda) artmaya (reseptör upregulasyonuna) yol açar. Böylece, söz konusu

ilaçlar hem lipoprotein sentezini azaltmak ve hem de apo-B içeren lipoproteinlerin

(başta aterojenik DDL olmak üzere) karaciğer hücrelerine ve diğer hücrelere girişini ve

orada yıkımını arttırmak suretiyle kanda DDL kolesterolü ve total kolesterol düzeyini

düşürürler. Hipertrigliseridemiyi de bir dereceye kadar düşürebilirler. Öte yandan

antiaterojenik nitelikte olan YDL (yüksek dansiteli lipoprotein) düzeyinde artma

yaparlar. Ancak hipertrigliseridemiyi düşürücü ve YDL kolesterolünü yükseltici

etkinlikleri diğer bir hipolipidemik ilaç grubu olan fibrat türevlerine göre daha düşüktür.

Statinler hiperkolesterolemi, familyal apo-B100 eksikliği ve hipertrigliseridemi

ile hiperkolesteroleminin birlikte olduğu karma hiperlipidemiye bağlı koroner kalp

hastalığı ve inmeye karşı primer ve özellikle sekonder profilaksi için kullanılırlar. Bu

amaçla, statinler genellikle düşük dozda kullanılırlar.

Statinlerin DDL düzeyinde yaptıkları düşme, iyon değiştirici reçinelerin

yaptığından fazladır. Bu bakımdan halen en güçlü etki yapan ilaçlardır. Ailesel olmayan

hiperkolesterolemi olgularında, lovastatin ile yapılan incelemeler bu ilacın DDL

kolesterolü ve total kolesterol düzeyini % 31-40 oranında düşürdüğünü göstermiştir.

Heterozigot ailesel hiperkolesterolemisi olgularında da buna yakın (% 23-35) oranda

düşme meydana gelir. Seyrek görülen ve diğer ilaçlara yeterli cevap vermeyen

homozigot ailesel hiperkolesterolomili çocuk ve genç erişkinlerde total kolesterol

düzeyinde yaptıkları düşme daha azdır (% 6-20); bu olgularda hepatositlerin DDL

reseptörlerinin oluşmadığı dikkate alınırsa, cevabın düşük oluşu, söz konusu ilaçların

terapötik etki mekanizmasında DDL reseptörü upregulasyon'unun katkısının önemini

gösterir. Bu ilaçlar normal kimselerde de plazma kolesterol düzeyinde belirgin düşme

3

yaparlar. Halen bir kısmı kullanımda olan farklı moleküler yapıda statinler

bulunmaktadır. Mevastatin bu ilaçların bir prototipi olarak kabul edilmektedir (Tablo

1).

Tablo I. Doğal ve sentetik statinler.

Doğal / yarı sentetik Sentetik

mevastatin

lovastatin

simvastatin

pravastatin

Fluvastatin

atorvastatin

serivastatin

rosuvastatin

pitavastatin

nisvastatin

krilvastatin

Oral olarak alınan statinler etkilerini HMG-KoA redüktaz enzimini kompetitif

bir şekilde inhibe ederek gösterirler. Bu enzim HMG-KoA'nın L-mevalonat’a

dönüşmesini katabolize eder ve bunun inhibisyonu sonucu statinler L-mevalonat’ın

oluşturacağı kolesterolü önlemiş olur (Şekil 1).

Şekil 1. Asetil KoA’dan kolesterole dönüşüm şeması. KoA: koenzim A, PP: pirofosfat

4

Statinlerin klinik etkinliklerinin yüksek oluşu ve diğer ilaçlara göre yan

tesirlerinin daha az oluşu nedeniyle belirgin bir uyum sorunu yaratmamaları, diğer

kolesterol düşürücü ilaçlara göre üstünlük sağlayabilecek özelliklerdir. Uzun süreli

denemelerle ateroskleroz gelişmesini yavaşlatarak koroner arter hastalığı gelişme riskini

azaltırlar. Koroner arter hastalığı bulunan, akut myokard infarktüsü geçirenler dahil,

hastalarda sekonder profilaksi sağladıkları ve kardiyovasküler olay insidensini ve

mortaliteyi azalttıkları gösterilmiştir. Ayrıca, bu ilaçların aterosklerotik lezyonların ge-

lişmesini yavaşlattıkları ve hatta geriletebildikleri koroner anjiyografısi ile de

doğrulanmıştır. Bundan başka, statinler serebral damarlardaki ateroskleroz gelişmesini

yavaşlatarak inme ve geçici iskemik atak insidensini azaltırlar18.

Statinlerin pleitropik etkisi HMG-CoA redüktaz enzimi üzerinden L-

mevalonatın metabolik yolu ile açıklanabilir. L-mevalonat katabolizmasının

engellenmesi ile statinler, farnesilpirofosfat (FPP) ve geranilgeranilpirofosfat (GGPP)

yolu ile oluşan ara ürünleri de engellemiş olur (şekil 1). FPP ve GGPP ile prenilasyon,

hücre içi organizasyon ve hücre membranı yapımı için önemlidir. Ayrıca, Ras’a benzer

Rab, Rac, Rap ve Rho gibi proteinlerin modifikasyonu da FPP ve GGPP’ye bağlıdır9.

Ras’a benzer proteinler GTP’ye bağlanıp hücrelerin çoğalması, farklılaşması ve

migrasyonu üzerinde önemli etkiye sahiptir10. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda

anjiyotensin II ile indüklenen hücre içi süperoksit anyon üretiminde RhoGDIα ve Rac1

proteinlerinin hücre memranındaki aktivitelerinin de rol oynadığı gösterilmiştir. Statin

uygulaması ile bu proteinlerin hücre membranında birbirlerine bağlanması

engellenmiştir. Böylece, hücre içi süperoksit anyonlarının oluşumu önlenmiştir15.

Bir çalışmada, statinler sıçanların mesenter arterlerinde ve aorta dokularında

endotelyum kaynaklı gevşeme oluşturmuştur. Bu cevapların nitrik oksid (NO)

salınımına ve siklooksijenaz’ın (COX) gevşetici ürünlerine bağlı olduğu ortaya

konmuştur. Sonuç olarak statinlerin gevşetici etkisinde mevalonat ve tirozin kinaz

yolağınının rolü olduğu gösterilmiştir18.

Statinlerin kardiyovasküler hastalıklara karşı koruyucu etkisine eNOS enzimini

upregüle etmesi de katkıda bulunur. Yapılan bir çalışmada Rosuvastatinin eNOS

enzimini upregule ettiği ve iskemik felçten koruduğu göserilmiştir2.

5

2.2 Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı

2.2.1. Rho proteinleri

Rho proteinleri monomerik GTP’azların Ras süperfamilyasının Rho

subfamilyası üyeleridir. Rho geni ilk olarak 1985’de bir deniz salyangozu olan

Aplysia’dan bir Ras homoloğu olarak klonlanmış ve bunu kısa süre sonra üç insan

homoloğu RhoA, RhoB, RhoC’nin bulunması izlemiştir19.

Küçük molekül ağırlıklı GTP bağlayıcı proteinler, 20-40 kDA’lık monomerik G

proteinleridir. Memeli Rho ailesi en az 10 farklı üyeden oluşur. Bunlar: Rho izoformları

olan RhoA, RhoB, RhoC, RhoD, RhoE, RhoG; Rac izoformları olan Rac1, Rac2; Cdc42

izoformu ve TC10 izoformudur20.

RhoA, RhoB ve RhoC’nin efektör bölgeleri aynı aminoasid dizilimine sahiptirler

ve bu GTP’az proteinlerin hücresel fonksiyonları benzerdir. Rho’nun açıklanan bir çok

fonksiyonu RhoA ile yapılan çalışmalara dayanmaktadır 21. RhoA, vücutta en fazla

bulunan ve en çok çalışılan bir Rho proteini alt tipidir22,23.

Küçük G proteinleri olan Rho alt tipleri GDP, GTP, GTP’az aktivitesi ve

efektörleri ile etkileşmekten sorumlu aminoasit dizilimine sahiptirler. Sentezlendikten

sonra lipidler ile posttranslasyonel değişikliklere gereksinim duyarlar. Bu lipid yapıları

genellikle, palmitoil (P), farnesil (F) ve geranilgeranil’dir (GG). Küçük G proteinlerinin

lipid modifikasyonu, bunların aktivitelerini yerine getirebilmeleri için gereklidir24.

Rho’nun aktive olabilmesi için geranilgeranile olmuş C-terminal ucu ile membrana

tutunması gerekir. Guanin nükleotid değişiminden sonra, Rho; Rho-kinaz (ROCK),

protein kinaz N, rhophillin, rhotekin, citron, p140 mDia ve fosfolipaz D gibi alt

efektörlerlerini aktive eder25.

Küçük G proteinlerinin GDP-bağlı inaktif ve GTP-bağlı aktif olmak üzere

birbirine dönüşebilen iki formu vardır. Bu dönüşüm üç grup protein tarafından

düzenlenir (Şekil 2). Bunlar:

1- GTPaz aktive edici proteinler (GAPs, Rho’nun intrinsik GTPaz aktivitesini arttırarak

GTP bağlı Rho’nun inaktivasyonunu kolaylaştırır).

2- GTPaz ayırıcı inhibitörler (GDIs, bazı Rho ailesi GTPazlarının membrana

bağlanmalarını inhibe eder. Nükleotid ayrılmasını ve böylece aktivasyonunu önler).

6

3- Guanin nükleotid değiştirici faktör (GEF, inaktif GDP-Rho’yu aktif GTP-Rho’ya

Dönüştürür)26,27.

Rho aktivitesi aynı zamanda çok sayıda G proteini ile kenetli reseptörler

tarafından da düzenlenebilir28.

Şekil 2. Rho aktivitesinin düzenlenmesi29. PKN; protein kinaz N

İstirahat halindeki hücrelerde, Rho-GDP disosiyasyon inhibitörü (Rho GDI),

GDP-Rho’ya bağlanır ve GDP-Rho’nun membrandan sitozole geçmesini sağlar.

Hücreler bazı agonistlerle stimüle edildiğinde, GDP-Rho GTP-Rho’ya dönüşür. Bu

dönüşüm GTP-GDP değişim reaksiyonunu stimüle eden guanin nükleotid değişim

faktörünün (GEFler) aktivasyonu aracılığıyla gerçekleşir21.

GTP-Rho, daha sonra geranil geranillenmiş C terminal kuyruğu aracılığı ile

hücre membranına yönlendirilir ve spesifik hedefleriyle etkileşir. GTPaz aktive edici

proteinler (GAPs) negatif regülatörler olarak görev yaparlar. Bu proteinler Rho’nun

intrinsik GTPaz aktivitesini azaltarak Rho’yu inaktif hali olan Rho-GDP’ye

dönüştürürler. Rho heterotrimetrik G proteinleri ile kenetli olan reseptörlerin bazı

agonistler tarafından uyarılması sonucu bir takım fonksiyonlar görür30.

Rho proteinleri agonist stimülasyonuyla indüklenen Ca2+ duyarlaşmasından

sorumludur ve miyozin fosfataz aktivitesini inhibe ederek fonksiyon gösterir (Şekil 3)21.

Ayrıca, Rho/Rho-kinaz yolağı stres liflerinin oluşumu, trombosit agregasyonu, lenfosit

7

ve fibroblast adezyonu, sitokinez ve hücre migrasyonu, düz kas kasılması, aktin hücre

iskeleti reorganizasyonu, hücre şekil değişikliği, proliferasyon ve hipertrofi gibi

hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde önemli göreve sahiptir11-14.

Şekil 3. Kontraktil stimülasyon ve Ca2+ sensitizasyonu31. PKC; protein kinaz C, PKN; protein kinaz

N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated inhibitory protein

of type 1 of protein fosfataz, [Ca2+]i; sitozolik Ca2+ konsantrasyonu, DAG; diasilgliserol,

RhoK; Rho-kinaz, MYPT-1; miyozin hedef alt ünite, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz.

2.2.2. Rho-kinaz

Rho-kinaz yaklaşık 1388 aminoasit dizisinden oluşur. Bu dizide, amino (N) ve

karboksil (C) uçları bulunmaktadır. Rho kinaz, aynı zamanda, ROCKα veya ROCK2

olarak isimlendirilir. ROKβ (aynı zamanda ROCK1 olarak da bilinir) Rho kinazın bir

izoformudur12,21. İnsanda ROCK1 ve ROCK2 genleri sırasıyla 18. kromozom (18q11.1)

ve 2. kromozomda (2p24) yer almaktadır43. Rho-kinaz enziminin vasküler düz kas

hücrelerinde Ca2+ duyarlığında rol aldığı bildirilmiştir14. ROCK2’nin beyin ve kalpte,

ROCK1’in akciğer karaciğer, dalak, böbrek ve testiste daha fazla ekprese edildiği

bildirilmiştir. Rho-kinaz enziminin hemen hemen her dokuda varlığı

gösterilmiştir12,21,32,33,34.

8

Rho kinazın N-terminalinde kinaz bölgesi vardır. Orta bölgesinde kuramsal

olarak kangal gibi kıvrılmış (coiled-coil) bölge ve C-terminal bölgesinde plekstrin

homoloji bölgesi bulunur (Şekil 4). Aktive olmuş Rho, Rho-kinazın kangal gibi

kıvrılmış bölgesinin C-terminal parçasıyla etkileşerek kinaz bölgesini aktive eder35. Bu

olay sonucu aktive olan Rho-kinaz aşağıda, tablo II’de, gösterilmiş olan substratları

fosforile ederek çeşitli hücre içi olaylara katkıda bulunur31,36-40.

Şekil 4. Rho-kinaz ve düzenlenmesi. PH; plekstrin homoloji bölgesi, RB; Rho bağlayıcı bölge, AA;

araşidonik asit, GTP-Rho; Rho’nun aktif formu.

9

Tablo II. Rho kinaz substratları

Substratlar Fonksiyonları Hücresel Yanıtlar

Miyozin fosfatazın miyozin

bağlayıcı alt ünitesi

Miyozin fosfatazın

inhibisyonu

Düz kas kasılmasında Ca2+

duyarlaşması

Miyozin hafif zinciri Miyozinin F-aktine

bağlanmasında artış

Stres lifleri oluşumu, fokal

adezyon oluşumu, nörit

retraksiyonu, hücre kasılması,

hücre motilitesi

CPI-17 proteini

Miyozin fosfatazın inaktive

edici aktivitesinin

aktivasyonu


duyarlaşması

Kalponin F-aktine bağlanmada azalma Düz kas kasılmasında Ca2+

duyarlaşması

Ezrin Radiksin Moesin

(ERM)

Ezrin Radiksin Moesin

aktivasyonu Mikrovillus oluşumu

Addusin F-aktine bağlanmada artış Membranal olaylar (ruffling),

hücre motilitesi

İntermediyer flamentler

(GFAB, vimentin) Flamentlerin dağılımı

Flamentlerin sitokinez için

ayrılması

Na+/H+ değiştiricisi Değiştirici aktivitenin

aktivasyonu Stres lifleri oluşumu

LIM kinaz Kinaz aktivitesinde artış Kofilinin fosforilasyonu

CRMP-2 --- Büyüme konisi kollapsı

ZİPK(zipper interacting

kinaz)

Miyozin fosfatazın

inhibisyonu


duyarlaşması

Vasküler düz kas hücrelerinin agonistle indüklenen kasılmasında Rho-kinazın

bir subtratı olan miyozin hafif zincirinin (MLC) fosforilasyon derecesi kasılma gücünün

belirleyicisidir. MLC fosforilasyonun miktarı Ca2+/kalmodulin bağımlı miyozin hafif

zincir kinaz (MLCK) ve miyozin fosfataz (MYPT) arasındaki dengeye bağlıdır41.

Miyozin fosfataz (MP) üç alt üniteden oluşur:

10

1. Miyozin bağlayan alt ünite (myosin binding subunit, MBS). Bu alt ünite miyozin

fosfataz target, MYPT, olarak da bilinir,

2. 37 kDA tip 1 fosfataz katalitik alt ünite,

3. 20 kDA katalitik olmayan alt ünite.

Miyozin fosfataz, miyozin bağlayıcı alt ünite üzerinden fosforillenmiş miyozin hafif

zincirine bağlanır ve onu defosforile eder. Rho kinaz MBS’i fosforile ederek miyozin

fosfataz (MP)’ı inhibe eder. Bu enzim MBS’i çeşitli bölgelerinden fosforile eder

bunlardan treonin 696 (T696) ve treonin 853 (T853) major olan bölgelerdir ve T853’ü

T696’dan üç kat daha fazla fosforile eder (Şekil 5)31. Rho kinaz aynı zamanda miyozin

hafif zinciri (MLC)’ni de fosforile ederek kasılma işlemine katkıda bulunur36.

11

Şekil 5. Düz kas kasılmasının regülasyonu. ZIPK; zipper-interactig protein kinaz, DMPK; miyotonik

distrofi protein kinaz, PAK; p21-aktivated protein kinaz , PKC; protein kinaz C, PKN;

protein kinaz N, ILK; integrin-bağlı kinaz, CPI-17; 17kDa protein kinaz C-potentiated

inhibitory protein of type 1 of protein fosfataz, [Ca2+]I; sitozolik Ca2+ konsantrasyonu,

DAG; diasilgliserol, GPCRs; G protein-bağlı reseptörler, IP3; inozitol-1,4,5- trisfosfat,

MLC20; 20-kDa regülatör miyozin hafif zincir, MLCK; Ca2+-kalmodülin-bağımlı miyozin

hafif zincir kinaz, MLCP; miyozin hafif zincir fosfataz, MYPT1; miyozin fosfataz hedef alt

ünite, M20; 20-kDa MLCP’nin katalitik olmayan alt ünitesi, PI3K-C2α; sınıf 2

fospfatidilinozitol 3-kinaz’ın α izoformu, PLC; fosfolipaz C, PP1c; katalitik alt ünite 1

protein fosfataz, RhoGEF; GDP-GTP değiştirici faktör, RhoK; Rho-kinaz’ın ROCKI ve

ROCK II izoformu 31.

12

2.3. Vasküler doku ve Rho/Rho-kinaz sinyalizasyon yolağı ilişkisi

Trombin, anjiyotensin II, trombosit kaynaklı büyüme faktörü ve serotonin gibi

çeşitli vazoaktif ajanlar Rho/Rho-kinaz sinyal yolağını aktive ederler. Fasudil ile uzun

süre tedavi sonucunda vasküler düz kas hücresinin kasılabilirliğini, fibroblast

proliferasyon ve migrasyonunu, inflamatuar hücrelerin vasküler duvara göçü gibi kritik

basamakların inhibe edilebileceği düşünülmektedir. Rho kinaz ile aracılık edilen sinyal

yolağı vasküler hastalıkların patolojisinde büyük önem taşır14.

NO, cGMP bağımlı protein kinaz aracılığıyla damar düz kasında gevşeme

oluşturur. Yapılan bir çalışmada rekombinat cGMP ile cGMP-bağımlı protein kinazın

RhoA’yı fosforilleyerek inhibe ettiği gösterilmiştir. Sıçan aortasında yapılan bu

çalışmada, bir Rho-kinaz inhibitörü olan Y-27632’nin endotelyumlu dokularda

fenilefrin ile oluşturulan kasılmaları endotelyumsuz olanlara göre nispeten daha güçlü

bir şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir. Ayrıca sodyum nitroprusiyatın fenilefrinle

indüklenen RhoA translokasyonunu geri çevirdiği bulunmuştur. Buna karşın, endoteli

sağlam aorta ringlerinde, nitrik oksid sentaz inhibitörleri ve guanilat siklaz inhibitörleri

varlığında, fenilefrin kasılmalarının Y-27632’ye verdiği gevşeme yanıtları

küntleşmiştir42. Bütün bu bulgular, intakt sıçan aortasında, nitrik oksidin Rho-kinaz’ın

kastırıcı etkinliği üzerinde inhibitör bir etkisi olduğunu telkin etmektedir.

Sıcaklık düşürülerek oluşturulan mikrotübül depolimerizasyonunun, Rho kinaz

aktivasyonu aracılığıyla sıçan aortasında kasılmaları arttırdığı hücresel mikrotubül

ağının veziküler transport, sinyal iletimi ve hücre bölünmesi gibi çeşitli hücresel

olaylarda görev aldığı bildirilmiştir43.

RhoA ve mitojenle-aktive olan kinaz gibi intrasellüler sinyalizasyon

yolaklarının, sfingozin 1-fosfat (SIP) ile aktive edildiği bulunmuştur. SIP, aktive olmuş

trombositlerden salıverilen bir lipiddir. Vasküler düz kas hücre kültürlerinde SIP

sinyalinin, hücre proliferasyonunu uyardığı gösterilmiştir44. Diğer taraftan Rho kinaz ile

aracılık edilen Ca2+ duyarlaşmasında sfingozil fosforilkolinin ayrı bir sinyal yolağı

olduğu bildirilmiştir45.

Tavşan baziler arterinde yapılan bir çalışmada, Rho-kinaz enziminin selektif bir

inhibitörü olan Y-27632 endotelin-1 ile indüklenen kasılmaları inhibe etmiştir14. Ek

olarak Rho/Rho-kinaz yolağı sığır serebral arterindeki Ca2+ duyarlığından da

sorumludur45. Rho kinaz enzimini ve kısmen protein kinazı da inhibe eden fasudilin in

13

vivo olarak hayvanlara verildiğinde vazodilatör etki oluşturduğu gösterilmiştir. Bu ajan,

günümüzde, serebral vazospazmın tedavisinde denenmektedir. Aynı zamanda, bu

bileşik, izole vasküler düz kaslarda agonistle olan kasılmaları inhibe eder. Naguma ve

ark. in vivo olarak uygulanan fasudilin Rho kinazı inhibe ettiğini göstermişlerdir. Aynı

ekip yaptıkları çalışmada fasudilin saflaştırılmış Rho kinaz için güçlü bir in vitro

inhibitör olduğunu göstermiştir46.

Aortokoroner ya da infrainguinal bypass ameliyatı yapılan hastalardan alınan

safen veni in vitro ortamda arteryel basınç koşullarında perfüze edildiğinde fenilefrin ve

serotonine duyarlılığın arttığı görülmüştür. Bu duyarlık Y-27632 ile önlenebilmiştir47.

Trombinin insan umblikal veninde hızlı ve geçici bir RhoA aktivasyonuna neden

olduğu gösterilmiştir. Buna artmış miyozin hafif zincir fosforilasyonu, F-aktin stres

lifleri oluşumu ve artan permeabilite eşlik etmiştir. Y-27632 ile Rho kinazın

inhibisyonu, bütün bu etkileri belirgin olarak azaltmıştır48.

Bir bakteri toksini olan lipopolisakkaritin kastırıcı reseptörlerin sinyalizasyon

yolağında bir etki yapacağı düşünülmüş ve Büyükafşar ve arkadaşları tarafından bu

toksinle muamele edilen sıçanların mezenter arterinde ROCK2’nin kontrole göre daha

fazla eksprese edildiği ve bu artışın endotelin-1 ile indüklenen vasokonstriksiyonun

güçlenmesine aracılık edebileceği bildirilmiştir54.

Koroner bypass ameliyatı yapılan 15 hastadan izole edilen endoteli

uzaklaştırılmış internal torasik arterlerde serotonin ve histamin ile oluşturulan

kasılmalar hidroksifasudil ile belirgin olarak inhibe edilmiştir. Serotoninle indüklenen

kasılmalar süresince MBS (miyozin fosfatazın miyozin bağlayıcı alt ünitesi) ve CPI-17

(C-kinaz ile aktive olan fosfataz inhibitörü) fosforilasyonu belirgin olarak artmıştır.

Hidroksifasudil MBS fosforilasyonunu inhibe ederken CPI-17 fosforilasyonunu inhibe

etmemiştir49.

Vasküler düz kas hücrelerinin medyadan subendotelyal bölgeye göçü

(migrasyonu), balon anjiyoplasti ve ateroskleroz sonucu gelişen intimal kalınlaşmada

önemli rol oynar. Aktive olmuş trombosit ve hücrelerin bir ürünü olan lizofosfatidik

asid (LPA), düz kas hücre büyümesine ve çeşitli hücrelerin göçüne neden olur. LPA ve

trombosit kaynaklı büyüme faktörü aracılığıyla oluşan düz kas göçü Rho/Rho-kinaz

aracılığıyla olmaktadır. Bununla birlikte söz konusu göçte Rho/Rho-kinazın farklı alt

inici sinyal yolakları yer almaktadır. LPA aracılı düz kas göçü MLC fosforilasyonu ile

14

bağlantılı iken trombosit kaynaklı düz kas göçü MLC fosforilasyonundan bağımsız

olarak bulunmuştur50.

Rho/Rho-kinaz yolağı bozuklukları sıklıkla ölüme neden olan hipertansiyon,

vasküler spazm ve arteriyosklerozun patolojisinde yer almaktadır. Rho-kinaz

aktivitesini spesifik olarak inhibe eden probların kullanılması bu patolojik durumların

tedavisinde yararlı olacaktır. İlk olarak, Ca2+-bağımlı kastırıcı mekanizmaları hedef alan

Ca2+ kanal blokerlerine ek olarak, spesifik Rho-kinaz inhibitörleri ile Rho/Rho-kinaz

yolağının modüle edilmesi düz kası gevşetmek için gelişmiş bir metod olabilir. İkincisi,

birçok iskemik hastalık patogenezi ve vasküler bozuklukla bağlantılı olan ateroskleroz

geri dönüşümlüdür ve Rho-kinaz inhibisyonu ile tedavi edilebilir21.

2.4. Rho/Rho-kinaz yolağının korpus kavernozum dokusundaki fonksiyonu

Korpus kavernozum düz kasının kasılmasında, Rho’nun Ca2+ duyarlaşmasında

rol aldığı gösterilmiştir. Wang ve ark. direk olarak permeabilize edilmiş tavşan ve insan

korpus kavernozumunda Ca2+ duyarlaşmasını göstermişlerdir ve onu bu yolağın fazlaca

eksprese edilen moleküler komponenti olarak belirlemişlerdir. Yapılan bir çalışmada Y-

27632, fenilefrinle kastırılmış kavernozal şeritleri doza bağımlı bir şekilde gevşetmiştir.

Bu bulgular, kastrasyonu takiben Rho/Rho-kinaz yolağının korpus kavernozumda aktive

olduğu ve testosteron kaybı sonucu erektil disfonksiyona katkıda bulunduğunu telkin

etmektedir. Hem ROKα (ROCK II) hem de ROKβ izoformlarının korpus kavernozumda

varlığı gösterilmiştir51. İn vivo sıçan modelinde bir Rho kinaz inhibitörü olan Y-27632

korpus kavernozum basıncını artırmıştır, yani ereksiyona neden olmuştur52.

Yapılan bir başka çalışmada, Rho-kinaz enziminin fare vas deferensinda

eksprese edildiği gösterilmiş ve bu enzimin inhibitörü olan Y-27632’nin erektil

disfonksiyonun tedavisinde yararlı olabileceği bildirilmiştir34.

Diğer bir çalışmada, korpus kavernozumda NO aktivitesindeki artışın Rho-kinaz

aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Buna göre NO’nun erektil fonksiyonu kısmen

Rho/Rho-kinaz aracılı Ca2+ duyarlığını inhibe ederek sağladığı düşünülmektedir. Y-

27632 ile tedavi edilen deney hayvanlarından elde edilen korpus kavernozum

preparatları düşük voltajdaki elektriksel saha stimülasyonu ile potansiyalize edilmiş

cevaplar oluşturmuştur52. Bu bulgular Rho/Rho-kinaz inhibisyonunun NO aktivitesini

15

artırdığını gösterir. Ayrıca, diğer vasküler yataklardan elde edilen verilerle uyumlu

olarak, sıçan korpus kavernozumunda da Rho-kinazın α-adrenerjik ve endotelin-1 ile

indüklenen kasılmalara aracılık ettiği gösterilmiştir53.

16

3. GEREÇ ve YÖNTEM

Deneylerde Ç.Ü. Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezinden

(TIBDAM) sağlanan 8 haftalık balb/c albino türü erkek fareler kullanıldı. Çalışmalara

başlamadan önce Ç.Ü Tıp Fakültesi Etik kurulundan onay alındı. Deney hayvanları 12

saat karanlık 12 saat aydınlık ortamda, % 45-65 nem oranı 22±1 ˚C sabit oda ısısı

sağlanan Ç.Ü Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarında barındırıldı. Farelere yem ve

su kısıtlaması yapılmadı. Fareler kontrol ve ilaçlı olarak iki gruba ayrıldı. İlaçlı gruba

uygulanacak ilaç Rosuvastatin (Crestor) Astra Zeneca’dan temin edildi. Rosuvastatin

suda çözülerek 30 gün boyunca günde 1 kez yaklaşık 30 mg/kg dozunda enjektör

yardımı ile farelerin midelerine verildi. Kontrol grubuna sadece su uygulandı. 30 gün

sonunda fareler servikal dislokasyonla öldürüldü. Farelerin toraksı açılarak kalbin sağ

ventrikülünden enjektör ile 2 mililitre civarında kan alındı. Kanlar eppendorf içerisine

alınarak 2000 RPM’de 10 dakika santrifüj edildi. Üstte berrak renkte ayrılan serum

pipetle başka bir eppendorfa alınıp kan-lipid seviyeleri tayini için -30 0C’de

dondurularak saklandı.

Torasik aorta ve penis dokuları hızlı bir şekilde izole edildi. Dokular oda

sıcaklığında, içinde Krebs solüsyonu bulunan bir petri kabına alındı ve çevre

dokulardan temizlendi. Bir farenin torasik aortundan yaklaşık 3 mm kalınlığında

halkalar hazırlandı. Bir aorttan ortalama 4 preparat elde edildi. Her bir farenin

penisinden glans penis, üretra ayrılıp her iki korpus kavernozum dokusu arasındaki

fibröz septum kesildi. Tunika albuginea intakt bırakılarak iki ayrı korpus kavernozum

preparatı elde edildi.

3.1. Kullanılan kimyasal ajanlar

Rosuvastatin (Crestor) Astra Zeneca İlaç Sanayi ve Tic. Ltd. Şti. firmasından,

sodyum klorür, potasyum klorür, magnezyum sülfat, potasyum dihidrojen fosfat,

sodyum hidrojen karbonat, glukoz, magnezyum sülfat, kalsiyum klorür, glisin, tris base,

tris hidroklorür, tween 20, sodyum dodesil sülfat, metanol, 1-bütanol, amonyum

persülfat, akrilamid, TEMED, 2-merkaptoetanol, bromofenol blue, gliserol Merck

17

firmasından, L-fenilefrin hidroklorid, asetilkolin klorür, etilen dinitrit tetra asetik asid

disodyum, leupeptin, pepstatin, fenilmetilsülfonilflorid (PMSF), dithiothreitol (DTT),

benzamidin, sığır serum albumini, aktin primer, aktin sekonder antikorları Sigma

firmasından temin edildi. Y-27632 TOCRIS Bioscience, bradford protein assay

solüsyonu, nitroselüloz membran Biorad’dan, görüntüleme solüsyonu ECL plus

Amersham firmasından, Rock-2 primer, Rock-2 sekonder, p-MYPT primer, p-mypt

sekonder antikorları Santa Cruz‘dan alındı.

3.2. Organ banyosu deneyleri

İzole torasik aorta ringleri ve korpus kavernoz dokuları % 95 O2, % 5 CO2

karışımıyla sürekli olarak gazlandırılmış 37ºC’de PH’sı 7.4 olan Krebs solüsyonu (mM

olarak NaCl 118, KCl 4.8, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3 24, glikoz 11, MgSO4 1.2,

Na2EDTA 0.01) içeren izole organ banyosuna konularak izometrik transdusere asıldı.

Aort preparatlarına 0.3 G, korpus kavernozum preparatlarına ise 0.5 G ön gerim

uygulandı ve bir saatlik dengelenme süresi boyunca 20 dakikada bir Krebs solüsyonuyla

yıkandı. Dokuların tonusundaki değişiklikler “force displacement transducer”

(COMMAT, Ankara, Türkiye) aracılığı ile izometrik olarak ölçüldü ve Biopac kayıt

sistemi (Biopac systems Inc., CA, USA) ile veriler bilgisayar ortamında elde edildi.

Her iki gruptan (kontrol ve rosuvastatin grubu) elde edilen aorta ringleri ve

korpus kavernozum dokularında Rho-kinaz enzim etkinliğindeki olası değişiklikleri

kaydetmek amacıyla fonksiyonel organ banyosu deneyleri yapıldı. Bu amaçla, dokular

fenilefrinle (korpus kavernozum için 5x10-5 M, aorta için 10–6 M) kastırılarak, dokuların

selektif Rho-kinaz inhibitörü olan Y-27632 (10-9-10-5 M) ye verdiği gevşeme yanıtları

kaydedildi. Bir başka deney grubunda, fenilefrine ait doz cevap eğrilerinin oluşturmak

amacıyla, dokular, fenilefrin kasılmalarından önce, KCl (80 mM) ile kastırıldı ve

kasılma maksimum düzeye erişince taze Krebsle yıkanarak ortamdaki KCl

uzaklaştırıldı. Bu işlemden sonra, dokular 40 dakika taze Krebste inkübasyona bırakıldı.

Bu sürenin sonunda, dokuların fenilefrin (10-8-10-4 M) ile doza bağımlı kasılma yanıtları

elde edildi ve taze Krebsle yıkanarak 40 dakika inkübasyona bırakıldı. Daha sonra,

dokular fenilefrin (10-6 M) ile kastırıldı ve kasılma maksimumuna ulaşıldığında; sıvı

azotla dondurulup, Rho-kinaz aktivasyonun bir göstergesi olan p-MYPT düzeylerinin

18

Western blot analizleri ile doğrudan tayini için saklandı. Ayrı bir deney grubunda, KCl

ile oluşturulacak kasılma cevapları kaydedilmeden önce, KCl kasılmalarını

değerlendirmek için, dokular fenilefrin (10-4 M) ile önceden kastırıldı. Bundan sonra,

dokular taze Krebs solusyonu ile yıkanarak 40 dakika inkübasyona bırakıldı. Bu

sürenin sonunda, sonra KCl (10-80 mM) ye verilen konsantrasyona bağımlı kasılmalar

kaydedildi. Bu işlemden sonra dokular taze krebsle yıkanarak 40 dakika inkübasyona

bırakıldı. Daha sonra, bu dokulardaki enzim aktivasyonunu tespit etmek amacıyla,

preparatlar fenilefrin (10-6 M) ile kastırıldıktan sonra sıvı azotla dondurulup Western

blot analizleriyle p-MYPT düzeylerinin tayini için saklandı.

3.3. Western blot deneyleri

3.3.1. Homojenizasyon

Proteaz enzim inhibitörü içermeyen stok solüsyon (TRIS-HCl 50mM, NaCl

400mM, EGTA 2mM, EDTA1mM, PH:7.5) hazırlandı. Bu stok solüsyon içerisine DTT

(1mM), PMSF (10µM), leupeptin (10µg/ml), pepstatin (1 µg/ml), benzamidin (1mM )

eklendi. Her bir doku üzerine 300µl soğuk homojenizasyon solüsyonu eklenerek

homojenize edildi. Eppendorf içerisine alınan homojenatlar 10.000 RPM’de 10 dakika

santrifüj edildi. Üstte ayrılan kısımlar (süpernatantlar) alındı, alttaki çökeltiler (pelletler)

atıldı.

3.3.2. Protein miktar tayini

Bradford yöntemi ile protein miktar tayini yapıldı. Sığır serum albumini

(1µg/ml) kullanılarak 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10 (µg/ml) konsantrasyonlarda standart hazırlandı.

Her bir örnekten 10 µl alınarak distile su ile 100 µl’ye tamamlandı. Standart ve

örneklerin üzerine 1ml bradford solüsyonu eklendi ve vorteksle karıştırıldıktan sonra

spektrofotometrede 595 nanometre dalga boyunda absorbans miktarları manuel olarak

ölçüldü. Prism programında çizilen standart eğriye göre protein miktar tayini µg/µl

cinsinden yapıldı.

19

3.3.3 Western-blot

%10’luk SDS poliakrilamid jel hazırlanarak önceden yerleştirilmiş olan camların

arasına döküldü. Üzerine 1-bütanol dökülerek alt jelin donması için 45 dakika beklendi.

Bu sürenin sonunda, camlar arasındaki bütanol pastör pipeti yardımıyla distile su ile

yıkandı. Üst jel (dH2O, %30 Akrilamid, 1M Tris (Ph 6.8) 62mM, %10SDS,

%10Amonyum persülfat, TEMED) hazırlandı. Alt jelin üzerine döküldü, 10 kuyucuklu

taraklar takıldı. 30 dakika beklendikten sonra taraklar çıkarıldı. Protein homojenatları,

sample buffer (TRIS-HCL 0.125M, SDS 0.14M, gliserol % 20, bromofenol blue

0.03mM, 2-merkaptoetanol 0.2mM) ile eppendorfların içerisinde eşit miktarda

karıştırıldıktan sonra eppendorflar 5 dk. kaynar suda bekletildi. Bu işlemden sonra,

hesaplanan miktarda protein jel kuyucuklarına pipet yardımıyla yüklendi. Elektroforez

tankı içerisine running solüsyonu (10X running buffer: 0.025M Trıs base, 0.192M

glisin, %0.1 SDS, distile su) doldurularak üst jele 50Volt, alt jele 150 volt uygulanarak,

4-8 0C’de dikey elektroforez yapıldı. Bio Rad minijel elektroforez sistemi kullanıldı.

İşaret boya olarak kullanılan bromfenol mavisi jelin alt ucuna ulaştığında elektroforez

işlemi sonlandırıldı. Jeller camlardan ayırıldı. Özel Western delikli transfer sandviçi

içine sırayla sünger, filtre kağıdı, jel, nitrosellüloz membran, filtre kağıdı, sünger olacak

sekilde konularak sandviç kapatıldı. Elektroblot solüsyonu (100ml 10X running buffer

+700ml distile su +200ml metanol) ile dolu tank içerisinde 4-8 C ‘de 90 miliamperde 16

saatte elektroblot işlemi yapıldı. Sandviç açılarak membran ayrıldı, 1 saat kapatıcı

(blocking) solüsyonu ile muamele edilerek nonspesifik proteinlerin bağlanması

sağlandı, TBS-T solüsyonu (tris-base, NaCl, tween-20) ile yıkandı ve primer antikorla 3

saat muamele edildi. Primer antikorun bağlandığı proteinleri belirlemek amacıyla,

örnekler primer antikora özgü peroksidaz enzimi ile konjuge sekonder antikorla

muamele edildi. TBS-T ile yıkanan membranların görüntüleme solüsyonu (ECL plus)

ile florasan ışık vermesi sağlandı. Membrandaki bu ışıma ile karanlık odada negatif film

yakıldıktan sonra, filmler banyo edildi. Protein bant görüntüleri, görüntüleme sistemi

ile, bilgisayar ortamına aktarıldı ve İmage Mode programı kullanılarak bantların

yoğunluğu ölçüldü.

3.4. Sonuçların değerlendirilmesi

20

Dokuların gevşeme yanıtları kasılmaların yüzdesi olarak ifade edildi. Kasılmalar

ise KCl veya fenilefrin kasılmalarının %’si olarak ifade edildi ve standart hataları ile

birlikte (± SEM) gösterildi. Western-blot tekniği ile elde edilen bantların analizi için

Scion İmage programı kullanıldı. Western blot deneylerinde eşitmiktarda protein

yüklenildiğinin kontrolü için ROCK2 ve p-mypt bantlarının dansiteleri aktin bantlarının

dansitelerine oranlandı. Rock2/aktin, p-mypt/aktin bant dansite oranlarının istatistiksel

analiz için Graph-Pad Prism (CA, USA) istatistik programı kullanılarak karşılaştırıldı.

Grafiklerin çizimi ve istatistiksel analiz için bilgisayar ortamında Graph-Pad Prism (CA,

USA) programı kullanıldı. İstatistiksel karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi

(ANOVA) ve post hoc testi olarak Bonferoni kullanıldı. Ayrıca, gerektiğinde, iki

ortalama arasındaki farkı karşılaştırmak için student t testinden faydalanıldı. 0.05’den

küçük P değerleri anlamlı olarak kabul edildi.

21

4. BULGULAR

4.1. Kontrol ve statin uygulanan farelerin kan lipid seviyeleri

Farelere günde bir kez 30 gün boyunca 30 mg/kg rosuvastatin verilmesiyle

deneklerin 30. gündeki kan lipid düzeyleri ile ilgili veriler total kolesterol, düşük

dansiteli lipoprotein (DDL), yüksek dansiteli lipoprotein (YDL), trigliserid, çok düşük

dansiteli lipoprotein (Ç-DDL) ölçüldüğünde bunlardan sadece total kolesterolün anlamlı

olarak azaldığı görüldü (Tablo III).

Tablo III. Kontrol ve rosuvastatin uygulanan farelerin 30. günlerindeki kan lipid düzeyleri.

Kan lipid düzeyi (mg/dl)

Total

kolesterol DDL YDL Trigliserid Ç-DDL

Kontrol grup n= 26 79.8±5.6 10.7±1.8 54.0±2.6 101.6±12.6 20.3±2.5

Statin uygulanan grup n= 26 67.0±2.0* 9.8±1.3 78.3±26.0 103.9±9.1 20.7±1.8

DDL : Düşük dansiteli lipoprotein, YDL: Yüksek dansiteli lipoprotein, Ç-DDL: Çok düşük dansiteli

lipoprotein. Değerler ortalama±ortalamanın standart hatası olarak verilmiştir. *: p<0.05.

4.2. Torasik aorta bulguları


aortalarına ait fenilefrin kasılmaları

Kontrol ve rosuvastatin uygulanan farelerin aortik halkalarında oluşturulan

fenilefrin (10-8-10-4 M) kasılmaları birbirleriyle karşılaştırıldığında, rosuvastatin

uygulanan grubtan elde edilen fenilefrin kasılmaları kontrole göre farklı değildi (Şekil

6). Ayrıca, her iki grubun fenilefrin kasılmalarının EC50 değerleri arasında da istatiksel

olarak anlamlı bir fark yoktu.

22

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -30

30

60

90

120

150Kontrol

Rosuvastatin

Log [Fenilefrin] M

% K

asıl

ma

Şekil 6. Kontrol ve statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen

torasik aorta halkalarında fenilefrin (10-8-10-4 M, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-

yanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmasının %’si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel

analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı.


aortalarına ait KCl kasılmaları

Bu deney grubunda, KCl’nin 40 ve 80mM konsantrasyonlarında ortaya çıkan

kasılma cevaplarının kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı

gözlenmiştir (Şekil 7).

23

0

50

100

150

200

250

300

350

Kontrol

Rosuvastatin

10 20 40 80 mM KCl

******

% K

asıl

ması


torasik aorta halkalarında KCl (10-80 mM, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-yanıt bar

grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmasının %'si olarak ifade edilmiştir.

İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi

kullanıldı. ***: P< 0.001.


aortalarına ait Y-27632 gevşemeleri

Rho-kinaz enziminin selektif bir inhibitörü olan Y-27632 (10-9-10-5 M) hem

kontrol hem de rosuvastatin uygulanan farelerin aortik halkalarında konsantrasyona

bağımlı gevşemelere neden oldu. Ancak, rosuvastatin alan grupta, Y-27632’nin

oluşturduğu gevşetici cevapların istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı gözlendi

(Şekil 8).

24

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -30

30

60

90

120

150Kontrol

Log[Fenilefrin]M

Rosuvastatin

*

Log [Y27632] M

% G

evşem

e

Şekil 8. Kontrol ve statin (30 mg/kg rosuvastatin, 30 gün boyunca) uygulanan farelerden izole edilen

torasik aorta halkalarında Y-27632 (10-9-10-5 M, n=10)’ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler

fenilefrin kasılmasının yüzdesi olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü

varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05.

4.2.4. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan

çeşitli vazoaktif ajanlara ait pEC50 değerleri

Rosuvastatin uygulanan grubun aortik halkalarında fenilefrinin EC50 değerleri

kontrole göre farklı değilken, KCl’ye ait EC50 değerleri kontrole göre istatistiksel

olarak anlamlı bir şekilde artmıştı. Ayrıca, Y-27632’nin EC50’si kontrole göre azalmıştı

(Tablo IV).

25

Tablo IV. Torasik aorta ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli vazoaktif ajanlara ait

pEC50 değerleri.

pEC50: -LOG(EC50).


aortalarında yapılan Western blot analizleri

Western blot deneylerinden elde edilen bulgular incelendiğinde, 30 gün boyunca

rosuvastatin uygulanan farelerin torasik aortasında ROCK2 enzim expresyonu kontrole

göre anlamlı değildi (Şekil 9). Ayrıca, rosuvastatin alan farelerden izole edilip

fenilefrinle kastırılmış dokularda Rho-kinaz enzim aktivitesinin bir ölçüsü olan p-

MYPT düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmedi (Şekil 10).

pEC50 değerleri

Kontrol 30 mg/kg Rosuvastatin

Fenilefrin 6.82±0.05 (n=8) 6.80±0.05 (n=10) p>0.05

KCl 2.62±0.07 (n=10) 2.10±0.05 (n=10) * p<0.05

Y-27632 6.31±0.03 (n=10) 6.76±0.01 (n=10) *** p<0.001

26

Şekil 9. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin torasik aortasında ROCK2

expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için

student t testi kullanılmıştır (n=5).

27

Şekil 10. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan farelerin fenilefrinle kastırılmış torasik

aortasında p-MYPT seviyeleri. K: kontrol, S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir.

İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5).

4.3. Korpus kavernozum bulguları


kavernozum dokularına ait fenilefrin kasılmaları

Kontrol ve Rosuvastatin uygulanan farelerin kavernozal dokularında fenilefrin

(10-8-10-4 M) kasılmaları KCl (80 mM) kasılmalarının %’si olarak değerlendirilip

karşılaştırıldığında, her iki grup arasında anlamlı bir farklılık bulunamadı (Şekil 11).

28

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -30

50

100

150

200

250

300Kontrol

Log[Fenilefrin]M

Rosuvastatin

Log [Fenilefrin] M

% K

asıl

ma


korpus kavernozum dokularında fenilefrin (10-8-10-4 M n=10) kasılmalarına ait

konsantrasyon-yanıt eğrileri. Kasılmalar KCl (80mM) kasılmalarının %’si olarak ifade

edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post

hoc testi kullanıldı.


kavernozum dokularına ait KCl kasılmaları

Bu deney grubunda, KCl (10-80 mM) kasılmaları fenilefrin (10-4 M)

kasılmasının %’si olarak ifade edildiğinde kontrol ve Rosuvastatin uygulanan gruplar

arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamadı (Şekil 12).

29

0

25

50

75

100

Kontrol

Rosuvastatin

10 20 40 80 mM KCl

% K

asıl

ma


korpus kavernozum dokularında KCl (10-80 mM, n=10) kasılmalarına ait konsantrasyon-

yanıt bar grafikleri. Kasılmalar fenilefrin (10-4 M) kasılmalarının %’si olarak ifade

edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Bonferroni post

hoc testi kullanıldı.


kavernozum dokularına ait Y-27632 gevşemeleri

Bu deney grubunda, kavernozal preparatları ön kastırmak için α-1 agonisti

fenilefrin (5x10-5 M) kullanıldı. Rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan farelerden

izole edilen ve fenilefrin ile kastırılan kavernoz dokularda Y-27632 (10-9-10-5 M) ile

doza bağımlı gevşemeler oluşturuldu. Rosuvastatin uygulanan farelerin kavernoz

dokularında Y-27632’ye verilen gevşeme yanıtlarının istatistiksel olarak anlamlı bir

şekilde arttığı gözlendi (Şekil 13).

30

-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -30

30

60

90

120

150Kontrol

Log[Fenilefrin]M

Rosuvastatin

*

Log [Y27632] M

% G

evşem

e

Şekil 13. Statin (Rosuvastatin 30 mg/kg, 30 gün boyunca) uygulanan ve uygulanmayan farelerin

kavernoz dokularında Y-27632(10-9-10-5 M, n=10)’ye ait gevşeme eğrileri. Gevşemeler

fenilefrin kasılmasının %’si olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel analiz için tek yönlü varyans

analizi (ANOVA) ve Bonferroni post hoc testi kullanıldı. *: P< 0.05.

4.3.4. Korpus kavernozum ile yapılan organ banyosu deneylerinde

kullanılan çeşitli ajanlara ait pEC50 değerleri

Rosuvastatin uygulanan farelerin korpus kavernozum dokularından elde edilen

fenilefrin’e ait EC50 değeri, karşılaştırıldığında, bu ilacın uygulanılmadığı farelerden

elde edilene göre anlamlı olarak arttığı görüldü. Buna karşın, rosuvastatin uygulanan ve

uygulanmayan farelerden izole edilen korpus kavernozum dokularında KCl’nin

EC50’sinde bir değişiklik görülemedi. Ayrıca, Y-27632’nin EC50’si rosuvastatin

uygulanmayan farelere göre anlamlı bir şekilde azaldı (Tablo V).

31

Tablo V. Korpus kavernozum ile yapılan organ banyosu deneylerinde kullanılan çeşitli ajanlara ait

pEC50değerleri..

pEC50: -LOG(EC50).


kavernozum dokularında yapılan Western blot analizleri

Western blot deneylerinde, 30 gün boyunca rosuvastatin uygulanan farelerin

kavernoz dokularında ROCK2 expresyonu kontrole göre, istatiksel olarak

karşılaştırıldığında, anlamlı değildi (Şekil 14). Ayrıca, fenilefrinle kastırılmış dokuların

p-MYPT seviyeleri de farklı değildi (Şekil 15).

pEC50 değerleri (M)

Kontrol 30 mg/kg Rosuvastatin

Fenilefrin 5.69±0.008 (n=8) 5.55± 0.01 (n=10)*** p<0.001

KCl 2.62± 0.06 (n=10) 2.74± 0.07 (n=10) p>0.05

Y-27632 6.03± 0.02 (n=10) 6.67± 0.03 (n=10)*** p<0.001

32

Şekil 14. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan ve uygulanmayan (Kontrol) farelerin

korpus kavernozum dokularındaki ROCK2 expresyonu. K: kontrol, S: rosuvastatin alan

grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı (n=5).

33

Şekil 15. 30 gün boyunca rosuvastatin (30 mg/kg) uygulanan ve uygulanmayan (Kontrol) farelerin

fenilefrin ile kastırılımış korpus kavernozum dokularındaki p-MYPT seviyeleri. K: kontrol,

S: rosuvastatin alan grubu temsil etmektedir. İstatistiksel analiz için student t testi kullanıldı

(n=5).

34

5. TARTIŞMA

Bu çalışmada, rosuvastatin uygulanan ve uygulanmayan (kontrol) farelerin

torasik aorta ve korpus kavernozum dokularında Rho-kinaz inhibitörü olan Y-27632’ye

verilen gevşeme yanıtları ve KCl’ye veya bir adrenoseptör agonisti olan fenilefrine

verilen kasılma cevapları incelendi. Diğer taraftan bu hayvanların aorta ve korpus

kavernozumunda, Rho-kinaz enzim ekspresyon ve aktiviteleri Western-blot yöntemiyle

araştırıldı. Deney hayvanlarının statinle beslenildiğinin tespiti için kan-lipid düzeylerine

bakıldı. Buna göre kan serumundaki total kolesterol düzeyleri statin uygulanan grupta

67.0±2.0 mg/dl, kontrol grubunda 79.8±5.6 mg/dl olarak bulundu (P<0.001).

Çalışmanın bulguları test edilen her iki doku için aşağıda tartışılmıştır.

Fenilefrinle α1 reseptörler aktive edildiğinde, heterotrimerik G proteinlerinden

Gα12/13 ve Gαq proteinleri aracılığı ile Rho proteinleri ve fosfolipaz C enzimi aktive

olur. Bunun sonucunda, fosfolipaz C’nin aktivasyonu ile inositol-3-fosfat (IP3)

düzeyleri artar, bu da sarkoplazmik retikulumdan kalsiyum (Ca2+) salınımını arttırarak

hücre içi Ca2+ seviyelerinin artışına neden olur. Buna bağlı olarak Ca2+-kalmodulin

kompleksi oluşur. Ca2+-kalmodulin kompleksi miyozin hafif zincir kinazı aktive ederek

miyozin hafif zincirini fosforile eder. Sonuçta, düz kas kontraksiyonu gerçekleşir. Bu

kontraksiyon miyozin hafif zincirinin miyozin fosfataz tarafından defosforilasyonu ile

sona erdirilir41. Miyozin fosfatazın; miyozin bağlayan alt ünite (miyosin binding

subunit, MBS veya MYPT olarakta bilinir), 37 kDA tip 1 fosfataz katalitik alt ünite ve

non-katalitik alt ünite olmak üzere üç tane alt ünitesi vardır. Rho-kinaz enzimi miyozin

fosfatazı fosforile etmek suretiyle inhibe eder. Bu enzimin düz kaslarda fenilefrin,

asetilkolin, serotonin ve yüksek düzeyde ekstraselüler potasyum klorür (KCl) ile aktive

edildiği gösterilmiştir55-60. Bundan başka, hücre membranındaki RhoA proteinin Ca2+

duyarlaşmasında rol aldığı ve bu protein aktive edildiğinde sitosolden membrana

transloke olduğu bilinmektedir. Yapılan bir çalışmada statinlerin RhoA proteinin

geranilasyonunu engelleyerek hücre membranındaki aktivitesini azalttığı gösterilmiştir9

Rho-kinaz enziminin aktivasyonunda RhoA’nın rolü bilinmektedir. Bu yüzden Rho

proteininin statinler tarafından aktivitesinin azaltılması Rho-kinaz enziminin

ekspresyonunu ve aktivasyonunu etkileyebilir. Rho-kinaz enziminin Y-27632 ve fasudil

35

ile selektif olarak inhibe edildiği önceden çeşitli dokularda yapılan çalışmalarda

gösterilmiştir33,34. Çalışmamızda, statinle muamele edilmiş farelerden izole edilerek

fenilefrinle kastırılmış torasik aorta ve korpus kavernozum dokularında, bir Rho-kinaz

enzim inhibitörü olan Y-27632 ye verilen fonksiyonel gevşeme yanıtlarının arttığı

görülmüştür. Bu bulgular, dokuların kasılma mekanizmasında Y-27632’ye karşı bir

duyarlılık artışı olduğunu ve bu duyarlılıktaki artışın Rho-kinaz enziminin

ekspresyonundaki ve/ya aktivasyonundaki bir azalmadan kaynaklanabileceğini telkin

etmektedir. Ayrıca, torasik aortadan kaydedilen KCl kasılmalarının ve kavernoz

dokudan elde edilen fenilefrin kasılmalarının kontrole göre anlamlı bir şekilde azaldığı

gözlenmiştir. KCl ile oluşturulan kasılmaların ROCK inhibitörlerine (Y-27632 ve

fasudil) de duyarlı olabileceği Büyükafşar ve arkadaşlarının yaptığı çalışmalarda

gösterilmiştir34,. Bu bulgular da kronik statin uygulamasının farelerde Rho/ROCK

sinyal ileti yolağında bir modülasyona neden olabileceği görüşünü desteklemektedir.

Ancak, statin uyguladığımız farelerin torasik aorta ve kavernoz dokularında yapılan

Western blot analizlerinden elde ettiğimiz bulgular Rho-kinaz enzim ekspresyon

düzeylerinin kontrole göre farklı olmadığını göstermektedir. Bundan başka, fenilefrinle

stimüle edilen izole fare dokularında Rho-kinaz aktivitesinin bir göstergesi olan

fosforile MYPT düzeylerinde de anlamlı bir değişiklik görülmemiştir. Wester blot

analizlerinden elde ettiğimiz bu bulgular organ banyosu deneyleriden elde ettiğimiz

bulgularla örtüşmemektedir.

Torasik aortada KCl kasılmalarının baskılanması hücre membranındaki RhoA

proteininin aktivitesinin azalmasından kaynaklanabilir. Rho-kinaz membranda Rho

proteinlerine bağlanarak aktive olur. Bu enzimin inhibitörü olan Y-27632 adı geçen

enzimin ATP bağlanma bölgesine bağlanarak onun aktivitesini inhibe eder33. Her iki

dokuda Rho-kinaz enzimin ekspresyonu ve aktivitesinde bir değişiklik görülmemiştir.

Ancak, Y-27632’ye verilen fonksiyonel cevapların arttığı kaydedilmiştir. Bu durum

Rho-Rho-kinaz sinyalizasyon kaskatında Rho proteinlerinin aktivitesinin azalmasından

kaynaklanabilir.

MYPT’in fosforilasyonunda, miyotonik distrofi protein kinaz (DMPK), p21-

aktivated protein kinaz (PAK), protein kinaz C (PKC), protein kinaz N (PKN), integrin-

linked kinaz (ILK), gibi diğer bazı enzimlerin de rolü vardır. Çalışmamızda

rosuvastatinle muamele edilmiş farelerde fenilefrin veya KCl’ye verilen kasılma

36

yanıtlarında bir duyarlılık azalması, Y-27632’ye verilen gevşeme yanıtlarında ise bir

duyarlılık artışının görülmesine rağmen, her iki dokuda Rho-kinaz enzim aktivitesinin

belirleyicisi olan fosforile miyozin fosfataz (p-MYPT) düzeylerinde beklenen düşme

olmamıştır, bu durum adı geçen enzimlerin aktivitesindeki olası değişiklikler tarafından

kompanse edilmiş olabilir. Ayrıca, ROCK aktivitesini değerlendirmek için

kullandığımız p-MYPT-1 antikoru, miyozin fosfatazın 695. serin aminoasidinin

fosforilasyonuna özgüdür. P-MYPT-1‘in diğer amino asit rezidülerinden fosforile olmuş

seviyeleri bilinmemektedir. Dolayısıyla diğer aminoasidlerin fosforilasyonuna özgü

antikorların da (örneğin, Thr-696, Ser-903, Thr-853 gibi) test edilmesi gerekmektedir.

Bunun yanında rosuvastatinin kronik uygulanması sonucunda KCl ve fenilefrine bağlı

olarak oluşan kasılmaya iştirak eden iyon kanalları veya iyon transportu rosuvastatin

uygulamasıyla modüle edilmiş olabilir. Ancak, bunun araştırılması gerekir.

Rho/ROCK yolağında değişiklik görülmemesinin bir başka nedeni de

çalışmamızın hiperkolesterolemik değil sağlıklı hayvanlarda yapılmış olmasından

kaynaklanabilir. Çünkü statin uygulamasına bağlı olarak Rho/ROCK sinyalizasyon

yolağındaki ortaya çıkabilecek olası değişiklikler sağlıklı bir endotel doku aktivitesi

tarafından kompanse edilmiş olabilir.

Sonuç olarak, sağlıklı farelerde, kronik rosuvastatin uygulanması kavernoz

dokuda α1 reseptör agonisti olan fenilefrin kasılmalarına, torasik aortada KCl

kasılmalarına olan duyarlılığın azalmasına ve her iki dokuda da bir ROCK inhibitorü

olan Y-27632’ye duyarlılık artışına neden olmuştur.

37

6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER

Statinlerin, vasküler sistem üzerine olumlu etkilerinde kolesterol düşürücü

etkilerinden başka mekanizmaların da rol oynadığı bildirilmiştir. Statinlerin kolesterol

düşürücü tesirlerinden başka; NOS’un modülasyonu, lökosit ve trombositlerin göçünün

engellenmesi, vazodilatasyon, antioksidan etkinlikleri, anjiyotensin II’nin neden olduğu

kalp hipertrofisini ve fibrozisini engellemeleri, antiinflamatuar etkileri ve hücre

duvarında sinyal ileti sisteminde rol alan küçük G proteinlerinin modülasyonu gibi

kardiovasküler sisteme yararlı etkileri sıralanabilir. Statinlerin bu etkileri hangi

mekanizmalarla yaptığı açık değildir ve büyük ilgi uyandırmaktadır. Bu nedenle,

çalışmamızda, bir statin olan rosuvastatinin kronik uygulanmasıyla farelerin torasik

aorta ve korpus kavernozum düz kaslarında ortaya çıkabilecek Rho-kinaz enzim

ekspresyonu ve aktivitesindeki olası değişiklikleri hem izole organ banyosu

deneyleriyle fonksiyonel olarak hem de Western blot analizleriyle doğrudan

değerlendirmeyi amaçladık.

Çalışmamızın sonuçları, kronik olarak rosuvastatin uygulanmış farelerden izole

edilen korpus kavernozum dokusunda, bu uygulamanın, fenilefrine verilen kasılma

yanıtlarında bir baskılanmaya ve torasik aortada KCl’ye verilen kasılma yanıtlarında bir

azalmaya neden olduğunu göstermektedir. Bundan başka rosuvastatin uygulaması her

iki dokuda Rho-kinaz enziminin selektif inhibitörü olan Y-27632’ye verilen gevşeme

yanıtlarında artmaya neden olmuştur. Ancak Western blot analizlerinde elden ettiğimiz

bulgular, statin uygulanmasına bağlı oluşan düz kas reaktivitesindeki bu değişikliklerin

Rho-kinaz ekspresyonu ve aktivitesinden bağımsız olduğunu göstermektedir ki, bu çok

ilginçtir. Bu etki farklı mekanizmaları içerebilir. Bunun anlaşılması bu ilaçların

kardiyovasküler sistem hastalıklarının profilaksisinde ve/ya tedavisindeki önemini

arttırabilir.

38

7. KAYNAKLAR

1. Napoli PD, Taccardi AA, Gioacchino LD. Regulation of endothelial function in coronary microcirculation by HMG-CoA reductase drugs. Ital Heart J 2002; 3 (Suppl 4): 20S-23S

2. Laufs U, Gertz K, Dirnagl U, Böhm M, Nickenig G, Endres M. Rosuvastatin, a new HMG-CoA reductase inhibitor, upregulates endothelial nitric oxide synthase and protects from ischemic stroke in mice. Brain Research 2002; 942:23–30

3. Denoyellea C, Albaneseb P, Uzan G, Honga L, Vanniera JP, Soriac J, Soria S. Molecular mechanism of the anti-cancer activity of cerivastatin, an inhibitor of HMG-CoA reductase, on aggressive human breast cancer. cells Cellular Signalling 2003; (15): 327–338

4. Doğan BSO, Topal G, Takır S, Alp Fİ, Kaleli D, Özdemir O. Relaxant effects of pravastatin, atorvastatin and cerivastatin on isolated rat aortic rings. Life Sciences 2005; (76): 1771–1786

5. Imaeda A, Kaneko T, Aoki T, Kondo Y, Nakamura N, Nagase H, Yoshikawa T. Antioxidative effects of fluvastatin and its metabolites against DNA damage in streptozotocin-treated mice. Food and Chemical Toxicology 2002; (40): 1415–1422

6. Naito Y, Katada K, Takagi T, Tsuboi H, Kuroda M, Handa O, Kokura S, Yoshida N, Ichikawa H, Yoshikawa T. Rosuvastatin reduces rat intestinal ischemia-reperfusion injury associated with the preservation of endothelial nitric oxide synthase protein. World J

Gastroenterol 2006; (13):2024-2030

7. Weitz-Schmidt G. Statins as anti-inflammatory agents. Trends Pharmacol Sci. 2002; (10):482-486.

8. Weitz-Schmidt G, Welzenbach K, Brinkmann V, Kamata T, Kallen J, Bruns C, Cottens S, Takada Y, Hommel U. Statins selectively inhibit leukocyte function antigen-1 by binding to a novel regulatory integrin site. Nature Med 2001;(7): 687-692.

9. Takemoto M, Liao JK. Pleiotropic effects of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;(2):1,1712-1719.

10. Neuhaus O, Stüve O, Zamvil SS, Hartug HP. Are statins a treatment option for multiple sclerosis? Lancet. Neurol 2004;(3):369-371.

11. Amano M, Fukato Y, Kaibuchi K. Regulation and function of Rho-associated kinase. Exp

Cell Res 2000; (261), 44-51.

12. Kimura K, Ito M, Amano M, et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 1996;(273):245-248

13. Kaneko T, Amano M, Maeda A, et al. Identification of calponin as a novel substrate of Rho-

39

kinase. Biochem Biophys Res Commun 2000; (273): 110-116.

14. Miao L, Dai Y, Zhang J. Mechanism of RhoA/Rho kinase activation in endothelin-1-induced contraction in rabbit basilar artery. Am J Physiol 2002; (283), 983-989..

15. Custodis F, Eberl M, Kitler H, Böhm M, Laufs U. Association of RhoGDIa with Rac1 GTPase mediates free radical production during myocardial hypertrophy. Cardiovascular

Research 2006; (71): 2, 342-351

16. Grundy SM. HMG-CoA reductase inhibitors for treatment of hypercholesterolemia. N Engl J Med 1988; (319): 24-33.

17. Kayaalp SO. Rasyonel tedavi yönünden tıbbi farmakoloji 2. Cilt, 8. baskı, Ankara, Feryal matbaacılık San. Tic. Ltd. Şti., 1998.

18. Sotomayor MAA, Herrera MD, Marhuenda E & Andriantsitohaina R. Characterization of endothelial factors involved in the vasodilatory effect of simvastatin in aorta and small mesenteric artery of the rat. Bjp 2000; (131): 1179-1187.

19. Madaule P.,Axel R. A novel ras-related gene family. Cell 1985;(41):31-40.)b

20. Takai Y, Sasaki T, Matazaki T. Small GTP-Binding Proteins. Physiol Rev 2001; (81): 1, 153-208.

21. Fukata Y, Amano M and Kaubuchi K. Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of non-muscle cells. Trends Pharmacol Sci 2001; (22): 1, 32-39.

22. Miao L, Calvert JW, Tang J et al. Upregulation of small GTPase RhoA in the basilar artery from diabetic (mellitus) rats. Life Sci 2002; (71): 1175-85.

23. Boettner B, Aelst LV. The role of Rho GTPases in disease development. Gene 2002; (286): 155-174.

24. Casey PJ, Seabra MC. Protein prenyl transferases. J Biol Chem 1996;(271):5289-5292.

25. Bishop AL, Hall A.Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J. 2000; (348):241-255

26. Olofsson B. Rho guanine dissociation inhibitors: pivotal molecules in cell signaling. Cell

Signal 1999;(11):545-554

27. Zheng Y. Db1 family guanine nucleotide Exchange factors. Trends Biochem Sci. 2001; (26):724-732.

28. Sah VP, Seasholtz TM, Sagi SA, Brown JH. The role of Rho in G-protein coupled receptor signal transduction. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000;(40):459-489.

40

29. Wettschureck N, Offermans S. Rho/Rho-kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology. J. Mol. Med; 2002; (80):629-638

30. Yoshioka K, Matsumura F, Akedo H, Itoh K. Small GTP-binding protein Rho stimulates the actomyosin system, leading to invasion of tumor cells. J Biol Chem, 1998; (273): 146-154.

31. Hirano K. Current topicks in the regulatory mechanism underlying the Ca+2 sensitization of the contractile apparatus in vascular smooth muscle. Journal of Pharmacological Sciences. 2007; (104): 109-115

32. Büyükafşar K, Levent A. Involvement of Rho/Rho-kinase signalling in the contractile activity and neurotransmitter release in the mouse gastric fundus. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 2003; (303), 777– 781.

33. Büyükafşar K, Ün İ. Effects of the Rho-kinase inhibitors, Y-27632 and fasudil on the corpus cavernosum from diabetic mice. Eur. J. Pharmacol. 2003; (472): 235-238.

34. Büyükafşar K, Levent, A, Ark M. Expression of Rho-kinase and its functional role in the contractile activity of mouse vas deferens. Br. J. Pharmacol. 2003; (140): 743– 749.

35. Amano M, Fukata Y and Kaibuchi K. Regulation of cytoskeleton and cell adhesion by the small GTPase Rho and its targets. Trends Cardiovasc Med 1998; (8): 162-168.

36. Buhl AM, Johnson NL, Dahanasekaran N, et. al. G alpha 12 and G alpha 13 stimulate Rho-dependent stress fiber formation and focal adhesion assembly. J Biol Chem, 1995;(270):24631-24634

37. Dhanasekaran N, Dermott JM. Signaling by the G12 class of G proteins. Cell Signal, 1996;(8):235-245.

38. Gohla A, Harhammer R, Schultz G. The G-protein G13 but not 12 mediates signaling from lysophosphatidic acid receptor via epidermal growth factor receptor to Rho. The J Biol Chem, 1998;(273):4653-4659.

39. Hırata K, Kıkuchı A, Sasakı T, Kuroda S. Involvement of rho p21 in the GTP enhanced calcium ion sensitivity of smooth muscle contraction. J Biol Chem, 1992;(267):8719-8722.

40. Miura Y, Kıkuchı A, Musha T, et al. Regulation of morphology by rho p21 and its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rho GDI) in Swıss 3T3 cells. J Biol Chem, 1993;(268):510-515.

41

41. Mukai Y, Shimokawa H, Mataba T et al. Involvement of Rho-kinase in hypertansive vascular disase–a novel therapeutic target in hypertension. The FASEB J 2001 10.1096/fj.00-0735

42. Chitaley K, Webb RC. Nitric oxide induces dilation of rat aorta via inhibition of Rho-kinase signaling. Hypertension 2002; (39): 2, 438-442.

43. Chitaley K, Webb RC. Microtubule depolymerization facilitates contraction of rat aorta via activation of Rho-kinase. Vasc Pharmacol, 2002;(38):157-161.

44. Coussin F, Scott RH, Wise A. Et al. Comparision of sphingosine 1-phosphate-induced intracellular signaling pathways in vascular smooth muscles differential roles in vasoconstriction. Circ Res 2002;( 91): 151-157.

45. Shirao S, Kashiwagi S, Sato M, Et al. Sphingosylphosphorylcholine is a novel messenger for Rho-kinase mediated Ca2+ sensitization in the bovine cerebral artery: unimportant role for protein kinase C. Circ Res 2002;( 91): 112-119.

46. Nagumo H, Sasaki Y, Ono Y et al. Rho kinase inhibitor HA-1077 prevents Rho-mediated myosin phosphatase inhibition in smooth muscle cells. Am Physiol Cell Physiol 2000; (278): 57-65.

47. McGregor E, Gosling M, Beattie DK, et al. Circumferential stretching of saphenous vein smooth muscle enhances vasoconstrictor responses by Rho kinase-dependent pathways. Cardiovasc Res 2002;(53): 219-216.

48. Amerongen GPN, Delft A, Vermeer MA et al. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability role of Rho kinase and protein tyrosine kinase. Circ Res 2000; (87): 335-340

42

49. Kandabashi T, Shimokawa H, Mukai Y, et al. Involvement of rho-kinase in agonist-induced contractions of arteriosclerotic human arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;(22): 243-248.

50. Ai S, Kuzuya M, Koike T et al. Rho-Rho kinase is involved in smooth muscle cell migration through myosin light chain phosphorylation-dependent and independent pathways.

Atherosclerosis 2001; (155): 321-327.

51. Wang H, Eto M, Steers WD et al. RhoA-mediated Ca2+sensitization in erectile function. J

Biol Chem 2002; (277): 34, 30614-30621.

52. Mills TM, Chitaley K, Lewis RW, et al. Nitric oxide inhibits RhoA/Rho-kinase signaling to cause penile erection. Eur J Pharmacol 2002; (439): 173-174.

53. Chitaley K, Bivalacqua TJ, Champion CJ et al. Adeno-associated viral gene transfer of dominant negative RhoA enhances erectile function in rats. Biochem Biophys Res Commun 2002; (298): 427-432.

54. Büyükafşar K, Arıkan O, Ark M, Kubat H, Özveren E. Upregulation of Rho-kinase (ROCK-2) expression and enhanced contraction to endothelin-1 in the mesenteric artery from lipopolysaccharide-treated rats. European Journal of Pharmacology. 2004; (498): 211 – 217

55. Ito M, Nakano T, Erdödi F and Hartshorne DJ. Myosin phosphatase: structure, regulation and function, Mol. Cell. Bochem. 2004;(259):197–209

56. Hartshorne DJ., Ito M, and Erdödi F. Role of protein phosphatase type 1 in contractile functions: myosin phosphatase, J. Biol. Chem. 2004; (279): 37211–37214

57. Somlyo AP and Somlyo AV, From pharmacomechanical coupling to G-proteins and myosin phosphatase, Acta Physiol. Scand. 1998; (164): 437–448.

58. Uehata M, Ishizaki T, Satoh H, Ono T, Kawahara T, Morishita T, Tamakawa H, Yamagami K, Inui J, Maekawa M and Narumiya S, Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a rho-associated protein kinase in hypertension, Nature 1997; (389): 990–994

59. Mita M, Yanaguhara H, Hishinuma S, Saito M and Walsh MP. Membrane depolarization-induced contraction of rat caudal arterial smooth muscle involves Rho-associated kinase, Biochem. J. 2002; (364):431–440.

60. Sakurada S, Takuwa N, Sugimoto N, Wang Y, Seto M, Sasaki Y and Takuwa Y. Ca2+-dependent activation of Rho and Rho kinase in membrane depolarization-induced and receptor stimulation-induced vascular smooth muscle contraction, Circ. Res. 2003 ;(93): 548–556

43

ÖZGEÇMİŞ

Halil Mahir Kaplan, 1983 yılında Adana’da doğdu. İlk ve orta öğrenimini

Adana’da tamamladı. 2004 yılında Çukurova Üniversitesi Biyoloji Bölümünden Mezun

oldu. 2004 yılının Eylül ayında Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Farmakoloji Anabilim Dalı’nda ‘Yüksek Lisans’ eğitimine başladı.

44

STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS … · Protein Miktar Tayini 19 3.3.3. Western-blot 20...

Documents

Transcript of STATİN UYGULANAN FARELERİN AORTA VE KORPUS … · Protein Miktar Tayini 19 3.3.3. Western-blot 20...