SEMINAR Mehanika citoskeleta -...

SEMINAR

Mehanika citoskeleta

Avtor: Samo Stajner

Mentor: doc. dr. Primoz Ziherl11. 11. 2010

Povzetek

V seminarski nalogi predstavimo nekaj fizikalnih modelov, ki opisujejomehaniko celice. Poudarimo teorijo entropicne elasticnosti filamentov. Uvede-mo persistencno dolzino. Pogledamo zamrezitev citoskeleta v dveh in trehdimenzijah. Na koncu omenimo se ostale fizikalne modele, ki so v razvoju inpojasnjujejo mehanske lastnosti celice. Raziskovalno dejavnost na podrocjumehanike celice postavimo v sirsi kontekst mehanotransdukcije in pogledamosmernice bodocega raziskovanja.

Kazalo

1 Uvod 1

2 Filamenti v celici 1

3 Mrezne strukture citoskeleta 5

4 Sklep 11

2 FILAMENTI V CELICI

1 Uvod

Motivacij za raziskovanje mehanskih lastnosti citoskeleta je zagotovo dovolj. Ze samorazumevanje obnasanja osnovnih gradnikov, iz katerih smo kot ziva bitja zgrajeni,je zadostni razlog za nase raziskovanje. Seveda pa obstaja poleg te najbolj osnovnemotivacije, ki izhaja iz radovednosti, se prakticna. V kolikor bi zeleli namrec posegativ nasa telesa in medicinsko pristopati k nepravilnostim in bolezenskim stanjem terjih odpravljati, moramo poznati lastnosti in naravo obravnavanih celic.

Elasticne lastnosti rdecih krvnick nam lahko povedo, kako hitro se bodo pre-mikale po kapilarah, kaksen bo njihov odziv na skrcitve, ko preidejo v kapilare,in podobno. Po drugi strani lahko tudi odkrijemo, kako delujejo misicna tkiva inkaj daje misicam trdnost in elasticnost, da lahko opravljajo svoje naloge. Ce lahkorazumemo delovanje misic, lahko morda identificiramo tudi napake v njihovem de-lovanju in jih odpravljamo.

Slika 1: Primer citoskeleta vevkariontski celici [2]. Zeleno jeobarvan polimer aktina, rdece panjegovi monomeri.

Celica ni samo s celicno membrano omejena cito-plazma, ampak vsebuje organele, ki so na mem-brano in drug na drugega pritrjeni s citoskeletom,kot prikazuje slika 1 [1]. Zaradi notranje strukturelahko celice kontrolirajo in spreminjajo svojo velikostin obliko, se zoperstavljajo zunanjim napetostim invodijo lastno celicno dinamiko. Vse to jim omogocacitoskelet, katerega mehaniko bomo obravnavali vtej seminarski nalogi. Citoskelet sestavljajo protein-ski filamenti razlicnih trdnosti in dolzin, ki delujejopodobno kot palice ali ohlapne vrvi [1]. Te se lahkopreko posebnih sidrisc pripnejo na celicno membranoin druge organele v celicah ter jih tako povezujejo inohranjajo njihovo relativno razdaljo [1].

Mnoge vidike mehanike celice lahko pripisemocitoskeletu in poiscemo fizikalne modele, s katerimi sezelimo cim bolj priblizati izmerjenim lastnostim celic. Taksen pristop je v svoji osnovifenomenoloski in deluje dobro, dokler je obravnavana celica razmeroma preprosta.Lahko pa model sestavimo iz enostavnih gradnikov citoskeleta, katerih lastnosti smoze raziskali. S tem pristopom smo sposobni napovedati in predvideti sirsi spekterpojavov v celici, zato mu bomo v zacetku tudi podrobneje sledili.

2 Filamenti v celici

Za zacetek klasificirajmo monomere, ki se bodo povezovali v citoskeletne filamente.Vsi glavni deli citoskeleta — to so aktin, intermedialni filamenti in mikrotubuli —so sestavljeni iz proteinskih podenot. Vsaka proteinska podenota je lahko tudi samadolga veriga iz vec deset ali sto aminokislin [1]. V podrobnejso strukturo citoskeletnihfilamentov se na tem mestu ne bomo spuscali, temvec bomo samo pogledali dimenzijenekaterih pomembnejsih predstavnikov.

1


Slika 2: Mikrotubul, aktin in intermedialnifilament. Filamenti so sestavljeni iz protofil-amentov, ki so polimerne verige [3].

V cloveskih eritrocitih sta dve sklen-jeni verigi, vsaka sestavljena iz pre-pletenih in med seboj razlicnih molekulspektrina (imenovani α in β). Ti dve ve-rigi sestavljata 200 nm dolg citoskeletnifilament [1]. Molekulski masi verig αin β sta 230000 oziroma 220000 Da. Izteh podatkov ugotovimo, da je skupnadolzinska masa tetramera 4500 Da/nm[1].

Nekoliko debelejsi filament kot spek-trin tvori protein aktin (slika 2). Ele-mentarni gradnik aktina je protein G-aktin, ki je veriga 375 amino-kislin inima molekulsko maso 42000 Da. Pro-teini G-aktina se zdruzijo v protofila-ment F-aktin, dva protofilamenta pa seprepleteta v aktin. Povejmo se, da staverigi sami zase neobstojni. Na stabil-nost proteinov lahko vpliva ionska struk-tura celicne raztopine, vendar pa je tunestabilnost povezana predvsem s samo strukturo F-aktina. Aktin ima premer okoli8 nm in maso na dolzinsko enoto 16000 Da/nm [1].

Intermedialni filamenti so se sirsi od F-aktina, hkrati pa imajo tudi bolj kom-pleksno strukturo. Vecinoma jih sestavlja 8 protofilamentov, ki lezijo drug zravendrugega v krogu in tako ustvarjajo intermedialni filament s premerom priblizno 10nm. Mnogi monomeri, ki sestavljajo intermedialne filamente imajo mase v rangu40000 − 700000 Da in povprecno dolzino okoli 50 nm. Hitro preracunamo, da jemasa na dolzinsko enoto teh protofilamentov 4500 Da/nm. Intermedialni filament jesestavljen iz 32 takih niti, tako da je njegova masa na dolzinsko enoto 35000 Da/nm.

Najdebelejsi individualni citoskeletni filamenti so mikrotubuli, ki jih sestavljataproteina tubulin α in β. Vsak izmed njiju ima maso okoli 50000 Da. Para obehrazlicic proteina sestavljata 8 nm dolg monomer. Monomeri tvorijo protofilament,13 takih protofilamentov pa se uredi v vijacnico in tvori votel mikrotubul, velikostnavoja pa je pogojena s polozajem aminokislin, ki lahko tvorijo intermolekulskevezi vzdolz posameznih mikrofilamentov. Masa na dolzinsko enoto mikrotubula jeposledicno najvecja izmed vseh obravnavanih, 160000 Da/nm. Ta vrednost je de-setkrat vecja kot pri aktinu. Dolzinske mase so pomembne, ker posredujejo infor-macijo o sirini filamentov, pricakujemo pa lahko, da bodo sirsi filamenti manj gibki[1].

Filamenti lahko obstajajo izven celic in jih najdemo v raznih vezivnih tkivih.Najbolj osnoven primer so proteinske komponente celulozne stene pri rastlinskihcelicah. Podrobneje posameznih protofilamentov ne bomo obravnavali. Pomembnose je zavedati, da se zaradi razlike v debelini in organizaciji protofilamentov ak-tin, mikrotubuli in drugi filamenti mocno razlikujejo v svojih mehanskih lastnostihna celicni skali. Tako se mikrotubuli s persistencno dolzino nekaj milimetrov na

2


mikrometrski skali celic obnasajo kot trde palicice, medtem ko sta aktin in spektrinbolj podobna gibkim nitim [1].

Elasticnost citoskeletnih filamentov

Pri absolutni nicli bi bili vsi citoskeletni filamenti ravni. Pri koncnih temperaturahpa njihova oblika fluktuira. Sposobnost ukrivljanja je zelo pomembna za elasticnelastnosti struktur, ki jih filamenti gradijo. Zato je pomembno, da ugotovimo, kaksneso elasticne lastnosti posameznih citoskeletnih filamentov. Iz elastomehanike poz-namo modele, ki napovedujejo potrebno energijo za ukrivljanje kontinuumskih palic.Preko te teorije lahko pridemo do modela Kratkyja in Poroda, ki napoveduje celotnoelasticno energijo filamenta [1,4]:

Ebend =κf

2

∫ Lc

0

(∂t

∂s

)2

ds. (1)

Tu predstavlja κf upogibni modul palice, t tangencialni vektor in s vzdolzno ko-ordinato filamenta. Ker je upogibni modul sorazmeren z Youngovim modu-lom Yin vztrajnostnim momentom preseka J citoskeletnega filamenta, se vrednost κf zarazlicne mikrofilamente razteza cez 6 velikostnih redov [1,4].

Ocitno so lastnosti citoskeletnih filamentov odvisne od Youngovega modu-laprotofilamentov in predvsem od nacina, kako se vec takih protofilamentov urediv vecjo tvorbo, saj bo od tega odvisen njihov vztrajnostni moment preseka. Vpel-jemo lahko persistencno dolzino citoskeletnega filamenta, ki je direktno merilo zanjihovo togost in je definirana kot [1]

ξp =κf

kBT=

Y JkBT

. (2)

Vidimo, da je persistencna dolzina odvisna od temperature. Z narascajoco tem-peraturo ima namrec citoskeletni filament na razpolago vec termicne energije, skatero lahko doseze bolj ukrivljena stanja. Vecja ξp pomeni manjse ukrivljanje fil-amenta, bolj tocno zvezo med ukrivljenostjo in persistencno dolzino pa lahko na-jdemo s statisticno obravnavo. Korelacijska funkcija tangente vzdolz filamenta jeeksponentna [1,5]

〈t(0) · t(s)〉 = exp (−s/ξp). (3)

Ta rezultat pove, da filamenti z zelo kratko persistencno dolzino postanejo zelohitro poljubno ukrivljeni. Na celicni skali je tako aktin skoraj prosto gibka nit.Njegova persistencna dolzina znasa priblizno 50 nm, medtem ko se mikrotubul spersistencno dolzino nekaj mm na mikrometrski skali skoraj ne ukrivi [1].

Energije ukrivljanja se med razlicnimi konfiguracijami citoskeletnih filamentovrazlikujejo. V splosnem se citoskeletni filamenti interno ne vezejo strukturno inobravnavamo vse njihove mozne konformacije. Vprasamo se lahko, kaksna je pridani temperaturi njihova povprecna ukrivljenost, ki jo prikladno opise razdalja medkrajiscema filamenta ree = r(Lc) − r(0). Ce je filament tezko upogniti, bo ree zeloblizu njegovi dolzini, ce pa bo zelo gibek, je lahko razdalja med krajiscema dostimanjsa od njegove dolzine.

3


Citoskeletne filamente z doloceno persistencno dolzino lahko obravnavamo kotpalico. Dostikrat pa je prikladneje razmisljati o filamentih kot o gibkih verigah,kjer je dolzina segmenta primerljiva s persistencno dolzino, tako da je naslednjisegment lahko usmerjen poljubno. V diskretni reprezentaciji je statisticna obravnavapreprostejsa, rezultat pa mora biti enak, kot ce bi vzeli za filament palico. Rezultatpovprecne vrednosti vektorja odmika pri dolzini citoskeletnega filamenta Lc je [1,5]

〈r2ee〉 ∼= 2ξpLc. (4)

Veriga se vecino casa nahaja v kofiguraciji, katere vektor razmika krajisc je vokolici svoje povprecne vrednosti. Razlog za to je veliko stevilo realizacij stanj sto vrednostjo ree. Ce bi polimer zeleli raztegniti ali skrciti, bi se temu zoperstavilin bi deloval kot vzmet. Elasticnost citoskeletnih filamentov je potem entropijskenarave. V primerjavi s Hookovo vzmetjo lahko taksni ’polimerni vzmeti’ pripisemokonstanto vzmeti [1]

ksp =3kBT

Nb2=

3kBT

2ξpLc

. (5)

Ta rezultat lahko uporabimo samo za majhne raztezke od povprecne dolzine.Citoskeletni filamenti imajo namrec koncno dolzino in se zaradi tega v rezimuvelikega raztezka ne obnasajo vec linearno. Za polimere poznamo resitev v oblikiLangevinove funkcije [5], za nas primer pa je se bolj pomemben rezultat Kratkyjain Poroda [1], kjer je sila f takole odvisna od raztezka x pri dolzini filamenta Lc

ξpf

kbT=

1

4

(1− x

Lc

)−2

− 1

4+

x

Lc

(6)

Ta formula dobro opisuje eksperimentalno dobljene rezultate tudi za vecje raztezke,ceprav se lahko na nekaterih intervalih od izmerjenih vrednosti razlikuje tudi do 15%[1]. V naslednjem podpoglavju si bomo ogledali nekaj meritev persistencnih dolzin.

Meritve persistencne dolzine v celicah

Metode za meritve persistencnih dolzin so zelo raznolike. Z aspiracijsko metodoso na primer dolocili persistencno dolzino mikrotubula [6]. Na sliki 3 vidimo, daso mikropipeto prislonili na vezikel z mikrotubulom in izcrpavali okolno raztopino.V rezimu majhnih odmikov so tako izmerili persistencno dolzino mikrotubula. Pridoloceni vrednosti aspiracijskega tlaka se je mikrotubul sesedel in vidimo lahkopopolnoma sfericno obliko vesikla. Rezultat meritve, ki znasa 6.3 mm [6], pada vinterval rezultatov, ki jih ponujajo druge metode [1].

Z metodo fluorescentne mikroskopije so izmerili gibanje aktina ob zunanjemvzbujanju njegovega krajisca [7]. Vzbujanje je potekalo preko opticne pincete, skatero so premikali na krajisce aktina pripet delec. Na ta nacin so opazovali vzbu-jene transverzalne valove in primerjali rezultate s teorijo. Rezultati so se skladali spolimerno teorijo citoskeletnih filamentov [1], izmerjena vrednost (9 µm) pa je sevedno v intervalu pricakovanih vrednosti. Druge metode dajo nekoliko visje vred-nosti, tako da lahko predpostavimo, da je mehanicno vzbujanje filamenta oslabilonjegovo strukturo in s tem zmanjsalo persistencno dolzino [7].

4

3 MREZNE STRUKTURE CITOSKELETA

Slika 3: Aspiracijski poizkus, vkaterem so obremenjevali vezikel, kivsebuje mikrotubul in je zaradi tegapodolgovat. Pri aspiracijskem tlaku80 Pa se mikrotubul sesede. [6]

Eksperimentalni podatki so zbrani v tabeli1. Opazimo lahko, da se rezultati nahajajo zno-traj predvidenih vrednosti, ki jih napovedujeteorija. Teoreticni minimum persistencne dolzinespektrina je denimo 2.5 nm. Do tega rezul-tata pridemo z upostevanjem dolzine monomeraspektrina, ki je okoli 5 nm. Vemo, da je per-sistencna dolzina za idealno gibko verigo karξp = b/2 = 2.5 nm [1]. Monomeri seveda nisoidealno gibki, zato je rezultat meritev vecji insicer v obmocju 10− 20 nm.

Do podatkov o persistencni dolzini pogostopridejo tudi posredno z aspiracijskim eksperi-mentom membranskega citoskeleta, kjer natorekonstruirajo vrednost persistencne dolzinepreko elasticnih konstant citoskeleta, ki ga se-stavljajo posamezni citoskeletni filamenti [8-10].V nadaljevanju si bomo ogledali, kako se fila-menti povezujejo v citoskelet. Najprej si bomo pogledali membranski citoskelet indokaze zanj, nato pa se bomo lotili se celicnega citoskeleta.

polimer λp (Da/nm) ξp (nm)dolgi alkani ∼ 110 ∼ 0.5spektrin 4500 10-20DNA 1900 53± 2F-aktin 16 000 10− 20× 103

intermedialni filament 35 000 —mikrotubul 160 000 1− 6× 106

Tabela 1: Masa na dolzinsko enoto nekaterih citoskeletnih filamentov in njihova persis-tencna dolzina [1]. Za primerjavo sta navedeni se vrednosti dobro znanih makromolekul(DNA, alkani). Opazimo, da je togost sorazmerna z narascajoco maso na enoto dolzine.

3 Mrezne strukture citoskeleta

Spoznali smo filamente, ki so sestavni del citoskeleta, nic pa se nismo povedali osamem citoskeletu. Zamislimo si lahko zelo veliko nacinov vezave filamentov v vecjeorganizirane strukture. Pogledali si bomo tvorbo mreznih struktur na celicni mem-brani. Za obravnavo celicnih membran se izkaze, da nekaterih njihovih lastnosti nemoremo razloziti brez vpeljave mreznega citoskeleta [10]. Tako nam te meritve ponu-jajo direktno potrditev, da bo model dvodimenzionalnega mreznega citoskeleta namembrani upravicen.

Najprej poglejmo, kako se aktin, spektrin in drugi filamenti povezujejo v kom-pleksnejse strukture. Dvodimenzionalne mreze so sestavljene iz filamentov, ki sopreko sidrisc v celicni membrani pripeti nanjo. Sidrisca v eritrocitu na primer pred-stavlja protein ankirin, ki se za vezavo na citoskeletne filamente poveze z integralnim

5


proteinom band 3. Vezi med sidriscem in filamentom so navadno kovalentne (es-terske) in orientirane. Povejmo se, da navadno v sidriscih sodeluje tudi aktin (slika4) [1].

Slika 4: 2D citoskeletna povecanem delu mem-brane [11]. Vidimo lahkoheksagonalno mrezo prekosidrisc na celicno mem-brano pripetega spektrina.

Filamenti se lahko na membrano sidrajo po celi svojidolzini, tako da se lahko en sam filament razteza prekomnogo sidrisc. Takrat si lahko predstavljamo, da je vsaksegment med sidriscema locena vzmet. Taksen citoskeletsestavlja v primeru eritrocita spektrin, ki se na celicnomembrano veze preko okoli 75 nm oddaljenih sidrisc. Kerje tipicna velikost spektrina okoli 200 nm, se spektrin medvozlisci ze lahko obnasa kot entropijska vzmet. Dejanskolahko povrsino eritrocita raztegnemo kar za faktor 7, cejo obremenimo z zadosti veliko raztezno silo. Tako je tudizato, ker eritrocit nima notranje strukture, recimo jedrain drugih organelov. Posledicno ne vsebuje mikrotubulov,ki bi tvorili volumski citoskelet.

Elasticne lastnosti dvodimenzionalnih struktur soodvisne od povezanosti in simetrije mreze. Mrezenavadno nimajo samo izkljucno stiristevne, petstevne aliseststevne povezanosti, ampak lahko zavzamejo razlicnekonfiguracije po prostoru, kjer se razpredajo. Vendar postajajo stanja z visjimstevilom povezav na vozlisce cedalje tezje dosegljiva, saj se mora na manjsem pros-toru urediti vecje stevilo filamentov. Hkrati se moramo zavedati, da vezi niso trajnein cim vecje je stevilo povezav na sidrisce, tem vecja je verjetnost, da se bo kaksnavez razgradila ali preuredila. Tako lahko pogledamo, kaksne so lastnosti pravil-nih kvadratnih in heksagonalnih mrez, nato pa primerjamo napovedane rezultatez izmerjenimi in ugotovimo, koliksno je odstopanje od idealne mreze.

Rezultati racuna za seststevne mreze nam dajo naslednje elasticne konstante [1]

KA =

√3ksp2

(1− τ√

3ksp

), (7)

µ =

√3ksp4

(1 +

√3τ

ksp

). (8)

KA je kompresijski modul, µ je strizni modul in ksp je konstanta vzmeti iz enacbe(5). Ucinek predobremenitve z izotropno dvodimenzionalno napetostjo τ opisujetaizraza v oklepajih v enacbah (7) in (8) [1].

Pri izracunu entalpije heksagonalne mreze ugotovimo, da se pri kompresijskemtlaku, vecjem od τcoll =

√3ksp/8, mreza sesede in postane njena povrsina enaka 0.

Do kolapsa pride, ker je energijsko ugodneje utrpeti malo vecjo deformacijo vzmeti,kot pa izpostavljati povrsino veliki povrsinski napetosti [1].

Kvadratna mreza ima 3 elasticne konstante: KA je znova kompresijski modul,µs in µp pa sta strizna modula obeh moznih nacinov striga za kvadratno mrezo.Rezultati, ki vkljucujejo tudi predobremenjeno strukturo, so:

KA =ksp − τ

2,

6


µp =ksp + τ

2, (9)

µs = τ.

Pri kvadratnih mrezah je zanimivo, da pride do kolapsa mreze takoj, ko mrezopredobremenimo s kompresijsko silo τcoll < 0. Do tega pride zato, ker se lahkokvadratna mreza poklopi v kolinearno obliko brez spremembe dolzine katere koliizmed vzmeti.

V resnici seveda nimamo pravilnih mreznih struktur. Tudi razmiki med sidrisciin dolzine veznih filamentov niso fiksni. Lahko pa izmerimo razmerja med elasticnimikonstantami in jih primerjamo z izracunanimi. Tako hitro vidimo, ali se vrednostinahajajo v obmocjih, ki jih taka obravnava napove.

Meritve membranske elasticnosti

Slika 5: Levo so prikazane dejan-sko opazene ehinocitne oblike er-itrocita, desno pa simulirane ob-like z modelom, ki poleg upogib-nosti lipidnega dvosloja vkljucujese membranski citoskelet [10]. Zeloznacilni so izrastki na izbocenem er-itrocitu (ehinocitu), ki jih lahko re-produciramo samo z upostevanjemcitoskeleta. Brez citoskeleta bi sebilo izrastkom energijsko ugodnejeodcepiti in tvoriti vesikel.

Osnovno vprasanje je, ali lahko z eksperimentomdokazemo prisotnost membranskega citoskeleta.Elasticne lastnosti membran bi lahko pripisalizgolj lipidnemu dvosloju, ki sestavlja celicnomembrano. Izracuni [8] so reproducirali vecinooblik, ki jih v normalnih pogojih zavzame eri-trocit. Taksna preprosta teorija pa vendarlene more pojasniti pojava izrastkov (spikul) namembrani, kar je tudi neposredni dokaz dvodi-menzionalnega citoskeleta [10].

V eksperimentu so eritrocit, ki je velik okoli8 µm, deformirali s spreminjanjem medija, vkaterem se nahaja. Tako so s spreminjanjem pH,slanosti, koncentracije holesterola in podobnegadosegli, da se je celica najprej raztezala, natopa krcila. Teoreticne napovedi oblik eritrocita,zasnovane na modelu, ki vkljucuje tako upo-gibno elasticnost dvosloja kot elastomehanikomembranskega skeleta, se popolnoma ujemajoz eksperimentalno opazenimi oblikami (slika 5)[10]. Citoskelet v tem primeru nudi dodatno to-gost in strizno elasticnost ter prepreci, da bi semembrana razletela [10].

Dve skupini sta racunalnisko modeliralivelike in majhne deformacije membranskegacitoskeleta cloveskega eritrocita [8,9]. Prvaskupina je izhajala iz teorije, ki smo jo povzeliv prejsnjem poglavju, in dobro reproduciralameritve, dokler niso prisli v rezime zelo velikihraztezkov. Takrat niso opazili ne kolapsa nepricakovanega razmerja med elasticnima modu-loma kompresije in striga [8].

7


Druga skupina je spektrinske filamente modelirana z bolj realisticnim modelom.Njihove numericne simulacije so pokazale dobro ujemanje s podatki (slika 6), kjer somodelirali tri razlicne zacetne pogoje [9]. Napovedali so rahlo anizotropijo, ki izvira izpredpisanih pritrdisc na membrani [9]. Vendar pa njihove napovedi za velike raztezkeizpodbijajo direktne fluorescentne mikroskopske meritve. Razliko pripisujejo dejstvu,da vecina eksperimentov poteka in vitro, ne in vivo. Upostevati je potrebno, da seziva celica na zunanje obremenitve odzove [8,9].

Slika 6: Na ordinati je razmerjemed dolzino vsesane membrane Lin polmerom mikropipete Rp. Naabscisi odberemo aspiracijski tlak.Tocke oznacene s krizci, kvadratki inkrogci, so modelirane vrednosti zatri razlicne modele membranskegacitoskeleta. Pri malih deformacijahte vrednosti dobro sovpadajo z mer-itvami, ki jih prikazujejo sivi trikot-niki [9].

Elasticne lastnosti membranskega citoskeletaso opazovali tudi preko termicnih fluktuacijcelicne membrane [1]. Mikroskopske metode dajorezultate, ki so za velikostni red manjsi kot primikromanipulativnih eksperimentih. Ni popol-noma jasno, zakaj pride do tako velike razlikepri teh dveh tehnikah. Mozno pa je tudi, da selastnosti citoskeleta znatno spremenijo v inte-rakciji z mikropipeto ali lasersko pinceto [1].Za predstavo navedimo, da je pri mikromani-pulativnih metodah vrednost striznega modulaokoli 5 × 10−6 J/m2, kompresijski modul pa jepriblizno dvakrat vecji.

Izveden je bil se en zelo zanimiv eksperiment,kjer so s kemijskimi spojinami poizkusali unicitiaktinski citoskelet v fibroblastih [12]. Ugotoviliso, da se citoskeletna struktura razgradi v prisot-nosti citohalasina D. Z meritvami so nato opazo-vali mehanske lastnosti fibroblastov z unicenimcitoskeletom [12].

Se ena dodatna anomalija, ki potrebuje raz-jasnitev, je temperaturni odziv spektrinskegacitoskeleta. Tudi to podrocje se raziskujejo, saj bise moral modul pri spektrinu, ce je res entropij-ska vzmet, povecati za 13% na temperaturnemporastu iz 5-45◦C. Zgodi pa se, da proznostnimodul pade za 30%. Mozno je, da se pri tem pojavu zaradi neznanega razlogarazklene stevilo povezanih sidrisc, kar bi ustrezalo znizanju striznega modula brezkrsitve entropijske narave proznosti [1].

Omenimo se, da lahko v lasnih celicah opazimo anizotropijo, ker ima celica ak-tinske filamente, ki jo ovijajo v eni smeri, precno pa za povezanost aktinov skrbijospektrini, ki imajo drugacne elasticne lastnosti. Razliko v elasticnosti glede na smerdeformacije so tudi v resnici izmerili [1].

Prostorski citoskelet

Ko preidemo na obravnavo trirazseznih mrez, se matematicni formalizem bistvenone spremeni. V splosnem lahko recemo, da imamo po celotnem volumnu celicesidrisca in citoskeletne filamente, ki se nanje pripnejo. Potem lahko znova izracunamo

8


elasticne konstante, ki jih bo v treh dimenzijah se vec kot prej, in jih primerjamoz izmerjenimi rezultati. V resnici celica v svoji notranjosti ni tako homogena kotcelicna membrana. Zato je taksna obravnava sicer mogoca, vendar ne nujno najboljrealna [1].

Primerov, kjer bi bila celica volumsko tako homogena in izotropna, da bi lahkoshajali samo s kompresijskim in striznim modulom, prakticno ni. Vedno imamovecje stevilo elasticnih konstant, ki nakazujejo na notranjo strukturiranost celice, kipresega preprosto mrezno interpretacijo [1].

Slika 7: Prag perkolacije nam pove,koliko crnih kvadratkov potrebujemo,da bomo pri nakljucnem razporejanjuneizbezno povezali stranice obmocja zneprekinjeno gruco [13].

Predstavljamo si lahko, da imamo po cito-plazmi prosto plavajoce filamente. Poleg mikro-tubulov, ki so praviloma zelo veliki citoskeletnifilamenti, imamo lahko tudi manjse trdnepalicice, ki lahko dajo citoplazmi nematskitekocekristalni znacaj. To se zgodi, ko se dvaaktina povezeta preko precnih proteinov s ko-valentnimi vezmi, ki dajejo takemu paru precnotrdnost. Taksni proteini so recimo fimbrin, ak-tinin in filaminski dimer.

Kolicina, ki pove, kdaj moramo obravna-vati citoskelet v celici kot mrezo in kdaj kotraztopino ali drugacno mikrostrukturno tvorbo,je perkolacijski prag (slika 7). Naceloma potre-bujemo za tvorbo 3D mreze v celici zadostnostevilo citoskeletnih filamentov, da se bodo lahkopovezali v mrezo, ki bo prepredala celotnocelico. Z manjsanjem gostote filamentov v nekemtrenutku preidemo v rezim, ko se citoskelet ni vecsposoben povezati v trdno strukturo. Tej tocki pravimo prag perkolacije [1].

Razjasnimo, kaj je perkolacija. Predstavljajmo si kvadratno mrezo s 5×5 vozlisci.Ce imamo na voljo samo 8 vezi, ni samoumevno, da se bodo povezale v gruco, kise bo razprostirala med koncema kvadrata. Lahko imamo nekaj locenih povezanihobmocij, vendar taksna struktura ni trdna. Pri sestnajstih vezeh neizogibno dobimoneprekinjeno mrezo, ki se bo razprostirala med robovi obmocja. Pravimo, da smodosegli prag perkulacije [13]. Delez izmed vseh moznih povezav, ki ga potrebujemoza trdno povezano strukturo, je odvisen od simetrije mreze. Rezultati so povzeti vtabeli 2.

Perkolacijo v celici lahko ocenimo, ce izmerimo maso vseh filamentov, ki se na-hajajo v celici. Te meritve so bile opravljene in postavljajo vecino celic v obmocjepolkoncentrirane raztopine filamentov [1]. V tem rezimu je prag perkolacije sicerlahko dosezen, je pa tezko ugoditi strozji zahtevi za perkolacijo trdnosti. Perkolacijatrdnosti nam pove, kdaj bo mreza toliko povezana, da bo tvorila trdno strukturo.Tako lahko celice obravnavamo kot skupek prepletenih filamentov, ki izkazuje viskoe-lasticne lastnosti [1,14].

Do viskoelasticnega obnasanja pride, ce imamo prepletene, vendar ne vezanepolimere. Pri velikih frekvencah se polimeri med sebojno odrivajo in ustvarjajo silokot odgovor na deformacijo. Ce pa je obremenitev dolgotrajna, se ze uspejo raz-

9


mreza z pc(vezi) pc(mest) P ∗(vezi)dve dimenzijisatovje 3 0.653 0.696 1kvadratna 4 0.500 0.593 1trikotna 6 0.347 0.500 2/3tri dimenzijeSC 6 0.249 0.312 1BCC 8 0.180 0.246 3/4FCC 12 0.119 0.198 1/2

Tabela 2: Potreben delez zasedenih vezi ali sidrisc v posameznih simetrijah, da dosezemoperkolacijski prag [1]. P∗ je perkolacijski prag trdnosti in je dosti strozja zahteva odenostavne povezanosti.

plesti in pocasi zrelaksirajo v novo ravnovesno stanje in sila izgine. Matematicniopis viskoelasticnosti poteka preko konstitutivne zveze

σxy = G′(ω)uxy(t) +G′′(ω) · duxy

dt· 1ω, (10)

kjer sta G′ in G′′ realna oziroma imaginarna komponenta striznega modula. Oglejmosi dve limiti. Recimo, da sistem nima nobenih izgub (G′′ = 0). Tedaj je napetostdirektno sorazmerna z odmikom in imamo elasticni odziv snovi. V kolikor pa se vsistemu energija le disipira (G′ = 0), prepoznamo v preostanku enacbe Newtonovzakon za viskozno tekocino σxy = η(duxy/dt), kjer η predstavlja ravno viskoznost.Torej predstavlja G′′/ω od frekvence odvisno dinamicno viskoznost [1,14].

V resnici so izmerili, da vecina celic lezi v polrazredcenem rezimu, kjer je zemogoce opaziti nekatere viskoelasticne znacilnosti. V primeru redkih in koncen-triranih raztopin G′ narasca s frekvenco, kot bi to pricakovali. Pri polrazredcenihpolimerih pa v rezimu srednjih frekvenc lahko opazimo plato, kjer se strizni moduls frekvenco ne spreminja [1].

Ugibamo lahko, da se v tem rezimu polimeri uspejo preplesti do mere, da seobnasajo, kot bi bili sklenjeni in tvorili mrezo. V primerjavi z eksperimentalnimipodatki lahko nato sklepamo na stopnjo razredcenosti filamentov v celicah, ki jolahko preverimo z meritvami gostote citoskeletnih filamentov. Meritve kazejo, da sedolocene celice dejansko obnasajo, kot bi vsebovale raztopino polimerov. Spet drugedominirajo s svojo mrezno strukturo ali se obnasajo tako kompleksno, da jih s temmodelom ne moremo zajeti [1,14].

Z razvojem mikromanipulativnih tehnologij smo dobili veliko nacinov pridobi-vanja informacij mehanskih lastnostih celice [14]. Mehanski model celice, ki smo gapredstavili v prejsnjih poglavjih, se je pretezno naslanjal na aspiracijsko metodo,lahko pa ga uspesno uporabimo tudi za razlago nekaterih drugih eksperimentalnihmetod. Slika 8 prikazuje se dve mozni eksperimentalni postavitvi, katerih rezultateprav tako lahko opisemo z elasticno teorijo citoskeletnih filamentov, vendar pa nemanjka merskih metod, pri katerih se celice obnasajo tudi drugace [14].

Celice se na zunanje drazljaje odzivajo zelo razlicno. Veliko stevilo uporabljenihmodelov [14] nakazuje, da je razumevanje mehanike celice se vedno na fenome-

10

4 SKLEP

(a) (b) (c)

Slika 8: Aspiracijska metoda uporablja sesalni tlak za pridobivanje podatkov (a). Mehanskelastnosti celice lahko opazujemo tudi pri obtekanju celice z viskozno tekocino (b). Ce na aktivnamesta celicne membrane pripnemo dva delca, ju lahko manipuliramo z opticnima pincetama (c)[14].

noloskem nivoju. Obstajajo poizkusi opisa celicnega citoskeleta z modelom pred-napete strukture. V tem modelu predpostavimo, da mikrotubuli prenasajo kompre-sijske sile, aktin in drugi bolj gibki citoskeletni filamenti pa natezne sile [15,16].

Slika 9: Mikrotubuli prenasajo kompresi-jske sile celicnega citoskeleta, bolj gibki fil-amenti pa natezne sile [16]. Pri razgradnjimikrotubula se zaradi prednapete struktureposledice vidijo tudi na ekstracelularnemmatriksu.

Model s prednapeto strukturo je diskretenin zahteva malo tezjo matematiko. Vseenolahko o njegovi veljavnosti odlocamo napodlagi treh preprostih kriterijev. Celicase mora obnasati kot diskretna mehanskastruktura in ne kot preprost kontinuum. Po-leg tega mora biti prednapetost pomembnaza deformabilnost celice. Naposled morajomikrotubuli delovati proti zunajcelicnemumatriksu, ki poskrbi za mehanicno obre-menitev celice [16]. To hkrati tudi pomeni,da se morajo celice na lokalno razgradnjocitoskeletnih filamentov odzvati na skali, kipresega takojsnjo okolico razkroja. Taksnoobnasanje v celicah resnicno opazimo (slika9) [15,16].

Vecina eksperimentov se izvaja in vitro,zato ne moremo vedeti, kako bi se odzi-vala ziva celica. Z mikropipetno aspiracijoso izvedli tudi in vivo poizkuse in dobili za-nimive rezultate [17]. Nevtrofilne celice so se obnasale po modelu membranskegacitoskeleta s prenapetostjo τ = 30 pN/m2 in viskoelasticno notranjostjo z viskoznos-tjo η = 100 Pas. Po drugi strani pa so se endotelijske celice obnasale popolnomaelasticno s kompresijskim modulom KA = 500 pN/µm2 [17].

4 Sklep

Trenutno se na podrocju mehanike celic nadaljuje zivahno raziskovanje lastnosticitoskeletnih filamentov [15,16]. Konkretno so raziskovali sidranje in zamrezevanjeaktina, od koder poizkusajo napovedati tudi in vivo elasticne lastnosti citoskeletnih

11

4 SKLEP

filamentov in njihovih struktur [18].

Slika 10: Bele puscice prikazujejogibanje markiranih mest na membranipo aktivaciji miozinskih II motorjev [19].Rdeca puscica nakazuje tocko, proti ka-teri poteka krcenje.

Se bolj aktualni temi pa sta motilnostali gibljivost celic in mehanotransdukcija[14,19]. Na podrocju gibanja celic poizkusajoodkriti mehanizme premikanja. Aktinskicitoskelet je zanimiv, ker pri doloceni gos-toti precnih povezav pri gibanju aktivnosodelujejo miozinski II motorji, ki jih naj-demo v misicnih tkivih (slika 10). Ti pret-varjajo energijo, ki jo dobijo z razgradnjoATP molekul, in povlecejo skupaj dva aktin-ska citoskeletna filamenta, katerih se drzijo,posredno pa lahko vplivajo tudi na vozlisca[19].

Da gibanje dejansko povzrocajo miozin-ski motorji, so potrdili z njihovo inhibi-cijo. Ce so v citoplazmo dodali molekule, kionemogocijo delovanje miozinskih motorjev,dejansko ni prislo do krcenja. V kolikor paso njihovo koncentracijo povecali, so opazilihitrejse krcenje. Za predstavo povejmo, dagovorimo o silah reda 100 pN na posamezenfilament aktina [19].

Raziskuje se tudi gibanje celic zaradi polimerizacije in razkroja aktina. Celice sepremikajo s spreminjanjem svojega citoskeleta. To poteka preko polimerizacije, torejpodaljsevanjem obstojecih in ustvarjanjem novih citoske-letnih filamentov, oziromarazkroja odsluzenih [20,21].

Se eno podrocje raziskav je stabilnost citoskeletnih struktur. Ko postavimo celicev sirsi okvir s svojo okolico, moramo obravnavati vlogo zunajcelicnega matriksa, kiprilagaja svojo strukturo in obliko delovanju celice. Celica deluje na zunajcelicnimatriks preko aktina. Zanima nas, kako vpliva na stabilnost citoskeleta razkrojposameznih aktinskih filamentov v strukturi. Posledice taksnega trganja citoskeletnihfilamentov so studirali z lasersko pinceto [22], kjer so z zelo ostro fokusiranimsnopom v pulznem delovanju hitro segreli material v goriscu. Posledice so opazo-vali z mikroskopom, se prej pa so preko aktivnih mest na citoskelet nanesli ’barvila’[22]. Opazili so, da se kazejo posledice razkroja posameznega citoskeletnega filamentazelo dalec od njegove dejanske lege [15,16,22].

Ce celotno prizadevanje raziskovalcev povzamemo z eno besedo, lahko recemo,da vsi skupaj raziskujejo mehanotransdukcijo [14]. Potrebno je umestiti celico vkontekst tkiva in ugotoviti, kako globalni pojavi vplivajo na njeno sintezo spojin inpremikanje. Citoskelet tako lahko razumemo tudi kot sredstvo sporazumevanja medcelicami, saj si lahko preko mehanske napetosti posiljajo signale.

Cilj je razumeti, kako se celice obnasajo v svojem delovnem okolju. Ker vecinepodatkov ne moremo pridobiti na zivih celicah, je ta naloga kar precejsen izziv.Pri studiju citoskeleta zato ne smemo pozabiti, da ta ni zgolj neziva komponentacelic, temvec igra svojo vlogo v celicnem zivljenju. Zato ga ne moremo obravnavati

12

LITERATURA LITERATURA

kot vnaprej doloceno strukturo, ampak moramo njegove mehanske lastnosti vednopovezovati z okolico ter funkcijo celice.

Literatura

[1] D. Boal, Mechanics of the Cell (Cambridge Univarsity Press, Cambridge, 2002).

[2] http://imcurious.wikispaces.com/Midterm+Exam+2010+Review+P2

[3] http://tutorvista.com/content/biology/biology-iii/cell-organization/nonmembranous-cell-organelles.php

[4] L. D. Landau in E. M. Lifshitz, Theory of Elasticity (Pergamon Press, Oxford, 1986).

[5] L. D. Landau in E. M. Lifshitz, Statistical Physics (Pergamon Press, Oxford, 1980).

[6] M. Elbaum, D. K. Fygenson in A. Libchaber, Phys. Rev. Lett. 76, 4078 (1996).

[7] D. Riveline, C. H. Wiggins, R. E. Goldstein in A. Ott, Phys. Rev. E 56, R1330(1997).

[8] S. K. Boey, D. H. Boal in D. E. Discher, Biophys. J. 75, 1573 (1998).

[9] D. E. Discher, D. H. Boal in S. K. Boey, Biophys. J. 75, 1584 (1998).

[10] G. H. W. Lim, M. Wortis in R. Mukhopadhyay, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,16766 (2002).

[11] http://www.coe.drexel.edu/ret/personalities/2005/Ziegler/researchfocus.html

[12] C.Rotsch in M. Radmacher, Biophys. J. 78, 520 (2000).

[13] D. Stauffer, Introduction to percolation theory (Taylor & Francis, London, 1985).

[14] C. T. Lim, E. H. Zhoua in S. T. Quekb, J. Biomech. 39, 573 (2006).

[15] N. Wang, K. Naruse, D. Stamenovic, J. J. Fredberg, S. M. Mijailovich, I. M. Tolic-Norrelykke, T. Polte, R. Mannix in D. E. Ingber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,7769 (2001).

[16] D. E. Ingber, J. Cell. Sci. 116, 1158 (2003).

[17] R. M. Hochmuth, J. Biomech 33, 15 (2000).

[18] M. Bathe, C. Heussinger, M. M. A. E. Claessens, A. R. Bausch in E. Frey, Biophys.J. 94, 2955 (2008).

[19] P. M. Bendix, G. H. Koenderink, D. Cuvelier, Z. Dogic, B. N. Koeleman, W. M.Brieher, C. M. Field, L. Mahadevan in D. A. Weitz, Biophys. J. 94, 3126 (2008).

[20] A. Mogilner in L. Edelstein-Keshet, Biophys. J. 83, 1237 (2002).

[21] T. D. Pollard in G. G. Borisy, Cell 112, 453 (2003).

[22] S. Kumar, I. Z. Maxwell, A. Heisterkamp, T. R. Polte, T. P. Lele, M. Salanga, E.Mazur in D. E. Ingber, Biophys. J. 90, 3762 (2006).

13

SEMINAR Mehanika citoskeleta -...

Documents

Transcript of SEMINAR Mehanika citoskeleta -...