Sejt-aggregációs kultúrák
description
Transcript of Sejt-aggregációs kultúrák
![Page 1: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/1.jpg)
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
![Page 2: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/2.jpg)
SEJT-AGGREGÁCIÓS KULTÚRÁK
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 15. Előadás
![Page 3: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/3.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Aggregációs sejtkultúrák
• Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat
• Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását
![Page 4: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/4.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához• Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellular
adhesion molecule) jelenléte a sejtfelszínen• Mátrix vagy mesterséges összetapadást
segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze
![Page 5: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/5.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtadhézió
Sejt-mátrix interakciók
Oldott állapotú ECM
Integrinek
Statikus ECM
Kadherinek
Sejt-sejtinterakciók
![Page 6: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/6.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A sejt-aggregáció kialakításának módszerei
Aggregáció gravitációs kultúrákban
Aggregáció alacsony tapadóképességű
anyagokhoz
Aggregáció scaffoldokon vagy kémiailag módosított
felszínű anyagokon
Aggregáció forgó vagy szuszpenziós kultúrákban
Aggregáció bioreaktorokban
![Page 7: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/7.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Gravitációs sejtkultúrák
A sejtek „gömböcskék”-ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben
Gravitációs kultúrák típusai:
• Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban
• Függőcsepp-kutúrák• Centrifugált aggregátumok
![Page 8: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/8.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák
• Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz
• A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához szükséges találkozások számának növelése érdekében
• A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petri-csészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni
![Page 9: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/9.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Aggregáció forgó bioreaktorokban
Forgó bioreaktorAdherens sejtekhez
Forgó bioreaktorSejtszuszpenziókhoz
MintavevőnyílásokTöltőnyílás
LSMMG
NG
Gravitációserő
Gravitációserő
Forgásirány
Mintavevőnyílások
Töltőnyílás
Forgásirány
![Page 10: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/10.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Bioreaktorok és sejt-aggregáció
Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok:
• High aspect rotation vessel (HARV)• Slow turning lateral vessel (STLV)
Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat
![Page 11: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/11.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban
Bioreaktor típus Sejttípus
Forgó bioreaktorHepG2 sejtek, humán őssejtek, humán bőr fibroblasztok, humán embrionális vesesejtek
Kevertetett bioreaktorPorcsejtek, primer egér és patkány májsejtek, L6 mioblasztok, CHO sejtek
![Page 12: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/12.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejt-aggregátumok felhasználása
Sejt-aggregátumok Felhasználás
CHORekombináns fehérjék szintézise
Humán embrionális őssejtek
Embrionális test (EB) kialakulása és differenciáció
![Page 13: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/13.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp I.
Vájt tárgylemez
A mintát kaccsal afedőlemezre helyezzük
Olajcsepp
Vazelin
180°
![Page 14: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/14.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp II.
180° 180°
180°
Idő(napok)
Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás
megkezdődik
0
2
5
![Page 15: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/15.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek
40 mm
150 mm
![Page 16: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/16.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez• Az alacsony adherenciájú felszín segíti a
szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását• A sejt-sejt kapcsolatok növekednek• Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel)
borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.
![Page 17: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/17.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója
Természetes aggregáció
PVLA potenciálisan jól használható mesterséges máj
kialakítására a különböző koncentrációjú borítások révén
PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid)
ASGP-R
EgyébIntegrinEGF-RHGF-R
Fas
MájsejtekASGP-Rmagas
lassú proliferáció
Szferoid kialakulása
MájsejtekASGP-Ralacsony
gyors proliferáció
+EGF
Sejtalak szabályozása
Szferoid
100 mg/ml PVLA-val borított edény
PVLA bevonat koncentrációja
15-20 ng/ml PVLA-valborított edény
Kitapadás
1 mg/ml PVLAbevonat
100 mg/ml PVLAbevonat
Lekerekedés
E-Kadherin
Epevezeték
Májsejt
![Page 18: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/18.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtaggregáció serkentése mesterséges módszerekkel
Polimerből álló híd képzése a sejtek között.
Típusok:
• Természetes adhéziós molekula• ECM-eredetű molekula része• Polimer mátrix
![Page 19: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/19.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Mesterséges sejt-aggregáció
Aggregálódott sejtekSejtek
Bifunkcionális polimer
![Page 20: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/20.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejtek keresztkötése biotinnal
Avidin
Sejtaggregátum
Biotinhidrazid
Perjodát-funkcionalizáltsejtek
![Page 21: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/21.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Felszínek kémiai módosítása
• Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810 kDa)
• Kémiailag módosított PEG (polietilén glikol)• Laktonnal módosított eudragit• PLGA nanogyöngyök• Lektinek és származékaik
![Page 22: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/22.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Chitosan
![Page 23: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/23.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Kémiailag módosított PEG
MA(PEG)n
Methyl-PEGn-AmineMethyl-(#ethyleneglycol) amine
H2NCH3
OO
OO
MA(PEG)8
M.W. 383.48Spacer arm 29.7 Å
[ ]8CH3
H2NO
MA(PEG)12
M.W. 559.69Spacer arm 43.9 Å
H2N[ ]12
CH3O
MA(PEG)24
M.W. 1088.32Spacer arm 86.1 Å
[ ]24CH3
H2NO
![Page 24: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/24.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Lakton-módosított eudragit
pH > 6
HOOC
COOH
COOH
HOOC
COOH
COOH
Ellenionok
Ko-ionok
COO-
-OOC
-OOC
COO-
COO-
COO-
+
-
+-
+ -
+
-
+
-
+
-+
-
+
![Page 25: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/25.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
PLGA nanogyöngyök
Oldott polimer(PLGA)
Diszperziósfázis
Pumpa
Pumpa
Előkeverés
Mágneses keverő
Magasnyomású vízbefolyás
Magasnyomású vízkifolyás
![Page 26: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/26.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Lektinek és származékaik I.
• A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek
• A lektinek, vagy fitohemagglutininek (PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikus sem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása nélkül
• Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére
![Page 27: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/27.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Lektinek és származékaik II.
• Hat lektin család ismeretes: – Legume lektinek (a pillangósvirágúak családjában) – Gabona-eredetű lektinek, – P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék)– A pentraxinok (állati fehérjék)
• A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok.
• A lektinek szénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N-acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetil-neraminsav.
• Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket.
• A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.
![Page 28: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/28.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A lektinek által felismert N-glikánok típusai
Type PHA
Bisected di-, tridiantennary complex-type N-glycan
Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (E-PHA)Inhibitor: GalNAc
Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan
Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (L-PHA)Inhibitor: GalNAc
Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan
Datura stramonium Agglutinin(DSA)Inhibitor: Chitotriose (GlcNAc3)
![Page 29: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/29.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejt-aggregáció scaffoldokon
• Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja
• Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként
![Page 30: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/30.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Nanoszerkezetű scaffold-ok
• Spontán összeszerelődő scaffold-ok• Nanokompozit anyagok• Nanoszálak
![Page 31: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/31.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Nanoszerkezetű anyagok felhasználása
Anyag Jellemzők Felhasználás
FullerénekSzénatomok hexagonális és pentagonális térszerkezetbe rendeződve
Gyógyszerek enkapszulációja, képalkotó vizsgálatok
Fluoreszcens „Quantum dot”-ok
Félvezetőkből készült nanokristályok
Bioszenzorok, képalkotás
LiposzómákFoszfolipid membránnal burkolt vezikulák
Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás
Dedrimerek Polimer szerkezetekGyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás
Arany nanorészecskék Kolloid aranyBioszenzorok, sejtszintű képalkotás
Szuper-paramágneses vas-oxid
Vas-oxid MRI kontrasztanyag
![Page 32: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/32.jpg)
SZÖVETEK NYOMTATÁSA
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 16. Előadás
![Page 33: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/33.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
A szövetnyomtatás alapjai
• Scaffoldmentes konstrukció• Tisztított sejtek aggregált halmazait
alkalmazzák• A sejthalmazokból áll a „biotinta”• A 3D szövetkonstrukciók felépítése a
sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul
![Page 34: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/34.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká I.
![Page 35: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/35.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká II.
Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchima fragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká
egyesülnek
![Page 36: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/36.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Szervek nyomtatása
3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet.
Szövetnyomtatás típusok:• Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális
carcinoma)• Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és
kortikális neuronok)
![Page 37: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/37.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az első szövetnyomtató
![Page 38: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/38.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Érett, szervspecifikus primer sejtek I.
Biopszia Tisztítás
Sejtkultúra
TE-ben használható
sejtek
![Page 39: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/39.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Érett, szervspecifikus primer sejtek II.
Biopszia
Tisztítás
TE-ben használható
sejtek
Differenciálódott szöveti sejtek
Szövetspecifikusrezidens őssejtek Sejtkultúrák
![Page 40: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/40.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára• Forrás: biopszia vagy reszekció• Tisztítás• Expanzió in vitro tenyésztés során• Újradifferenciáltatás
![Page 41: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/41.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Vérerek képzése szöveti nyomtatással
Fontos a megfelelő nyomóerő
alkalmazása
![Page 42: Sejt-aggregációs kultúrák](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062723/56813e3a550346895da81d77/html5/thumbnails/42.jpg)
TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása• Koszorúér betegség, bypass készítése• Trombózis kezelése• Baleseti érsérülés • Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-
vel