Scopi della analisi molecolare Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti Ricerca dei...
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Scopi della analisi molecolare
• Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti
• Ricerca dei portatori sani
• Diagnosi prenatale
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Patologia Genetica
• Patologia Monogenica:– malattie dovute a mutazioni di un singolo
gene
• Patologia Poligenica:– malattie dovute a mutazioni di più geni,
generalmente con presenza di una componente ambientale
• Patologia Cromosomica:– malattie dovute ad alterazioni numeriche o
strutturali del cariotipo
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Il cariotipo: una sola analisi per diverse
patologie
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Analisi molecolare: una analisi specifica
per una specifica patologia
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Tutto inizia dal DNA
• Molecola depositaria del patrimonio genetico
• Trasporta l' informazione genetica necessaria alla trasmissione dei caratteri ereditari
http://learn.genetics.utah.edu/
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Campioni da cui si può estrarre DNA
• Una goccia di sangue• Saliva presente su una sigaretta o su
un chewing-gum• Tracce di sperma• Urine e feci• Un capello• Fossili • Mummie
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Estrazione di DNA
• Varie metodiche per estrazione DNA
• Estrazione manuale: vari kit in commercio
( spin basket, biglie magnetiche)
• Estrattori automatici
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Estrazione Dna da sangue mediante Kit commerciali
Campione di sangue in EDTA Aliquotare 200μl di Binding Buffer Aggiungere 40 μl di proteinasi K Vortexare ed incubare per 10 min a 72° C in termoblocco Spinnare Aggiungere 100μl di isopropanolo Assemblare il filtro High Pure con una provetta relativa Pipettare il campione nel serbatoio superiore e centrifugare
per 1 min Successivi lavaggi con Inibitor Remaval e con Wash Buffer Aggiungere 200μl di Elution Buffer Centrifugare per 1 min e raccogliere il DNA
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Reazione a catena della polimerasi (PCR)
• Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA
• Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo
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PCR: 3 Fasi
• Denaturazione : apertura doppia elica
• Annealing : attacco dei primers
• Extension : copiatura da parte della Taq polimerasi
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Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)
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Reagenti necessari per la PCR
• DNA• Primers• Oligonucleotidi• Taq polimerasi• Baffer e Magnesio• H2O
Ciclo standard di PCR 94°C 10 m 1 ciclo
35 cicli
72°C 10 m 1 ciclo
94°C 30s58°C 30s72°C 30s
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Preparazione di una PCR
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
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Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici
• Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato
• Permette di separare i frammenti amplificati mediante PCR
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Elettroforesi su gel• Si preparano i gel di agarosio che costituiscono
una “matrice a setaccio”• Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i
campioni da analizzare e viene applicato un campo elettrico
• La direzione di migrazione dipende dalla carica delle molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente, migreranno verso il polo positivo
• La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del frammento di acido nucleico
• Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni (peso molecolare)
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Sequenziamento diretto del DNA
• Metodo accurato per ottenere informazioni precise e definitive su un gene
• Metodo ideale per la rilevazione di mutazioni difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi
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Sequenza di DNA
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Mutazione in eterozigosi
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MUTAZIONE IN OMOZIGOSI
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Analisi di frammenti
• Riconoscimento di paternità
• Identificazione di autori di reati
• Identificazione di vittime di reati o sinistri