Size Exclusion Chromatography
Transcript of Size Exclusion Chromatography
MAKALAH ANALISIS FARMASI
SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
DISUSUN OLEH:
Gama Nindya Saputra 128114093
Prita Patricia 128114094
Lucia Effelin Cindya 128114096
Dionisius Laffyanto 128114100
Stanislaus Kris Bangkit Tri Putra 128114101
Bertha Nathania 128114102
Agatha Riona Octavianus 128114105
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
A. PRINSIP SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)
Size Exclusion Chromatography (SEC) adalah metode kromatografi molekul
dalam larutan yang dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Nama lain dari size
exclusion chromatography yaitu gel filtration chromatography (GFC), gel permeation
chromatography (GPC), gel chromatography, steric exclusion chromatography, dan
exclusion chromatography. Kata “gel” merupakan konotasi dari fase diam yang
digunakan yaitu gel organik yang semirigid dan nonrigid, sedangakan SEC fase
diamnya yaitu gel yang organic atau organic yang rigid.
Size Exclusion Chromatography (SEC) biasa digunakan dalam pemisahan
molekul yang besar atau kompleks makromolekul seperti protein. Untuk pemisahan
yang biasanya makromolekul dalam fase gerak larutan disebut Gel Filtration
Chromatography sedangkan ketika pemisahan dilakukan di dalam fase gerak non-
larutan disebut Gel Permeation Chromatography.
Tujuan utama dari penggunaan metode Size Exclusion Chromatography (SEC)
ini adalah untuk memberikan informasi tentang distribusi berat molekul dari polimer-
polimer tertentu. Pada pemisahan ini informasi yang diberikan yaitu distribusi berat
molekul, karena adanya hubungan yang linear antara dimensi (ukuran molekul) dan
berat molekul pada rantai polimer bebas.
B. MEKANISME PEMISAHAN SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)
Pada bagian pertama (1), sampel diperlihatkan setelah injeksi pada kepala
kolom, fase gerak melewati kolom dengan laju aliran yang tetap, dengan tekanan
gradient pada seluruh panjang kolom. Bagian kedua (2), sampel sudah masuk ke
dalam kolom, partikel dari fase diam merupakan pori-pori dengan ukuran pori yang
dikontrol. Bagian ketika (3) molekul yang lebih kecil mampu untuk menembus pori-
pori ketika melewati kolom, tetapi yang molekul lebih besar terlalu besar untuk
masuk kedalam pori-pori fase diam dan hanya berada di daerah interstitial. Molekul
yang lebih kecil tertahan sebentar pada pori yang dimasuki, hingga molekul yang lain
masuk ke dalam pori. Molekul yang lebih besar mengalir lebih cepat karena mereka
tidak masuk ke dalam pori-pori fase diam. Akhirnya dua molekul tersebut dipisahkan
dan menjadi 2 peak kromatogram yang berbeda terlihat pada bagian keempat (4).
a) Kelebihan SEC
Waktu pemisahan cepat
Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak bereaksi dengan fase diam
Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa mengganggu proses filtrasi
b) Kekurangan SEC
Hanya sejumlah frekuensi terbatas yang dapat diakomodasi karna skala watku
kromatogram pendek
Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran yang seragam seperti isomer
C. INSTRUMENTASI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)
Secara umum instrumen SEC yang terdiri dari sebuah pompa untuk
mendorong pelarut melalui instrumen, port injeksi dilakukakan untuk memasukkan
sampel ke kolom, dan kolom berfungsi untuk menahan fase diam, sedangkan detektor
berfungsi untuk mendeteksi komponen ketika sampel meninggalkan kolom, kemudian
software akan berfungsi untuk mengontrol bagian-bagian yang berbeda dari
instrumen dan menghitung dan menampilkan hasil.
Pengukuran SEC dapat dilakukan dengan pengukuran HPLC, dimana sistem
terdiri dari penghantar pelarut, sistem mekanisme, dan sistem deteksinya. sistem
penghantar pelarut adalah rangkaian reservoir pelarut, degasser dan pompa aliran
pelarut. Sistem pemisahan terdiri dari injector sampel dan kolom SEC. Sistem deteksi
terdiri dari detektor, perekam strip-chart dan tabung pembuangan. Sistem penanganan
data digunakan untuk menganalisis SEC chromatogram dan menghitung rata-rata
berat molekul sampel. Pengukuran dapat digunakan di tempat perekam strip-chart.
Autosampler (autoinjector) yang digunakan untuk menyuntikkan sampel solusi ke
sistem pemisahan pada interval tertentu yang juga dapat digunakan dengan instrumen
HPLC.
Komponen yang digunakan dalam system kromatografi ini antara lain :
1. Kolom
Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul zat yang
akan dipisahkan. Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak
mampu dipisahkan jika digunakan satu ukuran pori-pori dari kolom.
Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu
kurva kalibrasi tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan
dengan jelas karena distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar
maka akan dihasilkan kurva dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian,
senyawa-senyawa yang memiliki ukuran molekul hampir sama akan dihasilkan
daya pisah yang rendah jika rentang kerja BM-nya besar. Sebaliknya, jika
distribusinya sempit maka akan didapat kurva yang lebih mendatar. Sehingga,
rentang kerja BM akan menjadi lebih kecil tetapi daya pisah molekul yang
memiliki ukuran hampir sama akan meningkat. Pemisahan optimum komponen-
komponen suatu senyawa sampel yang memiliki distribusi bobot molekul lebar
dapat diperoleh jika kolom eksklusi memiliki rentang kerja BM yang berbeda.
Pada setiap rangkaian kolom dapat dihasilkan kurva kalibrasi tersendiri dimana
perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan menyuntikkan senyawa baku (standar
baku) yang diketahui bobot molekulnya, kemudian menentukan VR masing-
masing. Dengan demikian, SEC merupakan suatu metode cepat yang dapat
digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot molekul (BM) suatu sampel
dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar baku.
Untuk memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan
senyawa standar baku haruslah sama.
2. Fase Gerak
Fase gerak dalam SEC harus merupakan pelarut polimer yang baik
untuk menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang
sesuai dan bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut
bertujuan agar pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain
memecahkan agregat. Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka
dapat terjadi peningkatan tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu
besar. Efek tersebut dapat diatasi dengan cara memilih pelarut lain, atau
meningkatkan temperatur kolom.
Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar
terjadi disagregasi, sedangkan beberapa polimer seperti polyolefin, biasa
digunakan untuk analisis pada suhu tinggi (140-1500 °C). Bila analisis dilakukan
pada kondisi tersebut, maka fase gerak yang bersifat toksik tidak dapat digunakan
(contoh: triklorobenzen), sehingga perlu dipilih fase gerak yang lain. Fase gerak
dalam SEC terbagi menjadi dua bagian besar, yaitu:
Fase gerak untuk protein dan polimer larut air
SEC sering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan
agregat, desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau
untuk mengetahui sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat,
sediaan farmasi, dan sebagainya. Fase gerak yang digunakan disesuaikan
dengan fase diam, antara lain:
1) Silika
Jenis kolom SW, SWxI, dan Super SW digunakan untuk menganalisis
protein dan asam nukleat, menggunakan aqueous buffer sebagai fase
gerak.
2) Polimetakrilat
Jenis kolom PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer
karida, asam nukleat virus, menggunakan fase gerak berupa
larutan buffer atau larutan garam. Kolom PWxI yang digunakan untuk
menganalisis polimer kationik menggunakan fase gerak berupa larutan
garam encer.
Contoh pelarut mengandung air yang sering digunakan sebagai fase
gerak dalam SEC yaitu buffer fosfat (pH 7,0), larutan KCl dan larutan NaCl.
Fase gerak SEC untuk polimer non-polar dan polimer larut dalam pelarut
organik.
Fase gerak SEC untuk polimer non-polar dan polimer larut dalam pelarut
organik SEC sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organik polar
dan polimer larut dalam pelarut organik. Pemilihan pelarut organik didasarkan
atas efek partisi dan adsorpsi pelarut. Jenis fase gerak yang digunakan
disesuaikan dengan fase diam, antara lain:
1) Polimetakrilat (high % X-linking)
Jenis kolom Alpha dan Super AW menggunakan fase gerak berupa
pelarut organik polar seperti metanol, asetonitril, DMF, DMSO, THF,
dan HFIP.
2) Polistirena
Ada dua jenis kolom, yaitu kolom Ultra-low Adsorption (contoh: Super
HZ, Super Multipore HZ, HxI dan Multipore) menggunakan pelarut
yang terbatas, dan kolom Low Adsorption (contoh: Super H dan Hhr)
dapat menggunakan pelarut yang lebih bervariasi.
3. Detektor
Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan
sistem detektor yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor
UV-Vis. Intensitas detektor direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem
dikalibrasi dengan menggunakan polimer sampel yang diketahui berat molekulnya,
dapat dilakukan dengan evaluasi berat molekul dan distribusi berat molekul
menggunakan detektor sinar menyebar (light scatter detector), berat molekul
polimer dapat ditentukan secara langsung dan tidak perlu dikaliberasi terlebih
dahulu.
Untuk mendapatkan data yang tepat dan akurat dapat digunakan SEC, dimana
terdapat sedikit perbedaan pada alat yang digunakan dalam HPLC konvensional. Ada
beberapa ketentuan yang perlu diperhatikan dalam SEC. Pertama, perlu digunakan
pompa kualitas tinggi yang membuat laju alir lebih konstan dalam memompa pelarut
yang digunakan. Kedua, katup loop harus digunakan untuk menyuntikkan larutan
sampel, dan ketiga, suhu kolom harus dijaga agar konstan.
D. PREPARASI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)
1. Pemilihan fase gerak
Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:
a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam
b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem SEC sehingga dapat
dijalankan dengan range tekanan yang normal.
c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang kuat
dengan fase diam (contoh: lewat adsorpsi).
Fase gerak yang digunakan dapat berupa fase gerak larutan, fase gerak organik
atau dalam larutan buffer.
2. Pemilihan fase diam
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat
porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam.
Fase diam optimum yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:
a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel
b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak, tetapi tidak
mengalami efek pembengkakan.
c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur
d. Harus memiliki volume pori yang cukup dan berbagai ukuran pori
sehingga dapat melakukan distribusi berat molekul sampel yang memadai.
Fase diam yang digunakan biasanya terdiri dari dekstrosa, agarosa,
poliakrilamid atau silika yang memiliki sifat fisik yang berbeda. Jenis ukuran
pori yang ada pada fase diam ini berkisar 60-4000 Å dengan ukuran partikel
berkisar 5-10 µm dengan efisiensi ribuan theoritical plate setiap 15 cm kolom.
Untuk fase gerak organik, kolom yang biasa digunakan yaitu crosslinked
(dengan difinilbenzen) gel polistiren atau trimetilsilane turunan silika. Untuk
fase gerak larutan yang digunakan yaitu crosslinked hidroksilat polimetakrilat
atau gel poli(propilen oksida) atau gliseril (diol) turunan silika. Contoh fase
diam yang dapat digunakan pada Size Exclusion Chromatography:
Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesis
dari polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus hidroksil
menyebabkan dekstran menjadi polar sehingga dapat direaksikan dengan
epiklorhidrin CH2(O)CHCH2Cl. Polimer yang terjadi dapat dikontrol
dengan penambahan asam.
Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang dibuat
dengan kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N’ metal-bis-akrilamid.
Senyawa ini tidak larut dalam air maupun beberapa pelarut organik.
Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul >500.000
, dinamakan juga Bio-Gel A. dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga
agak lunak dan tidak tahan tekanan tinggi.
Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali
dalam air dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organic. Stiragel
dibuat dari polistiren yang tahan pada suhu di atas 150⁰C. berat molekul
senyawa yang dapat dipisahkan antara 16.000 – 40.000 dalton.
3. Penyiapan sampel
Sampel harus bebas dari patikel, terutama untuk partikel yang
berukuran 34 mikrometer atau kurang; kemudian dilakukan ekstraksi clean up,
sentrifugasi dan filtrasi. Campuran ekstrak sampel kemudian difiltrasi, dimana
campuran sampel terbut melewati membran filter yang memisahkan sampel
padat dari solut. Kemudian pelarut mencuci sampel dari filter ke bejana
pengumpul. Dua atau tiga kali dicuci dapat mencegah pengurangan sampel.
Kemudian sampel disentrifugasi dan ekstras didecanter dan dipisahkan.
Residual sampel dicuci 2 sampai 3 kali. Buffer sampel tidak sama dengan
buffer kolom. Buffer sampel yang dipilih adalah buffer yang membantu
stabilitas dan aktivitas protein. Buffer harus mempertahankan kapasitasnya dan
pH yang konstan. Buffer yang dapat digunakan yaitu 0.05 M Natrium fosfat,
0.15 M NaCl pH 7 atau buffer sampel dimana proteinnya dapat larut dan stabil.
Hal-hal yang perlu diperhatikan pada waktu preparasi sampel:
- Sampel harus larut semuanya. Lakukan sentrifugasi atau filtrasi untuk
memisahkan partikel yang tidak larut.
- Temperatur kolom dan buffer harus sama untuk menghindari masuknya
udara ke dalam kolom
- Jika menggunakan sampel yang baru gunakan 0.55 mM Natrium Fosfat,
0.5 mM NaCl, pH 7
- Jika menggunakan konsentrasi yang tinggi, turunkan kecepatan sentrifugasi
dan perpanjang waktu.
E. DETEKSI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)
Detektor digunakan untuk memantau perubahan konsentrasi fase diam pada
kolom dengan mengukur konsentrasi atau berat solut dalam kolom. Setelah pemisahan
sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem detektor yang berbeda-beda,
misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis. Intensitas detektor direkam
sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikaliberasi dengan menggunakan
polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat dilakukan dengan evaluasi
berat molekul dan distribusi berat molekul menggunakan detektor sinar menyebar
(light scatter detector), berat molekul polimer dapat ditentukan secara langsung dan
tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu.
Detektor diklasifikasikan dalam 3 kelompok yaitu detektor konsentrasi,
detektor selektifitas struktur; detektor berat molekul.
1. Detektor berdasarkan konsentrasi
Detektor ini dianggap sebagai detektor universal yang mengukur perubahan fisik
tertentu dari fase diam, contohnya RID (Refraction Index Detector), Flame
Ionization Detector.
2. Detektor selektifitas struktur
Detektor selektifitas struktur mengukur hal yang spesifik dari solut dan hanya
sensitif pada satu komponen sampel. Contohnya yaitu detektor fluoresens, spektro
massa, dan fotometer UV dan inframerah
3. Detektor berat molekul
Contohnya yaitu viskometer, detektor penghamburan cahaya juga sensitif pada
berat molekul dan konsentrasi solut pada fase diam.
F. APLIKASI SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY (SEC)
SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekuler seperti
protein dan polimer industri terutama digunakan untuk memisahkan
molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot molekul dari
polimer. Contoh aplikasi SEC yaitu:
1. Pemisahan campuran peptida yang terdiri dari Insulin, Glukagon, Angiotensin I,
dan Bradikinin asetat.
Pada pemisahan peptida ini, sistem fase yang digunakan yaitu untuk fase diam
yaitu Zenix™-80 (3 µM, 80 Å, 7.8x300 mm) dan Fase Gerak: Asetonitril dengan
0,1 % TFA dan air, garam konsentrasi tinggi dan tambahan metanol. Kecepatan
alirnya yaitu 0,8 mL/menit.
Bahan dan Metode:
Bahan-bahan yang digunakan: Garam Bradikinin asetat, MW 1,060 Da
Angiotensin I Asetat MW 1,297 Da; Glukagon, MW 3,483 Da; Insulin dari
Pankreas, MW 5,778 Da. Semua sampel peptida dibeli dari Sigma Aldrich.
5mg/mL larutan stok dibuat dengan asam asetat 50 MM. untuk injeksi sampel,
larutan stok kemudian diencerkan dengan asam asetat 50 mM konsentrasi yang
diinnginkan. Sekuensing dimodifikasi dengan tipsin yang dibeli dari promega.
Kemudian dilakukan kromatografi
Hasil: Pada gambar I A menunjukkan profil pemisahan dari 4 peptida dengan
fase gerak 25 mM Sodium Asetat/300 mM NaCL, PH 4.5. Empat peptida tidak
memisah dengan penambahan garam. Ketika fase gerak diubah menjadi 50 mM
Fosfat, 30 % MeOH dan 0.1 % TFA, empat peptida memisah tetapi tidak menurut
urutan berat molekul. Pada gambar I B, menunjukkan profil pemisahan dengan
urutan elusi yaitu Insulin, Bradikinin, Angiotensin I, dan Glucagon. Kombinasi
dari metanol dan TFS tidak kuat untuk mengganggu interaksi antara matriks kolom
dan peptida. Itu, tidak dapat dicapai pemisahannya menurut ukuran molekul
Ketika fase gerak diganti dengan TFA/sistem asetonitril, semua peptida elusi
lebih cepat dari waktu retensinya dan pemisahannya lebih meningkat. Interaksi
fase padat dan peptida dikecilkan dengan penambahan konsentrasi asetonitril. Pada
gambar 2 terlihat pemisahan yang baik pada fase asetonitril. Untuk mencapai
pemisahan peptida, konsentrasi asetonitril yang optimal yaitu 75% dalam larutan
0.1 % TFA. Jadi urutan pemisahan peptida yaitu Insulin, Glukagon, Angiotensin I
kemudian Bradikinin, yang sesuai dengan berat molekulnya yaitu : Garam
Bradykinin asetat, MW 1,060 Da Angiotensin I Asetat MW 1,297 Da; Glukagon,
MW 3,483 Da; Insuin, MW 5,778 Da.
2. Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri Lokal dan Aplikasinya dalam Reaksi
Esterifikasi
Pada pemurnian enzim lipase digunakan Gel Permeation Chromatography
dengan sistem fase yaitu fase diam menggunakan sephadex G-100 dan larutan
buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Enzim lipase diperoleh dari
produksi enzim lipase dilakukan dengan cara yaitu, 100 ml inokulum dimasukkan
padaerlenmeyer 1000 ml yang berisi media fermentasi kemudian diinkubasi
selama 24 jam dengan pH 8 dan suhu 35ºC. Setelah itu dilakukan sentrifugasi
dengan kecepatan 5000 rpm selama 15menit. Filtrat hasil sentrifugasi disebut
ekstrak enzim kasar. Ekstrak kasar tersebut kemudian digunakan dalam proses
pemurnian hingga aktivitas esterifikasinya.
Pemurnian Enzim Lipase:
Fraksinasi Amonium Sulfat
Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan
fraksinasi bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat
kejenuhan (0-20%), (20-40%), (40-60%), (60-80%) dan (80-100%).
Fraksinasi dengan amonium sulfat dilakukan dengan cara menambahkan
amonium sulfat sedikit demi sedikit pada larutan ekstrak kasar enzim sambil
diaduk dengan pengaduk magnet. Pengadukan diusahakan sedemikian rupa
sehingga tidak menimbulkan busa selama kurang lebih 20 menit. Setiap
endapan protein enzim yang didapat dipisahkan dari filtratnya dengan
menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit
kemudian dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 8 dengan konsentrasi 0,05
M lalu diuji aktivitasnya menggunakan Metode titrimetri dan ditentukan kadar
proteinnya menggunakan Metode Lowry. Fraksi yang memberi aktivitas
tertinggi diuji aktivitas esterifikasinya.
Dialisis
Endapan enzim hasil fraksinasi bertingkat yang memiliki aktivitas tertinggi
dilarutkan kedalam buffer fosfat pH 8; 0,05 M selanjutnya dimasukkan
kedalam kantong selofan, kemudiandidialisis menggunakan buffer fosfat pH 8;
0,05 M selama ± 48 jam pada suhu 4ºC.
Kromatografi Kolom
Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan
kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100 sebagai fase
diam. Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang
berfungsi sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi
sebagai fase gerak. Sampel enzim yang memiliki bobot molekul lebih besar
dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan lebih
dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil akan
masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah
proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15 ml.
Eluen yang telah ditampung pada
wadah kemudian diukur kadar protein dan aktivitas enzimnya. Fraksi yang me
mberikan aktivitas tinggi dikumpulkan dan dikarakterisasi serta
ditentukan aktivitas esterifikasinya.
G. DAFTAR PUSTAKA
http://www.harvardapparatus.com , Guide to Gel Filtration or Size
Exclusion Chromatography, diakses pada tanggal 23 April 2014 pukul
06.10 WIB.
Jie W., Arakawa, T., Philo, J. S., 1996, Analytical Biochemistry: Size Exclusion
Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive
Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions, Protein Chemistry
Department, Amgen Inc., Thousand Oaks, California.
Mori, Sadao, 1999, Size Exclusion Chromatography, Springer-Verlag, Berlin, p. 4,
31-32, 37.
Nurhasanah, Herasari, D., 2008, Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri Lokal dan
Aplikasinya dalam Reaksi Esterifikasi,Seminar Nasional Sains dan Teknologi-
II, Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung, Bandar Lampung, hal. 267-
277.
Tosoh, 2014, Principles of Size Exclusion Chromatography,
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/
Resource Center /Principles of Chromatography/Size Exclusion/, diakses pada
tanggal 17 April 2014 pukul 22.59 WIB.
Wu Chi-san, 1995, Handbook of Size Exclusion Chromatography, Marcel Dekker, Inc,
New York, p.1-3, 8-9, 16-17.