REAZIONE ANTIGENE- ANTICORPO E TECNICHE IMMUNOLOGICHE · 2018. 1. 5. · Reazione...
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REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO
E TECNICHE IMMUNOLOGICHE
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Tecniche immunologiche
Ag
Ab
Ag-Ab
-identificazione dell’antigene
- rilevazione di anticorpi specifici
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AntigeneQualsiasi sostanza in grado di reagire specificamente con i prodotti della
reazione immunitaria umorale o cellulo-mediata
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AnticorpiGlicoproteine prodotte dalle cellule del sistema
immunitario che si legano a sostanze riconosciute come non-self
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Enzima
Fluorocromi
ELISA catching
Background
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Meccanismi di azione degli Meccanismi di azione degli anticorpianticorpi
Attività neutralizzanteAttività agglutinanteAttività precipitanteAttività opsonizzanteFissazione del complemento
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Neutralizzazione
Es.: legame degli Abs alle strutture di superficie dei virus, mancatoadsorbimento ai recettori cellulari, mancata penetrazione
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TEST IMMUNOLOGICO DI SIERONEUTRALIZZAZIONETEST IMMUNOLOGICO DI SIERONEUTRALIZZAZIONE
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Agglutinazione
Reazione con Ags particolati(batteri, cellule eucariote) e
stimolazione fagocitosi
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TEST IMMUNOLOGICO DI AGGLUTINAZIONETEST IMMUNOLOGICO DI AGGLUTINAZIONE
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OpsonizzazioneFissazione
del complemento
Induzione della fagocitosi attraverso la formazione di complessi Ag/Ab
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TEST IMMUNOLOGICO DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTOTEST IMMUNOLOGICO DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
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Reazione antigene-anticorpoInterazione tra il determinante antigenico
(epitopo) dell’antigene e i domini delle regioni variabili (VH/VL) dell’anticorpo
Caratteristiche:
- Specifica- Reversibile- Legami non covalenti
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Specificità
CapacitCapacitàà di un singolo sito di un singolo sito combinatorio dellcombinatorio dell’’AbAb di reagire di reagire
con un solo determinante antigenico con un solo determinante antigenico o capacito capacitàà di una popolazione di molecole di una popolazione di molecole anticorpalianticorpali di reagire con un solo antigenedi reagire con un solo antigene
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Capacità di distinguere minime differenze nella struttura chimica dell’antigene!!!
SO3SO3
-NH
meta
SO3SO3
-NH
orto
SO3SO3
-NH
meta
SO3SO3-NH
para
+/+/-- ++++++ +/+/--
Immunizzazione degli animali con una proteina coniugatacon meta-azobenzene sulfonato
Prelievo di siero
Incubazione del siero con
Legame dell’anticorpo all’apteneLandsteinerLandsteiner, 1930, 1930
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MA…Cross-reattività
Tra un anticorpo e due o piTra un anticorpo e due o piùù antigeni antigeni o tra un antigene e diversi anticorpio tra un antigene e diversi anticorpi
Gli Ags possiedono determinanti antigenici comuni o strutturalmente simili!!!!
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Implicazioni….
1) Malattie infettive
2) Malattie autoimmuni
3) Scopi diagnostici
Cross-reattività tra gli antigeni di BRUCELLA ABORTUS e
gli antigeni di alcuni ceppi di YERSINIA ENTEROCOLITICA
Cross-reattività tra un antigene di STREPTOCOCCHI
beta-emolitici e le CELLULE MIOCARDICHE
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1) Malattie infettive
2) Malattie autoimmuni
3) Scopi diagnostici
Utilizzo della cross-reattività a fini
diagnostici:Peritonite infettiva del gatto (FIP) e Gastroenterite
trasmissibile del suino (TGE)
NB: cross-reattività di Abs anti-Ags umani nei confronti di Ags simili o uguali di altre specie
(scarsità di Abs animale-specifici!!!)
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Legami non covalenti
Legame tra molecole non polari
Interazione tra le nuvole
elettroniche
Forze di attrazione tra gruppi di carica
opposta
Formazione di ponti a H tra atomi
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Fattori che influenzano la reazione Ag/Ab
AffinitàAviditàForma fisica dell’AgRapporto quantitativo Ag/Ab
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AffinitàForza del legame
tra un singolo determinante antigenico
ed una specifica regione dell’anticorpo
> affinità = interazione più stabile
(> facilità di evidenziare l’interazione)
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Risvolto pratico dell’affinità
1) Abs ad alta affinità = legame di un maggior numero di Ags in un tempo di incubazione piùbreve
2) > affinità = > diluzione dell’Ab
Reazioni Ag-Ab reversibili: possibile dissociazione degli immunocomplessidurante le fasi di lavaggio-usare Abs monoclonali ad alta affinità-evitare alte concentrazioni di sali, alte T°, basso pH
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Avidità
Forza di attrazione tra unAb e un Ag multivalente
(con copie multiple dello stesso epitopo)
Forza complessiva del legame
Dipende da….
1) Affinità dell’Ab per l’epitopo
2) Valenza di Ag e Ab
3) Disposizione strutturale delle parti interagenti
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Globulo rossoGlobulo rosso
Globulo rossoGlobulo rosso
Globulo rossoGlobulo rosso
determinante Xdeterminante X
1
2Caso 1: Il tipo di legame aumenta,
a parità di affinità, l’avidità dell’Ab perché ↓ probabilità
che l’Ab si “stacchi” dall’Ag
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> avidità per gli Ags
Importanza nella risposta immunitaria…perché?
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VALENZA dellVALENZA dell’’antigene: antigene: numero di Absche si può legare ad una molecola antigenicanello stesso momento
VALENZA dellVALENZA dell’’anticorpo: anticorpo: numero di epitopi antigenici che si possono legare ai siti
combinatori dell’Ab nello stesso momento
IMPORTANZA DELLA VALENZA IMPORTANZA DELLA VALENZA NELLE REAZIONI DI NELLE REAZIONI DI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONE……..
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Reazione di precipitazione Reazione di precipitazione dipendente dadipendente da……....
a.a. NUMERO DI SITI DI NUMERO DI SITI DI LEGAME DI OGNI LEGAME DI OGNI AbAbPER LPER L’’AgAg
b.b. NUMERO MASSIMO DI NUMERO MASSIMO DI AbsAbs CHE POSSONO CHE POSSONO ESSERE LEGATI DA ESSERE LEGATI DA UNA MOLECOLA UNA MOLECOLA ANTIGENICAANTIGENICA
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Rapporto quantitativo Ag/Ab
Il rapporto Ag/Ab influenza la rilevazione deicomplessi Ag/Ab dato che le dimensioni dei complessi
sono correlate alla concentrazione di Ag e Ab
> Quantità di immunocomplessiquando Ag e Ab sono all’equivalenza (saturazione Ab, no Ags o Abs liberi)
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-Complessi di piccole dimensioni
-Un Ab con 2 Ags
-Complessi di piccole dimensioni (restano in soluzione)
-Un Ag che tiene insieme poche molecole di Ab
-Complessi lineari, tridimensionali, di grandi dimensioni (facile precipitazione)
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Forma fisica dell’Ag
• Antigene particolato in sospensione (eritrociti, batteri, cellule eucariote, parassiti): reazione di agglutinazione
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• Antigene solubile in soluzione (es.: tossine batteriche): reazione di precipitazione (formazione di complessi insolubili)
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Reagenti comunemente utilizzati nei tests sierologici
Siero (plasma privo di fibrinogeno) ComplementoAntiglobulineAnticorpi (monoclonali, policlonali) coniugati o non coniugati
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Siero
Il sangue prelevato viene lasciato “a riposo” per almeno 2 h (T°: 10-20°C)
Dopo la formazione del coagulo, questo viene “scollato” dalle delicatamentepareti della provetta,con una pipetta Pasteur
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Centrifugazione a 500-1000 g, per allontanare gli eventuali GR rimasti
Se sottoposto subito ad esame, lo si può conservare fino a 2 h a T° ambiente, o fino a 48 h a +4°C
Per il trasporto bisogna utilizzare contenitori termici a +4°C
Per usi successivi,il siero viene aliquotato in piccole quantità e conservato in congelatore a –20°C
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Complemento-- Normale costituente del siero fresco- Scomplementazione - Per i tests emolitici, il migliore è quello
del siero fresco di cavia (ma anche di uomo e suino)
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AntiglobulineAnticorpi prodotti nei confronti di
immunoglobuline di una specie animale inoculate in una specie diversa
Mouse monoclonal IgG anti-human
Ag
sheep anti-mouseIgG
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IMPORTANZA DELLA SCELTA DI ANTICORPI SECONDARI IMPORTANZA DELLA SCELTA DI ANTICORPI SECONDARI NELLE METODICHE INDIRETTE A SECONDA DELLA NELLE METODICHE INDIRETTE A SECONDA DELLA
SPECIE ANIMALE OGGETTO DI STUDIOSPECIE ANIMALE OGGETTO DI STUDIO……..
Caso Caso AA
Caso Caso BB
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AnticorpiAnticorpi policlonali
Coniglio, capra, suino, pecora, cavallo, cavia
Reagiscono contro i diversi epitopi dell’antigene verso cui sono prodotti (verso tutti gli
antigeni presenti nel microrganismo o nel preparato
immunizzante)
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Risospensione dell’antigene in una soluzione diadiuvanteInoculazione per via intradermica, s.c., cavitàperitonealeInoculazioni mensili (effetto Booster)Prelievo di sangue dal padiglione auricolare (coniglio), dalla vena giugulare (GA) o dal cuorePurificazione degli anticorpi (cromatografia di affinità)
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Anticorpi monoclonaliAnticorpi monospecifici puri,
prodotti da un singolo clone cellulareimmunocompetente
- Alta omogeneità- Assenza di Abs aspecifici- Facile caratterizzazione- Assenza di variabilità (>
riproducibilità dei risultati)
Milstein e Kohler (1975): tecnica dell’ibridoma per la produzione di Abs monoclonali
“Immortalizzazione” di cellule produttrici di Absfacendole reagire con le cellule neoplastiche
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Cellule ibride: capaci di crescere illimitatamente in
vitro (mieloma) e di produrre Abs specifici
(cellule spleniche)
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Vantaggi degli Vantaggi degli AnticorpiAnticorpi MonoclonaliMonoclonali
di Coniglio:di Coniglio:
1)Affinità superiori 2)Maggior sensibilità3)Elevata specificità4)Migliore risposta agli antigeni meno immunogenici 5)Miglior segnale con campioni di roditori
Sistema immunitario di coniglio → generazione di una risposta anticorpalediversificata e con maggiore affinità rispetto a topi e ratti
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Ab policlonali Ab monoclonali
Origine Varie specie animali (coniglio, cavallo, capra)
+++ topo
Affinità Variabile Nessuna variazione
Sensibilità Alta (identificazione epitopi multipli dello stesso Ag)
Bassa-moderata
specificità Bassa-alta Alta
Esigenze di fissazione ampie ristrette
Tolleranza alla fissazione Alta Bassa
Omogeneità Variazioni della partita Nessuna variazione tra le partite
costi moderata alti
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Abs coniugati con fluorocromi
Anticorpi coniugati
FITC (fluoresceina isotiocianato)TRITC (tetrametilrodamina isotiocianato)TR (Texas Red)PE (ficoeritrina)
- immunofluorescenza, immunoblotting, citofluorimetria a flusso
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Abs coniugati con enzimi
Perossidasi di rafano (horseradish peroxidase, HRP): scissione di H2O2Fosfatasi alcalina (AP): rimozione di fosfato da molecole fosforilate
immunoistochimica,, ELISA, immunoblotting
HRP+DAB
AP+Fast Red
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Abs coniugati ad oro colloidale
Au
Ab
Ag
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AgAg cellularecellulare
AbAb primarioprimario
AbAb secondariosecondariobiotinilatobiotinilato
Complesso Complesso avidinaavidina--biotinabiotina
SubstratoSubstrato cromogenocromogeno
Abs biotinilati
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Conservazione degli abs
Prodotti liofilizzati o in forma liquidaProdotti liofilizzati mai aperti: conservati a 2-8°CProdotti liofilizzati ricostituiti: conservazione a 2-8°C per alcune settimane (con l’aggiunta di sodio azide) o alcuni giorni ( senza antimicrobico)Divisione in aliquote stoccate a –20°C o–80°c
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Tests immunologici (sierologici)
Immunofluorescenza (diretta e indiretta)ELISA CitofluorimetriaRIA (RadioImmunoAssay)Tecniche immunoistochimicheWestern BlottingImmunoelettromicroscopiaTest di precipitazione: immunodiffusione,immunoelettroforesiTests di agglutinazioneTest di Fissazione del complementoSieroneutralizzazione
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ImmunofluorescenzaImmunofluorescenza
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ImmunoistochimicaImmunoistochimica
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ELISAELISA((EnzymeEnzyme--LInkedLInked ImmunosorbentImmunosorbent AssayAssay))
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ImmunoelettronmicroscopiaImmunoelettronmicroscopia
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CitofluorimetriaCitofluorimetria
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Western Western blottingblotting
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SieroneutralizzazioneSieroneutralizzazione
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Fissazione Fissazione del complementodel complemento
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TestsTests di agglutinazionedi agglutinazione
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TestsTests di precipitazionedi precipitazione
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Applicazione delle tecnichesierologiche
Ricerca dell’antigeneRicerca degli anticorpiSieroconversione (siero acuto subito dopo la comparsa dei sintomi e siero convalescente dopo 2-3 settimane)Dati quantitativi sul contenuto di anticorpi
Aumento del titolo di almeno 4 volte =
infezione recente!!!
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1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280
Titolo Titolo anticorpaleanticorpale = ultima diluizione di anticorpo che provoca ancora la reazione con una concentrazione fissa del corrispondente antigene
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Esami scientifici per spiegare eventi “miracolosi”
Miracolo eucaristico di Lanciano (VIII secolo): trasformazione dell’ostia in un
pezzo di carne e del vino in sangue coagulato)
Test di emoagglutinazione
Esame istologico della “carne miracolosa” (vero cuore!!!)
SIERO ANTI-A SIERO ANTI-B
Gruppo sanguigno AB
Esame istologico del “sangue miracoloso”
…Altre applicazioni…
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Analisi di reperti archeologici:- determinazione del gruppo sanguigno in reperti di
ossa- rilevazione di Hb in ossa di 4500 anni
studi di medicina legaleanalisi degli alimenti (rilevazione di microrganismi
patogeni)
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Espressione di proteine???
Down- o up-regulation delle proteine???
Localizzazione cellulare???
Modificazioni post-traslazionali???
Profilo proteico/metabolico???
WBWB IFIF ELISAELISA IHCIHC
XX XX XX XXXX XX XX XX
XX XX XXXXXX
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Qualitativa?
semiquantitativa?
Quantitativa?
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SENSITIVITY
SPECIFICITY
PROPORZIONE DEI +IDENTIFICATI COME TALI
PROPORZIONE DEI -IDENTIFICATI COME TALI
CONDIZIONEpositivo negativo
positivo TRUE POSITIVE
FALSE FALSE POSITIVEPOSITIVE
TEST OUTCOME
negativo FALSE FALSE NEGATIVENEGATIVE
TRUE NEGATIVE
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TEST DIAGNOSTICO CONSIDERATO DEFINITIVO
Test “gold standard”ideale: sensibilitsensibilitàà e e
specificitspecificitàà del 100%del 100%