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Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum und
anderer pathogener ClostridienDr. B. Köhler,
RIPAC-LABOR GmbH, Potsdam
Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer
Berücksichtigung von Clostridium botulinum und
anderer pathogener Clostridien
11.04.2012 TLL Jena
Dr. med. vet. habil. Bernd Köhler
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anderer pathogener ClostridienDr. B. Köhler,
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Abbildung 1: Übersicht der Clostridien-Erkrankungen
1. Gasödeminfektionen (Rauschbrand, Pararauschbrand, Gasbrand,
Bradsot, Nekrotisierende Hepatitis u.a.)
2. Enterotoxämien (Breiniere, Nekrotisierende Enteritis,
Cl. perfringens Typ A- Enterotoxämie, Cl. sordellii- Enterotoxämie u.a.)
3. Intoxikationen durch Neurotoxine (Tetanus, Botulismus)
4. Lokale Infektionen [Ulzerative Enteritis (Cl. colinum),
Antibiotikainduzierte Colitis durch Cl. difficile) u.a.]
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Abbildung 2: Bildung von Clostridium botulinum- Toxin
Clostridium barati und Clostridium butyricum- wahrscheinlichdurch die Aufnahme von Toxinplasmiden von
Clostridium botulinum
Clostridium botulinum - 7 Toxintypen A-G
Clostridium barati - Typ F
Clostridium butyricum - Typ E
Clostridium limosum - Typ C (eigene Untersuchungen)
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Abbildung 3: Empfindlichkeit von Tieren und dem Menschen gegen die Toxine der Clostridium botulinum- Typen A-G
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Abbildung 4: Vorkommen von C2-Toxin bei Clostridium botulinum Typ C und Typ D
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Abbildung 5: Clostridium botulinum C2- Toxin (Enterotoxin)
• Binäres Toxin aus Hafttoxin und Enterotoxin, kein Neurotoxin !
• Bildung während der Sporulation
• Cytopathogen für viele Zellarten besonders für Enterozyten
• Erhöhung der Permeabilität der Darmschleimhaut
• Hochgradige Flüssigkeitsakkumulation im Darm und in der Lunge (Lungenödem)
• Nekrotisch-haemorrhagische Schäden der Darmschleimhaut beifortgeschrittenen Erkrankungen
•Ursache verlustreicher Darmerkrankungen bei Wasservögeln
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Abbildung 6: Kodierung der Toxinbildung von pathogenen Clostridienstämmen
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Abbildung 7: Nachweis Botulinum-Neurotoxin bildender Keime im Boden eines Areals mit akutem Auftreten von Botulismus bei Wasservögeln
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Aus “Clostridia Molecular Biology in the Post-genomic Era”by Holger Brüggemann and
Gerhard GottschalkCaister Academic Press 2009, Norfolk KKSeite 108
• “Compared with culture methods, molecular detection
techniques are sensitive, specific, and rapid to perform.”
• “A disadvantage of molecular detection assays is that they do
not detect biologically active neurotoxin or even activity of
genes.”
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Abbildung 8: Untersuchungen zum Vorkommen von Cl. botulinum- Neurotoxin bildenden Stämmen im Biokompost, in Gärrückständen, in Gülle aus landwirtschaftlichen Betrieben und in Klärschlämmen von Kläranlagen 1980 -2007
1) Nachweis mittels Mausbioassay nach 7 tägiger Anreicherung in cooked meat-Medium bzw. Maltose Kalbfleischbouillon nachNishida und Nakagawara (Grenzwert ≥10 Dlm/ml)
2) zweifelhafter Befund, Toxin nicht typisierbar
0,722)30288Summe
003112Biogasanlagen
002211Proben aus Biotonne
009431Gülle aus Rinder- Schwein- und
Geflügelbetrieben (ca. 6-wöchige Vergärung)
005614Klärschlamm
2 Proben schwach toxisch/Ohne Zuordnung zu speziellem Toxintyp
2
22)10220Kompostproben
%Anzahl
BemerkungenNachweis Toxin-bildenderCl. botulinum –Stämme 1)
Anzahlder
Proben
Anzahl dergeprüften BetriebeUntersuchungsmaterial
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Abbildung 9: Übersicht der Ergebnisse der Untersuchung von Gärrückständen von Biogasanlagen auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum- Stämme nach ihrer Herkunft 1990 - 2012
2 x Typ A , 2 x Typ C/D, 1 x Typ B6,8593,26974Summe
010022Baden-Württemberg
2 x Typ A5025024Bayern
010022Sachsen
010066Sachsen-Anhalt
010055Nordrhein-Westfalen
01002020Brandenburg
2 x Typ C/D, 1 x Typ B123882225Niedersachsen
010066Mecklenburg-Vorpommern
10044Schleswig-Holstein
Toxintyp%Anzahl%Anzahl
PositivNegativGetestete Anlagen
Bundesland
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Abbildung 10: Geografische Verteilung der untersuchten Biogasanlagen
• Anlagen mit Nachweis Neurotoxin bildenderClostridium botulinum- Stämme in Gärrück-ständen von Biogasanlagen
o Negative Anlagen
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BlesshuhnFulica atra
LachmöweLarus ridibundus
StockenteAnas platyrhynchos
HöckerschwanCygnus olor
Abbildung 11: Vergleich der Befunde in Rohstoffen und Gärrückständen von Biogasanlagen und Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum-Stämme in Gärresten
1) Verarbeitung von verdorbener Silage, nach deren Verfütterung ein Botulismusausbruch bei Rindern erfolgte
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Abbildung 11A: Persistenz von Neurotoxin Typ A bildenden Clostridium botulinum- Stämmen in einer positiven Gärrückstandsprobe
1) Nach 7 tägiger Anreicherung im cooked meat medium2) ca. 25g schwere Mäuse
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Abbildung 12: Ursachen des Nachweises von Neurotoxin bildenden Clostridium botulinum in Gärrückständen von Biogasanlagen
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Abbildung 13: Biogasanlagen mit Nachweis Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme in Rohstoffen mit negativen Befunden von Gärrückständen
1) Mit typenspezifischen Antitoxinen
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Abbildung 14: Beispiel Diagnostik B2 S1 Verdünnung 105 anaerob
Abbildung 2: Beispiel Diagnostik B2 S1 Verdünnung 105 anaerob
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Abbildung 15: Beispiel Diagnostik B1 S4 Verdünnung 106 mikroaerophil
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Abbildung 16: Gesamtübersicht Anlagentyp und Substratverteilung
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Abbildung 17: Vergleich der Clostridienkonzentrationen in Rohstoffen und Gärresten der Anlage A, B und C
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Abbildung 18: Vergleich der anaeroben Gesamtkeimzahlen insgesamt in Rohstoffen und Gärresten der Biogasanlagen A, B und C
0,00E+002,00E+064,00E+066,00E+068,00E+061,00E+071,20E+071,40E+071,60E+071,80E+072,00E+07
durc
hsch
nittl
iche
G
esam
tkei
mza
hl
Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C
Alle Anlagen 1,00E+07 2,74E+06Anlage A 1,89E+07 3,3E+06Anlage B 5,50E+06 2,8E+06Anlage C 5,60E+06 2,1E+06
Rohstoffe Gärresteanaerob anaerob
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Abbildung 19: Vergleich der aeroben und anaeroben Gesamtkeimzahlen
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
3,00E+07
3,50E+07
durc
hsch
nittl
iche
Ges
amtk
eim
zahl
Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste
aerob aerob anaerob anaerob gesamt gesamt
Vergleich der Gesamtkeimzahlen
Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C
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Abbildung 20: Vergleich des Spektrums und der Nachweisraten der Clostridia spp. in Rohstoff- und Gärrückstandsproben in Prozent
-2Sonstige Clostridia spp. 1)
-1Clostridium septicum
-1Clostridium limosum
11Clostridium glycolicum
11Clostridium sordellii
73Clostridium tyrobutyricum
14Clostridium tertium
74Neue Clostridia spp.
94Clostridium sporogenes
108Clostridium butyricum
38Clostridium barati
1916Clostridium bifermentans
4247Clostridium perfringens
Gärrückstände in %Rohstoffe in %Spezies
1) Nicht Differenzierbar mittels MALDI-System
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Abbildung 21: Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spp. alle Anlagen
Vergleich der Gesamtkeimzahlen für Clostridia spezies
1
10
100
1000
10000
100000
Rohstof fe Gärreste Rohstof fe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste Rohstoffe Gärreste
Cl.p. Cl.p. Cl. sporo. Cl. sporo. Cl. bif. Cl. bif . Cl. baratii Cl. baratii Cl. buty. Cl. buty. Cl. sordelii Cl. sordelii
KB
E/g
Unt
ersu
chun
gsm
ater
ial
Alle Anlagen
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Abbildung 22: Vergleich der Gesamtkeimzahlen der verschiedenenClostridia spp. in den Biogasanlagen A, B und C
V e rg le ic h d e r G e sa m tke im z ah le n fü r C lo s tr id ia s p e z ie s
1
10
100
1000
10000
100000
Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te Rohs tof f e Gärres te
Cl.p. Cl.p . Cl. s poro. Cl. s poro. Cl. b if . Cl. b if . Cl. baratii Cl. baratii Cl. buty . Cl. buty .
KB
E/g
Unt
ersu
chun
gsm
ater
ial
Alle Anlagen Anlage A Anlage B Anlage C
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Abbildung 22 A: Hemmung der Vermehrung von Cl. botulinum in Gärrückständen von Biogasanlagen
• Vergleichsweise lange Generationszeit von Cl. botulinum von 20-30 Minuten im Verhältnis zu Cl. perfringens (Generationszeit 8-10 Minuten) u.a. schnell wachsenden Bakterienarten
• Verschiebung des Nährsubstrates in Richtung Zellulose u.a. pflanzlichen Rohstoffen
• Dominanz Zellulose abbauender Mikroflora
• Mangel von ausreichenden Nährstoffen für Cl. botulinum, die zudem von schnell wachsenden Keimen vor allem pathogenen Clostridien aufgebraucht werden
Konkurrenzmikroflora, die Cl. botulinum durch Bacteriozide hemmt
• pH-Wert (alkalischer pH-Wert für pathogene Clostridien)
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Abbildung 22: Vorkommen u. Toxizität von Cl. perfringens in Rohstoffen und in Gärresten der Biogasanlagentypen A, B und C
1) Ergebnisse mittels PCR
k. A. = keine Angaben
Multiplex PCR
Majorletale Toxine Minorletale Toxine
α-Toxin Nagler-Einheiten (NE)
Anlagen- Typ
Proben/ Material
Anzahl der
Proben
Cl. perfringens
positiv in %
Anzahl der
Isolate1)
α- Toxin
β1-Toxin
β2-Toxin
NetB-Toxin
Epsilon-Toxin
Jota- Toxin
μ-Toxin Hyaluro- nidase
Theta- Toxin
< 8 NE
16-32 NE
> 64 NE
Rohstoffe 20 20 4 4 0 1 0 0 0 k. A. 4 4 - - A1-A5
Gärreste 15 26,4 4 4 0 1 0 0 0 k. A. 4 4 - -
Rohstoffe 20 90 18 17 0 0 0 0 0 k. A. 18 11 7 - B1-B5
Gärreste 15 66,6 10 10 0 0 0 0 0 k. A. 10 3 6 1
Rohstoffe 20 95 19 19 0 6 0 0 0 k. A. 19 15 1 3 C1-C5
Gärreste 15 86,6 14 14 0 5 0 0 0 k. A. 14 12 1 1
Rohstoffe 60 68,3 41 41 0 7 0 0 0 k. A. 41 30 8 3 Σ
Gärreste 45 62,2 28 28 0 6 0 0 0 k. A. 28 19 7 2
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Abbildung 23: Veterinärhygienische Richtlinien/Anforderungen für denBetrieb von Biogasanlagen
• Regelmäßige Rohstoffkontrolle insbesondere von tierischen Rohstoffen
• Kein Einsatz von tierischen und pflanzlichen Rohstoffen aus Beständen mit Botulismusausbrüchen
• Mikrobiologische Untersuchung von Starterkulturen auf Neurotoxin bildende Clostridium botulinum- Stämme
• Ausstattung aller Biogasanlagen mit 2 Rohstoffsilos, die wechselseitig (etwa 4 wöchiger Rhythmus) bzw. nach Reinigung und Desinfektion betrieben werden sollten
• Ausstattung aller Biogasanlagen mit 2 Gärrückstandssilos, die abwechselnd inca. 3 monatigem Abstand zu befüllen sind
• Sicherung der Gärrückstände vor nachträglichen Kontaminationen (Schwarz-Weiß-Prinzip)
• Aus veterinärhygienischer Sicht kann die Verbreitung Neurotoxin bildender Cl. botulinumStämme nicht toleriert werden
• Jährliche Kontrolluntersuchung der Gärrückstände aller Biogasanlagen hinsichtlichdes Vorkommens Neurotoxin bildender Clostridium botulinum- Stämme
• Freiheit von Cl. chauvoei, Cl. perfringens Typ C und EHEC (Untersuchung bei speziellem Anlaß/ Verdacht)
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Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum und
anderer pathogener ClostridienDr. B. Köhler,
RIPAC-LABOR GmbH, Potsdam
+1) Positiv (Nachweis Toxin bildender Stämme)- Negativ
- Stufenkontrolle- Hygienische Maßnahmen- Strukturelle Veränderungen
+1)+1)
Stufenkontrolle → Bewertung, Hygienische Maßnahmen+1)-
Keine Beanstandungen-+1)
Keine Beanstandungen--
Bewertung/ SchlussfolgerungenGärrückständeRohstoffe
Abbildung 24: Verfahrensweisen bei positivem Befund von Neurotoxin bildenden Cl. botulinum- Stämmen in Gärrückständen von Biogasanlagen
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Hygienische Probleme von Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung von Clostridium botulinum und
anderer pathogener ClostridienDr. B. Köhler,
RIPAC-LABOR GmbH, Potsdam
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