Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor...
Transcript of Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor...
![Page 1: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/1.jpg)
Stanovení aktivity enzymů
![Page 2: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/2.jpg)
Obecné schema:
Detekce enzymu– chceme zjistit, jestli je ve vzorku aktivní enzym
Stanovení katalytické aktivity– chceme zjistit kolik je ve vzorku aktivního enzymu
Měření katalytických schopností enzymů– chceme zjistit kolik substrátu by dokázal enzym transformovat za určitý čas
![Page 3: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/3.jpg)
Obecné schema:
Jednotka aktivity
reakční rychlost mol.l–1.s–1
katalytická aktivita katal (kat) mol.s–1
jednotka (U) μmol.min–1
ostatní jednotky mg.min–1
specifická aktivita vztažená na objem kat.l–1
U.ml–1
specifická aktivita vztažená na hmotnost U.mg–1
číslo přeměny kat.mol–1 = s–1
![Page 4: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/4.jpg)
Obecné schema:
kontinuálnísmícháme substrát(y) s enzymem a měřímezměnu koncentrace substrátů a produktů
přesnost, jistota že měříme rozsah použitelných metodpočáteční reakční rychlost paralelizovatelnost
„end-point“smícháme substrát(y) s enzymem, směsinkubujeme po vybraný čas, pak reakci zastavímea změříme koncentrace substrátů nebo produktů
speciální metody
![Page 5: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/5.jpg)
Obecné schema:
Nutno kontrolovat:- dobu reakce- teplotu- pH- koncentrace substrátů- koncentrace aktivního enzymu- koncentrace solí, kofaktorů a podobně
α-L-Fucosidase assay
Enzymatic activity of α-L-fucosidase was measured in 25 mM EPPS buffer
(pH 8) at 37°C for 10 min using pNPα-L-Fuc (Biosynth AG®, Switzerland) as
a substrate (7 mM in the reaction mixture). An equal volume of 10% Na2CO
3
was used for reaction termination and the absorbance of reaction mixture
was measured at 405 nm. Calibration curve, constructed for p-nitrophenol in
the concentration range 0–100 μmol/L, was constructed under the same
reaction conditions and served for the calculation of realeased amount of
p-nitrophenol. Enzyme amount, which was able to release 1 μmol of
p-nitrophenol per minute at 37°C, was defined as one unit.
![Page 6: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/6.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
- rychlost v čase měření t = 0
- abychom jí mohli měřit, nesmí se podmínky během měření příliš měnit,konkrétně:
- nemění se příliš koncentrace substrátu- nemění se pH- nedochází k inhibici produktem- enzym je stabilní- …
![Page 7: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/7.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 1:Reakce se zpomaluje
![Page 8: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/8.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 1:Reakce se zpomaluje
- nedostatek substrátu/rovnováha
- inhibice produktem(včetně změny pH)
- nestabilita enzymu
- inhibice s pomalou rovnováhou
- artefakt metody
- jiná změna v podmínkáchstanovení
![Page 9: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/9.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 2:„lag-fáze“ nebo zrychlení na začátku
![Page 10: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/10.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 2:„lag-fáze“ nebo zrychlení na začátku
- pomalé smíchání roztoků
- špatná regulace teploty
- usazování částic
- pomalá odezva detektoru
- pomalé ustalování ustáleného stavu
- inhibice s pomalou rovnováhou
- inhibice substrátem
- aktivace produktem
- přeměna mezi formami substrátu
![Page 11: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/11.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 3:nenulový slepý pokus
![Page 12: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/12.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 3:nenulový slepý pokus
- precipitace
- usazování částic
- kontaminace substrátem
- kontaminace jiným enzymem
- adsorbce na stěny nádoby
- neenzymatické reakce
![Page 13: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/13.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 4:Nelineární závislost rychlosti
na koncentraci enzymu
![Page 14: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/14.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 4:Nelineární závislost rychlosti
na koncentraci enzymu
- kovalentní inhibitor
- aktivátor
![Page 15: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/15.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 5:Nelineární závislost rychlosti
na koncentraci enzymu
![Page 16: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/16.jpg)
Počáteční reakční rychlost:
Problém č. 5:Nelineární závislost rychlosti
na koncentraci enzymu
- viz problém 1
- pomalá spřažená reakce
- přítomnost inhibitoruv preparátu enzymu
![Page 17: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/17.jpg)
Analytické metody používané při stanovování aktivity:
- spektrofotometrie- spektrofluorimetrie- luminimetrie
- radiometrické metody
- chromatografie- elektroforesa
- potenciometrie, měření pH, pH-stat- polarografie, voltametrie, amperometrie- coulometrie
![Page 18: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/18.jpg)
Spektrofotometrie
Lambert-Beerův zákon:
A=−log10( II 0)=εc l
![Page 19: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/19.jpg)
Spektrofotometrie
Chromogenní substrátyhydrolasy
![Page 20: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/20.jpg)
Spektrofotometrie
Chromogenní substrátyhydrolasy
![Page 21: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/21.jpg)
Spektrofotometrie
Chromogenní substrátyperoxidasa
![Page 22: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/22.jpg)
Spektrofotometrie
Chromogenní substrátyalkalická fosfatasa
![Page 23: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/23.jpg)
Spektrofotometrie
Chromogenní substrátyvyužití tetrazoliových solí
![Page 24: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/24.jpg)
Spektrofotometrie
NAD(P)+/NAD(P)H jako „přírodní“ chromogenní substrát
![Page 25: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/25.jpg)
Spektrofotometrie
NAD(P)+/NAD(P)H jako „přírodní“ chromogenní substrát
Aspartátaminotransferasa2-oxoglutarát + L-aspartát → L-glutamát + oxalacetátoxalacetát + NADH + H+ → L-malát + NAD+
Alaninaminotransferasa2-oxoglutarát + L-alanin → L-glutamát + pyruvátpyruvát + NADH + H+ → L-laktát + NAD+
Kreatinkinasakreatinfosfát + ADP → kreatin + ATPATP + glukosa → ADP + glukosa-6-fosfátglukosa-6-fosfát + NADP+ → 6-fosfoglukonát + NADPH + H+
![Page 26: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/26.jpg)
Spektrofotometrie
NAD(P)+/NAD(P)H jako „přírodní“ chromogenní substrát
ATPATP + glukosa → ADP + glukosa-6-fosfátglukosa-6-fosfát + NADP+ → 6-fosfoglukonát + NADPH + H+
ATP + fosfoglycerát → 1,3-bisfosfoglycerát + ADP1,3-bisfosfoglycerát + NADH + H+ → glyceraldehyd-3-fosfát + NAD+ + Piglyceraldehyd-3-fosfát → dihydroxyacetonfosfátdihydroxyacetonfosfát + NADH + H+ → glycerol-3-fosfát + NAD+
ADPfosfoenolpyruvát + ADP → pyruvát + ATPpyruvát + NADH + H+ → L-laktát + NAD+
AMPAMP + ATP → 2 ADPADP …
![Page 27: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/27.jpg)
Spektrofotometrie
NAD(P)+/NAD(P)H jako „přírodní“ chromogenní substrát
Piglykogenn + Pi → glukosa-1-fosfátglukosa-1-fosfát → glukosa-6-fosfátglukosa-6-fosfát …
PPiPPi + H
2O → 2 Pi
Pi …
HCO3
–
HCO3
– + fosfoenolpyruvát → oxalacetát + Pi
oxalacetát + NADH + H+ → malát + NAD+
![Page 28: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/28.jpg)
Spektrofotometrie
rozpustné vs. nerozpustné produkty
+ spektrofotometrie + detekce v gelu, v mikroskopickýchpreparátech a na agarových miskách
![Page 29: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/29.jpg)
Spektrofluorimetrie
fluorogenní substráty hydrolas
![Page 30: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/30.jpg)
Spektrofluorimetrie
FRET – fluorescence (Förster) resonance energy transfer
+
![Page 31: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/31.jpg)
Spektrofluorimetrie
FRET – fluorescence (Förster) resonance energy transfer
![Page 32: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/32.jpg)
Luminimetrie
Bioluminiscence – produkce a emise světla živými systémChemiluminiscence – reakce emitující světlo, včetně enzymových reakcí
se synthetickými substráty
![Page 33: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/33.jpg)
Luminimetrie
Luciferin + luciferasa
Peptid
![Page 34: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/34.jpg)
Luminimetrie
Chemiluminiscence
Peroxidasa Alkalické fosfatasa
![Page 35: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/35.jpg)
Radiometrie
Nuklid Rozpad Poločas Použití
3H β– 12,3 roků Měření aktivity, studium kinetikystudium metabolismu
14C β– 5 700 let Měření aktivity, studium kinetikystudium metabolismu
32P β– 14,3 dnů Měření aktivity a studium kinetikykinas, fosfatas atd., značeníDNA/RNA
35S β– 87 dní značení proteinů
125I γ 57,4 dní značení protilátek při RIA,značení proteinů
![Page 36: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/36.jpg)
Radiometrie
Popis sloučenin- jednoduché (3H2O, 14CO2)- uniformě značené ([14C] alanin)- specificky značené (L-[methyl-14C] methionin, [methyl-3H] thymidin)
JednotkyBequerel – jeden rozpad za sekunduCurie – radioaktivita 1 g 226Ra
Detekce- ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice)- scintilační – pevné nebo tekuté „koktejly“- fotografická média- polovodiče (scannery)- tomografie (PET, SPECT)
![Page 37: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/37.jpg)
Radiometrie
Separace produktů- chromatografie, např. ionexový papír
Thymidinkinasa:[methyl-3H] thymidin + ATP → [methyl-3H] TMP + ADP
- zachycení radioaktivního TMP na ionexový papír a změření radioaktivity
- precipitace (DNA/RNA – isopropanol, proteiny – TFA, HClO4)
- měření radioaktivity ve vznikajícím plynu nebo těkavé látce- extrakce- elektroforesa, TLC, papírová chromatografie
![Page 38: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/38.jpg)
Použití stabilních isotopů
karbonáthydrolyasa:
[18O] H2O + CO
2H
2O + [13CO
2]
rovnováha rovnováha
rovnováha
![Page 39: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/39.jpg)
Chromatografie
TypGC, LC, TLC, HPLC
Stacionární fázeSilikagel, ionex, reversní fáze, size exclusion, afinitní, atd.
DetektorUV-vis, fluorescenční, index lomu, elektrochemický, MS, atd.
Příprava vzorkůOdstranění proteinů: HClO
4, TFA, solid phase extraction
KvantifikaceKalibrační křivka, vnitřní standart
![Page 40: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/40.jpg)
Elektroforesa
TypPAGE, SDS-PAGE, Tricine-PAGE, agarosová, IEF
Zymogram
barvení
chromogennísubstrát
Varianty:- s renaturací- s blottingem- se sandwichovým gelem- vyříznutí proužku, elektroeluce
![Page 41: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/41.jpg)
Elektroforesa + Western blot
Proteinkinasy
WB: anti-pY
![Page 42: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/42.jpg)
Elektroforesa + Western blot
Proteinkinasy
WB: anti-pY
IP: anti-protein XWB: anti-protein X
![Page 43: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/43.jpg)
Elektrochemické metody
Metoda Měřené veličina Přiváděné napětí Vztah s koncentrací
Potenciometrie Napětí žádné U ~ log(c)
Coulometrie Náboj stejnosměrné Q ~ n
Voltametrie Proud stejnosměrné I ~ cPolarografie konstantní neboAmperometrie proměnlivé
Konduktometrie Vodivost střídavé G ~ c
![Page 44: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/44.jpg)
Elektrochemické metody
Potenciometrie
amoniak (iontově selektivní elektroda)
hexakyanoželeznatan/hexakyanoželezitan
pH
Halogenidy, kovy
V
![Page 45: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/45.jpg)
Elektrochemické metody
pH-stat
+ coulometrické provedení
pH
![Page 46: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/46.jpg)
Elektrochemické metody
Voltametrie, Polarografie, Amperometrie
H2O
2
R-S-H
C=O (např. pyruvát)
NAD+
S polopropustnou membránou
Kyslík
A
V
![Page 47: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/47.jpg)
Elektrochemické metody
Enzymová elektroda
Glukosa – glukosaoxidasa
Glutamát – glutamátoxidasa
Xanthin – xanthinoxidasa
Různé sloučeniny – peroxidasa
A
V
Enzym (+mediátor)
Membrána
![Page 48: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/48.jpg)
High-throuput screening
Mikrotitrační destičky – 96, 384, 1536 a 3456 (uHTS – více než 100 000 za den)
Chromogenní substráty, fluorogenní substráty, FRET, ...
http://www.openscreen.cz/
![Page 49: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/49.jpg)
Profilování enzymů
Activity-based enzyme profiling
![Page 50: Stanovení aktivity enzymůspiwokv/enzymologie/aktivity.pdf · - ionisační detektor (Geiger-Müllerova trubice) - scintilační ... Detektor UV-vis, fluorescenční, index lomu,](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022042801/5aee51f37f8b9a903190fdaa/html5/thumbnails/50.jpg)
Jednomolekulární enzymologie
sklíčko
PEGbiotin streptavidin
kulička
enzym