Seminarski Rad - Biotehnoligija (Monoklonska Antitijela)

8/19/2019 Seminarski Rad - Biotehnoligija (Monoklonska Antitijela)

1/72

Monoklonska antitijela

Seminarski rad - Biotehnologija


2/72

Cilj

Objasniti i predstaviti slijedeće pojmove :• Imunologija•

Imunološki sistem• Antigen• Antitijelo•

Monoklonska antitijela• !ISA test


3/72

Imunološki sistem

• Imunologija " lat - immunitas # otpornost$ gr% & logos #nauka'- nauka koja se bavi otpornošću organi(ma naštetne uti)aje okoline$ tj*prou%ava sposobnost organi(ma

da se odupre stranim materijama "antigenima '*• Imunitet & odbrambeni mehani(am koji štiti organi(am

od štetnih uti)aja mikroba i sli%nih stranih agenasa*• Imunološki sistem - skup ćelija $ tkiva i molekula koji

posreduju u otpornosti na in+ek)iju a koordinisanareak)ija tih ćelija i molekula na in+ektivnemikroorgani(me predstavlja imunološki odgovor.


4/72

,ta poja%ava imunološki odgovor i kojesu +unk)ije ovog sistema

• Vakcinacija - poja%ava imunološki odgovor te štiti odin+ek)ije*

• Imunološki sistem :

a* prepo(naje i odgovara na presa.ena tkiva i nove

proteine$ odnosno predstavlja barijeru (a transplanta)ijui gensku terapiju

b* ima ulogu i u odbrani od tumora


5/72

Organi(a)ija imunološkogsistema

• Imunološki sistem se sastoji od lim+nih organa$ tkiva i)irkulirajućih sastojaka raspore.enih gotovo posvuda potijelu*

• Organi uklju%eni u imunološki sistem dijele se na :

a. Primarne ( središnje ) & timus$ +etalna jetra$ koštanasr/

b. Sekundarne ( periferne ) & sle(ena$ lim+ni %vorovi$lim+na tkiva


6/72

0elije imunološkog sistema

• Stani)e imunološkog sistema nastaju i( pluripotentnihpraćelija koje sa(rijevaju u dva glavna puta:

a* i( lim+oidnih prekursora nastaju lim+o)iti "lim+o)iti 1$lim+o)iti B i prirodnoubila%ke ćelije'

b* i( mijeloidnih prekursora nastaju +ago)iti"mono)iti2makro+agi$ neutro+ilni i eo(ino+ilni granulo)iti -ćelije (a predo%avanje antigena' i posredni%ke ćelije"ba(o+ilni granulo)iti$ masto)iti i trombo)iti'


7/72

0elije imunološkog sistem


8/72


• Limfociti ( bijela krvna zrnca ) & imaju najva/niju uloguu odr/avanju ljudskog (dravlja

• 3ostoje tri osnovne grupe lim+o)ita koji se mor+ološki ne

ra(likuju već su ra(like samo +unk)ionalne:a. !limfociti su odgovorni (a humoralni imunitet- regulišu

stvaranje antitijela

b. "!limfociti u%estvuju u ćelijskom imunitetu -imaju ulogu

da prepo(naju i ra(likuju strane materije od onih kojepripadaju organi(mu i da ih unište*


9/72


• #ranulociti - proi(vode se u koštanoj sr/i a igraju va/nuulogu u akutnoj upali (ajedno sa antitijelima*

• $onociti%makrofagi - imaju ulogu u +ago)ito(i i

predo%avanju antigena i imunoregula)iji*• 4unk)ije mono)ita2makro+aga su:

a* izvršne-+ago)ito(a$

b. regulacijske +unk)ije-makro+ag5* "rombociti - osim uloge u koagula)iji krvi posreduju i u

imunološkim reak)ijama$ u upali*


10/72

Antigeni

5 &ntigen "gr%*anti "protiv' 6 gen$skraćeno od lat* generatus - "stvarati$

roditi' je molekula koja poti%e stvaranjeantitijela$ odnosno imunu reak)iju uorgani(mu*

5 Antigeni koji i(a(ivaju stvaranjeantitijela u organi(mu na(ivaju se još i

imunogeni*5 7 u/em smislu$ imunogeni poti%u

reak)iju imunog sistema dok suantigeni supstan)e (a koja se ve/u

odre.ena antitijela*


11/72

Antigeni

• 8anije se antigen de+inirao kao molekula koja mo/epotaknuti lim+o)it B na stvaranje antitijela "engl*9A1Ibod;


12/72

Antigeni

• Antigenska determinanta ili epitop je dio makromolekulakoji prepo(naje antitijelo*

• pitopi mogu biti nepreklapajući$ kada su prostorno

udaljeni i omogućavaju ve(ivanje dva ili više antitijela*• 3reklapajuće determinante su bli(u jedna drugoj i

dovode do sternih smetnji prilikom ve(ivanja antitijela$ au rijetkim slu%ajevima je moguće i da ve(ivanje prvog

antitijela dovede do kon+orma)ione promjene struktureantigena %ime se uti%e na ve(ivanje drugog antitijela*


13/72

Antigeni


14/72

Antigeni

• Antigeni su u ??@ slu%ajeva proteini$ mada mogu bitii nukleinske kiseline$ polisaharidi i neki slo/eni lipidi*

• Oni mogu %initi dio bakterija ili virusa ili mogu biti toksini"otrovi koje ispuštaju ti strani organi(mi'*

• eki antigeni su u tijelu prisutni od ro.enja$ npr* oni kojiodre.uju krvne grupe ABO i 8h sistema i tkivni antigeni*

• Sopstvene bjelan%evine nemaju odlike antigena$ ali akose belan%evine jedne osobe unesu u drugu osobu$nastaju imunološke reak)ije* Imunološke reak)ije uslu%aju pogrešne trans+u(ije krvi mogu biti vrlo teške*


15/72

Antigeni

• Podjela antigena :

* Antigeni klase koje se nala(e u svim ćelijama*

* Antigeni klase koje se nala(e jedino u imunimćelijama*5* Porijeklo antigena :5* Egzogeni antigeni$ su oni antigeni koji su dospjeli u

organi(am i(vana5* Endogeni antigeni$ koji se stvaraju unutar ćelije$ kao

produkt normalnog metaboli(ma ćelije ili (bog in+ek)ijeunutar ćelije nastale djelovanjem virusa ili bakterija*


16/72

Antigeni


17/72

Antigeni

• 3rin)ip odre.ivanja krvne grupe

!ijevo se nala(i serum krvi sa antiB antitijelom* >esno sa anti Aantitijelom $(bog aglutana)ije sadesne strane (aklju%ujemo da jetip krvi A*


18/72

Antitijela

• Antitijela "imunoglobulini' - proteini2bjelan%evine i( grupeglobulina

• Markiraju9 se antigenima• astaju u vrsti bijelih krvnih (rna)a$ B-lim+o)itima• Antitijela su prisutna u krvi$ lim+i$ tkivima te u

membranama slu(oko/e


19/72

Antitijela

Svako antitijelo se sastoji od dva jednaka teška lan)a "heavy

chains, H ' i dva laka lan)a "lightchains, L' koji su kovalentnimdisul+idnim mostovimame.usobno pove(ani u strukture

oblika slova "D'*


20/72

Mehani(mi djelovanja antitijela

• 3ostoji više na%ina mehani(ma djelovanja antitijela:

* eutrali(a)ija antigena

* Antitijela ve(ujući se na površinske strukture nekogantigena npr* bakterije u%ine ovu lakše prepo(natljivom(a odbrambene ćelije organi(ma & +ago)ite koji će takoo(na%enu bakteriju lakše prepo(nati i uništiti jeEpro/diranjemE njenog materijala

F* 1reći na%in djelovanja se ispoljava kro( tako(vanoaktiviranje komplementarnog sistema


21/72

Mehani(mi djelovanja antitijela

• Antitijela imaju sposobnost ve(ivanja i na neke ćelijevlastitog organi(ma kod kojih je došlo do ne/eljenih i poorgani(am opasnih promjena


22/72

8a(li%ite klase antitijela

• Imunoglobin A


23/72


• Imunoglobin >


24/72


• Imunoglobin


25/72


• Imunoglobin M


26/72


• Imunoglobin


27/72


28/72

Antitijela

• Antitijela (a krvnogrupne antigene dijele se i premana%inu dejstva$ odnosno prema sposobnosti da stupaju ureak)iju sa odgovarajućim antigenom suspendovanim u

slanom +i(iološkom rastvoru$ na: kompletna iinkompletna

• 1ako.er$ postoji podjela antitijela s ob(irom naspe)i+i%nost antigena:

* Monoklonska antitijela "antitijelo koje se ve/e na samo jedan antigen'

* 3oliklonska antitijela


29/72

Otkriće monoklonskih antitijela

• 7 odnosu na spe)i+i%nost antigena$ postoje dva tipaantitijela:

* Monoklonska antitijela "spe)i+i%na'

* 3oliklonska antitijela "nespe)i+i%na'5* 3oloklonska antitijela su heterogena-proi(vodi ih više

ra(li%itih klonova ćelija*5* Monoklonska su homogena jer nastaju od jednog klona

ćelija*


30/72

Historijat

Paul 'rlic$ utemeljiteljimunologije$ /elio pronaći lijek

koji bi uništio mikroorgani(me$be( štetnog djelovanja na%ovjeka*


31/72

Historijat

•


32/72

>e+ini)ija i podjela

• $onoklonska antitijela su supstan)e proi(vedene ulaboratorijama koje spe)i+i%no prepo(naju odre.enestrukture na površini malignih ćelija kao što su naprimjer proteini* Svako monoklonsko antitijeloprepo(naje samo jedan )ilj "spe)i+i%an protein iliantigen*'

• "ipovi monoklonski antitijela:

1. Mišja monoklonska antitijela 2. Himerična monoklonska antitijela

3. Humanizirana monoklonska antitijela


33/72

7potreba monoklonskihantitijela

• bog visokog spe)i+i%nog i selektivnog ve(anja (aantigen koriste se u:

* In vitro dijagnosti)i$ kao terapijski agensi$ kao ligandi uimunoa+initetnoj hromatogra+iji$ katali(i*

* Monoklonska antitijela poka(ala su se u%inkovitim itr/išno isplativim lijekovima (a lije%enje raka*


34/72

na%aj i prin)ip djelovanjamonoklonskih antitijela

• Stalna upotreba novih biotehnloških metoda jere(ultirala$ ne samo potpuno novim lijekovima$ nego inovim metodama istra/ivanja i ra(voja proi(vodnje

lijekova u novonastalim i br(o rastućim biotehnološkimlaboratorijama i kompanijama*

• ova slektivno molekulska grana medi)ine - ra(voj novih

lijekova je ba(iran na monoklonskim antitijelima*


35/72

na%aj i prin)ip djelovanjamonoklonskih antitijela

• a biotehnologiju je interesantan je na%in na koji antitjelaprepo(naju strane tvari i na njih se ve/u*

• Svako monoklonsko antitijelo prepo(naje samo jedan )ilj"spe)i+i%an protein ili antigen'$ potom mo/e da uništimalignu ćeliju i2ili da stimuliše imuni sisitem organi(mada napadne ovaj )ilj*

• Monoklonska antitijela napadaju samo i isklju%ivo

molekul (a koji su spe)i+i%na tako da su ne/eljeni e+ektii(bjegnuti ili (natno smanjeni*


36/72

ako dobiti MA


37/72

>obivanje MA

• B-stani)e umiru kratko nakon što se odvoje od tijela*

• jihov je /ivotni vijek u laboratoriju suviše kratak da bi se

mogao stvoriti toliko veliki klon (a koji bi se moglo ta%noutvrditi koju vrstu antitijela proi(vodi*

• bog tog ra(loga ne mo/e se dobiti ni dovoljna koli%ina

antitijela (a prakti%nu primjenu*


38/72

>obivanje MA

• Nhler i Milstein su pronašli tehni%ko rješenje togproblema*

• 3aradoksalno rješenje - upotreba stani)a raka

• Stani)e raka su vrlo prikladne (a u(goj$ u primjerenimlaboratorijskim uvjetima one će rasti i dijeliti sebeskona%no$ kombiniranjem sposobnosti B-stani)a da

proi(vode antitijela s pseudobesmrtnošću stani)a rakamogu dobiti velike koli%ine monoklonskih protutijela*


39/72

>obivanje MA

• 1e/ak je bio (adatak usavršavanje neke metodestvaranja hibridoma stani)a$ ali već nekoliko godinanakon po%etnih uspjeha Milsteina i Nhlera$ ti su

postup)i dotjerani i uvedeni u svakodnevnu praksu ustotinama laboratorija *

• 7 po%etku se to radilo miješanjem stani)a s virusima$ a unovije je vrijeme ustanovljeno da taj (adatak još bolje

mo/e obaviti jednostavna i je+tina supstan)apolietilenglikol*


40/72

>obivanje MA

• a dobivanje monoklonskih antitijela naj%ešće se koristestani)e sle(ene i stani)e mijeloma "stani)e tumora koštanesr/i' miša koje su kan)ero(ni oblik B-stani)a*


41/72

>obivanje MA

• ora)i u produk)iji monoklonskih antitijela:

* Imuni(a)ija eksperimentalne /ivotinje /eljenim antigenom

* I(ola)ija B lim+o)ita i( lim+nog %vora ili sle(ene

F* 4u(ija sa stani)ama mijeloma* Selek)ija in vitro u HA1 medijumu 51estiranje supernatanta

kulture na prisustvo antitijelala"!ISA$ 8IA'

L* I(dvajanje /eljenog klona

P* I(dvajanje i pre%išćavanje antitijela

K* 3roduk)ija monoklonskih antitijela


42/72

>obivanje MA

• Imuni(a)ija eksperimentalne (ivotinje /eljenimantigenom "imuni(a)ija miša na stimulisanu produk)iju

A1'• Inokula)ija antigena se vrši subkutano ili

intraperitonealno


43/72

>obivanje MA

• 4u(ijom nastaju hibridoma stani)e: trajne stani%ne linijekoje i(lu%uju monoklonalna antitijela


44/72

>obivanje MA

• Hibridoma stani)e se dalje :

a' injektiraju u miša "in vivo' & u abdomenalnoj šupljini se

stvara tekućina bogata antitijelima "as)ites'b' u(gajaju u mediju (a kulturu stani)a "in vitro &

antitijela se ispuštaju u medij ") Q R g2ml' u kojemnema "ili ima vrlo malo' seruma


45/72

>obivanje MA


46/72

3rimjena MA


47/72

3rimjena MA

• 3oduslovi (a primjenu MA :• visoka ekspresija na površini ćelija• ne eksprimiraju se na ćelijama od vitalnog (na%aja• odsustvo (na%ajne toksi%nosti u slu%aju kompletne

elimina)ije antigen po(itivnih ćelija• stabilna genetska struktura antigena "nema muta)ija ili

varija)ija'• neophodan (a kriti%ne biološke +unk)ije ili ćelijsko

pre/ivljavanje• ne dola(i do modi+ika)ije nakon ve(ivanja antitijela


48/72

3rimjena MA

• Monoklonska antitijela se mogu primjenjivati u:

* >etek)iji ra(li%itih proteina u tjelesnim te%nostima" lisa testovi' & )itokini$ tumorski markeri$ hormoni itd*

* Imuno+enotipi(a)iji ćelija & ra(li%iti tipovi lim+o)ita$ ćelije$ makro+agi*

F* Imunohistohemiji- ra(li%itih proteina u tkivima$ ćelijskihre)eptora itd*

• 3rimjena monoklonskih antitijela mo/e biti : in vitro i invivo*

• In vivo primjena: dijagnostika$ terapija i pro+ilaksa*


49/72

3rimjena MA u dijagnosti)i

• Identi+ika)ija ćelijskih antigena: prema )itoskeletalnimproteinima$ antitijela prema organ-spe)i+i%nim antigenima

• Identi+ika)ija solubilnih antigena: hormoni$ en(imi$ i druge

biološki aktivne supstan)e• Identi+ika)ija bakterijskih$ virusnih i para(itnih antigena• U terapiji se primjenjuju kao :

• -Anti-tumorski agensi " u terapiji nekih vrsta tumora pluća'• -Imunosupresivni agensi " u transplata)iji nekih tkiva i

organa'• -Anti-toksinski agensi " u neutrali(a)iji toksina nekih gljiva


50/72

3rimjena MA u pro+ilaksi

• Aktivna i pasivna imuni(a)ija• Aktivna imuni(a)ija- imunosistemu domaćina se

pre(entira prikladan antigenski stimulans• 3asivna imuni(a)ija- unošenje gotovog imunoreaktivnog

seruma$ unošenje puri+ikovanih antitijela


51/72

Her)eptin

Monoklonsko antitijelo protivrbB- onkoproteina

erbB- gen prekomjernoeksprimiran u T FR@slu%ajeva raka dojkeUe(anjem Her)eptina navanstani%nu domenu rbB-inhibira se rast stani)a kojeeksprimiraju taj onkoprotin


52/72

!ISA test

• ' nzyme Linke! I mmunosorbent &ssay• "#munoa!sor$cioni enzimski test%

'nz-me Linked Immunosorbent &ssa-(Imunoadsorpcioni enzimski test)


53/72

!ISA test

• Svra testa: detek)ija patogena$ identi+ika)ija hemijskihkomponenata i toksina*

• 3rednosti:

* lahkoća pri i(vo.enjuG* br(ina pri i(vo.enjuG

F* primijenjljivost na veći broj patogenaG

* mogućnost djelimi%ne automati(a)ijeG

L* mogućnost anali(e većeg broja u(oraka


54/72

!ISA test

• Interak)ija antitijelo-antigen klju% (a !ISA test*• n(im kao EmarkerE (a antitijelo*• 1ipi%ni supstrat-en(im kompleksi:• - alkalna +os+ata(a "en(im' sa para-nitro+enol +os+atom

"supstrat'G• - peroksida(a hrena "en(im' sa tetrametilben(idinom

"supstrat'*


55/72

!ISA test

Vvrsti$ +i(i%ki nosa%reak)ije:

- mikrotitarske plo%eG - papirne membraneG - polistirenske lopati)e*


56/72

lisa test

• 3rin)ip metode: konjuga)ija en(ima sa antigenom iliantitijelom*

• >etek)ija en(ima: dodatkom be(bojnog supstrata i

mjerenjem en(imske aktivnosti


57/72

lisa test

• Mjerenje inten(iteta boje kolorimetrijski*• >irektno propor)ionalan sadr/aju spe)i+i%nih antitijela u

ispitivanom materijalu*• >etek)ija krajnjeg re(ultata: okom ili spektro+otometrijski*


58/72

lisa test


59/72

!ISA test

• 1ipovi !ISA testa :

* Sendvi% !ISA test

* Indirektan sendvi% !ISA test

F* ompetitivan !ISA test


60/72

!ISA test

Sendvi/ 'LIS& test


61/72

!ISA test

Sendvič ELISA test


62/72

!ISA test

• Indirektan sendvi/ 'LIS& test 0• >etek)iono protutijelo ne nosi ve(ani

en(im$ već posebne marker molekule kojeće se spe)i+i%no ve(ati (a drugu molekulu$npr* protein*

•

Biotin kao marker*• Biotin & avidin en(im*


63/72

!ISA test

• ompetitivan 'LIS& test


64/72

!ISA test

3rednosti i nedosta)i !ISA


65/72

3rednosti i nedosta)i !ISAtesta

• 1S+'"L+IV1S" • Osjetljivost većine !ISA testova je RL

ćelija2ml* ovaj relativno ni(ak nivo jeosnovni nedostatak korištenja ovog tipatesta*



66/72


• SP',I2I3*1S" • !ISA test treba da ima odgovarajuću spe)i+i%nost

niskog broja la/nih negativnih i prihvatljiv broj la/no

po(itivnih re(ultata* Antitijela koja se koriste bi trebala daimaju visok a+initet (a spe)i+i%ne antigene*

• >va tipa antitijela koja se koriste u !ISA testu sumonoklonska i poliklonska*

• Jedan od nedostataak korištenja poliklonskih antitijela jetaj da se oni dobijaju ili i( (e%ijeg ili ko(ijeg seruma pri%emu mo/e doći do ra(li%itosti u imunom odgovorura(li%itih /ivotinja*



67/72


• Monoklonska antitijela su više spe)i+i%na idjeluju na jedno antigeno mjesto*

• Uećina !ISA testova je br(a " anali(a od-L dana je svedena na -FR sati'*


68/72

8e(ime

• Imunitet & odbrambeni mehani(am koji štiti organi(amod štetnih uti)aja mikroba i sli%nih stranih agenasa*

• Imunološki sistem - skup ćelija $ tkiva i molekula koji

posreduju u otpornosti na in+ek)iju a koordinisanareak)ija tih ćelija i molekula na in+ektivnemikroorgani(me predstavlja imunološki odgovor.

• 4elije imunološkog sistema 0 lim+o)iti$ granulo)iti$

mono)iti2makro+agi****• &ntigen je molekula koja poti%e stvaranje antitijela$

odnosno imunu reak)iju u organi(mu*


69/72

8e(ime

• Podjela antigena :

* Antigeni klase koje se nala(e u svim ćelijama*

* Antigeni klase koje se nala(e jedino u imunim

ćelijama5* &ntitijela (imunoglobulini) - proteini2bjelan%evine i(

grupe globulina - Markiraju9 se antigenima*5* Svako antitijelo se sastoji od dva jednaka teška lan)a

"heavy chains, H ' i dva laka lan)a "light chains, L' koji sukovalentnim disul+idnim mostovima me.usobno pove(aniu strukture oblika slova "D'*


70/72

8e(ime

• 7 odnosu na spe)i+i%nost antigena$ postoje dva tipaantitijela:

* Monoklonska antitijela "spe)i+i%na'

* 3oliklonska antitijela "nespe)i+i%na'5* $onoklonska antitijela su supstan)e proi(vedene u

laboratorijama koje spe)i+i%no prepo(naju odre.enestrukture na površini malignih ćelija kao što su na

primjer proteini*5* 4u(ijom nastaju hibridoma stani)e: trajne stani%ne linije

koje i(lu%uju monoklonalna antitijela


71/72

8e(ime

• 3rimjena MA : detek)ija ra(li%itih proteina u tjelesnimte%nostima$ imuno+enotipi(a)iji ćelija te uimunohistohemiji*

• Svra 'LIS& testa: detek)ija patogena$ identi+ika)ijahemijskih komponenata i toksina*

• Interak)ija antitijelo-antigen klju% (a !ISA test*• 3rin)ip metode: konjuga)ija en(ima sa antigenom ili

antitijelom*• 1ipovi !ISA testa : sendvi% !ISA test$ indirektan

sendvi% !ISA test$ kompetitivan !ISA test*


72/72

Hvala na pa/nji

Seminarski Rad - Biotehnoligija (Monoklonska Antitijela)

Documents

Transcript of Seminarski Rad - Biotehnoligija (Monoklonska Antitijela)