Mekanisme Pemisahan Secara Exklusi ( Exclusion Chromatography )
description
Transcript of Mekanisme Pemisahan Secara Exklusi ( Exclusion Chromatography )
Mekanisme Pemisahan Secara Exklusi (Exclusion Chromatography)
Prinsip : Pemisahan komponen oleh gel didasarkan ukuran besar atau kecil molekul-molekul komponen.
Molekul-molekul (larut), komponen kecil masuk ke dalam jaringan polimer (gel), sehingga gerakan dihambat. Sedangkan molekul besar tak dapat memasuki jaringan polimer dan akan keluar kolom lebih cepat dibawa fase gerak.
Fase diam (dalam kolom)
- Gel non ionik, berpori banyak dan sama rata ukuran bentuk.
- misalnya : Sephadex
- Dibedakan dua gel : 1. Gel Filtrasi adalah polimer sukrosa atau
dextran yang membengkak dalam air.
2. Gel Permeasi adalah polimer membengkak di
dalam pelarut organik.
O OO
O
O
O
CH
2
OOH CH
2
OH
OH
O
O CH
2
CH2
CH
CH2
O
CH2O
O
OH
OH
OOH
CH
2
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
OH
CH
2O
O
O
CH2 CH
CONH2
CH2 CH
CO NH
) H2C
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CONH
CH
CONHCONH
CONH2
CH2CH2
CONH
CH
CH2
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CONH
CH2
CH
CONH2
CONH2
Sephadex(dextran cross linkdengan glycerine)
(2
acrylamide N,N'-methylbisacryllamide
Polyacrylamide
Mekanisme Pemisahan Secara Penukar Ion (Ion Exchange)
- Setelah dikembangkan resina polistiren (1940)
- Pemisahan unsur tanah jarang
- Senyawa-senyawa pada Biokimia.
Dasar Pemisahan :
Perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut dengan resina
Senyawa terlarut (linarut) yang berinteraksi lemah akan keluar lebih cepat, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat akan ditahan kolom lebih lama, maka akan keluar kemudian.
X - + R+ Y - Y - + R+ X -
X+ + R - Y+ Y+ + R - X+
Senyawa sampel
Bag. ion resin
ion fase gerak
Fase Diam : resin buatan organik atau anorganik
Contoh : Polistirena kation
Polistirena anion
Polidextran pemisahan protein
Fase Gerak :
Contoh : air + anion
air + Kation (KH2PO4 NaH2PO4 ) pH 4
CH CH2
CH CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH2
CH
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2N(CH3)3
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH2
CH
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH2
CH
CH
2
SO3-
SO3-
SO3-
Styren divinylbenzen
H+
H+
H+
+
Cl-
Resin penukar anion
Resin penukar kation
Mekanisme Pemisahan Secara Afinitas (Affinity Chromatography)
Prinsip : Interaksi yang sangat spesifik antara solute dengan molekul yang terikat secara kovalen (immobilized) pada fase diam.
Contoh : Molekul antibody terikat secara kovalen dengan fase diam. Jika campuran berisi 1000 protein dilewatkan kolom, hanya satu protein bereaksi dengan antibody yang terikat pada kolom.
Setelah pencucian semua solute (1000-1) protein keluar dari kolom. Protein yang diinginkan dilepaskan dari antibody dengan perubahan: pH fase gerak atau kekuatan mengionkan fase gerak.
Contoh : Mol coplanar mempunyai ggs Cis-diol dapat dipisahkan dari campuran komplek (nukleotida) dengan cara melewatkan pada kolom dengan asam fenil boronat terikat
AFFI GEL 601 yang dijual dipasaran adalah bentuk dari Biogel P-6 yang mengikat asam fenil boronat yang dapat mengikat coplanar Cis-diol.
Nukleotida yg tak ada ggs cis diol akan keluar.
Sedangkan Nukleotida dg ggs cis diol
Akan ditahan. Setelah dielusi buffer sitrat Nukleotida cis diol akan keluar.
Bio Gel P-6-C-N-C-C-N-C-C-C-C-N-
B
HO OH
O
H
Teori Pelat dan Teori Kecepatan
Teori Pelat (Plate theory) (Martin dan Synge, 1941)
: pada fase diam dan fase gerak terjadi kesetimbangan senyawa (analit),
terjadi pada satu plat.
Teori Kecepatan / Rate theory (van Deemter, 1956)
: terjadinya pelebaran puncak tergantung pada proses transfer massa
Teori distilasi Teori Kromatografi
Teori Pelat (Plate theory) (Martin dan Synge, 1941)
HETP = -----------L
N
N = 16 (-------)tR
Wb
2 atau N = 5,54 (--------)tR
W1/2
2
Menentukan kecepatan alir optimum
Teori Kecepatan / Rate theory (van Deemter, 1956)
HETP = A + B/ + C
A = difusi eddy B/ = difusi longitudinal C = pemindahan massa
Column
Diffusion
Difusi Eddy(efek jalur ganda)
Difusi longitudinal
Efek perpindahan massa
R = -------------- = ----------------- tR2-tR1
2 (tR2-tR1)
1/2 (Wb1 + Wb2) (Wb1 + Wb2)
Resolusi : Derajat pemisahan dua komponen pada proses kromatografi
Jarak antar dua puncak dibagi lebar alas puncak
Faktor pemisah ( : = -----------------tR2 - to
tR1 - to
R = ---------------------------------
2 ( tR2 - tR1)
1,699 ( W 1/2 1 + W 1/2 2)
R = 1,5 Base Line Resolution Puncak overlap 0,3%