Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy
-
Upload
hadley-hodge -
Category
Documents
-
view
44 -
download
0
description
Transcript of Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy
• Co jsou to fluorescenční metody, možnosti jejich použití
• Vlastní a nevlastní fluorescence
• Fluorescenční značky
• Fluorescenční sondy
• Příklady použití fluorescenčních sond
Fluorescence
Fluorescence - schopnost některých látek po ozáření - excitaci světlem určité vlnové délky vyzařovat - emitovat světlo jiné vlnové délky
Stokesův posun
Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima
Emitované záření má větší vlnovou délku (nižší energii)
Fluorescenční metody, možnosti použití
• Biochemický a biofyzikální výzkum– Enzymové reakce, transport membránou, přenos signálu, studium neurotransmiterových
receptorů a iontových kanálů, hledání vazebného místa v biomolekule
• Klinická chemie• Genetické analýzy, genetické manipulace
– Analýza DNA
• Biomedicína• Nahrazení metod využívajících radionuklidové zářiče
Využití fluorescence
Výhoda – možnost studia pochodů v živých buňkách
Výhody fotoafinitních sond
Afinitní sondy – nevýhody:
možnost deaktivace, hydrolýzy ještě před navázáním na vazebné místo
možnost interakce na jiném než vazebném místě
Fotoaktivovatelná sonda:
Chemicky inertní sonda chemicky reaktivníozáření
Používané přístroje
Přístroje:
• Fluorimetry• Spektrofluorimetry• Fluorescenční skenery• Fluorescenční mikroskopy• Průtokové cytometry
Princip přístrojů využívajících fluorescenci
Měření fluorescence
vzorek
emisní monochromátor
detektor
zdrojexcitační
monochromátor
čtecí zařízení
Fluorimetr Jenway řady 6200
Fluorescenční mikroskopy
FL 2002 K – Fluorescenční mikroskopFluorescenční mikroskop XFT 313
Software
Leica Application Suite Advance Fluorescence je modulární systém pro základní i profesionální práci s fluorescenčním obrazem.
Endotelové buňky pod mikroskopem
Fluorescenční mikroskop se třemi kanály umožňuje zobrazení jednotlivých částí buňky (mitochondrie, cytoskelet, jádro)
.
Vlastní a nevlastní fluorescence
• Vlastní fluorofory (vnitřní, intrinsic)– vyskytují se přirozeně
• Proteiny (aromatické aminokyseliny, např. fenylalanin), vitamin A, cytochromy, hemoglobin, chlorofyl
• Nevlastní fluorofory (vnější, extrinsic) – jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti
• Použití nevlastních fluoroforů je mnohem častější než použití vlastních
Nevlastní fluoroscence
• Fluorescenční značky• látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží kovalentně
• fluorescenční značení proteinů
• Fluorescenční sondy• látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží
nekovalentně
Požadované vlastnostispecifická vazba na buněčné složkycitlivost emise na změny v okolípodobnost s původní sloučeninoupo zavedení fluoroforu nesmí dojít k narušení biologických systémů
• Biologicky aktivní• Chemicky stálé bez přítomnosti světla – možnost
skladování• Stálé v podmínkách experimentu • Krátký poločas – minimalizace nespecifického
značení• Vysoká specificita• Snadná syntetická dostupnost• Stálost aduktu v podmínkách použitých analytických
technik (elektroforéza, hmotnostní spektrometrie)
Principy fotoafinitního značení
Principy fotoafinitního značení
Fotoreaktivní skupina – modrá
Radioizotop – červený
Protein - zelený
Syntéza AFCS
OH
OHOH
OH
O
CMO.HClOH
OHOH
OH
Npy
Okastasteron
OH
OHOH
OH
N
OH
OHOH
OH
N O N
N
N+
NSO3
-
AF 647
O
O
NHS
DCC
NaHCO3
HN
HN SO3
-
SO3-
SO3-
DMF
O
OH
O
O O
DCC: Dicyklohexylkarbodiimid, CMO.HCl: karboxymethyloxim hydrochlorid, NHS: N-Hydroxyskcinimid
Specifičnost absorpce AFCS
Absorpce fluoroforu AF647 minimální ve srovnání s absorpcí AFCS
Snažší absorpce způsobena CS částí molekuly
Význam AFCS
Vývoj bioaktivního fluorescenčně značeného brassinosteroidu BR Alexa Fluor 647 kastasteron (AFCS) umožňuje pozorování endocytózy komplexů BR1-ligandu v živých buňkách.
Užitím různých endomembránových značek lze mapovat endocytickou cestu komplexu BRI1-AFCS z plasmatické membrány do vakuol.
Příprava steroidu pro navázání Alexy
O
OH
O
OHN
O
O O
O
O
HO
HO
O
OH
O
O
O
O NH2
O
HO
HO
H H
H H
Me2CO
p-TosOH
BocGlyDCCDMAP
TFA
py
Příprava steroidu pro navázání Alexy
O
OH
O
OHN
O
O O
O
O
HO
HO
O
OH
O
O
O
O NH2
O
HO
HO
H H
H H
Me2CO
p-TosOH
BocGlyDCCDMAP
TFA
py
Příprava aktivního esteru Alexy
HN O NH+
-O3S SO3-
O
H+
N
O
NOO
HN O NH+
-O3S SO3-
O
H+
N
OH
TSTU
EDIPA
ethyldiisopropylamine, (O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3 tetramethyluronium tetrafluoroborate, H2O, DMF, 0 °C
Další fluorofory
HN O N
HO3S SO3H
O
O
O
OH
HN
PA-Alexa
O
O
O
OH
HN
PA-NBD
NO2
N
NO
CO2H
O
7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
BODIPY
b
boron-dipyrromethene4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
N
B
N
F F
Skupina fluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bórPoužití: značení proteinů, nukleotidů, enzymových substrátů, mastných kyselin, fosfolipidů
Dansylchlorid
S
OO
Cl
N
Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů
DNS-Cl5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid
Závěr
Využití fluorescence – nedestruktivní způsob sledování a analýzy biologických molekul prosřednictvím fluorescenční emise o určité frekvenci.
Existuje velká řada vnějších fluoroforů, takže je možnost výběru toho nejvhodnějšího.
Přehled je možno nalézt na stránkách www.molecularprobes.com
Literatura
Gimpl G. Gehrig-Burger K.: Probes for studying cholesterol binding and cell biology. Steroids 76 (2011) 216–231
Waschatko G. et al.: Photo-DHEA—A functional photoreactive dehydroepiandrosterone (DHEA) analog. Steroids, 76 (2011), 502-507
Irani N. G. et al.: Fluorescent brassinosteroids trace the endocytic route of BRI1, k tisku
Borovska J. et al.:. Neurosteroid access to the NMDA receptor, k tisku
www.molecular probes.com