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Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del
análisis molecular de plasma materno.
Sesarini C1, Giménez ML2, Redal M1, Argibay P1, Otaño L2. (1) Unidad de Medicina Molecular y Genómica, ICBME
(2) Unidad Medicina Fetal, Servicio de Obstetricia
Hospital Italiano de Buenos Aires
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Introducción
Diagnóstico prenatal No invasivo
Células fetales en sangre materna
• Técnicamente complejo
• Pocas células fetales en sangre
• A partir de las 15 semanas
• Vida media: 25-35 días.
• Pueden persistir por décadas
ADN fetal libre en plasma materno
• Técnicamente más simple: PCR
• 3 a 6% del ADN libre
• A partir de las 6 semanas
• Vida media: 16 minutos
• Persisten hasta 2 hs. post-parto
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Aplicaciones
Diagnóstico(Alelos Paternos)
Screening
• Sexo
• RHD
• Anomalías Génicas
• Preeclampsia?
• RCIU?
• Parto pretérmino?
• Aneuploidías?
Introducción
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Uso eficiente de la gammaglobulina- Escasa- Costosa - Exposición innecesaria a hemoderivados
Asesoramiento precozEvitar procedimientos invasivos
- Riesgo de pérdida- Mayor sensibilización
Pacientes no sensibilizadas
Pacientes sensibilizadas
Genotipificación del Rh fetal
Mujeres Rh (-) con Pareja Rh (+) heterocigota
Introducción
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
El diagnóstico de sexo genético prenatal requiere la extracción de material del embarazo.
El análisis de ADN fetal en sangre materna permitiría evitar estos procedimientos y mejoraría el manejo perinatal de patologías como:
- enfermedades ligadas al cromosoma X- virilización en HSC- malformaciones que afectan selectivamente a un sexo
Determinación del sexo fetal
Introducción
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Objetivo General
Identificar y analizar marcadores de ácidos nucleicos fetales
libres en sangre de embarazadas con el objeto de desarrollar
un método no invasivo de diagnóstico prenatal de
condiciones genéticas fetales y de patologías del embarazo
con impacto sobre la salud materno-fetal.
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Objetivos
Evaluar la factibilidad y la eficacia diagnóstica de la
determinación del genotipo RHD fetal a través del análisis
molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas Rh (-)
Evaluar la factibilidad y la performance del diagnóstico de
sexo fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en
plasma materno.
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Materiales y Métodos
• Extracción de sangre (5 ml) de 60 embarazadas Rh (-),
previa firma del consentimiento informado.
• Edad gestacional media: 27 semanas (rango: 7 a 41)
• Separación del plasma y extracción de ADN- Vi: 1000 μl- Vf: 40 μl
• Real Time-PCR: amplificación de una secuencia del gen
RHD exón 7 (125 pb), marcador DYS14 del cromosoma Y
(84 pb) y β-Actina (88 pb).
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Materiales y Métodos
• Resultados RhD positivoRhD negativo
Sexo masculino
Sexo femenino
• Se calculó - sensibilidad
- especificidad
- valor predictivo
- exactitud de la prueba
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Resultados
Electroforesis (gel de agarosa) de productos de amplificación.
125 pb
1: Ladder; 2-3: Feto Rh (+), duplicados; 4-5: Feto Rh (-), duplicados; 6: Control
Rh (+); 7: Control Rh (-); 8: Agua
Curva de Amplificación gen RH
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Rh de los RN
Positivo Negativo
Rh en plasma materno
Positivo 33 6 39
Negativo 2 19 21
35 25 60
Exactitud: 86,70% (52/60)
Sensibilidad: 94,30% (33/35)
Especificidad: 76,00% (19/25)
Valor predictivo de RhD positivo: 84,60% (33/39)
Valor predictivo de RhD negativo: 94,50% (19/21)
Resultados
Análisis del gen RHD en plasma materno y Rh del RN
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Embarazadas RhD negativas n: 60
Fetos RhD positivos n: 35
Fetos RhD negativos n: 25
Test positivo n: 33
Test falso negativo n: 2
Test falso positivo n: 6
Test negativo n: 19
ɣ-globulina Ahorro de ɣ-globulina
ɣ-globulina
innecesario
No se aplicaría tratamiento necesario
ResultadosUso de Gammaglobulina Anti Rh D en base al resultado del análisis del ADN Fetal
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Curva de aprendizaje de genotipificación RHD
Resultados
0
1
2
3
1 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60
Casos
Dis
co
rda
nc
ias
Rh
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Resultados
Sexo de los RN
Masculino Femenino
DYS14 en
plasma materno
Positivo 38 2 40
Negativo 1 19 20
39 21 60
Exactitud: 95,00% (57/60)
Sensibilidad: 97,44% (38/39)
Especificidad: 90,48% (19/21)
Valor predictivo sexo masculino: 95,00% (38/40)
Valor predictivo sexo femenino: 95,00% (19/20)
Análisis del marcador DYS14 en plasma materno y sexo fenotípico del RN.
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Resultados
0
1
2
1 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60
Casos
Dis
co
rda
nc
ia
DY
S1
4
Curva de aprendizaje de la determinación del sexo fetal
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Discusión
• La amplificación de secuencias (RHD y DYS14) en embarazadas
demuestra la factibilidad de realizar un diagnóstico prenatal no invasivo
del Rh y sexo fetal a partir del análisis de ADN fetal en plasma materno.
• La determinación del Rh fetal en madres Rh (-) fue factible en la
mayoría de los casos; exactitud 86,70%
• Problemas diagnósticos:
- Primera etapa de la serie
- Falsos positivo (6) sin riesgo en la práctica clínica contaminación,
“vanishing twin” o variantes alélicas.
- Falsos negativo (2) baja concentración de ADN fetal
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• La asignación del sexo fetal se predijo correctamente en 57 de 60
embarazos evaluados (95%).
• Problemas diagnósticos:
- Primera etapa de la serie
- Falsos positivo (2): contaminación, “vanishing twin”
- Falso negativo (1): baja concentración de ADN fetal
• Se han detectado secuencias de ARN fetal libre en plasma materno (Poon et al. 2000)
• Detección de secuencias de expresión placentaria (gen PLAC4,
cromosoma 21) permitiría cuantificar niveles de expresión y podrían
utilizarse para medir ploidía (Lo et al. 2007)
Discusión
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Conclusión
• Aplicación en práctica clínica: mujeres Rh (-) no sensibilizadas limitaría
profilaxis a fetos Rh (+) y sensibilizadas permitiría asesoramiento más
preciso, realizando estudios invasivos sólo en embarazos con fetos Rh
(+)
• La determinación del sexo fetal a partir de la semana 7 permitiría el
manejo temprano de embarazos en riesgo de ciertas patologías.
• La inclusión de otra secuencia del gen RHD (exón 5) y del cromosoma
Y (gen SRY), permitirán aumentar la especificidad del método.
• Desafíos diagnósticos: evaluación diferenciada de ácidos nucleicos
fetales de maternos y evaluación de ploidía.
Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.
Gracias por su atención.
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• Poon LL, Leung TN, Lau TK & Lo YM. Presence of fetal RNA in maternal
plasma. Clin Chem 2000; 46: 1832-1834.
• Lo YM, Tsui NB, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Heung MM, Gerovassili A,
Jin Y, Nicolaides KH, Cantor CR & Ding C. Plasma placental RNA allelic
ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat
Med 2007; 13: 218-223.
• Hahn S & Chitty LS. Noninvasive prenatal diagnosis: current practice and
future perspectives. Curr Opin Obstet Gynecol 2008; 20: 146-151.
Bibliografía